專利名稱：環(huán)狀利尿鈉肽構(gòu)建體的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)要求2006年3月30日提交的名為“環(huán)狀利尿鈉肽構(gòu)建體”的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)60/743,960以及2006年3月30日提交的名為“具有輔基的環(huán)狀利尿鈉肽構(gòu)建體”的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)60/743,961的提交內(nèi)容的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，并且所述各篇專利文獻(xiàn)的說(shuō)明書及權(quán)利要求書通過(guò)引用的方式并入本文中。
名為“用于肽構(gòu)建體的氨基酸替代物”的相關(guān)申請(qǐng)?jiān)诖伺c代理人案號(hào)0307-043-PCT的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US07/65632一起同時(shí)提交，并且其說(shuō)明書和權(quán)利要求書通過(guò)引用的方式并入本文中。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域(技術(shù)領(lǐng)域) 本發(fā)明涉及環(huán)狀利尿鈉肽構(gòu)建體，其包含多個(gè)氨基酸殘基、一個(gè)或多個(gè)環(huán)約束性氨基酸替代物和任選一個(gè)或多個(gè)輔基，所述構(gòu)建體結(jié)合利尿鈉肽受體并且可以用于治療目的。

背景技術(shù)：
自1984年鑒定人心房鈉尿肽(ANP)序列和基因結(jié)構(gòu)以來(lái)，已深入研究了利尿鈉肽系統(tǒng)。ANP有時(shí)候也稱作“ANF”或心鈉素。ANP是利尿鈉肽系統(tǒng)的部分，它包括在人類中因翻譯后加工上的差異而產(chǎn)生ANP和尿舒張肽的ANP基因、產(chǎn)生BNP或腦鈉肽的基因以及產(chǎn)生CNP或c-型利尿鈉肽的基因。ANP、尿舒張肽、BNP和CNP分別是環(huán)結(jié)構(gòu)，具有由半胱氨酸-半胱氨酸二硫鍵形成的一個(gè)17氨基酸環(huán)。人ANP(hANP)的氨基酸序列及結(jié)構(gòu)在圖1中顯示。ANP、尿舒張肽、BNP和CNP是密切相關(guān)的，因所述環(huán)中某5個(gè)或6個(gè)氨基酸不同，盡管氨基端尾和羧基端尾基本上是不同的。
ANP、BNP和CNP分別針對(duì)不同的受體利尿鈉肽受體A、B和C(NPRA、NPRB和NPRC)具有特異性。NPRA和NPRB與鳥苷酸環(huán)化酶連接，而NPRC是G蛋白偶聯(lián)的清除受體。ANP、BNP和CNP是迄今鑒定的主要內(nèi)源性哺乳動(dòng)物利尿鈉肽。然而，存在已經(jīng)鑒定并可以在哺乳動(dòng)物中具有治療性用途的眾多非哺乳動(dòng)物利尿鈉肽。這些非哺乳動(dòng)物利尿鈉肽包括鮭利尿鈉肽或心臟肽(sCP)、心室利尿鈉肽(VNP)(在鰻魚和多種魚中鑒定到的一種心利尿鈉肽)、樹眼鏡蛇利尿鈉肽(DNP)(在樹眼鏡蛇蛇毒中鑒定到的一種利尿鈉肽)和三種從太攀蛇蛇毒中分離的利尿鈉樣肽(TNP-a、TNP-b和TNP-c)。通常參見Tervonen V，Ruskoaho H，Lecklin T，Ilves M，Vuolteenaho O.Salmon cardiac natriuretic peptide is a volume-regulating hormone.Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.283E353-61(2002)；Takei Y，F(xiàn)ukuzawa A，ltaharaY，Watanabe TX，Yoshizawa Kumagaye K，Nakajima K，Yasuda A，Smith MP，Duff DW，Olson KR.A new natriuretic peptide isolated from cardiac atria oftrout，Oncorhynchus mykiss.FEBS Lett.414377-80(1997)；Schweitz H，VigneP，Moinier D，F(xiàn)relin C，Lazdunski M.A new member of the natriuretic peptidefamily is present in the venom of the green mamba(Dendroaspis angusticeps).J.Biol.Chem.26713928-32(1992)；Lisy O，Jougasaki M，Heublein DM，SchirgerJA，Chen HH，Wennberg PW，Burnett JC.Renal actions of syntheticdendroaspis natriuretic peptide.Kidney Int.56502-8(1999)和Fry BG，Wickramaratana JC，Lemme S，Beuve A，Garbers D，Hodgson WC，Alewood P.Novel natriuretic peptides from the venom of the inland(Oxyuranusmicrolepidotus)isolation，chemical和biological characterization.Biochem.Biophys.Res.Comm.3271011-1015(2005)。
ANP主要在應(yīng)答于增加的心房壓時(shí)內(nèi)源性地分泌，但是其它因素(包括細(xì)胞因子受體刺激)可以促進(jìn)內(nèi)源性分泌。一旦釋放，則ANP是血壓、鈉和流體穩(wěn)態(tài)的激素性調(diào)節(jié)物，提供血管舒張效應(yīng)，影響心血管重塑等。因此，ANP(包括內(nèi)源性ANP)有效用于充血性心力衰竭和其它心血管病中，其部分原因在于提供針對(duì)慢性活化的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的防御。循環(huán)性ANP通過(guò)兩種機(jī)制，即與利尿鈉肽受體結(jié)合和酶降解，而從循環(huán)中迅速地除去。
人ANP也稱作野生型人ANP、hANP、ANP(1-28)和ANP(99-126)(后者指前ANP(1-126)中的相關(guān)序列，其中所述的前ANP通常在分泌期間在羧基端區(qū)域內(nèi)在Arg98-Ser99處被切割)。下文中，人ANP有時(shí)候稱作“hANP”。
通常，認(rèn)為利尿鈉肽及其變體用于治療充血性心力衰竭、腎性高血壓、急性腎衰竭及相關(guān)狀況以及對(duì)其而言利尿反應(yīng)、促鈉尿排泄反應(yīng)和/或血管擴(kuò)張反應(yīng)將具有治療或預(yù)防效果的任何狀況、疾病或綜合征中。一篇描述利尿鈉肽(包括ANP)及利尿鈉肽系統(tǒng)在心力衰竭中用途的綜述是SchmittM.，Cockcroft J.R.和Frenneaux M.P.Modulation of the natriuretic peptidesystem in heart failurefrom bench to bedside？Clinical Science105141-160(2003)。
已經(jīng)產(chǎn)生為數(shù)眾多的ANP模擬物和變體，其中的一些模擬物和變體在尺寸上比ANP大幅度縮小。一種尺寸上縮小但仍有生物學(xué)活性的ANP形式是如Li B，Tom JY，Oare D，Yen R，F(xiàn)airbrother WJ，Wells JA，CunninghamBC.Minimization of a polypeptide hormone。Science 2701657-60(1995)中所述的15聚二硫化環(huán)狀肽H-Met-環(huán)(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2(SEQ ID NO1)。這種15聚肽常稱作“mini-ANP”。
眾多專利和專利申請(qǐng)?zhí)峤涣死蜮c肽的不同合成性模擬物，聲稱基于一種或多種因素而優(yōu)于野生型利尿鈉肽。這些模擬物包括在下列美國(guó)專利4,496,544；4,609,725；4,656,158；4,673,732；4,716,147；4,757,048；4,764,504；4,804,650；4,816,443；4,824,937；4,861,755；4,904,763；4,935,492；4,952,561；5,047,397；5,057,495；5,057,603；5,091,366；5,095,004；5,106,834；5,114,923；5,159,061；5,204,328；5,212,286；5,352,587；5,376,635；5,418,219；5,665,704；5,846,932；5,583,108；5,965,533；6,028,055；6,083,982；6,124,430；6,150,402；6,407,211；6,525,022；6,586,396和6,818,619中和在下列美國(guó)專利申請(qǐng)公開2004/0002458；2004/0063630；2004/0077537；2005/0113286；2005/0176641；2006/0030004中公開的構(gòu)建體。此外，多個(gè)非美國(guó)專利和專利申請(qǐng)公開了構(gòu)建體，它們包括WO 85/04870；WO 85/04872；WO 88/03537；WO88/06596；WO 89/10935；WO 89/05654；WO 90/01940；WO 90/14362；WO 92/06998；WO 95/13296；WO 99/08510；WO 99/12576；WO 01/016295；WO 2004/047871；WO 2005/072055；EPO 0 291 999；EPO 0 323 740；EPO0 341 603；EPO 0 350 318；EPO 0 356 124；EPO 0 385 476；EPO 0 497 368；和EPO 0 542 863。如在公開樹眼鏡蛇屬(dendroaspis)嵌合肽的美國(guó)專利5,583,108或在美國(guó)專利6,407,211和6,818,619中描述了嵌合型利尿鈉肽，如稱作“血管利尿鈉肽”并描述為ANP與CNP的嵌合體的肽。每篇前述專利和專利申請(qǐng)的教導(dǎo)如完整描述那樣通過(guò)引用的方式并入。
有一種利尿鈉肽產(chǎn)品由美國(guó)食品藥品管理局(Food and DrugAdministration)批準(zhǔn)以類屬名稱nestiritide和商品名Natrecor

(Scios Inc.)出售。這是使用重組DNA技術(shù)從大腸桿菌中制造的人B-型利尿鈉肽。該產(chǎn)品經(jīng)批準(zhǔn)僅用于靜脈內(nèi)輸注以治療在休息和最小活動(dòng)情況下發(fā)生呼吸困難的急性代償失調(diào)性充血性心力衰竭患者。盡管有效，然而nestiritide的藥物代謝動(dòng)力學(xué)和半壽期為如此情況，以至于該產(chǎn)品僅可以通過(guò)靜脈內(nèi)輸注而使用，這使該藥物的使用限于醫(yī)院或有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)療中心環(huán)境。
盡管已經(jīng)開發(fā)的化合物為數(shù)眾多，然而幾乎沒有一種得到商業(yè)化或處于積極臨床開發(fā)階段。對(duì)如此產(chǎn)物存在巨大需求，其具有改善特征，包括改善的效力、半壽期、施用模式、生物利用度和延長(zhǎng)的作用持續(xù)時(shí)間，該產(chǎn)物有效用于一種或多種治療適應(yīng)癥并且優(yōu)選地可以基于門診患者而施用。
發(fā)明簡(jiǎn)述 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種環(huán)狀構(gòu)建體，其與利尿鈉肽的受體結(jié)合，所述受體包括但不限于針對(duì)ANP、BNP、CNP、sCP、DNP、TNP-a、TNP-b或TNP-c的受體，其中所述構(gòu)建體包括多個(gè)氨基酸殘基、至少一個(gè)通式I的氨基酸替代物
