專利名稱：：環(huán)狀抗微生物肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及環(huán)狀陽離子肽及其在治療微生物感染中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：抗微生物肽(AMP)形成了真核生物免疫性的基礎(chǔ)，并且提供了抵抗微生物破壞皮膚和粘膜表面的第一道防線。天然的AMP的例子包括防御素以及cathelicidin肽家族。這些AMP的長度、序列及結(jié)構(gòu)各異，但它們最主要的共同點(diǎn)在于分子小，帶陽離子凈電荷以及兩性結(jié)構(gòu)。也已經(jīng)從多種細(xì)菌、真菌、植物、無脊柱動(dòng)物和脊柱動(dòng)物中分離出小的、陽離子抗微生物肽，因此抗微生物肽看來也在原核生物的防御中發(fā)揮了作用。天然的AMP表現(xiàn)出抗革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性細(xì)菌、酵母、真菌以及包膜病毒的廣譜活性。病原微生物看來沒有獲得對這些陽離子肽的抗性，而且同樣地，AMP已經(jīng)保守地作為重要的天然免疫宿主防御分子經(jīng)歷了幾千年的演化。因此不難理解，AMP已經(jīng)成為用于多種感染的治療劑的潛在研究目標(biāo)。然而，AMP面臨著纟支術(shù)上的才兆戰(zhàn)，并且其在重組系統(tǒng)生產(chǎn)的成本高，具有強(qiáng)效的趨化作用和炎性生物學(xué)功能，這些都阻礙了天然的AMP成為治療劑。在我們的共同未決申請中，我們已經(jīng)表明富含某些堿性殘基，如賴氨酸或精氨酸的線性肽具有抗微生物活性，特別是抗真菌活性。然而，仍然還需要能夠用于治療和預(yù)防微生物感染的藥物。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，其中提供了包含2至約200個(gè)D和/或L-氨基酸的肽，所述氨基酸可以是相同的或不同的，選自疏水性氨基酸和/或陽離子氨基酸，并且其中的肽是環(huán)狀的。該環(huán)狀肽可以包含3至約100個(gè)D和/或L-氨基酸，例如3至50個(gè)D和/或L-氨基酸，包含4至約50個(gè)D和/或L-氨基酸。本發(fā)明的肽可以用于預(yù)防和治療微生物感染。由于本發(fā)明的環(huán)狀肽的有效性高，對蛋白水解穩(wěn)定，對鹽實(shí)質(zhì)上不敏感，無肝毒性，無溶血作用并且易于合成，因此它們有希望作為治療劑。本發(fā)明的肽的陽離子電荷被認(rèn)為可以促進(jìn)肽與微生物膜上的極性頭部基團(tuán)結(jié)合。通過環(huán)化使帶電基團(tuán)以更加密集的形式(confirmation)得到穩(wěn)定，相信這樣增強(qiáng)了這種吸引從而增強(qiáng)肽的抗微生物作用。在本發(fā)明更具體的方面中，提供了包含根據(jù)式I的氨基酸的肽((X),(Y)m)n(I)其中l(wèi)和m為0至10的整數(shù)，但1和m不能都為0;n為1至10的整數(shù)；X和Y可以是相同或不同的，為選自疏水性氨基酸和/或陽離子氨基酸的氨基酸，并且作為藥物使用的該肽為環(huán)狀肽。肽可以包含2至50個(gè)氨基酸，例如3、4、5、6或7直到50個(gè)氨基酸，包括3、4、5、6或7直到10、15、20、25、30、35、40、45或50個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，肽包含2至15個(gè)氨基酸，例如3到15個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，肽包含5至13個(gè)氨基酸。進(jìn)一步優(yōu)選的是包含3至7個(gè)氨基酸，例如7個(gè)氨基酸的肽。正如技術(shù)人員所知的，主要根據(jù)氨基酸側(cè)鏈的化學(xué)和物理性質(zhì)，可以將氨基酸分為不同的種類。例如，一些氨基酸通常被認(rèn)為是親水性或極性氨基酸，而其它的則被認(rèn)為是疏水性或非極性氨基酸。疏水性氨基酸可以選自包括甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、色氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸以及蘇氨酸的疏水氨基酸組；陽離子氨基酸可以選自鳥氨酸、組氨酸、精氨酸和賴氨酸。本發(fā)明使用的術(shù)語"疏水性"和"陽離子的，，是指疏水性大于或等于-1.10和/或依據(jù)Fauchere和PliskaEur.J.MedChem.10:39,1983所描述的方法，凈電荷大于或等于0的氨基酸。疏水性或非極性氨基酸也可以是指具有在生理pH下不帶電荷的非極性側(cè)鏈的氨基酸，并且該側(cè)鏈通常與水溶液不相容。氨基酸可以是天然的或合成的。在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，X和/或Y為選自組氨酸、鳥氨酸、精氨酸和賴氨酸的陽離子氨基酸。優(yōu)選的X和/或Y為精氨酸或賴氨酸。X和/或Y可以是本發(fā)明定義的疏水性氨基酸或陽離子氨基酸的光學(xué)異構(gòu)體，如D或L-氨基酸。優(yōu)選的X和/或Y為D-氨基酸。在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，式I所示的肽包含至少90%,例如至少95%,如97-99%,或者甚至100%的D-氨基酸。在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，式I所示的肽包含至少90%,例如至少95%,如97-99%,或者甚至100%的L-氨基酸。本發(fā)明也包括上述氨基酸的已知異構(gòu)體(結(jié)構(gòu)異構(gòu)體、立體異構(gòu)體、構(gòu)象和構(gòu)型異構(gòu)體)，肽模擬物(peptidomimetics)以及結(jié)構(gòu)類似物，以及天然修飾的(例如翻譯后修飾)或化學(xué)修飾的、包括但不限于磷酸化、糖基化、磺酰化和/或羥基化的上述氨基酸。一般來說，本發(fā)明的肽不包括以下氨基酸天冬氨酸、谷氨酸，天冬酰胺、谷氨酰胺或絲氨酸，但是即使這些氨基酸存在，本發(fā)明的某些肽仍可以具有生物活性。在本發(fā)明的更優(yōu)選方面中，X和Y是相同的。優(yōu)選地，X和Y是相同的并且為賴氨酸和精氨酸。在式(I)所示的肽中，I和m可以是l、2、3、4、5、6、7、8、9或10,并且n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在式(I)所示的肽中，l可以是l,n可以是1并且m可以介于4和9之間，例如m可以是3、4、5、6、7、8或9。在式(I)所示的肽中，1、n和/或m可以介于1和5之間，例如1、2、3、4或5。在式(I)所示的肽中，l和m可以是介于0和7之間的整數(shù)，并且n可以是介于1和IO之間的整數(shù)。在式(I)所示的肽中，l和m可以是0、1或2,并且n可以是介于l和IO之間的整數(shù)。在式(I)所示的肽中，X和Y可以是相同的，l可以是0，m可以是1,并且n可以是3、4、5、6、7、8、9或10。在式(I)所示的肽中，X和Y可以是相同的，l和m可以是l,并且n可以是2、3、4或5。在式(I)所示的肽中，X和Y可以是相同的，l可以是l，m可以是2,并且n可以是1、2、3或4。在式(I)所示的肽中，X和Y可以是相同的，l和m可以是2，并且n可以是1、2、3或4。在本發(fā)明更具體的方面中，提供了包含根據(jù)式II的氨基酸的環(huán)狀肽(X)n(II)其中X和n如上所述。