其中R和R′各自獨(dú)立地是H或天然或非天然的氨基酸側(cè)鏈部分或氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物；x是1或2；Y是CH2或C＝O；W是CH2、NH或NR″′；Z是H或CH3；n是0、1或2；J是-C(＝O)-，除非該替代物位于構(gòu)建體的羧基端位置，否則在此情況下J是-H、-OH、-C(＝O)-OH、-C(＝O)-NH2或羧基端封端基團(tuán)；Q是一個(gè)鍵，除非替代物位于構(gòu)建體的氨基端位置處，否則在此情況下Q是-H或胺封端基團(tuán)；R″′是?；1-C17直鏈或支鏈的烷基鏈、C2-C19直鏈或支鏈的烷基酰基鏈、C1-C17直鏈或支鏈的Ω氨基脂族酰基或C1-C17直鏈或支鏈的Ω氨基脂族?；蝗芜x地包括至少一個(gè)輔基，其與至少一個(gè)氨基酸殘基的側(cè)鏈內(nèi)的反應(yīng)基共價(jià)連接、當(dāng)替代物位于構(gòu)建體的氨基端位置處時(shí)與胺封端基團(tuán)共價(jià)連接、或者當(dāng)替代物位于構(gòu)建體的羧基端位置處時(shí)與羧基端封端基團(tuán)共價(jià)連接；并且用星號(hào)標(biāo)記的碳原子可以具有任何立體化學(xué)構(gòu)型。該構(gòu)建體是環(huán)狀構(gòu)建體，通過(guò)兩個(gè)氨基酸殘基的側(cè)鏈之間、氨基酸殘基側(cè)鏈與氨基酸替代物的R或R′基團(tuán)之間、兩個(gè)氨基酸替代物的R或R′基團(tuán)之間、構(gòu)建體的端基與氨基酸殘基側(cè)鏈之間或構(gòu)建體的端基與氨基酸替代物的R或R’基團(tuán)之間的鍵而環(huán)化。優(yōu)選地，在其側(cè)鏈之間形成鍵的兩個(gè)氨基酸殘基由約8個(gè)-10個(gè)氨基酸殘基并且任選地由零個(gè)、一個(gè)或兩個(gè)氨基酸替代物分隔。多個(gè)氨基酸殘基可以包括選自天然或非天然的α-氨基酸、β-氨基酸、α，α-雙取代氨基酸和N-取代氨基酸中的任何氨基酸殘基，包括任何前述基團(tuán)的全部(R)或(S)構(gòu)型。
輔基可以包括包含重復(fù)單元的聚合物基團(tuán)，其中所述的重復(fù)單元包括一個(gè)或多個(gè)碳原子和氫原子和任選地其它原子，包括氧。此類聚合物基團(tuán)優(yōu)選地是水溶性聚合物，并且優(yōu)選地是聚醚、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚噁唑啉或聚(丙烯酰嗎啉)。優(yōu)選的聚醚是聚乙二醇(PEG)，任選地以連接基團(tuán)衍生化。
在一個(gè)方面，J是選自下列基團(tuán)的羧基端封端基團(tuán) -(CH2)m-OH、 -C(＝O)-(CH2)m-N(v1)(v2)、 -C(＝O)-O-(CH2)m-CH3、 -O-(CH2)m-CH3、 -O-(CH2)m-N(v1)(v2)、 -O-(CH2)m-OH、 -C(＝O)-NH-(CH2)m-S(v1)、 -C(＝O)-NH-(CH2)m-CH3、 -C(＝O)-NH-(CH2)m-N(v1)(v2)、 -C(＝O)-NH-((CH2)m-N(v1)(v2))2、 -C(＝O)-NH-CH(-C(＝O)-OH)-(CH2)m-N(v1)(v2)、 C(＝O)-NH-(CH2)m-NH-C(＝O)-CH(N(v1)(v2))((CH2)m-N(v1)(v2))或 -C(＝O)-NH-CH((-C(＝O)-N(v1)(v2))-(CH2)m-N(v1)(v2)，包括所有前述基團(tuán)的(R)或(S)構(gòu)型，其中v1和v2各自獨(dú)立地是H或C1-C17直鏈或支鏈的烷基鏈并且m在每種情況下獨(dú)立地是0-17。
在其中氨基酸替代物位于構(gòu)建體的羧基端位置處的另一個(gè)方面，J是由Ω氨基脂族基、末端芳基或芳烷基或任何的單個(gè)天然或非天然α-氨基酸、β-氨基酸、α，α-雙取代氨基酸或N-取代氨基酸構(gòu)成的羧基端封端基團(tuán)，其包括其中取代基不同的α，α-雙取代氨基酸的全部(R)或(S)構(gòu)型，任選地與如上所定義的羧基端封端基團(tuán)組合。
在另一方面，Q是選自下列的胺封端基團(tuán) -(CH2)m-N(v3)(v4)、 -(CH2)m-CH3、 -(CH2)m-O(v3)、 -(CH2)m-C(＝O)-(v3)、 -(CH2)m-C(＝O)-O-(v3)、 -(CH2)m-S(v3)、 -C(＝O)-(CH2)m-CH3、 -C(＝O)-(CH2)m-N(v3)(v4)、 -C(＝O)-(CH2)m-C(＝O)-(v3)、 -C(＝O)-(CH2)m-O(v3)或 -C(＝O)-(CH2)m-S(v3)； 其中v3和v4各自獨(dú)立地是H、C1-C17直鏈或支鏈的烷基鏈或C2-C19直鏈或支鏈的烷基?；?，前提是若v3或v4之一是烷基?；?，則v3或v4的另一個(gè)是H，并且m是0-17。
在相關(guān)的方面，式I的氨基酸替代物位于構(gòu)建體的羧基端位置處，并且R和R′中的至少一個(gè)是天然或非天然氨基酸的側(cè)鏈部分、或帶有包含至少一個(gè)氮原子的雜原子基團(tuán)的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物，并且R和R′中的另一個(gè)是H或者天然或非天然氨基酸的側(cè)鏈部分或氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物。
在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種構(gòu)建體，其與利尿鈉肽的受體結(jié)合，所述受體包括但不限于針對(duì)ANP、BNP、CNP、sCP、DNP、TNP-a、TNP-b或TNP-c的受體，其中所述構(gòu)建體包括多個(gè)氨基酸殘基、位于除羧基端位置或氨基端位置之外的任何位置并通過(guò)兩個(gè)肽鍵而共價(jià)連接的至少一種氨基酸替代物，并且所述氨基酸替代物具有式II
其中R和R′各自獨(dú)立地是H、或者天然或非天然氨基酸側(cè)鏈部分、或者氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物；x是1或2；Y是CH2或C＝O；W是CH2、NH或NR″′；Z是H或CH3；R″′是?；?、C1-C17直鏈或支鏈的烷基鏈、C2-C19直鏈或支鏈的烷基?；湣1-C17直鏈或支鏈的Ω氨基脂族基團(tuán)或者C1-C17直鏈或支鏈的Ω氨基脂族?；?；n是0、1或2；用星號(hào)標(biāo)記的碳原子可以具有任何的立體化學(xué)構(gòu)型；并且虛線表示形成肽鍵的鍵。
其中式I的替代物位于構(gòu)建體的羧基端處時(shí)，該替代物通過(guò)單一肽鍵與該構(gòu)建體的羧基端共價(jià)地連接，從而該替代物具有下式
其中虛線表示形成肽鍵的鍵。其中替代物位于構(gòu)建體的氨基端處時(shí)，替代物優(yōu)選地具有式I，并且通過(guò)單一肽鍵而與該構(gòu)建體的氨基端共價(jià)連接，從而該替代物具有下式
其中虛線表示形成肽鍵的鍵。然而，其中替代物處于除構(gòu)建體的氨基端或羧基端之外的其它位置時(shí)，替代物優(yōu)選地具有式II并且通過(guò)兩個(gè)肽鍵而與該構(gòu)建體共價(jià)地連接。
在本發(fā)明的不同實(shí)施方案中，可以在本發(fā)明的構(gòu)建體中使用一個(gè)氨基酸替代物，可以在本發(fā)明的構(gòu)建體中使用兩個(gè)氨基酸替代物或可以在本發(fā)明的構(gòu)建體中使用多于兩個(gè)氨基酸替代物。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供其中以非肽鍵取代氨基酸殘基間一個(gè)或多個(gè)肽鍵的構(gòu)建體。
本發(fā)明的主要目的是提供利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基由環(huán)約束性氨基酸替代物取代的利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體，其中該構(gòu)建體在施用至哺乳動(dòng)物時(shí)表現(xiàn)出相對(duì)于不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)優(yōu)勢(shì)，其中所述的優(yōu)勢(shì)選自增加的抗酶降解性、增加的循環(huán)半壽期、增加的生物利用度、增加的效力、延長(zhǎng)的作用持續(xù)時(shí)間及其前述的組合。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體，其中構(gòu)建體具有如相同濃度的不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列的至少10％最大cGMP刺激活性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體，其中構(gòu)建體具有如相同濃度的不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列的至少50％最大cGMP刺激活性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體，其中構(gòu)建體具有如相同濃度的不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列的至少100％最大cGMP刺激活性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體，其中構(gòu)建體具有如相同濃度的不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列的大于100％的最大cGMP刺激活性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體，其中構(gòu)建體具有由Ki(nM)值確定的平衡受體結(jié)合親和力，其比不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列的Ki(nM)值高出不大于兩個(gè)對(duì)數(shù)數(shù)量級(jí)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體，其中構(gòu)建體具有由Ki(nM)值確定的平衡受體結(jié)合親和力，其比不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列的Ki(nM)值高出不大于3倍。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體，其中構(gòu)建體具有由Ki(nM)值確定的平衡受體結(jié)合親和力，其與不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列的Ki(nM)值相等或較之更小。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體，其中構(gòu)建體具有由Ki(nM)值確定的平衡受體結(jié)合親和力，其小于不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列的Ki(nM)值。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體，其中構(gòu)建體具有針對(duì)利尿鈉肽受體的受體結(jié)合親和力，其大于不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列的受體結(jié)合親和力。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體，其中構(gòu)建體具有由隨時(shí)間的血壓降低或尿排出量增加所確定的生物學(xué)效力，該構(gòu)建體至少如同等劑量的不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列那樣有效或較之更有效。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體，其中構(gòu)建體具有由隨時(shí)間的血壓降低或尿排出量增加所確定的生物學(xué)效力，該構(gòu)建體比同等劑量的不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列更有效。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體，其中不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列與利尿鈉肽的序列具有至少約60％的同源性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體，其中不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列與利尿鈉肽的序列具有至少約80％的同源性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體，其中不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列與肽的序列具有至少約60％的同源性，其中所述的肽與ANP、BNP、CNP、sCP、DNP、TNP-a、TNP-b或TNP-c的受體結(jié)合。