優(yōu)選的X為賴氨酸、精氨酸和鳥氨酸。優(yōu)選的n為介于3和15之間的整數(shù)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，X為精氨酸。在本發(fā)明的備選實(shí)施方案中，X為賴氨酸。在本發(fā)明的另外的備選實(shí)施方案中，X為鳥氨酸。本發(fā)明的肽可以包含一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基，例如多達(dá)6個(gè)半胱氨酸殘基，如l、2、3、4、5或6個(gè)半胱氨酸殘基。此外，肽的氨基酸序列可以被修飾從而形成肽的變異體，該變異體包括肽中的至少一個(gè)氨基酸殘基替代另一個(gè)氨基酸殘基，包括使用D型而不是L型的替代。肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可以被替換成另一個(gè)，以改變、增強(qiáng)或保留肽的生物活性。這樣的變異體可以具有例如至少具有約10%相應(yīng)的非變異體肽的生物活性。經(jīng)常使用保守性氨基酸，即替換上述具有相似的化學(xué)和物理性質(zhì)的氨基酸。因此，例如保守性氨基酸替換可以包括賴氨酸替換精氨酸、鳥氨酸或組氨酸；或者精氨酸替換賴氨酸或異亮氨酸，鳥氨酸替換組氨酸；或者一種疏水性氨基酸替換另一種。在進(jìn)行替換后，篩選變異體的生物學(xué)活性。就通常的術(shù)語而言，本發(fā)明使用的術(shù)語"肽"是指通過肽鍵連接起來的多個(gè)氨基酸殘基。該術(shù)語可以與多肽和蛋白質(zhì)互換使用，并且意義相同。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)狀肽選自K畫K-K-K-K誦K匿KR-R-R-R畫R畫R-R本發(fā)明的肽通常是合成的肽。肽可以是分離的、純化的肽或者它們的變異體，這些可以是體外合成的，例如通過固相肽合成方法、通過酶催化的肽合成或者借助重組DNA技術(shù)。在本發(fā)明更具體的方面中，提供了制備根據(jù)本發(fā)明的肽的方法，該方法包括通過肽與偶聯(lián)劑的反應(yīng)將式(I)或式(II)所示的肽環(huán)化。偶聯(lián)劑可以是任何能夠在線性形式的肽的兩個(gè)末端(C末端和N末端)氨基酸殘基之間，例如兩個(gè)氨基酸骨架或側(cè)鏈之間形成肽鍵的試劑。對偶聯(lián)劑的選擇會(huì)影響偶聯(lián)的效率，從而影響環(huán)狀肽的產(chǎn)量。表l顯示了本發(fā)明的方法中所用的偶聯(lián)劑，而技術(shù)人員將意識(shí)到其它已知的偶聯(lián)劑也可以用于本發(fā)明。優(yōu)選的偶聯(lián)劑為HATU-0-(7-偶氮苯并三氮唑-1-基)-N,N,N',N'-四曱基脲六氟磷酸酯。優(yōu)選地，肽與偶合劑之間的反應(yīng)是發(fā)生在堿存在情況下。堿可以包括但并不限于N-曱基嗎啉(NMM)或二異丙基乙胺(DIEA)。優(yōu)選地，反應(yīng)發(fā)生在堿性pH下，例如pH介于8.5-9之間。在肽與偶聯(lián)劑反應(yīng)之前，可以將肽修飾成包括保護(hù)基團(tuán)的肽。保護(hù)基團(tuán)可以包括Pbf(2,2,4,6,7-五曱基二氫苯并呋喃-5-磺?；?，tBu(叔丁基醚)，Mtr(曱氧三甲苯磺?；?，Pmc(2,2,5,7,8-五曱基苯并二氫吡喃-6-磺酰氯)，Mbh(4,4-二曱氧基千基氪化物，4,4-dimethyloxybenzylhydride),Tmob(2，3,4-三曱氧千基)，Aloc(烯丙氧羰基)，F(xiàn)moc(9-藥曱氧羰基)和Boc(叔丁氧羰基)。當(dāng)與偶聯(lián)劑的反應(yīng)之后，可以通過在弱酸性條件下的裂解去除保護(hù)基團(tuán)，例如在三氟醋酸(TFA)溶液的存在下。在肽的骨架環(huán)化過程中，線性肽C末端的肽與偶聯(lián)劑的活化基團(tuán)相接觸，并且隨著反應(yīng)進(jìn)行，在該氨基酸的a碳上形成酮-烯醇式中間體。因此，當(dāng)/人鄰位石灰上去除活化基團(tuán)時(shí)，烯醇(enol)(或烯醇，alkenol)中間體可以導(dǎo)致兩種對映異構(gòu)體的形成，并形成了肽鍵。通過所使用的偶聯(lián)劑一經(jīng)活化，這種外消旋化，即單一氨基酸對映異構(gòu)體的形成(例如右旋形式和左旋形式(即分別為d和/異構(gòu)體))以及作為整體的肽的非對映異構(gòu)體的形成，就可以發(fā)生在環(huán)化位置上。由于希望本發(fā)明的肽是純對映異構(gòu)體，因此應(yīng)減少或避免不希望的非對映異構(gòu)體的產(chǎn)生。為了減少和避免這種非對映異構(gòu)體的產(chǎn)生，以及生產(chǎn)出純非對映異構(gòu)體的肽，本發(fā)明的肽可以被修飾成包括非手性部分的肽，該部分避免了環(huán)化過程中肽的外消旋化。因此在本發(fā)明的更優(yōu)選方面中，本發(fā)明的肽或本發(fā)明的方法定義的肽被修飾成包括避免環(huán)化過程中形成肽的非對映異構(gòu)體的部分。本發(fā)明使用的"外消旋的肽"是指在肽環(huán)化之前，包含一定量的(通常是等量的)肽C末端氨基酸的各自的光學(xué)異構(gòu)體，例如右旋的和左旋的形式(即分別為d和/或/異構(gòu)體)的肽。被引入肽的部分通常為非手性氨基酸，可以是天然形成的氨基酸或氨基酸類似物。非手性氨基酸可以選自甘氨酸、P-丙氨酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸和6-氨基己酸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在C末端將肽修飾成包括非手性氨基酸，例如甘氨酸。除如上所述將本發(fā)明的肽修飾成C末端包括一部分外，在肽的環(huán)化過程中形成的兩種對映體的比例取決于幾個(gè)因素，如環(huán)化過程(即與偶聯(lián)劑反應(yīng))中使用的溶劑、環(huán)化反應(yīng)時(shí)間(incubationtime)和溫度，以及用于促進(jìn)環(huán)化的活化基團(tuán)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)狀肽包含選自下列氨基酸序列的氨基酸序列K-K-K-K-K-K-KR-R-R畫R-R畫R-RO-O-O-O-O-O-OdR-dR-dR-dR-dR扁dR-dRdO-dO-dO-dO-dO-dO-dOdK-dK-dK-dK-dK-dK-dK為了鑒定對哺乳動(dòng)物細(xì)胞的不希望的毒性很小或者沒有不希望的毒性的活性肽，可以制備單一的肽或肽庫(librariesofpeptides),并且可以篩選單一的肽或這些肽庫的肽的抗微生物活性和毒性，包括但并不限于抗真菌、抗細(xì)菌、抗病毒、抗原生動(dòng)物、抗寄生蟲活性以及毒性。本發(fā)明的肽可以以不同形式存在，如以游離酸、游離石威、酯和其它前藥、鹽或互變異構(gòu)體，例如，并且本發(fā)明包括了這些化合物所有的變體形式。因此，本發(fā)明包括了本發(fā)明的肽或肽變異體的鹽或前藥。本發(fā)明的肽可以以藥學(xué)上可接受的鹽的形式給藥。本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的鹽可以通過常規(guī)化學(xué)方法由母體肽合成，該母體肽包含堿性或酸性部分。一般來說，這些鹽是通過在水或在有機(jī)溶劑、或兩者的混合物中，有機(jī)酸或堿形式的肽與化學(xué)計(jì)量的適合的堿或酸反應(yīng)來制備的；通常地，非水介質(zhì)象醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈是優(yōu)選的。適合的鹽類的歹'J表見于iemf"gtowk/Vzarmacez^c"/Sc/e"cas，17thed"MackPublishingCompany,Easton,Pa.,US,1985，p.1418，因此引入其披露的內(nèi)容作為參考；還參見Stahl等纟扁6々"/7aw<iZ)ooA:o/尸/zarmacei^z'ca/尸ro/eW,esSe/ec^owam/L^e",VerlagHelveticaChimicaActa和Wiley-VCH,2002。因此，本發(fā)明包括了本發(fā)明的肽的藥學(xué)上可接受的鹽，其中通過制備母體化合物的酸或堿的鹽對其進(jìn)行修飾，所述鹽例如常規(guī)的無毒鹽或者由無機(jī)或有機(jī)酸或堿形成的季銨鹽。這樣的酸加成鹽的例子包括醋酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氬鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環(huán)戊丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、延胡索酸鹽、葡糖庚酸鹽(glucoheptanoate)、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、曱磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽(palmoate)、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、辟^氰酸鹽、曱苯磺酸鹽以及十一酸鹽。堿性鹽包括銨鹽，堿金屬鹽如鈉鹽和鉀鹽，堿土金屬鹽如4丐鹽和《美鹽，含有機(jī)堿的鹽類如雙環(huán)己胺鹽、N-甲基-D-谷氨酰胺，以及含氨基酸如精氨酸、賴氨酸的鹽，等等。此外，含氮的堿性基團(tuán)可以被以下試劑季銨化，低級(jí)卣代烷烴，如氯甲烷、氯乙烷、氯丙烷、氯丁烷、溴曱烷、溴乙烷、溴丙烷、溴丁烷、碘曱烷、碘乙烷、碘丙烷和碘丁烷；二烷基硫酸鹽，如二曱基硫酸鹽、二乙基硫酸鹽、二丁基硫酸鹽和二戊基硫酸鹽；長鏈卣化物，如氯代癸烷、溴代癸烷、碘代癸烷、月桂基氯、月桂基溴、月桂基碘、肉豆蔻基氯、肉豆蔻基溴、肉豆蔻基碘、硬脂氯、硬脂基溴和硬脂基碘；卣代芳香烷，如溴代苯曱烷和溴代苯乙烷以及其它。本發(fā)明的肽或肽的變異體的羧酸鹽可以按照常規(guī)方式制備，即通過肽與一當(dāng)量或多當(dāng)量的目標(biāo)堿接觸，例如金屬氫氧化物堿，如氫氧化鈉；金屬碳酸鹽或碳酸氫鹽，如碳酸鈉或碳酸氫鈉；或者胺類堿，如三乙胺、三乙醇胺等。本發(fā)明包括用于所述肽的藥物活性形式的前藥，例如其中一個(gè)或多個(gè)功能基團(tuán)被保護(hù)或衍生化，但其在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為功能基團(tuán)，如可以在體內(nèi)被轉(zhuǎn)化為游離酸的羧酸酯，或可以轉(zhuǎn)化為游離氨基的被保護(hù)的氨基的情形。本發(fā)明使用的術(shù)語"前藥"特指在體內(nèi)被迅速轉(zhuǎn)化為母體結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)，例如在血液中水解。本發(fā)明更具體的方面提供了包含藥學(xué)上有效量的本發(fā)明的肽，或兩種或多種不同的本發(fā)明的肽的藥物組合物。組合物也包括藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑和稀釋劑。本發(fā)明使用的短語"藥學(xué)上可接受的，，是指在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)，適宜用于與人類的組織接觸，或者在某些情況下與動(dòng)物的組織接觸，而不產(chǎn)生過量毒性、刺激和過敏反應(yīng)、或其它問題或并發(fā)癥，并且具有相稱的合理效益/風(fēng)險(xiǎn)比的那些化合物、原料、組合物和/或劑型。本發(fā)明的肽特別用作抗微生物的肽，例如抗細(xì)菌、真菌、酵母、寄生蟲、原生動(dòng)物和病毒。本發(fā)明可以使用術(shù)語"抗微生物的肽"來定義Y壬何具有殺微生物和/或抑菌活性的肽，并且非唯一地包括所述的任何具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗霉菌、抗寄生蟲，抗原生動(dòng)物、抗病毒、抗感染、抗傳染和/或殺菌、殺藻、殺阿米巴、殺微生物、殺細(xì)菌、殺真菌、殺寄生蟲、殺原生動(dòng)物性質(zhì)的肽。感染的藥物中的用途。"微生物感染"是指由細(xì)菌、寄生蟲、原生動(dòng)物、病毒或真菌包括酵母等引起的感染。"病原體"通常被定義為任何引發(fā)疾病的生物體。細(xì)菌性病原體可以來源于選自以下組，但不局限于以下組的細(xì)菌種類，包括葡萄球菌屬，例如金黃色葡萄球菌(例如金黃色葡萄球菌NCTC10442),表皮葡萄球菌；衣原體屬，例如沙眼衣原體，肺炎衣原體和鷚鵡熱衣原體；腸球菌屬，例如糞腸球菌；化膿鏈球菌；利斯特菌屬；假單胞菌屬；分枝桿菌屬，例如結(jié)核分枝桿菌；腸桿菌屬；彎曲桿菌屬；沙門氏菌屬；鏈球菌屬，例如A或B群鏈球菌，肺炎鏈球菌；螺桿菌屬，例如幽門螺桿菌；奈瑟菌屬，例如淋病奈瑟菌，腦膜炎奈瑟菌；伯氏疏螺旋體；志賀氏菌屬，例如弗氏志賀菌；大腸桿菌(大腸桿菌0157:H7NCTC12900);嗜血桿菌屬，例如流感嗜血桿菌；土拉弗朗西斯菌；芽胞桿菌屬，例如炭疽桿菌；梭狀芽胞桿菌屬，例如肉毒桿菌；耶爾森菌屬，例如鼠疫耶爾森菌；密螺旋體屬；伯克霍爾德菌屬，例如洋蔥伯克霍爾德菌，鼻疽伯克霍爾德菌和類鼻疽伯克霍爾德菌。在根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選用途中，細(xì)菌病原體為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。病毒性病原體可以來源于選自以下組，但不局限于以下組的病毒，包括人類免疫缺陷病毒(HIV1型和2型)；人類T細(xì)胞白血病病毒(HTLVl型和2型)；埃博拉病毒；人乳頭瘤病毒(例如HPV-2、HPV-5、HPV-8、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-52、HPV-54和HPV-56);乳多空病毒；鼻病毒；脊髓灰質(zhì)炎病毒(polioviras);皰滲病毒；腺病毒；EB病毒；流感病毒；乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒，天花病毒，輪狀病毒或SARS冠狀病毒。寄生蟲病原體可以來源于選自以下組，但不局限于以下組的寄生蟲錐蟲屬(克氏錐蟲和布氏錐蟲)，利什曼原蟲屬，賈第蟲屬，毛滴蟲屬，內(nèi)阿米巴屬，耐格里原蟲屬，棘阿米巴屬，血吸蟲屬，瘧原蟲屬，隱孢子蟲屬(O^to^oWAwmspp.)，等孢子球蟲屬，小袋蟲屬，羅阿絲蟲，蛔蟲，犬惡絲蟲屬，弓形體屬例如鼠弓形體。在根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選用途中，微生物感染為真菌感染。真菌病原體可以來源于選自以下屬，但不局限于以下屬的真菌(包括酵母)念珠菌屬(例如白色念珠菌)，表皮癬菌屬，外瓶柄霉菌屬，小孢霉屬，發(fā)癬菌屬(例如紅色發(fā)癬菌和趾間發(fā)癬菌)，癬屬(7Y"easpp.)