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體，其中不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列與肽的序列具有至少約80％的同源性，其中所述的肽與ANP、BNP、CNP、sCP、DNP、TNP-a、TNP-b或TNP-c的受體結(jié)合。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體，其中不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列與序列H-Met-環(huán)(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2(SEQ IDNO1)具有至少約60％的同源性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體，其中不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列與序列H-Met-環(huán)(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2(SEQ IDNO1)具有至少約80％的同源性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體，其中不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列與序列H-Met-環(huán)(Xaa-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Xaa)-Tyr-Arg-NH2(SEQ IDNO2)具有至少約60％的同源性，其中Xaa各自獨(dú)立地是共同形成環(huán)狀肽的任何氨基酸殘基。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體，其中不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列與序列H-Met-環(huán)(Xaa-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Xaa)-Tyr-Arg-NH2(SEQ IDNO2)具有至少約80％的同源性，其中Xaa各自獨(dú)立地是共同形成環(huán)狀肽的任何氨基酸殘基。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包括如本文中所定義替代物的利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體，其中不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列是與ANP的受體結(jié)合的肽。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包括如本文中所定義替代物的利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體，其中不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列是與BNP的受體結(jié)合的肽。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供比ANP或BNP的天然形式或重組形式具有更大生物利用度和半壽期的利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供可以施用至充血性心力衰竭患者的利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供可以通過(guò)除靜脈內(nèi)施用之外的至少一種施用途徑而施用的利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供可以通過(guò)皮下注射或肌內(nèi)注射施用至患者的利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供具有增加的抗降解性不過(guò)對(duì)其受體具有顯著高的結(jié)合親和力的利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供在持續(xù)釋放制劑中的利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體。
本發(fā)明的其它目的、優(yōu)勢(shì)和新特性和可用性的其它范圍將部分地在以下詳細(xì)敘述中結(jié)合附圖進(jìn)行描述，并且部分地在檢驗(yàn)下文時(shí)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言變得顯而易見，或可以通過(guò)實(shí)施本發(fā)明而習(xí)得。本發(fā)明的目的和優(yōu)勢(shì)可以通過(guò)所附權(quán)利要求書中具體指出的手段和組合而實(shí)現(xiàn)和達(dá)到。
附圖若干方面的簡(jiǎn)述 以下


了本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，連同說(shuō)明書一起，起到解釋本發(fā)明原理的作用。附圖僅用于說(shuō)明了本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案并且不視為限制本發(fā)明。在圖中； 圖1是野生型內(nèi)源性人ANP(hANP)的序列； 圖2是構(gòu)建體1-18以5mg/kg通過(guò)皮下方式或以2mg/kg通過(guò)靜脈內(nèi)方式施用時(shí)在大鼠內(nèi)隨時(shí)間的濃度曲線圖； 圖3是一組4只大鼠在通過(guò)靜脈內(nèi)途徑施用構(gòu)建體1-18和1-63時(shí)經(jīng)三十分鐘的總尿排出量曲線圖；和 圖4是一組4只大鼠在通過(guò)皮下途徑以不同劑量施用構(gòu)建體1-18時(shí)經(jīng)四十五分鐘的總尿排出量曲線圖。
發(fā)明詳述 本發(fā)明提供由多個(gè)氨基酸殘基、至少一種環(huán)約束性氨基酸替代物和任選至少一種輔基組成的利尿鈉肽受體特異性構(gòu)建體。本發(fā)明中所用的環(huán)約束性氨基酸替代物優(yōu)選地是這樣的，以至于它們可以用常規(guī)的氨基受保護(hù)的氨基端(使用保護(hù)基團(tuán)(如Fmoc))和活性羧基的羧基端產(chǎn)生，并且可以因此用于常規(guī)的肽合成方法學(xué)中，理解的是若氨基酸替代物位于構(gòu)建體的羧基端位置處，則除羧基端之外的位置可以在此種替代物中上使用。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供合成產(chǎn)生的構(gòu)建體，其使用根據(jù)需要加以改進(jìn)的肽合成方法學(xué)合成，并且包含多個(gè)氨基酸殘基和至少一個(gè)環(huán)約束性氨基酸替代物。在相關(guān)的優(yōu)選實(shí)施方案中，該構(gòu)建體還包括至少一個(gè)輔基。
優(yōu)選的輔基包括包含重復(fù)單元的聚合物基團(tuán)，其中所述的重復(fù)單元包括一個(gè)或多個(gè)碳原子和氫原子，以及任選地其它原子，包括氧。此類聚合物基團(tuán)優(yōu)選地是水溶性聚合物，并且優(yōu)選地是聚醚、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚噁唑啉或聚(丙烯酰嗎啉)。優(yōu)選的聚醚是聚乙二醇(PEG)，任選地以連接基團(tuán)衍生化。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供這樣的構(gòu)建體，其具有作為已知利尿鈉肽如ANP或BNP的同系物或作為利尿鈉肽的任何已知肽變體的同系物的氨基酸序列，其中該構(gòu)建體包括式I或II的至少一個(gè)氨基酸替代物。不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列可以與已知利尿鈉肽或已知肽變體相同或可以與之同源，如至少60％同源或更優(yōu)選地至少約80％同源的對(duì)應(yīng)氨基酸序列。如本文中所用，短語(yǔ)“不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列”意指這樣的氨基酸序列，其包括與利尿鈉肽的受體結(jié)合并且不包括替代物的已知氨基酸序列。若氨基酸序列除一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代物的置換或添加之外是相同的，則這種已知氨基酸序列與所述構(gòu)建體相同。類似地，除一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代物的置換或添加之外，參考這種已知的氨基酸序列與該構(gòu)建體的同一性而確定同源性。
在另一方面，本發(fā)明提供基于已知肽而建模的構(gòu)建體，其中所述的已知肽與利尿鈉肽受體結(jié)合，但包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代物，此類替代物取代了已知肽中含有的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，或添加至包含已知肽的序列。已知肽可以是本領(lǐng)域已知的任何利尿鈉肽，包括但不限于在本文中援引的任何出版物、專利、申請(qǐng)或參考文獻(xiàn)中公開的那些利尿鈉肽，包括但不限于在美國(guó)專利4,496,544；4,609,725；4,656,158；4,673,732；4,716,147；4,757,048；4,764,504；4,804,650；4,816,443；4,824,937；4,861,755；4,904,763；4,935,492；4,952,561；5,047,397；5,057,495；5,057,603；5,091,366；5,095,004；5,106,834；5,114,923；5,159,061；5,204,328；5,212,286；5,352,587；5,376,635；5,418,219；5,665,704；5,846,932；5,583,108；5,965,533；6,028,055；6,083,982；6,124,430；6,150,402；6,407,211；6,525,022；6,586,396或6,818,619；在美國(guó)專利申請(qǐng)公開2004/0002458；2004/0063630；2004/0077537；2005/0113286；2005/0176641；或2006/0030004；或在多種非美國(guó)專利和專利申請(qǐng)，包括WO 85/04870；WO 85/04872；WO 88/03537；WO 88/06596；WO 89/10935；WO 89/05654；WO 90/01940；WO 90/14362；WO 92/06998；WO 95/13296；WO 99/08510；WO 99/12576；WO 01/016295；WO 2004/047871；WO2005/072055；EPO 0 291 999；EPO 0 323 740；EPO 0 341 603；EPO 0 350318；EPO 0 356 124；EPO 0 385 476；EPO 0 497 368；或EPO 0 542 863中公開的利尿鈉肽。在一個(gè)方面，已知肽是在美國(guó)專利4,656,158、4,824,937、4,935,492、5,159,061、5,204,328、5,376,635、5,665,704、5,846,932、6,028,055、6,407,211、6,525,022、6,586,396或6,818,619，美國(guó)專利申請(qǐng)公開2004/0002458、2004/0063630或2005/0176641或國(guó)際專利申請(qǐng)公開WO2004/047871或WO 2005/072055中公開的肽或其同系物。每篇前述專利和專利申請(qǐng)的教導(dǎo)通過(guò)引用的方式而如同完整所述那樣并入。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供構(gòu)建體，包含與利尿鈉肽受體結(jié)合的氨基酸序列，其中與利尿鈉肽受體結(jié)合的這種氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基用式I的氨基酸替代物置換。在一個(gè)方面，與利尿鈉肽受體結(jié)合的氨基酸序列在置換之前是H-Met-環(huán)(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2(SEQ IDNO1)。