，曲霉菌屬，芽生菌屬，芽生裂殖菌屬(說osto"/^owyc^spp.),球孢子菌屬，隱球菌屬(例如新型隱球菌)，組織胞漿菌屬，副球孢子菌屬(戶(2racoccW簡ycesspp.),孑包子絲菌屬,舉頭霉屬,CA^op/z/a/op/zora屬,產(chǎn)色芽生菌屬,瓶霉菌屬，Z"c"z/a屬，v4w/zragrap/z/6"屬，支頂孢菌屬，馬都拉放線菌屬，^o//2"omycM屬，單嚢霉屬，團(tuán)擔(dān)子菌屬，白僵菌屬，金孢子菌屬，耳霉屬，小克銀漢霉屬，新月菌屬，地霉屬，粘束孢屬，小球腔菌屬(丄印to^/zaen'aspp.)，馬拉塞霉菌屬(例如糠秕馬拉塞霉菌)，毛霉菌屬，新龜曱屬，諾卡爾菌屬，諾卡爾土壤菌屬，擬青霉屬，莖點(diǎn)霉屬，毛孢子菌屬，肺孢子蟲屬，偽霉樣真菌屬，核菌屬(」P,e"oc/wetospp),根毛霉屬，根霉屬，紅酵母屬，酵母菌屬，足放線病菌屬，帚霉屬，擲孢酵母屬，共頭霉屬，木霉屬，毛孢子菌屬，單格孢屬(f//oc/aAwmspp.),黑4分菌屬，l侖枝《包菌屬，萬吉拉菌屬(spp.)。在根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選用途中，真菌病原體屬于發(fā)癬菌屬或隱球菌屬。例如真菌病原體可以是紅色發(fā)痺菌，趾間發(fā)癬菌或新型隱球菌。真菌感染可以是全身性的、局部的、皮下的、皮膚的或粘膜感染。盡管某些非皮膚真菌，如酵母也能引起皮膚感染，但是皮膚和指(趾)曱的局部真菌感染通常是由皮膚真菌引起的。皮膚真菌感染可以包括癬感染，例如須痺(胡須)，頭癬(頭)，體癬(身體)，股癬(腹股溝)，面部癬(面部)，手癬(手)，腳癬(足)，曱癬(指(趾)曱)，花斑癬(糠疹)，難辨認(rèn)癬和黑褲。這些感染可以由表皮癬菌屬、小孢霉屬和發(fā)癬菌屬(紅色發(fā)癬菌和趾間發(fā)癬菌)的真菌引起。皮膚真菌感染可以是皮膚、基質(zhì)層(lamina)、角質(zhì)層、曱(指曱和趾曱)或毛發(fā)的感染。特別提及的是由發(fā)癬菌屬、表皮癬菌屬或小孢霉屬的皮膚真菌引起的皮膚真菌感染。皮膚真菌的例子包括絮狀表皮癬菌，犬小孢霉，奧杜尼小孢霉，石膏樣小孢霉，矮小孢子菌，鐵銹色小孢子菌，扭曲小孢子菌，黃褐色小孢霉，紅色發(fā)癬菌，須發(fā)辨菌變種趾間發(fā)癬菌，須發(fā)褲菌變種結(jié)節(jié)須發(fā)褲菌(7Hc/zop一o"膨幽grap/^as"。<iw/"w),斷發(fā)癬菌，蘇丹發(fā)癬菌(7h'c/zo//^w7Sm^a"ew),堇色發(fā)癬菌，麥格尼發(fā))，舍恩萊茵發(fā)癬菌，雞發(fā)癬菌，/tra^em'z'發(fā)癬菌,，oww必發(fā)褲菌，馬發(fā)褲菌,發(fā)褲菌和疾狀發(fā)禱菌。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，皮膚真菌感染為曱真菌病。術(shù)語"曱真菌病"包括但不限于，遠(yuǎn)端側(cè)位曱下型，淺表白色型，近端白色甲下型，繼發(fā)營養(yǎng)不良型，原發(fā)營養(yǎng)不良型，endonyx型，念珠菌型(例如曱真菌病與慢性粘膜皮膚疾病)曱真菌病和曱痺。與曱真菌病有關(guān)的非皮膚真菌性真菌包括曲霉菌屬，頭孢子菌屬，尖鐮孑包菌，短尾帚霉(Sco—6rev/ca幽)，柱霉菌屬。本發(fā)明的肽是對多種病原生物體均有效的抗孩t生物肽。此外，本發(fā)明的肽也可以用于其它病征的治療，包括但不限于與粘膜感染有關(guān)的病征，例如嚢性纖維化，胃腸道、泌尿生殖系統(tǒng)、泌尿系(腎臟感染或膀胱炎)或呼吸系統(tǒng)的感染。創(chuàng)傷、潰瘍和損傷，例如皮膚創(chuàng)傷如割傷或燒傷，以及相關(guān)的病征。在本發(fā)明優(yōu)選的方面中，肽用于治療細(xì)菌性皮膚感染或"膿皮病"。術(shù)語"治療"涉及本發(fā)明所述的肽在使經(jīng)受(感染性)疾病痛苦的患者受益方面的作用，包括改善患者的癥狀或延緩疾病發(fā)展。本發(fā)明使用的術(shù)語"創(chuàng)傷治療"可以包括創(chuàng)傷愈合和相關(guān)的情形，以及促進(jìn)、增加或加速組織愈合的治療，包括手術(shù)后瘢疤形成、燒傷、潰瘍、銀屑病，加速組織重塑(tissueremodelling),例如整形手術(shù)或器官移植術(shù)后。質(zhì)。優(yōu)選的基質(zhì)適合施用于創(chuàng)傷或者向創(chuàng)傷部位輸送。優(yōu)選的基質(zhì)使得本發(fā)明的肽從基質(zhì)轉(zhuǎn)移至創(chuàng)面，以實(shí)現(xiàn)其抗生素的作用?；|(zhì)可以是敷料，例如創(chuàng)傷用敷料。敷料可以包括纖維材料，或者可以是膠原樣材料。本發(fā)明的肽也可以用作消毒劑或用在消毒劑中。在這種情況下，肽或本發(fā)明的藥物組合物可以單獨(dú)或與其它消毒劑組合施用于待處理的表面。本發(fā)明使用的"待處理表面，，可以是本發(fā)明定義的基質(zhì)或者醫(yī)療裝置。在更具體的方面中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防受試者微生物感染的方法，其中包括給予所述受試者治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的肽。在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，微生物感染為真菌感染。在本發(fā)明的方法中，肽局部施用于所述受試者的皮膚或指(趾)曱。本發(fā)明所述的肽、組合物和方法可以治療哺乳動(dòng)物、鳥類和其它動(dòng)物。這些哺乳動(dòng)物和鳥類包括人，狗，貓和家畜，如馬、牛、綿羊、山羊、雞、火雞等。此外，本發(fā)明所述的肽、組合物和方法也可以治療植物。當(dāng)受試者為動(dòng)物時(shí)，本發(fā)明的方法可以施用于具有指(趾)曱樣特征的部位，包括但不限于if帝、爪和腳。除了肽治療之外，本發(fā)明的方法可以包括可以增強(qiáng)肽向指(趾)曱滲透的治療。這是通過化學(xué)和物理方法實(shí)現(xiàn)的。物理治療例如指(趾)曱刻蝕(nailetching),或銼掉指(趾)曱背面層，可以增強(qiáng)本發(fā)明的肽的滲透性。增強(qiáng)本發(fā)明的肽的指(趾)曱滲透性的化學(xué)方法是通過破壞指(趾)甲板角蛋白中的物理或化學(xué)鍵來實(shí)現(xiàn)的。指(趾)曱軟化劑包括但不限于尿素和水楊酸，其增強(qiáng)指(趾)曱的水合作用以降低指(趾)曱的密度，因此可以提高本發(fā)明的肽的滲透性。包含巰基基團(tuán)的化合物會(huì)裂解指(趾)曱角蛋白中的二硫鍵，并且可以導(dǎo)致去穩(wěn)定化和提高藥物的滲透性。在更具體的方面中，本發(fā)明提供了治療受試者創(chuàng)傷的方法，其中包括向創(chuàng)傷施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的肽或基質(zhì)。為了獲得理想的效果，肽及其變異體或組合可以以單劑量或分劑量給藥，例如至少約0.01mg/kg至約500-750mg/kg,至少約0.01mg/kg至約300-500mg/kg，至少約0.1mg/kg至約100-300mg/kg或者至少約1mg/kg至約50-100mg/kg體重，或者至少約lmg/kg至20mg/kg體重，盡管其它劑量也可以提供有益的效果。給藥劑量將隨著各種因素而變化，包括但不限于所選擇的肽及其臨床效果、疾病、體重、身體狀況、健康狀況、哺乳動(dòng)物的年齡、要實(shí)現(xiàn)的是治療還是預(yù)防，以及肽是否經(jīng)過化學(xué)修飾。根據(jù)本發(fā)明，給予治療劑可以是單劑量、多劑量、連續(xù)的或間歇的方式，這取決于例如接受者的生理狀況，給藥的目的是治療還是預(yù)防，以及專業(yè)技術(shù)人員已知的其它因素。給予本發(fā)明的肽實(shí)質(zhì)上是在預(yù)定的時(shí)間期間連續(xù)的，或者可以是以一系列間隔的劑量的形式。局部和全身給藥都考慮在內(nèi)為了制備組合物，可以合成肽或以其它方式獲得肽，根據(jù)需要和期望進(jìn)行純化，然后經(jīng)凍干和穩(wěn)定化。然后調(diào)節(jié)肽至適當(dāng)?shù)臐舛?，并且任選地與其它試劑組合。單位劑量中包含的特定肽的絕對重量可以有很大的變化。例如，可以給予約0.01至約2g或約0.01至約500mg的至少一種本發(fā)明的肽，或特異性針對特定細(xì)胞類別的多種肽。備選地，單位劑量可以從約O.Olg至約50g,從約O.Olg至約35g,從約O.lg至約25g,從約0.5g至約12g,從約0.5g至約8g，從約0.5g至約4g或者從約0.5g至約2g來變化。因此，一種或多種包含本發(fā)明的治療性肽的適宜的單位劑型可以通過多種途徑給藥，包括口服，腸道外(包括皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)和腹腔內(nèi))，直腸，皮膚，透皮，胸內(nèi)，肺內(nèi)，鼻內(nèi)(呼吸的)途徑。治療性肽也可以配制成脂質(zhì)制劑或用于緩釋(例如使用微嚢化，參見WO94/07529和美國專利No.4,962,091)。如果適合，劑型可以是離散的單位劑型以便于使用，并且可以通過藥學(xué)領(lǐng)域熟知的任何方法來制備。這些方法可以包括治療劑與液體載體、固體基質(zhì)、半固體載體，細(xì)分散的固體載體或它們的組合混合，以及隨后根據(jù)需要將產(chǎn)品加入所需的輸送系統(tǒng)或成型后進(jìn)入所需的輸送系統(tǒng)的步驟。當(dāng)本發(fā)明的治療性肽被制成用于口服給藥時(shí)，它們通常與藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑組合以形成藥物制劑或單位劑型。為了口服給藥，肽可以以呈現(xiàn)為粉末、顆粒、溶液、懸浮液、乳液，或者處在天然的或合成的聚合物或樹脂中用于從口香糖中攝入活性成分?；钚噪囊部梢猿尸F(xiàn)為丸劑、沖劑或糊劑?？诜o藥的本發(fā)明的治療性肽液可以被配制成緩釋劑型，例如肽可以被包衣、微嚢化或者置于其它緩釋輸送的裝置中。在這樣的制劑中，活性成分總量占制劑重量的0.1-99.9%。包含本發(fā)明的治療性肽的藥物制劑可以使用熟知且容易獲得的成分通過本領(lǐng)域的方法制備。例如，肽可以與常用的賦形劑、稀釋劑或載體一起配制成片劑、膠嚢、溶液、懸浮液、粉末和氣霧劑等。適于這些制劑的賦形劑、稀釋劑和載體的例子包括緩沖劑以及填充劑和膨脹劑，如淀粉、纖維素、蔗糖、甘露醇以及硅的衍生物。也可以包括粘合劑，如羧曱基纖維素、羥曱基纖維素、羥丙甲基纖維素以及其它纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮?？梢园ǖ谋駝┤绺视?，崩解劑如碳酸鈣和碳酸氫鈉。還可以包括延遲溶出的試劑，如石蠟。也可以包括再吸收促進(jìn)劑(Resorptionaccelerators),如季4妄化合物?？梢园ū砻婊钚詣琏L蠟醇、甘油單硬脂酸酯。可以加入的吸附載體如高嶺土和膨潤土；還可以包括的潤滑劑如滑石、石更脂酸4丐和硬脂酸鎂，以及固體聚乙二醇；也可以加入防腐劑。本發(fā)明的組合物也可以包含增稠劑，如纖維素和/或纖維素衍生物。它們也可以包含樹膠如黃原膠、瓜爾膠或carbo膠或阿拉伯膠，或備選的聚乙二醇、有機(jī)皂土和蒙脫土等。例如，包含本發(fā)明的肽的片劑或嚢片(caplets)可以包括緩沖劑，如碳酸鉤、氧化鎂和碳酸鎂。適宜的緩沖劑還包括醋酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽和磷酸鹽等。嚢片和片劑也可以包括非活性成分，如纖維素、預(yù)膠化淀粉、二氧化硅、羥丙曱基纖維素、硬脂酸鎂，微結(jié)晶纖維素、淀粉、滑石、二氧化鈦、苯曱酸、檸檬酸、玉米淀粉、礦物油、聚丙二醇、磷酸鈉、硬脂酸鋅等。包含至少一種本發(fā)明的肽的硬或軟明膠膠嚢可以包含非活性成分如明膠、微結(jié)晶纖維素、十二烷基硫酸鈉、淀粉、滑石和二氧化鈦等，以及液體載體如聚乙二醇(PEGs)和才直物油。此外，包含至少一種或多種本發(fā)明的肽的腸衣嚢片或片劑被設(shè)計(jì)成防止在胃內(nèi)崩解，并且十二指腸內(nèi)更加中性到堿性的環(huán)境下溶解。配制成適于腸道外給藥的溶液，例如肌肉內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)的途徑。本發(fā)明的治療性肽的藥物制劑也可以采用水溶液或無水溶液或分散體的形式，或者備選的乳劑、懸浮劑或軟膏的形式。因此，治療性肽可以配制成用于腸道外給藥的制劑(例如，通過注射，例如團(tuán)注或連續(xù)輸注)，并且可以以單位劑量的形式存在于安瓿、預(yù)填充的注射器、小體積輸注容器或多劑量容器中。活性肽和其它成分可以在油性或水性載體中形成懸浮液、溶液或乳液，并且可以包含調(diào)節(jié)劑(formulatoryagent)，如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。備選地，活性肽和其它成分可以是粉末形式，這是通過無菌固體的無菌分離，或由用適合的載體，例如使用前無菌無熱原的水構(gòu)成的溶液經(jīng)凍干而獲得的。這些制劑可以包含本領(lǐng)域熟知的藥學(xué)上可接受的載體(carriers)、載體(vehicles)和輔劑。例如，能夠使用一種或多種從生理學(xué)的觀點(diǎn)而言可接受的有機(jī)溶劑來制備溶液，除水之外，所述溶劑選自丙酮，醋酸，乙醇，異丙醇，二曱基亞砜，乙二醇醚如以名稱為"Dowanol"銷售的產(chǎn)品，聚二醇類和聚乙二醇，CrC4短鏈酸的烷基酯，乳酸乙酯或乳酸異丙酯，脂肪酸甘油三酯如以名稱為"Miglyol"出售的產(chǎn)品，肉豆蔻酸異丙酯(isopropylmytrisate),動(dòng)物油，礦物油禾口才直物油以及聚硅氧烷。包含本發(fā)明的肽的溶劑或稀釋劑可以包括酸性溶液，二曱基亞砜，N-(2-巰基丙酰)甘氨酸，2-正壬基-l,3-二氧戊環(huán)和乙醇。優(yōu)選的溶劑/稀釋劑是酸性溶劑，例如醋酸、檸檬酸、硼酸、乳酸、丙酸、磷酸、苯曱酸、丁酸、,果酸、丙二酸、草酸、琥珀酸或酒石酸。還考慮了包括一種或多種本發(fā)明的肽以及一種或多種其它抗微生物或抗真菌劑的組合產(chǎn)品，所述其它抗微生物或抗真菌劑例如多烯類，如兩性霉素B、兩性霉素B脂質(zhì)復(fù)合物(ABCD)、兩性霉素B脂質(zhì)體(L-ABM)以及制菌霉素脂質(zhì)體；唑類和三唑類，伏立康唑、氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、泊沙康唑(pozaconazole)等；葡聚糖合成酶抑制劑，如卡泊芬凈，米卡芬凈(FK463)和V-棘白菌素(LY303366);灰黃霉素；烯丙基胺類，如特比萘芬；氟胞嘧啶或其它抗真菌劑，包括本發(fā)明描述的那些。此外，可以考慮肽與局部抗真菌劑組合起來，局部抗真菌劑如環(huán)吡酮胺，鹵普羅近，托萘酯，十一烯酸酯(鹽)，局部用制菌霉素，阿莫羅芬，布替萘芬，萘替芬，特比萘芬以及其它局部藥物。此外，肽可以配制成緩釋劑型等。制劑的組成能使該制劑能夠在一定的時(shí)間內(nèi)釋放活性肽，例如在腸道或呼吸道的特定部分釋放。包衣，包膜和保護(hù)性基質(zhì)可以由例如聚合物質(zhì)，如聚乳酸-乙醇酸，脂質(zhì)體，微乳，微粒，納米顆?；蛳炛瞥?。這些包衣、包膜和保護(hù)性基質(zhì)用于包覆留置裝置，例如支架、導(dǎo)管、腹膜透析管、排液裝置(drainingdevices)等。