在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供與利尿鈉肽受體(包括ANP或BNP的受體)結(jié)合并且包括至少一個(gè)式I或II的氨基酸替代物的構(gòu)建體，但是該構(gòu)建體同結(jié)合利尿鈉肽受體的任何已知肽不同源。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供式III的環(huán)狀構(gòu)建體
其中 Aaa1是α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體或從α-氨基酸衍生的α，α-雙取代氨基酸，包括其中Aaa1是包括Nle、Ala、Leu、Ile、Val、Arg、Phe、Lys、Tyr、Asp、Nva、Met、Met(O)或Met(O2)的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體或是從Nle、Ala、Leu、Ile、Val、Arg、Phe、Lys、Tyr、Asp、Nva、Met、Met(O)或Met(O2)衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體，或是從Nle、Ala、Leu、Ile、Val、Arg、Phe、Lys、Tyr、Asp、Nva、Met、Met(O)或Met(O2)衍生的α，α-雙取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-雙取代氨基酸的全部(R)或(S)構(gòu)型，或Aaa1是包含C2-C18直鏈烷基、C3-C17支鏈烷基、C2-C18直鏈鏈烯基或炔基或C3-C18支鏈鏈烯基或炔基的酰基，或Aaa1是結(jié)構(gòu)如下的氨基酸替代物
其中虛線表示肽鍵；R和R′獨(dú)立地是H、直鏈或支鏈的C1-C6脂族鏈、-(CH2)y-S-CH3、-(CH2)y-S(＝O)-CH3、-(CH2)y-S(O2)-CH3、鍵和環(huán)丙烷、環(huán)丁烷、環(huán)戊烷或環(huán)己烷環(huán)，或C1-C3脂族鏈和環(huán)丙烷、環(huán)丁烷、環(huán)戊烷或環(huán)己烷環(huán)；x是1或2；Y是CH2或C＝O；W是CH2、NH或NR″′；Z是H或CH3；Q是-H、-(CH2)m-N(v3)(v4)、-(CH2)m-CH3、-(CH2)m-O(v3)、-(CH2)m-C(＝O)-(v3)、-(CH2)m-C(＝O)-O-(v3)、-(CH2)m-S(v3)、-C(＝O)-(CH2)m-CH3、-C(＝O)-(CH2)m-N(v3)(v4)、-C(＝O)-(CH2)m-C(＝O)-(v3)、-C(＝O)-(CH2)m-O(v3)或-C(＝O)-(CH2)m-S(v3)；R″′是?；?、C1-C17直鏈或支鏈的烷基鏈、C2-C-19直鏈或支鏈的烷基?；?、C1-C17直鏈或支鏈的Ω氨基脂族基團(tuán)或C1-C17直鏈或支鏈的Ω氨基脂族酰基；n是0、1或2；m是0-17；y是1-5；v3和v4各自獨(dú)立地是H、C1-C17直鏈或支鏈的烷基鏈或C2-C19直鏈或支鏈的烷基?；?，前提是若v3或v4之一是烷基酰基鏈，則另一個(gè)v3或v4是H；并且用星號(hào)標(biāo)記的碳原子可以具有任何立體化學(xué)構(gòu)型； Aaa2和Aaa13是相同或不同的，并且分別是經(jīng)過(guò)Aaa2和Aaa13的各自側(cè)鏈而形成環(huán)橋的L-或D-異構(gòu)體氨基酸殘基，其中該環(huán)橋的連接基團(tuán)是-S-S-、-S-CH2-S-、-S-CH2-、-CH2-S-、-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-、-CH2-NH-、-NH-CH2-、-CH2-S(O)n-其中n是1或2、-S(O)n-CH2-其中n是1或2、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(E或Z)、-C≡C-、-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-、-C(＝O)-CH2-、-CH2-C(＝O)-、-O-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-O-或-NH-C(＝O)-NH-； Aaa3是包括His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Dap或Dab的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體或是從His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Dap或Dab衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體，或是從His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Dap或Dab衍生的α，α-雙取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-雙取代氨基酸的全部(R)或(S)構(gòu)型，或Aaa3是結(jié)構(gòu)如下的氨基酸替代物
其中R和R′獨(dú)立地是H或者His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Dap或Dab的氨基酸側(cè)鏈部分或者His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Dap或Dab的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物；x是1或2；Y是CH2或C＝O；W是CH2、NH或NR″′；Z是H或CH3；R″′是?；?、C1-C17直鏈或支鏈的烷基鏈、C2-C19直鏈或支鏈的烷基?；?、C1-C17直鏈或支鏈的Ω氨基脂族基團(tuán)或C1-C17直鏈或支鏈的Ω氨基脂族?；?；并且n是0、1或2； Aaa4是包括取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Nle、Nva或Tle的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體或是從取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Nle、Nva或Tle衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體，或從取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Nle、Nva或Tle衍生的α，α-雙取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-雙取代氨基酸的全部(R)或(S)構(gòu)型，或Aaa4是如對(duì)Aaa3所述的氨基酸替代物，其中R和R′獨(dú)立地是H或者取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Nle、Nva或Tle的氨基酸側(cè)鏈部分，或者取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Nle、Nva或Tle的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物； Aaa5是Gly、Sar、包括Ala的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體或是從Ala衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體，或Aib(其是從Ala衍生的α，α-雙取代氨基酸)，或Aaa5是如對(duì)Aaa3所述的氨基酸替代物，其中R和R′獨(dú)立地是H或-CH3； Aaa6是Gly、Sar、包括從Ala的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體或是從Ala衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體，或Aib，或Aaa6是如對(duì)Aaa3所述的氨基酸替代物，其中R和R′獨(dú)立地是H或-CH3； Aaa7是包括Arg、His、Ala、Ser、HSer、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Cit、Abu、Dap或Dab的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體或從Arg、His、Ala、Ser、HSer、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Cit、Abu、Dap或Dab衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體或從Arg、His、Ala、Ser、HSer、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Cit、Abu、Dap或Dab衍生的α，α-雙取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-雙取代氨基酸的全部(R)或(S)構(gòu)型，或Aaa7是如對(duì)Aaa3所述的氨基酸替代物，其中R和R′獨(dú)立地是H或者Arg、His、Ala、Ser、HSer、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Abu、Dap或Dab的氨基酸側(cè)鏈部分或者Arg、His、Ala、Ser、HSer、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Abu、Dap或Dab的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物； Aaa8是Gly、包括Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Met(O)、Met(O2)或Tle的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體或從Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Met(O)、Met(O2)或Tle衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體，或是從Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Met(O)、Met(O2)或Tle衍生的α，α-雙取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-雙取代氨基酸的全部(R)或(S)構(gòu)型，或Aaa8是如對(duì)Aaa3所述的氨基酸替代物，其中R和R′獨(dú)立地是H或Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Met(O)、Met(O2)或Tle的氨基酸側(cè)鏈部分或者Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Met(O)、Met(O2)或Tle的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物； Aaa9是包括Asp、Glu、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Met(O2)、Orn、Dap或Dab的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體或從Asp、Glu、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Met(O2)、Orn、Dap或Dab衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體，或是從Asp、Glu、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Met(O2)、Orn、Dap或Dab衍生的α，α-雙取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-雙取代氨基酸的全部(R)或(S)構(gòu)型，或Aaa9是如對(duì)Aaa3所述的氨基酸替代物，其中R和R′獨(dú)立地是H或Asp、Glu、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Met(O2)、Orn、Dap或Dab的氨基酸側(cè)鏈部分或者Asp、Glu、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Met(O2)、Orn、Dap或Dab的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物； Aaa10是包括Arg、