對于局部給藥，如本領(lǐng)域已知的那樣，可以將活性藥物配制成直接應(yīng)用于耙點(diǎn)區(qū)域。主要為局部應(yīng)用而配制的形式采用了例如乳膏，乳液，凝膠，粉末，分散體，微乳，調(diào)節(jié)得更稠或更稀的洗劑，浸漬的藥墊，軟膏或棒，氣霧劑(例如噴霧或泡沫)，皂，洗滌劑，皂類洗劑或皂塊的形式。其它用于該目的的常規(guī)形式包括醫(yī)用敷料，涂層繃帶(coatedbandages),或其它聚合物覆蓋物，軟膏，乳膏，洗劑，糊劑，凝膠，噴霧劑和氣霧劑。因此，可以通過貼劑和繃帶輸送本發(fā)明的治療性肽以用于皮膚給藥。備選地，也可以將肽配制成粘性聚合物，如聚丙烯酸酯或丙烯酸酯/醋酸乙烯酯共聚物的一部分。為了適于長期應(yīng)用，可能希望使用帶微孔的和/或透氣的襯底層，這樣可以使皮膚的水合作用和浸漬降到最小。襯底層可以是任何能夠提供所需的保護(hù)和支持功能的厚度。適宜的厚度一般為約10至約200微米。局部給藥可以是指(趾)曱涂層或漆的形式。例如，抗真菌的肽可以配制成用于局部給藥的溶液，其中包含乙酸乙酯(NF),異丙醇(USP)以及聚[曱基乙烯基醚/馬來酸]單丁酯的異丙醇溶液。局部應(yīng)用的藥物制劑可以包含例如生理上可接受的緩沖鹽溶液，該溶液包含約0.001mg/ml和100mg/ml之間，例如0.1mg/ml和10mg/ml之間例如，軟膏和乳膏可以用水性或油性基質(zhì)配制，其中加入適宜的增稠劑和/或膠凝劑。洗劑可以用水性或油性基質(zhì)配制，并通常還含有一種或多種乳化劑，穩(wěn)定劑，分散劑，懸浮劑，增稠劑或著色劑。活性肽也可以通過電離子導(dǎo)入來輸送，例如美國專利Nos.4,140,122;4,383,529或4,051,842中所公開的方法。局部制劑中存在的本發(fā)明的肽的重量百分比要取決于多種因素，但通常會(huì)為制劑總重量的0.01%至95%,并且典型的是0.1-85%重量。滴劑，如滴眼劑或滴鼻劑，可以采用一種或多種水性或非水性基質(zhì)中的治療性肽來配制，該基質(zhì)中還包含一種或多種分散劑，增溶劑或懸浮劑。液體噴霧劑可以是以泵驅(qū)動(dòng)的，或者是便于從加壓包裝中輸送出來的。滴劑可以通過筒單的眼用帶蓋滴管并瓦(eyedropper-cappedbottle),通過適于輸送液體內(nèi)容物液滴的塑料瓶，或者通過特定形狀封閉容器來輸送。治療性肽可以被進(jìn)一步配制成用于口腔和咽喉局部給藥。例如，活性成分可以配制成進(jìn)一步含有調(diào)味基質(zhì)，通常是蔗糖和阿拉伯膠或西黃蓍膠的錠劑(lozenge);包含惰性基質(zhì)如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠中的組合物的4定劑(pastilles);以及包含適宜液體載體中的本發(fā)明組合物的漱口水。用于本發(fā)明的藥物制劑的載體和/或稀釋劑的特定的非限制性例子包括水和生理上可接受的緩沖鹽溶液，如pH.O-8.0的磷酸緩沖鹽溶液。本發(fā)明的肽也可以經(jīng)呼吸道給藥。就吸入或吹入給藥而言，組合物可以采用干粉形式，例如治療劑與適宜的粉狀基質(zhì)如乳糖或淀粉的粉狀混合物。當(dāng)以氣霧劑或吸入的形式給藥時(shí)，本發(fā)明的治療性肽也可以以水溶液給藥。因此，其它的氣霧劑藥物制劑可以包含例如生理上可接受的緩沖鹽溶液，溶液中包含介于約0.001mg/ml和100mg/ml之間，例如0.1和100mg/ml之間，如0.5-50mg/ml,0.5-20mg/ml,0.5-10mg/ml，0.5-5mg/ml或l-5mg/ml的一種或多種特異性針對將被治療的適應(yīng)癥或疾病的本發(fā)明的肽。貫穿本申請的說明書和權(quán)利要求書，詞語"包括(comprise)"和"包含(contain)"以及這些詞語的變體，例如"包括(comprising)"和"包括(comprises)"意味著"包括但不限于"，并且不想要排除(和排除)其它部分、附加物、組分、整數(shù)或步驟。貫穿本申請的說明書和權(quán)利要求書，單數(shù)包含了復(fù)數(shù)，除非上下文另有需要。特別地，當(dāng)使用不定冠詞時(shí)，說明應(yīng)被理解為考慮了復(fù)數(shù)以及單數(shù)，除非上下文另有需要。與本發(fā)明特定的方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├黄鸨幻枋龅募夹g(shù)特征、整數(shù)、特性、化合物、化學(xué)基團(tuán)(chemicalmoieties)或基團(tuán)將被理解為可適用于本發(fā)明描述的其它方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├?，除非與之不相容。實(shí)施例材料和方法實(shí)施例1通過將l叫的被保護(hù)的肽和leq(eq-相等的體積)的HATU以100mg/ml的濃度溶于DMF(二曱基曱酰胺)中，使7個(gè)氨基酸的多賴氨酸肽進(jìn)行環(huán)化。為了l是高pH值，加入2.5eq的DIEA(二異丙基乙胺)，并且通過HPLC跟蹤反應(yīng)過程。當(dāng)反應(yīng)完成時(shí)，在水中沉淀肽，并且另外進(jìn)行水洗。然后將肽干燥并用氫氟酸去保護(hù)以形成最終的環(huán)狀肽。此后，在凍干之前使用離子交換色譜以醋酸替換氫氟酸溶劑。實(shí)施例2通過將leq的,皮保護(hù)的肽與5叫的NaHC03(石友酸氫鈉)和2eq的PyBOP以28.5mg/ml的濃度溶于DMF中，使7個(gè)氨基酸的多精氨酸肽進(jìn)行環(huán)化。通過TLC追蹤反應(yīng)，并且當(dāng)反應(yīng)完成時(shí)在水中沉淀肽，并且另外進(jìn)行水洗。然后將肽千燥并用氫氟酸去保護(hù)以形成最終的環(huán)狀肽。此后，在凍干之前使用離子交換色譜以醋酸替換氫氟酸溶劑。實(shí)施例37個(gè)氨基酸的多精氨酸肽的環(huán)化溶液1:將57mg的HBTU(Mwt=379.3，0.15毫摩爾)或57mg的HATU(M=380.3,0.15毫摩爾)和60nl的0.92mg/mlNMM(n-曱基嗎啉，Mwt=101.2:0.55毫摩爾)溶于2.86ml的DMF中。溶液2:將288mg的H-[Arg(Pbf)]7-OH(Mwt=2877.6,0.1毫摩爾)(7個(gè)氨基酸的多精氨酸肽)溶于0.71ml的DMF中。在30分鐘內(nèi)將溶液2滴加到溶液1中。用濕pH試紙4企查pH值，并且pH值必須為8.5-9。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜*?；旌衔锝?jīng)真空濃縮。加入NaHC03(5%)溶液。被保護(hù)的環(huán)肽的沉淀經(jīng)過濾并用水洗滌。得到150-200mg。在TFA/水(95/5,v/v)(lg被保護(hù)的肽用10ml)中進(jìn)行Pbf基團(tuán)的裂解。濃縮混合物并加入IPE沉淀粗產(chǎn)品。得到100-110mg粗環(huán)狀A(yù)rg。(*使用HATU進(jìn)行的偶聯(lián)在5小時(shí)后完成。NMM的量取決于H-[Arg(Pbf)]7-OH中過量的TFA)。合成的環(huán)狀肽至少有純度為95%的對映體，并且趨向于在97-99%之間變化。根據(jù)該方法合成的環(huán)狀肽至少有純度為95%的對映體。肉湯稀釋抗真菌易感性試驗(yàn)采用臨床實(shí)'險(xiǎn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所(ClinicalLaboratoryStandardInstitute,CLSI,以前為NCCLS)認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)，確定相關(guān)真菌菌4朱對環(huán)化的肽的每丈感性。