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Cit、Met(O)、Orn、Dap或Dab的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體或從Arg、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Cit、Met(O)、Orn、Dap或Dab衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體，或是從Arg、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Cit、Met(O)、Orn、Dap或Dab衍生的α，α-雙取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-雙取代氨基酸的全部(R)或(S)構(gòu)型，或Aaa10是如對(duì)Aaa3所述的氨基酸替代物，其中R和R′獨(dú)立地是H或者Arg、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Orn、Dap或Dab的氨基酸側(cè)鏈部分或者Arg、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Orn、Dap或Dab的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物； Aaa11是Gly或包括Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Cys、HCys、Abu或Tle的α-氨基酸或β-氨基酸的D-或L-異構(gòu)體或從Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Cys、HCys、Abu或Tle衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的D-或L-異構(gòu)體，或是從Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Cys、HCys、Abu或Tle衍生的α，α-雙取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-雙取代氨基酸的全部(R)或(S)構(gòu)型，或Aaa11是如對(duì)Aaa3所述的氨基酸替代物，其中R和R′獨(dú)立地是H或Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Cys、HCys、Abu或Tle的氨基酸側(cè)鏈部分或者Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Cys、HCys、Abu或Tle的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物； Aaa12是Gly、包括Ser、Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Arg、Lys、Orn、Cys、HCys、Abu或Tle的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體或從Ser、Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Arg、Lys、Orn、Cys、HCys、Abu或Tle衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體，或是從Ser、Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Arg、Lys、Orn、Cys、HCys、Abu或Tle衍生的α，α-雙取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-雙取代氨基酸的全部(R)或(S)構(gòu)型，或Aaa12是如對(duì)Aaa3所述的氨基酸替代物，其中R和R′獨(dú)立地是H或Ser、Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Arg、Lys、Orn、Cys、HCys、Abu或Tle的氨基酸側(cè)鏈部分或Ser、Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Arg、Lys、Orn、Cys、HCys、Abu或Tle的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物； Aaa14是包括取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Lys、Orn、Nle、Nva或Tle的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體或從取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Lys、Orn、Nle、Nva或Tle衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體，或是從取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Lys、Orn、Nle、Nva或Tle衍生的α，α-雙取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-雙取代氨基酸的全部(R)或(S)構(gòu)型，或Aaa14是如對(duì)Aaa3所述的具有式II結(jié)構(gòu)的氨基酸替代物，其中R和R′獨(dú)立地是H或者取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Lys、Orn、Nle、Nva或Tle的氨基酸側(cè)鏈部分或者取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Lys、Orn、Nle、Nva或Tle的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物；并且 Aaa15是包括Ala、Arg、Orn、Lys、Ala、Dap、Dab、HArg或HLys的α-氨基酸或β-氨基酸的D-或L-異構(gòu)體或從Ala、Arg、Orn、Lys、Ala、Dap、Dab、HArg或HLys衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的D-或L-異構(gòu)體，或是從Ala、Arg、Orn、Lys、Ala、Dap、Dab、HArg或HLys衍生的α，α-雙取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-雙取代氨基酸的全部(R)或(S)構(gòu)型，或Aaa15是結(jié)構(gòu)如下的氨基酸替代物
其中虛線表示肽鍵；R和R′的至少之一是(CH2)y-R＂，并且若一個(gè)具有此式，則R和R′中另一個(gè)是H，其中R＂是 -NH2、 -NH-C(＝NH)-NH2、 -NH-(CH2)y-NH2、 -NH-C(＝O)-NH2、 -C(＝O)-NH2、 -C(＝O)-NH-CH3、 -C(＝O)-NH-(CH2)y-NH2、 -NH-C(＝NH)-NH-Me、 -NH-C(＝NH)-NH-Et、 -NH-C(＝NH)-NH-Pr、 -NH-C(＝NH)-NH-Pr-i、 -NH-C(＝O)-CH3、 -NH-C(＝O)-CH2-CH3、 -NH-C(＝O)-CH-(CH3)2、 -NH-C(＝O)-O-CH3、 -NH-C(＝O)-O-CH2-CH3、 -NH-C(＝O)-O-C-(CH3)3、 -NH-C(＝O)-NH-CH3、 -NH-C(＝N-C(＝O)-O-C-(CH3)3)-NH-C(＝O)-O-C-(CH3)3、 -N(C(＝O)-O-C-(CH3)3)-C(＝NH)-NH-C(＝O)-O-C-(CH3)3、



或
x是1或2；Y是CH2或C＝O；W是CH2、NH或NR″′，Z是H或CH3；J是-H、-(CH2)m-OH、-C(＝O)-CH2)m-OH、-C(＝O)-CH2)m-N(V1)(v2)、-C(＝O)-O-(CH2)m-CH3、-O-(CH2)m-CH3、-O-(CH2)m-N(V1)(v2)、-O-(CH2)m-OH、-C(＝O)-NH-(CH2)m-CH3、-C(＝O)-NH-(CH2)m-N(v1)(v2)、-C(＝O)-NH-(CH2)m-S(v1)、-C(＝O)-N-((CH2)m-N(v1)(v2))2、-C(＝O)-NH-CH(-C(＝O)-OH)-(CH2)m-N(v1)(v2)、-C(＝O)-NH-(CH2)m-NH-C(＝O)-CH(N(v1)(v2))((CH2)m-N(v1)(v2))、-C(＝O)-NH-CH(-C(＝O)-N(v1)(v2))-(CH2)m-N(v1)(v2)、Ω氨基脂族基團(tuán)、末端芳基或芳烷基、與定義J的前述組中的一項(xiàng)組合的任何的單個(gè)天然或非天然α-氨基酸、β-氨基酸或α，α-雙取代氨基酸或任何的單個(gè)天然或非天然α-氨基酸、β-氨基酸或α，α-雙取代氨基酸，包括任何前述項(xiàng)的全部(R)和(S)構(gòu)型；R″′是?；?、C1-C17直鏈或支鏈的烷基鏈、C2-C19直鏈或支鏈的烷基酰基鏈、C1-C17直鏈或支鏈的Ω氨基脂族基團(tuán)或C1-C17直鏈或支鏈的Ω氨基脂族酰基；v1和v2各自獨(dú)立地是H或C1-C17直鏈或支鏈的烷基鏈；n是0、1或2；m是0-17；y是1-5；并且用星號(hào)標(biāo)記的碳原子可以具有任何的立體化學(xué)構(gòu)型； 前提是Aaa1、Aaa3至Aaa12、Aaa14或Aaa15中至少之一是氨基酸替代物。
式III的相關(guān)實(shí)施方案提供這樣的構(gòu)建體，其中Aaa1、Aaa3至Aaa12、Aaa14或Aaa15的一個(gè)或多個(gè)是如上所定義的氨基酸替代物，并且如下文定義的輔基在Aaa1、Aaa3至Aaa12、Aaa14或Aaa15中的一個(gè)或多個(gè)Aaa處連接至氨基酸殘基側(cè)鏈的反應(yīng)基、在Aaa3至Aaa12或Aaa14處連接至氨基酸替代物的活性R或R’基團(tuán)、在Aaa3至Aaa12或Aaa14處連接至氨基酸替代物的活性R或R’基團(tuán)、在Aaa1處直接或通過(guò)Q基團(tuán)連接至氨基酸替代物的末端胺、在Aaa15處連接至氨基酸替代物的活性末端羧基、或在Aaa15處連接至基酸替代物中形成J的一部分的反應(yīng)基。與一個(gè)或多個(gè)輔基共價(jià)連接的反應(yīng)基可以是伯胺、仲胺、羧基、硫氫基或羥基。在一個(gè)方面，輔基可以在位置Aaa1、Aaa3、Aaa7、Aaa10、Aaa12或Aaa15或前述位置組合與活性胺共價(jià)連接。在另一方面，輔基可以在位置Aaa9或Aaa15或這兩個(gè)位置與活性羧基共價(jià)連接。在另一方面，輔基可以在位置Aaa3、Aaa7、Aaa9、Aaa10、Aaa11或Aaa12或前述位置組合與活性硫氫基共價(jià)連接。
在式III構(gòu)建體的優(yōu)選方面中，Aaa1至Aaa15(排除Aaa2和Aaa13)中的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)Aaa是前述式之一的氨基酸替代物。在第一特別優(yōu)選方面，Aaa1、Aaa5和Aaa15之一是氨基酸替代物。在第二特別優(yōu)選方面，Aaa1、Aaa5和Aaa15中的兩個(gè)Aaa是氨基酸替代物。在第三特別優(yōu)選方面，Aaa1、Aaa5和Aaa15均是氨基酸替代物。在另一個(gè)特別優(yōu)選方面，Aaa1、Aaa5和Aaa15中的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)Aaa是氨基酸替代物，并且構(gòu)建體是經(jīng)Aaa2和Aaa13的側(cè)鏈通過(guò)二硫鍵形成作用所形成的環(huán)狀構(gòu)建體。在其中Aaa1至Aaa15中的兩個(gè)或多個(gè)Aaa是氨基酸替代物的另一個(gè)特別優(yōu)選方面，氨基酸替代物不是連續(xù)的，也就是說(shuō)每個(gè)氨基酸替代物由一級(jí)序列中至少一個(gè)在氨基酸替代物之間插入的氨基酸殘基而與其它氨基酸替代物隔開。
在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，式III構(gòu)建體中的Aaa3、Aaa5、Aaa6、Aaa7、Aaa9、Aaa10或Aaa12至少之一是Ala的L-或D-異構(gòu)體、優(yōu)選地是Ala的L-異構(gòu)體。