使用"絲狀真菌的肉湯稀釋抗真菌易感性試驗(yàn)的參考方法，認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)M38-P)"測試真菌的易感性。使用"酵母的肉湯稀釋抗真菌易感性試驗(yàn)的參考方法，認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)一第二版M27-A)"測試酵母的易感性。肉湯稀釋抗細(xì)菌易感性試驗(yàn)采用臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所(CLSI,以前為NCCLS)認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)，確定相關(guān)細(xì)菌菌林對環(huán)化的肽的敏感性。使用"厭氧生長細(xì)菌的稀釋抗微生物易感性試驗(yàn)的參考方法，認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)一第七版M7-A7,)測試細(xì)菌的易感性。溶血試驗(yàn)將所研究的肽以所需濃度等分成三份置于Nunc96孔板中，并且以1:1進(jìn)行連續(xù)稀釋(100^1)。將100|il經(jīng)洗滌的(50mlHBSS洗滌3次)聚集的人紅細(xì)胞(RBC)(lxl08RBC/ml)加到測試孔中，并在37°C下孵育3小時(shí)。孵育后，再向所有的孔中加入lOOpl的HBSS,并將孔板在4。C下孵育過夜。移出100jil上清液，并置于新的微量滴定4反中，在450/620nm下用Sunrise孔板讀數(shù)儀(Tascam)讀數(shù)。還包括了單獨(dú)的緩沖液，緩沖液與RBC,以及水與RBC作為對照孔(設(shè)4個(gè)復(fù)孔)。用GraphPad(Prismsoftware)對數(shù)據(jù)繪圖并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果環(huán)化的肽的序列被分析的肽的序列如下肽l:環(huán)狀-K-K-K-K-K-K-K肽2:環(huán)狀-R-R國R畫R-R-R-R肽3:環(huán)狀-K-K-K-K-K-K-K-G肽4:環(huán)狀-R-R-R隱R-R-R-R-G肽5:環(huán)狀畫O-O-O-O-O-O-O-G肽6:壞狀-dR-dR-dR-dR-dR-dR-dR-G肽7:壞狀-dO-dO-dO-dO-dO-dO-dO-G肽8:環(huán)狀-dK-dK隱dK-dK-dK-dK-dK-G前綴"d"表示在肽的合成中使用的氨基酸為D-異構(gòu)體。"O"代表非天然氨基酸鳥氨酸。已經(jīng)合成了包含3、5、9、11、13或15個(gè)精氨酸或賴氨酸的環(huán)狀肽，并且已經(jīng)測定了活性(數(shù)據(jù)未顯示)。環(huán)化的肽的抗細(xì)菌活性將肽1暴露于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)物中，在37。C下再培養(yǎng)16小時(shí)后，針對兩種樣吏生物的MIC均為ImM(表2)。在該濃度下，肽l完全抑制了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長。用肽2重復(fù)該實(shí)驗(yàn)。肽2對大腸桿菌的MIC為O.lmM;肽2對金黃色葡萄球菌的MIC為1.0mM。這表明環(huán)化的肽對細(xì)菌活性具有顯著的作用。而大小與肽1和肽2相對應(yīng)的線性肽分別表現(xiàn)出的活性顯著低于肽1和肽2。環(huán)化的肽對紅色發(fā)癬菌的抗真菌活性對紅色發(fā)癬菌對肽1-8的易感性進(jìn)行測試。肽1表現(xiàn)出的對紅色發(fā)癬菌培養(yǎng)物的MIC為O.lmM(表2)。肽2表現(xiàn)出的對紅色發(fā)癬菌培養(yǎng)物的MIC為0.25mM。而大小與肽1和肽2相對應(yīng)的線性肽分別表現(xiàn)出的活性顯著低于肽1和肽2。肽3-8具有一個(gè)被引入環(huán)狀肽環(huán)的單獨(dú)甘氨酸殘基。因此，相對于肽1和肽2的7個(gè)氨基酸，肽3-8的長度為8個(gè)氨基酸。肽3-6都表現(xiàn)出抗紅色發(fā)癬菌的抗真菌活性(MIC(mM)分別為4.0、2.0、4.0、1.0)。肽7-8即使在最大檢測濃度(4mM)下也沒有顯示出抗紅色發(fā)癬菌的抗真菌活性。肽3-6顯示出抗真菌活性，但是非陽離子氨基酸甘氨酸的引入顯著地減弱了抗真菌活性。例如，這可以從肽2(無甘氨酸；MIC=0.2mM)與肽4(加入甘氨酸；MIC=2.0mM)的活性比較看出來(表2)。該數(shù)據(jù)顯示長度為7個(gè)和8個(gè)氨基酸的環(huán)狀肽均有抗真菌活性，但是肽的陽離子性降低時(shí)，對紅色發(fā)癬菌的抗真菌活性也降低。環(huán)化的肽對趾間發(fā)癬菌的抑制對趾間發(fā)褲菌對肽2-8的易感性進(jìn)行測試。肽2-8抗趾間發(fā)癬菌的抗真菌活性見于表2。肽2、4和6對趾間發(fā)癬菌有活性。環(huán)化的肽對新型隱球菌的抑制使用"酵母的肉湯稀釋抗真菌易感性試驗(yàn)的參考方法，認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)一第二版M27-A)"測試新型隱球菌對肽4和6-8的易感性。表2顯示陽離子環(huán)狀肽4和6-8對病原性酵母新型隱球菌具有抗真菌活性(MIC分別為l.OmM、0.5mM、2.0mM和0.5mM)。肽2對所選的病原微生物的抗微生物活性表3中顯示了肽2對60種所選的病原微生物的抗微生物活性。正如可以看到的，一致地看到了抗真菌，特別是皮膚真菌、短尾帚霉、糠秕馬拉塞霉菌、非白色的念珠菌屬和細(xì)菌大腸桿菌的最強(qiáng)抗微生物活性(即最小的MIC)。在環(huán)化的肽中使用對映異構(gòu)體氨基酸的作用表2顯示了全L和全D環(huán)狀陽離子肽的抑制效果的對比情況。肽4和6是包含氨基酸精氨酸(7個(gè)氨基酸)和甘氨酸(1個(gè)氨基酸)的等量全L和全D環(huán)狀陽離子肽。全D型的抗紅色發(fā)癬菌的抗真菌活性強(qiáng)于全L型(MIC分別為1.0和2.0mM)。全D型抗趾間發(fā)癬菌的抗真菌活性強(qiáng)于全L型(MIC分別為0.25和0.5mM)。全D型抗酵母新型隱球菌的抗真菌活性強(qiáng)于全L型(MIC分別為0.5和l.OmM)。這些表明該肽的全D型的活性強(qiáng)于全L型。肽3和8是包含氨基酸賴氨酸(7個(gè)氨基酸)和甘氨酸(1個(gè)氨基酸)的等量全L和全D環(huán)狀陽離子肽。全L型的抗紅色發(fā)癬菌的抗真菌活性強(qiáng)于全D型(MIC分別為4.0和M.0mM)。兩種肽未表現(xiàn)出抗趾間發(fā)癬菌的抗真菌活性(兩種肽的MIC均大于4.0mM)。環(huán)化的肽的溶血活性在濃度超過顯示抗真菌活性的濃度下，環(huán)狀陽離子肽的溶血活性是可以忽略的(表4)。環(huán)化的肽的肝毒性在濃度接近于顯示抗真菌活性的濃度下，肽2、9和10未顯示出肝毒性。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>表2:環(huán)化的肽對所選病原纟效生物的抗微生物活性(MIC;mM)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表4:所選的肽對紅細(xì)胞的溶血活性<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>權(quán)利要求1.