在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供還包含一個(gè)或多個(gè)非肽鍵的式III構(gòu)建體。非肽鍵可以是用來(lái)降低本發(fā)明構(gòu)建體對(duì)降解的易感性，如通過(guò)用非肽鍵如酰胺、取代酰胺或肽模擬鍵(peptidmminetic linkage)的電子等排物替換在每個(gè)Lys或Arg殘基之前的天然肽鍵，而改善構(gòu)建體對(duì)胰蛋白酶樣蛋白酶的體內(nèi)穩(wěn)定性。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，天然肽鍵用具有倒轉(zhuǎn)極性的肽鍵替換。通常，可以利用并且可以在任何兩個(gè)殘基之間利用任何非肽鍵。非肽鍵包括其中參與兩個(gè)殘基之間鍵的碳原子從羰基碳被還原成亞甲基碳的鍵，如非肽鍵-CH2-NH-或其電子等排物-NH-CH2-，或使用其它鍵如-CH2-S-、-CH2-O-或-C(＝O)-CH2-，或任何前述項(xiàng)的電子等排物，或-CH2-CH2-或-CH＝CH-。通常，非肽鍵包括亞氨基鍵、酯鍵、肼鍵、氨基脲鍵、肟鍵或偶氮鍵。
上文定義的構(gòu)建體可以包括一個(gè)或多個(gè)輔基。輔基可以用來(lái)調(diào)整在循環(huán)中的停留時(shí)間、調(diào)整生物利用度、調(diào)整構(gòu)建體的免疫原性等。通常根據(jù)具體情況，輔基通過(guò)增加停留時(shí)間、生物利用度等而“調(diào)整”，不過(guò)輔基可以任選地減少停留時(shí)間、生物利用度等?！拜o基”因此包括如通過(guò)共價(jià)鍵綴合至任何式的構(gòu)建體，以改善該構(gòu)建體的藥物代謝動(dòng)力學(xué)或藥物動(dòng)力學(xué)特性的任何化合物。優(yōu)選的輔基包括包含重復(fù)單元的聚合物基團(tuán)，其中所述的重復(fù)單元又包含一個(gè)或多個(gè)碳原子和氫原子和任選地其它原子，包括氧原子。此類聚合物基團(tuán)優(yōu)選地是水溶性聚合物，并且優(yōu)選地是聚醚、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚噁唑啉或聚(丙烯酰嗎啉)。優(yōu)選的聚醚是聚乙二醇(PEG)。除了PEG之外，可以使用其它聚醚聚合物，如聚丙二醇和聚丁二醇。
在一個(gè)實(shí)施方案中，輔基是與構(gòu)建體的反應(yīng)基共價(jià)結(jié)合的一種或多種PEG聚合物。PEG聚合物或其它輔基可以共價(jià)結(jié)合至一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的側(cè)鏈上的反應(yīng)基，或可以共價(jià)結(jié)合至氨基酸替代物上的反應(yīng)基。氨基酸替代物的此類反應(yīng)基可以包括直接或經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)中間體而共價(jià)結(jié)合至Q或J的基團(tuán)，或可以包括形成R或R′的部分的反應(yīng)基。
若PEG用作輔基，則PEG聚合物可以具有約200MW至約50000MW的分子量。PEG聚合物可以是直鏈的，并且若是直鏈，則可以是單官能性的，即在一個(gè)末端帶反應(yīng)基而在另一末端帶非反應(yīng)基，可以是同雙官能性的，即在每個(gè)末端帶相同反應(yīng)基，或可以是異雙官能性的，即在即每個(gè)末端帶不同反應(yīng)基?；蛘撸琍EG聚合物可以是支化的，一般具有“Y”形結(jié)構(gòu)、多臂結(jié)構(gòu)如具有兩條、三條、四條或八條臂或本領(lǐng)域已知的其它結(jié)構(gòu)。PEG聚合物優(yōu)選地具有至少一個(gè)衍生化反應(yīng)基以便連接、優(yōu)選通過(guò)共價(jià)鍵連接至式III至式XIII的任何構(gòu)建體上的一個(gè)或多個(gè)定義的基團(tuán)。衍生化的反應(yīng)基可以連接至例如構(gòu)建體上的(包括在氨基酸殘基的端基上的、氨基酸殘基的側(cè)鏈上的、在替代物的Q基團(tuán)上的、或在替代物的J基團(tuán)上的、在替代物的R或R′基團(tuán)上的)胺基、羥基、硫氫基或羧基。
PEG聚合物優(yōu)選地具有在一個(gè)末端處的封端基團(tuán)，如羥基、烷氧基、取代的烷氧基、鏈烯氧基(aleknoxy)、取代的鏈烯氧基、炔氧基、取代的炔氧基、芳氧基或取代的芳氧基。PEG聚合物還優(yōu)選地具有在至少一個(gè)其它末端處的衍生化反應(yīng)基。在一個(gè)實(shí)施方案中，PEG聚合物是具有用連接基團(tuán)如胺、馬來(lái)酰亞胺或羧酸加以衍生化的末端羥基的線形或支化的聚醚，如單甲氧基PEG。構(gòu)建體的可用的反應(yīng)基決定了在PEG聚合物上使用的衍生化連接基團(tuán)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，使用羧酸衍生化的PEG利用構(gòu)建體的氨基端胺。在另一個(gè)實(shí)施方案中，再次使用羧酸衍生化的PEG利用構(gòu)建體的羧基端胺。在又一個(gè)實(shí)施方案中，若構(gòu)建體中存在Lys殘基或其同系物，則可以再次使用羧酸衍生化的PEG而利用其α或ε氨基。馬來(lái)酰亞胺衍生化的PEG可以與構(gòu)建體上的活性硫氫基或羥基一起使用。類似地，胺衍生化的PEG可以與在氨基酸殘基的任何端基或側(cè)鏈上的、在替代物的Q基團(tuán)上、在替代物的J基團(tuán)上、在替代物的R或R’基團(tuán)上的活性羧基一起使用。
因此，在一個(gè)方面，PEG以一個(gè)或多個(gè)親電子基團(tuán)加以活化，并且可以用于偶聯(lián)至構(gòu)建體的氨基，包括偶聯(lián)至側(cè)鏈的ε氨基或氨基端或羧基端胺。代表性的親電子反應(yīng)基包括琥珀酰亞胺α-甲基丁酸酯和其它α-甲基丁酸酯，如美國(guó)專利5,672,662和6,737,505中所公開，并且可以與蛋白質(zhì)一起使用，如美國(guó)專利申請(qǐng)公開2004/0235734中所公開?；蛘?，琥珀酰亞胺丙酸酯可以用作反應(yīng)基，如美國(guó)專利5,567,662中所公開，或N-羥基琥珀酰亞胺可以與支化的PEG一起使用，如美國(guó)專利5,932,462中所公開。前述每篇專利和專利申請(qǐng)的教導(dǎo)通過(guò)引用的方式而如完整所述那樣并入。
在另一方面，PEG聚合物具有一個(gè)或多個(gè)活性醛基，并用于偶聯(lián)至末端伯胺，如氨基端或羧基端胺。在另一方面，PEG聚合物具有一個(gè)或多個(gè)硫氫基反應(yīng)基(如馬來(lái)酰亞胺、二硫化正吡啶或硫氫基)，并用于偶聯(lián)至式III至式XIII的任何構(gòu)建體中的活性硫氫基，如半胱氨酸側(cè)鏈中的活性硫氫基或構(gòu)建體的Q基團(tuán)內(nèi)的活性硫氫基。
在一個(gè)方面，如國(guó)際專利公開號(hào)WO 2004/047871中公開的任何方法、綴合物或方案或其中援引的任何參考文獻(xiàn)可以用于本發(fā)明的構(gòu)建體。前述專利申請(qǐng)的教導(dǎo)通過(guò)引用的方式而如完整所述那樣并入。
通常，某種形式的化學(xué)修飾可以用來(lái)產(chǎn)生帶反應(yīng)基的活性PEG衍生物。反應(yīng)基可以是活性碳酸酯、活性酯、醛或三氟乙磺酸酯。PEG的反應(yīng)基部分地決定與PEG衍生物結(jié)合的氨基酸端基或側(cè)鏈部分。通常，優(yōu)選位點(diǎn)特異性PEG化，其部分原因在于得到的構(gòu)建體是均一的，使生物學(xué)活性損失最小化并降低免疫原性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，PEG具有約200MW至約50,000MW、更優(yōu)選約2,000MW至約20,000MW的分子量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用單甲氧基PEG，如式CH3-O(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-OH或CH3-O(CH2-CH2-O)n-H，其中n是從2至約1200的任何整數(shù)，其優(yōu)選地用胺、馬來(lái)酰亞胺或羧酸連接基團(tuán)進(jìn)行衍生化。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，輔基如PEG通過(guò)如Veronese FM和Pasut G.Pegylation，successful approach to drug delivery.Drug Discovery Today101451-1458(2005)中描述的酶不穩(wěn)定性接頭與構(gòu)建體綴合，并且在其中公開的方法通過(guò)引用的方式并入本文。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所用的輔基是如美國(guó)專利5,359,030和5,681,811中公開的具有親脂部分和親水聚合物部分的聚合物。在相關(guān)的實(shí)施方案中，所用的輔基是由可水解鍵(如酯鍵)連接的具有親水構(gòu)件(如PEG聚合物)和親脂構(gòu)件(如支鏈脂肪酸或烷基鏈)的寡聚綴合物，如美國(guó)專利6,309,633中公開。在另一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，所用的輔基是包括聚(丙二醇)和優(yōu)選地至少2個(gè)聚(丙二醇)亞單位的寡聚物，如美國(guó)專利6,858,580中公開。前述每篇專利和專利申請(qǐng)的教導(dǎo)通過(guò)引用的方式而如完整所述那樣并入。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，美國(guó)公開專利申請(qǐng)2004/0203081的教導(dǎo)通過(guò)引用的方式并入本文，其中該專利申請(qǐng)具體地包括涉及與多種促鈉尿排泄性化合物連接的輔基(在本申請(qǐng)中稱作“修飾部分”)和尤其具有多種長(zhǎng)度及構(gòu)造的寡聚體結(jié)構(gòu)的教導(dǎo)。在相關(guān)的實(shí)施方案中，國(guó)際專利申請(qǐng)WO2004/047871的教導(dǎo)通過(guò)引用的方式并入，其中該專利申請(qǐng)包括涉及“修飾部分”的教導(dǎo)，其中所述的“修飾部分”通過(guò)“修飾部分綴合位點(diǎn)”而與結(jié)合NPRA的促鈉尿排泄分子連接，可理解相似的方法可以用于與其它利尿鈉肽受體結(jié)合的促鈉尿排泄分子。
在本說(shuō)明書及權(quán)利要求書通篇范圍內(nèi)使用的某些術(shù)語(yǔ)定義如下。
本發(fā)明的“構(gòu)建體”和“氨基酸殘基序列”可以是a)天然存在的、b)由化學(xué)合成法產(chǎn)生、c)通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生、d)通過(guò)較大分子的生物化學(xué)片段化法或酶的片段化法而產(chǎn)生、e)通過(guò)以上所列a至d方法的組合而生成的方法所產(chǎn)生，或f)通過(guò)用于產(chǎn)生肽或氨基酸序列的任何其它方法產(chǎn)生。
通過(guò)使用優(yōu)選的產(chǎn)生方法即化學(xué)合成法，有可能向構(gòu)建體內(nèi)導(dǎo)入非天然存在的多種氨基酸、修飾的氨基端或羧基端等，因而提供改善的穩(wěn)定性和組成、抗蛋白酶降解性等，并有可能向構(gòu)建體內(nèi)導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代物。
術(shù)語(yǔ)“肽”如本說(shuō)明書及權(quán)利要求書通篇范圍中所用，意圖包括由兩個(gè)或多個(gè)氨基酸(包括氨基酸的化學(xué)變型和衍生物)構(gòu)成的任何結(jié)構(gòu)。形成肽的全部或部分的氨基酸可以是天然存在的氨基酸、此類氨基酸的立體異構(gòu)體和變型、非蛋白質(zhì)氨基酸、翻譯后修飾的氨基酸、酶修飾的氨基酸等。術(shù)語(yǔ)“肽”也包括肽的二聚體或多聚體?！爸圃斓摹彪陌ㄍㄟ^(guò)化學(xué)合成法、重組DNA技術(shù)、較大分子的生物化學(xué)片段化法或酶的片段化法、前述方法組合而產(chǎn)生的肽，或通常由任何其它方法制造的肽。
用于本發(fā)明中(包括如用于說(shuō)明書和權(quán)利要求書中)的術(shù)語(yǔ)“氨基酸側(cè)鏈部分”包括如本文中術(shù)語(yǔ)“氨基酸”所定義任何氨基酸的任何側(cè)鏈。該術(shù)語(yǔ)因此包括在天然存在的氨基酸中出現(xiàn)的側(cè)鏈部分。它還包括在修飾的天然存在的氨基酸(如糖基化氨基酸)中的側(cè)鏈部分。它還包括在天然存在的蛋白質(zhì)氨基酸的立體異構(gòu)體和變型、非蛋白質(zhì)氨基酸、翻譯后修飾的氨基酸、酶合成的氨基酸、衍生化氨基酸、為模擬氨基酸所設(shè)計(jì)的構(gòu)建體或結(jié)構(gòu)等中的側(cè)鏈部分。例如，在該定義的范圍內(nèi)包含本文中所公開任何氨基酸的側(cè)鏈部分。在氨基酸側(cè)鏈部分的定義范圍內(nèi)包含如本文以下所定義的“氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物”。
“氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物”是針對(duì)任何氨基酸側(cè)鏈部分的修飾或在其中的變異，包括針對(duì)天然存在或非天然氨基酸側(cè)鏈部分的修飾或在其中的變異，其中修飾或變異包括(a)向現(xiàn)有的烷基、芳基或芳烷基鏈添加一個(gè)或多個(gè)飽和或不飽和碳原子；(b)用另一種原子，優(yōu)選氧或氮取代側(cè)鏈中的碳；(c)向側(cè)鏈的碳原子添加端基，所述的端基包括甲基(-CH3)、甲氧基(-OCH3)、硝基(-NO2)、羥基(-OH)或氰基(-C≡N)；(d)對(duì)于包括羥基、硫氫基或氨基的側(cè)鏈部分，添加合適的羥基、硫氫基或氨基保護(hù)基團(tuán)；或(e)對(duì)于包括環(huán)結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈部分，添加一個(gè)取代基或環(huán)狀取代基，包括直接連接或通過(guò)醚鍵連接的羥基、鹵素、烷基或芳基。對(duì)于氨基，合適的氨基保護(hù)基團(tuán)包括，但不限于Z、Fmoc、Boc、Pbf、Pmc等。
在本發(fā)明實(shí)施方案中所用的“氨基酸”和如用于說(shuō)明書和權(quán)利要求書中的此術(shù)語(yǔ)包括已知的天然存在的蛋白質(zhì)氨基酸，所述氨基酸由其常用的三字母縮寫和單字母縮寫提及。通常參見Synthetic PeptidesA User’s Guide，編者G.A.Grant，W.H.Freeman & Co.，New York(1992)，其教導(dǎo)通過(guò)引用的方式并入本文中，包括在第11至24頁(yè)中所述的文本內(nèi)容及表格?！鞍被帷卑ǔＲ?guī)的α-氨基酸，并且還包括其中至少一個(gè)側(cè)鏈?zhǔn)侨绫疚闹兴x的氨基酸側(cè)鏈部分的β-氨基酸、α，α-雙取代氨基酸和N-取代氨基酸?！鞍被帷边€包括N-烷基α-氨基酸，其中氨基端氨基具有C1-C6直鏈或支鏈的烷基取代基。因此可以看出術(shù)語(yǔ)“氨基酸”包括天然存在的蛋白質(zhì)氨基酸的立體異構(gòu)體和變型、非蛋白質(zhì)氨基酸、翻譯后修飾的氨基酸、酶合成的氨基酸、衍生化氨基酸、為模擬氨基酸所設(shè)計(jì)的構(gòu)建體或結(jié)構(gòu)等。修飾及非天然氨基酸通常在上文援引的Synthetic PeptidesA User’s Guide；Hruby V.J.，Al-obeidi F.，Kazmierski W.，Biochem.J.268249-262(1990)；和Toniolo C，Int.J.Peptide Protein Res.35287-300(1990)中描述；全部文獻(xiàn)的教導(dǎo)通過(guò)引用的方式并入本文中。此外，下列縮寫(包括氨基酸及其保護(hù)基團(tuán)和修飾基團(tuán))具有給出的意思 Abu —γ-氨基丁酸 12-Ado —12-氨基十二烷酸 Aib —α-氨基異丁酸 6-Ahx—6-氨基己酸 Amc — 4-(氨甲基)-環(huán)己烷羧酸 8-Aoc — 8-氨基辛酸 Bip — 聯(lián)苯胺 Boc — 叔丁氧羰基 Bzl — 芐基 Bz— 苯甲酰 Cit — 瓜氨酸 Dab — 二氨基丁酸 Dap — 二氨基丙酸 Dip — 3，3-二苯基丙氨酸 Disc — 1，3-二氫-2H-異吲哚羧酸 Et— 乙基 Fmoc — 芴甲氧羰基 Hept — 庚酰基(CH3-(CH2)5-C(＝O)-) Hex — 己?；?CH3-(CH2)4-C(＝O)-) HArg — 高精氨酸 HCys — 高半胱氨酸 HLys — 高賴氨酸 HPhe — 高苯丙氨酸 HSer — 高絲氨酸 Me— 甲基 Met(O)— 甲硫氨酸亞砜 Met(O2) — 甲硫氨酸砜 Nva — 正纈氨酸 Pgl — 苯基甘氨酸 Pr— 丙基 Pr-i — 異丙基 Sar — 肌氨酸 Tle — 叔丁基丙氨酸 Z — 芐氧羰基 在本發(fā)明構(gòu)建體的列表中，常規(guī)氨基酸殘基具有如《專利審查程序手冊(cè)》(Manual of Patent Examing Procedure)第8版第2400章中給出的常規(guī)含義。因此，“Nle”是正亮氨酸；“Asp”是天冬氨酸；“His”是組氨酸；“Arg”是精氨酸；“Trp”是色氨酸；“Lys”是賴氨酸；“Gly”是甘氨酸；“Pro”是脯氨酸；“Tyr”是酪氨酸；“Ser”是絲氨酸等。全部殘基處于L-異構(gòu)體構(gòu)型，除非指明D-異構(gòu)體，如“D-Ala”表示D-丙氨酸。
單個(gè)氨基酸，包括天然存在的蛋白質(zhì)氨基酸的立體異構(gòu)體和變型、非蛋白質(zhì)氨基酸、翻譯后修飾的氨基酸、酶合成的氨基酸、衍生化氨基酸、從任何前述項(xiàng)衍生的α，α-雙取代氨基酸(即這樣的α，α-雙取代氨基酸，其中至少一個(gè)側(cè)鏈與從中衍生該α，α-雙取代氨基酸的殘基的側(cè)鏈相同)、從任何前述項(xiàng)衍生的β-氨基酸(即這樣的β-氨基酸，其除存在β-碳之外與從中衍生所述β-氨基酸的殘基相同)和包括前述各項(xiàng)的其它情況，有時(shí)在本文中稱作“殘基”。
“α，α-雙取代氨基酸”包括在α-位置具有其它取代基的任何α-氨基酸，其中取代基可以與α-氨基酸的側(cè)鏈部分相同或不同。除了α-氨基酸的側(cè)鏈部分之外，合適的取代基還包括C1-C6直鏈或支鏈的烷基。Aib是α，α-雙取代氨基酸的實(shí)例。在可以使用常規(guī)的L-和D-異構(gòu)體稱謂提及α，α-雙取代氨基酸時(shí)，將理解的是這些稱謂旨在便利，并且其中在α-位置上的取代基不同的情況下，此類氨基酸根據(jù)需要可以可互換地稱作從具有所指明氨基酸側(cè)鏈部分的殘基的L-或D-異構(gòu)體衍生的α，α-雙取代氨基酸。因此(S)-2-氨基-2-甲基-己酸可以稱作從L-Nle衍生或稱作從D-Ala衍生的α，α-雙取代氨基酸。無(wú)論何時(shí)提供α，α-雙取代氨基酸，將理解為包括其全部(R)和(S)構(gòu)型。
“N-取代氨基酸”包括其中氨基酸側(cè)鏈部分與主鏈氨基共價(jià)連接的任何氨基酸，任選其中在α-碳位置內(nèi)除H之外沒有取代基。肌氨酸是N-取代氨基酸的實(shí)例。例如，肌氨酸可以稱作Ala的N-取代氨基酸衍生物，因?yàn)榧“彼崤cAla的氨基酸側(cè)鏈部分是相同的，即均為甲基。
術(shù)語(yǔ)“氨基酸替代物”包括本文中公開的作為殘基的模擬物的分子，所述的殘基包括但不限于哌嗪核心分子、酮-哌嗪核心分子和二氮雜卓核心分子。除非另外說(shuō)明，將氨基酸替代物理解為包括羧基和氨基，以及對(duì)應(yīng)于氨基酸側(cè)鏈的基團(tuán)，或在甘氨酸的氨基酸替代物的例子中，除氫之外無(wú)側(cè)鏈。因此，氨基酸替代物包括以上給出的式I或I1通式的分子。氨基酸替代物還包括具有以下任一結(jié)構(gòu)的分子，可理解為方便起見，此類結(jié)構(gòu)作為孤立的替代物給出，不包括任何保護(hù)基團(tuán)，并且沒有通過(guò)一個(gè)或兩個(gè)肽鍵與形成本發(fā)明構(gòu)建體的部分的一個(gè)或兩個(gè)氨基酸殘基連接
其中R、R′、x和星號(hào)如對(duì)式I的替代物所定義。氨基酸替代物還包括具有以下任一結(jié)構(gòu)的分子，再次可理解為方便起見，此類結(jié)構(gòu)作為孤立的替代物給出，不包括任何保護(hù)基團(tuán)，并且沒有通過(guò)一個(gè)或兩個(gè)肽鍵與形成本發(fā)明構(gòu)建體的部分的一個(gè)或兩個(gè)氨基酸殘基連接
其中R、R′、x和星號(hào)如對(duì)式I的替代物所定義。為了合成，任何氨基酸替代物的羧基或氨基優(yōu)選地由保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，使得它在保護(hù)基團(tuán)存在時(shí)沒有反應(yīng)性，并且類似地，形成R或R′的部分的任何反應(yīng)基可以類似地由保護(hù)基團(tuán)保護(hù)。將理解的是本發(fā)明的替代物具有多于一個(gè)的非對(duì)稱中心，并且因而能夠以多于一種立體異構(gòu)體形式存在。化合物中的某一些也可以作為幾何異構(gòu)體和旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體存在。另外，本發(fā)明的一些化合物也可以具有產(chǎn)生阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體的構(gòu)象軸手性。本發(fā)明分別延伸至這些形式中的每一種并延伸至其混合物，包括消旋物。在一個(gè)方面，替代物異構(gòu)體可以通過(guò)色譜方法或通過(guò)使用拆分劑而常規(guī)地分離。在另一方面，各種替代物的異構(gòu)體或?qū)τ丑w純的替代物通過(guò)合成方案(如本文中公開的那些方案)或此類方案的變型，采用非對(duì)稱合成法，使用手性中間體、試劑或催化劑加以合成。
術(shù)語(yǔ)“羧基端封端基團(tuán)”包括經(jīng)構(gòu)建體的羧基端的末端環(huán)碳原子或(若提供)末端羧基連接的任何端基。末端環(huán)碳原子或(若提供)末端羧基可以形成殘基的一部分或可以形成氨基酸替代物的一部分。在優(yōu)選的方面，羧基端封端基團(tuán)形成在構(gòu)建體的羧基端位置處的氨基酸替代物的一部分。羧基端封端基團(tuán)包括，但不限于-(CH2)n-OH、-(CH2)n-C(＝O)-OH、-(CH2)m-OH、-(CH2)n-C(＝O)-N(v1)(v2)、-(CH2)n-C(＝O)-(CH2)m-N(v1)(v2)、-(CH2)n-O-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-C(＝O)-NH-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-C(＝O)-NH-(CH2)m-N(v1)(v2)))2、-(CH2)n-C(＝O)-NH-CH(-C(＝O)-OH)-(CH2)m-N(v1)(v2)、-C(＝O)-NH-(CH2)m-NH-C(＝O)-CH(N(v1)(v2))((CH2)m-N(v1)(v2))或-(CH2)n-C(＝O)-NH-CH(-C(＝O)-NH2)-(CH2)m-N(v1)(v2)，包括前述基團(tuán)的全部(R)或(S)構(gòu)型，其中v1和v2各自獨(dú)立地是H、C1-C17直鏈或支鏈的烷基鏈，m是0-17和n是0-2；或任何Ω氨基脂族基團(tuán)、末端芳基或芳烷基，包括下列基團(tuán)，如甲基、二甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、戊基、己基、烯丙基、環(huán)丙烷甲基、己?；?、庚?；⒁阴；⒈；?、丁?；?、苯乙?；?、環(huán)己基乙?；?、萘乙?；?、肉桂酰基、苯基、芐基、苯甲酰、12-Ado、7′-氨基庚?；?、6-Ahx、Amc或8-Aoc或任何單個(gè)天然或非天然α-氨基酸、β-氨基酸或α，α-雙取代氨基酸，包括前述基團(tuán)的全部(R)或(S)構(gòu)型，任選地與任何的前述非氨基酸封端基團(tuán)的組合。在前述基團(tuán)中，例如將理解-C(＝O)-NH-(CH2)m-NH-C(＝O)-CH(N(v1)(v2))((CH2)m-N(v1)(v2))是
術(shù)語(yǔ)“氨基端封端基團(tuán)”包括經(jīng)構(gòu)建體的氨基端的末端胺連接的任何端基。該末端胺可以形成殘基的一部分或可以形成氨基酸替代物的一部分。在優(yōu)選的方面，氨基端封端基團(tuán)形成在構(gòu)建體的氨基端位置處的氨基酸替代物的一部分。氨基端封端基團(tuán)包括，但不限于任何Ω氨基脂族基團(tuán)、酰基團(tuán)或末端芳基或芳烷基，包括下列基團(tuán)，如甲基、二甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、戊基、己基、烯丙基、環(huán)丙烷甲基、己?；?、庚酰基、乙?；?、丙?；?、丁?；?、苯乙?；?、環(huán)己基乙?；?、萘乙?；?、肉桂?；?、苯基、芐基、苯甲酰、12-Ado、7′-氨基庚酰基、6-Ahx、Amc或8-Aoc，或者，氨基端封端基團(tuán)是-(CH2)m-NH(v3)、-(CH2)m-CH3、-C(＝O)-(CH2)m-CH3、-C(＝O)-(CH2)m-NH(v3)、-C(＝O)-(CH2)m-C(＝O)-OH、-C(＝O)-(CH2)m-C(＝O)-(v4)、-(CH2)m-C(＝O)-OH、-(CH2)m-C(＝O)-(v4)、C(＝O)-(CH2)m-O(v3)、-(CH2)m-O(v3)、C(＝O)-(CH2)m-S(v3)或-(CH2)m-S(v3)，其中v3是H或C1-C17直鏈或支鏈的烷基鏈，并且v4是C1-C17直鏈或支鏈的烷基鏈及m是0-17。