環(huán)狀肽或其變異體，其中包含根據(jù)式I的氨基酸((X)l(Y)m)n(I)其中1和m為0至10的整數(shù)，但l和m不能都為0，n為1至10的整數(shù)，X和Y可以是相同的或不同的，為選自陽離子氨基酸的氨基酸，該環(huán)狀肽或其變異體用作藥物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中所述肽包含2至50個(gè)氨基酸。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肽，其中所述肽包含3至15個(gè)氨基酸。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肽，其中所述肽包含5至13個(gè)氨基酸。5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的肽，其中所述X和/或Y是精氨酸、賴氨酸或鳥氨酸。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的肽，其中所述X和Y是相同的并且為精氨酸或賴氨酸。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的肽，其中所述X和Y是相同的并且為精氨酸。8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的肽，其中所述X和/或Y是D-氨基酸。9.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的肽，其中所述X和/或Y是L-氨基酸。10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的肽，其中所述1和m為介于0和7之間的整數(shù)，并且n為介于1和IO之間的整數(shù)。11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的肽，其中所述肽為R-R-R-R-R-R-R。12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的肽的制備方法，該方法包括通過肽與偶聯(lián)劑的反應(yīng)使式(I)所示的肽環(huán)化，所述偶聯(lián)劑能夠在肽的兩個(gè)末端氨基酸殘基之間形成肽鍵。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述偶聯(lián)劑為HATU-0-(7-偶氮苯并三氮唑-l-基)-N,N,N',N'-四曱基脲六氟磷酸酯。14.通過權(quán)利要求12或13的方法獲得的環(huán)化的肽。15.包含藥學(xué)上有效量的根據(jù)權(quán)利要求l至ll中任一項(xiàng)所述的肽以及藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑的組合物。16.包含根據(jù)式I的氨基酸的環(huán)狀肽或其變異體在制備治療微生物感染的藥物中的用途，((X)!(Y)m)n(I)其中l(wèi)和m為0至10的整數(shù)，但l和m不能都為0，n為1至10的整數(shù)，X和Y可以是相同的或不同的，為選自陽離子氨基酸的氨基酸。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的用途，其中所述感染為真菌感染。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途，其中所述真菌感染是由源自真菌的真菌病原體引起的，所述真菌屬于以下屬念珠菌屬，表皮癬菌屬，外瓶柄霉菌屬，小孢霉屬，發(fā)癬菌屬，癬屬，曲霉菌屬，芽生菌屬，芽生裂殖菌屬，球孢子菌屬，隱球菌屬，組織胞漿菌屬，副球孢子菌屬，孢子絲菌屬,犁頭霉屬，C7c2(io//z/a/(9//zora屬，產(chǎn)色芽生菌屬，瓶霉菌屬,Z"c"zz.a屬,JW/7ragrapto屬,支頂孑包菌屬,馬都拉放線菌屬,卻op/zjAy畫yces屬,單囊霉屬，團(tuán)擔(dān)子菌屬，白僵菌屬，金孢子菌屬，耳霉屬，小克銀漢霉屬，新月菌屬，地霉屬，粘束孢屬，小球腔菌屬，馬拉塞霉菌屬，毛霉菌屬，新龜曱屬，諾卡爾土壤菌屬，擬青霉屬，莖點(diǎn)霉屬，毛孢子菌屬(/^Jra/aspp.),肺孢子蟲屬，偽霉樣真菌屬，核菌屬，根毛霉屬，根霉屬，紅酵母屬，酵母菌屬，足放線病菌屬，帚霉屬，擲孢酵母屬，共頭霉屬，木霉屬，毛孢子菌屬(7Hc/70S"/wra"spp.)，單格孢屬，黑粉菌屬，輪枝孢菌屬，萬吉4立菌屬。19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途，其中所述真菌感染為皮膚真菌感染。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的用途，其中所述皮膚真菌感染為癬感染。21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的用途，其中所述皮膚真菌感染是由發(fā)癬菌屬、表皮褲菌屬或小孢霉屬的皮膚真菌引起的。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的用途，其中所述皮膚真菌為發(fā)癬菌屬。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的用途，其中所述皮膚真菌為趾間發(fā)癬菌。24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的用途，其中所述皮膚真菌為紅色發(fā)癬菌。25.根據(jù)權(quán)利要求17至24中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述真菌感染為曱真菌病。26.包含根據(jù)式I的氨基酸的環(huán)狀肽或其變異體在制備治療創(chuàng)傷的藥物中的用途，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中1和m為0至10的整數(shù)，但1和m不能都為0,n為1至10的整數(shù)，X和Y可以是相同的或不同的，為選自陽離子氨基酸的氨基酸。27.治療或預(yù)防受試者的微生物感染的方法，該方法包括給予所述受試者治療有效量的環(huán)狀肽或其變異體，該環(huán)狀肽或其變異體包含根據(jù)式I的氨基酸<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中l(wèi)和m為0至IO的整數(shù)，但l和m不能都為0，n為1至IO的整數(shù)，X和Y可以是相同的或不同的，為選自陽離子氨基酸的氨基酸。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述微生物感染為真菌感染。29.根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的方法，其中所述治療有效量的肽或肽的變異體是局部給藥的。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述治療有效量的肽或肽的變異體向受試者的皮膚或指(趾)曱局部給藥。全文摘要本發(fā)明涉及環(huán)狀陽離子肽以及它們在治療微生物感染中的用途。文檔編號(hào)C07K7/64GK101389642SQ200680053281公開日2009年3月18日申請日期2006年12月21日優(yōu)先權(quán)日2005年12月22日發(fā)明者D·奧尼爾申請人:諾瓦生命科學(xué)有限公司