當(dāng)苯基環(huán)包括一個(gè)或多個(gè)取代基時(shí)，苯基環(huán)是“取代的”，其中所述的取代基獨(dú)立地包含直接連接或通過(guò)醚鍵連接的羥基、鹵素、烷基或芳基。當(dāng)苯基環(huán)是如此取代的情況下，氨基酸殘基可以稱作取代的，如在取代的Phe、取代的HPhe或取代的Pgl中。
術(shù)語(yǔ)“烯”包括含有一個(gè)或多個(gè)碳-碳雙鍵的不飽和烴。烯基的實(shí)例包括乙烯、丙烯等。
術(shù)語(yǔ)“鏈烯基”包括含有至少一個(gè)雙鍵的2-6個(gè)碳原子的直鏈單價(jià)烴基或3-6個(gè)碳原子的支鏈單價(jià)烴基；其實(shí)例包括乙烯基、2-丙烯基等。
本文中所述的“烷基”包括具有所指明長(zhǎng)度的處于直鏈或支鏈構(gòu)型的那些烷基。烷基的實(shí)例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、己基、異己基等。
術(shù)語(yǔ)“炔基”包括含有至少一個(gè)三鍵的2-6個(gè)碳原子的直鏈單價(jià)烴基或3-6個(gè)碳原子的支鏈單價(jià)烴基；其實(shí)例包括乙炔基、丙炔基、丁炔基等。
術(shù)語(yǔ)“芳基”包括具有6-12環(huán)原子的并且任選用一個(gè)或多個(gè)取代基進(jìn)行獨(dú)立取代的單環(huán)或雙環(huán)芳烴基，所述的取代基選自烷基、鹵烷基、環(huán)烷基、烷氧基、烷基硫代、鹵素、硝基、?；?、氰基、氨基、單取代氨基、雙取代氨基、羥基、羧基或烷氧基-羰基。芳基的實(shí)例包括苯基、聯(lián)苯基、萘基、1-萘基和2-萘基、其衍生物等。
術(shù)語(yǔ)“芳烷基”包括原子團(tuán)-RaRb，其中Ra是烯基(雙價(jià)烷基)，并且Rb是如上所定義的芳基。芳烷基的實(shí)例包括芐基、苯乙基、3-(3-氯苯基)-2-甲基戊基等。
術(shù)語(yǔ)“脂族的”包括具有烴鏈例如烷烴、烯烴、炔烴及其衍生物的化合物。
術(shù)語(yǔ)“?；卑ɑ鶊F(tuán)R-C(＝O)-，其中R是有機(jī)基團(tuán)。實(shí)例是乙?；鵆H3-C(＝O)-，在本文中稱作“Ac”。
當(dāng)如上所定義的芳基、烷基或取代烷基經(jīng)一個(gè)或多個(gè)羰基{-(C＝O)-}連接時(shí)，肽或脂族部分受到“酰化”。肽最常見地在氨基端處酰化。
“Ω氨基脂族基團(tuán)”包括帶末端氨基的脂族部分。Ω氨基脂族基團(tuán)的實(shí)例包括7′-氨基-庚?；约傍B氨酸和賴氨酸的氨基酸側(cè)鏈部分。
術(shù)語(yǔ)“雜芳基”包括含有1-4個(gè)選自氮、氧和硫的雜原子的單環(huán)和雙環(huán)芳環(huán)。5-元或6-元雜芳基是單環(huán)雜芳環(huán)；其實(shí)例包括噻唑、噁唑、噻吩、呋喃、吡咯、咪唑、異噁唑、吡唑、三唑、噻二唑、四唑、噁二唑、吡啶、噠嗪、嘧啶、吡嗪等。雙環(huán)雜芳環(huán)包括，但不限于苯并噻二唑、吲哚、苯并噻吩、苯并呋喃、苯并咪唑、苯并異噁唑、苯并噻唑、喹啉、苯并三唑、苯并噁唑、異喹啉、嘌呤、呋喃并吡啶和噻吩并吡啶。
“酰胺”包括具有與羰基連接的三價(jià)氮(-C(＝O)-NH2)的化合物，例如甲酰胺、乙酰胺、丙酰胺等。
“酰亞胺”包括含有亞胺基(-C(＝O)-NH-C(＝O)-)的化合物。
“胺”包括含有氨基(-NH2)的化合物。
“腈”包括作為羧酸衍生物并含有與有機(jī)基團(tuán)連接的(-CN)基的化合物。
術(shù)語(yǔ)“鹵素”意圖包括鹵原子氟、氯、溴和碘，以及包括一個(gè)或多個(gè)鹵原子的基團(tuán)，如-CF3等。
術(shù)語(yǔ)“組合物”，如在藥物組合物中，意圖包括包含活性成分和充當(dāng)載體的惰性成分的產(chǎn)物，以及直接或間接地因任何兩種或多種成分的組合、復(fù)合或聚集、因一種或多種成分的解離或因一種或多種成分的其它類型反應(yīng)或相互作用而產(chǎn)生的任何產(chǎn)物。因此，本發(fā)明的藥物組合物包括通過(guò)將本發(fā)明構(gòu)建體與可藥用的載體混合而制造的任何組合物。
術(shù)語(yǔ)“EC50”意圖包括激動(dòng)劑的摩爾濃度，該摩爾濃度產(chǎn)生50％針對(duì)激動(dòng)劑的最大可能反應(yīng)。例如，構(gòu)建體在濃度72nM上產(chǎn)生如cGMP測(cè)定法中所測(cè)定針對(duì)構(gòu)建體的最大可能反應(yīng)的50％，則該構(gòu)建體具有72nM的EC50。除非另外說(shuō)明，與EC50測(cè)定有關(guān)的摩爾濃度以納摩爾(nM)為單位。
術(shù)語(yǔ)“Ki(nM)”意圖包括平衡受體結(jié)合親和力，其代表平衡時(shí)在競(jìng)爭(zhēng)劑不存在下與半數(shù)的受體結(jié)合部位相結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性化合物的摩爾濃度。通常，Ki與化合物對(duì)受體的親和力成反比，從而當(dāng)Ki低時(shí)，則親和力高。Ki可以使用Cheng和Prusoff(Cheng Y.，Prusoff W.H.，Biochem.Pharmacol.223099-3108，1973)等式測(cè)定
其中“配體”是配體的濃度，所述配體可以是放射性配體，并且Kd是產(chǎn)生50％受體占據(jù)的受體親和力的倒數(shù)量值。除非另外說(shuō)明，與Ki測(cè)定有關(guān)的摩爾濃度是nM。
本文中所用的化學(xué)命名方案和結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖采用并依賴如(可從Cambridgesoft Corp.，Cambridge，Mass.獲得的)ChemDraw程序所用的化學(xué)命名特征。尤其，某些化合物名稱使用Autonom程序從如Chemdraw Ultra或ISISbase(MDL Corp.)所用的結(jié)構(gòu)中衍生。通常，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖不描繪與碳原子連接的氫原子除非在端基內(nèi)和在其它特定環(huán)境下。
本文中的某些結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖和附圖如在表1和2中包括的那些圖，描繪了由氨基酸替代物和氨基酸殘基組成的構(gòu)建體，其中替代物由結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖確定，并且氨基酸殘基由三字母縮寫確定。除非另外說(shuō)明，可理解的是在所述替代物和殘基之間、或者所述殘基和替代物之間、或者一個(gè)替代物和其氨基端和羧基端側(cè)上的殘基之間的鍵是常規(guī)肽鍵-C(＝O)-NH-，或在其中肽鍵與替代物的氨基端上環(huán)氮連接的情況下，是-C(＝O)-N-。通常，在此類鍵的圖中，繪出氨基酸替代物的原子(例如-C(＝O)-或-N)，但是不繪出氨基酸殘基的原子。
制劑和用途 本文中公開的構(gòu)建體既可以用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用，也可以用于畜牧業(yè)或獸醫(yī)應(yīng)用。一般，所述構(gòu)建體或包括該構(gòu)建體的藥物組合物在人類中使用，不過(guò)也可以用在其它哺乳動(dòng)物中使用。術(shù)語(yǔ)“患者”意圖指哺乳動(dòng)物個(gè)體，并且在本說(shuō)明書通篇范圍內(nèi)和在權(quán)利要求書中如此使用。本發(fā)明的主要應(yīng)用涉及人類患者，不過(guò)本發(fā)明可以應(yīng)用至實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、動(dòng)物園動(dòng)物、野生動(dòng)物、寵物、體育動(dòng)物或其它動(dòng)物。
本文中公開的構(gòu)建體可以用于治療需要對(duì)其誘導(dǎo)抗高血壓、抗心血管作用、抗腎臟作用和/或抗內(nèi)分泌作用的任何狀況、綜合征或疾病。這具體包括可以對(duì)其使用天然利尿鈉肽的任何狀況、綜合征或疾病。因此，本文中公開的構(gòu)建體可以用來(lái)引起患者中所需的鈉尿排泄、利尿和/或血管舒張。
在一個(gè)方面，本文中公開的構(gòu)建體在治療早期如1級(jí)充血性心力衰竭中使用。在另一方面，本文中公開的構(gòu)建體用于慢性或代償失調(diào)性充血性心力衰竭的治療中。在另一方面，本文中公開的構(gòu)建體用于急性充血性心力衰竭(包括在休息及最小活動(dòng)情況下呼吸困難的患者的急性代償失調(diào)性充血性心力衰竭)的治療中。
構(gòu)建體的鹽形式。本發(fā)明的構(gòu)建體可以處于任何可藥用鹽形式。術(shù)語(yǔ)“可藥用鹽”指從可藥用的無(wú)毒堿或無(wú)毒酸(包括無(wú)機(jī)堿或有機(jī)堿和無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸)制備的鹽。從無(wú)機(jī)堿衍生的鹽包括鋁、銨、鈣、銅、高鐵、亞鐵、鋰、鎂、錳、亞錳、鉀、鈉、鋅等的鹽。特別優(yōu)選銨、鈣、鋰、鎂、鉀和鈉鹽。從可藥用的有機(jī)無(wú)毒堿中衍生的鹽包括伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)、環(huán)狀胺和堿性離子交換樹脂如精氨酸、甜菜堿、咖啡因、膽堿、N，N′-二芐基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基-嗎啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、氨基葡糖、組氨酸、哈胺、異丙基胺、賴氨酸、甲基葡糖胺、嗎啉、哌嗪、哌啶、多胺樹脂、普魯卡因、嘌呤、可可堿、三乙胺、三甲胺、三丙基胺、氨丁三醇等的鹽。
當(dāng)本發(fā)明的構(gòu)建體呈堿性時(shí)，酸加成鹽可以從可藥用的無(wú)毒酸(包括無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸)制備。此類酸包括乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟腦磺酸、羧酸、檸檬酸、羧酸、檸檬酸、乙磺酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖酸、谷氨酸、氫溴酸、氫氯酸、羥乙磺酸、乳酸、馬來(lái)酸、蘋果酸、扁桃酸、甲磺酸、丙二酸、粘酸、硝酸、雙羥萘酸、泛酸、磷酸、丙酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、對(duì)甲苯磺酸、三氟乙酸等。本發(fā)明的構(gòu)建體的酸加成鹽在合適的溶劑中從該構(gòu)建體和過(guò)量的酸如氫氯酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、檸檬酸、酒石酸、馬來(lái)酸、琥珀酸或甲磺酸制備。乙酸鹽形式尤其是有用的。在本發(fā)明實(shí)施方案的構(gòu)建體包括酸性部分的情況下，合適的可藥用鹽可以包括堿金屬鹽，如鈉或鉀鹽，或堿土金屬鹽，如鈣或鎂鹽。
此外，申請(qǐng)人已經(jīng)有利地發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)應(yīng)的乙酸鹽鹽形式，本發(fā)明的肽構(gòu)建體的某些鹽形式，包括雙羥萘酸鹽、辛酸鹽、癸酸鹽、油酸鹽、硬脂酸鹽、鞣酸鈉和棕櫚酸鹽形式，具有增加的循環(huán)半壽期，在一些情況下加倍。這些鹽形式特別適用于通過(guò)皮下注射或肌內(nèi)注射施用，尤其適用于長(zhǎng)期治療，其原因在于可以因較長(zhǎng)半壽期而實(shí)現(xiàn)的給藥頻率減少。盡管不受理論限制，然而認(rèn)為與乙酸鹽鹽形式相比，增加的半壽期涉及溶解度下降。本發(fā)明肽構(gòu)建體的半壽期增加的鹽形式可以通過(guò)任何方法制造，包括例如離子交換法，將構(gòu)建體的乙酸鹽形式的溶液雙羥萘酸二鈉以形成雙羥萘酸鹽混懸液，或在構(gòu)建體的制造中在終末純化步驟期間使用所需的鹽。
藥物組合物。本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供包括本發(fā)明的構(gòu)建體和可藥用載體的藥物組合物。載體可以是液體制劑，并且優(yōu)選地是緩沖、等張的水溶液。可藥用載體也包括賦形劑如稀釋劑、載體等，以及添加劑，如穩(wěn)定劑、防腐劑、增溶劑、緩沖劑等，如下文所述。
本發(fā)明數(shù)個(gè)實(shí)施方案的構(gòu)建體可以配制成或復(fù)合成包括至少一種本發(fā)明構(gòu)建體連同一種或多種可藥用載體的藥物組合物，其中所述的可藥用載體可以根據(jù)需要包括賦形劑如稀釋劑、載體等和添加劑如穩(wěn)定劑、防腐劑、增溶劑、緩沖劑等。制劑用賦形劑可以包括聚乙烯吡咯烷酮、明膠、羥基纖維素、阿拉伯膠、聚乙二醇、甘露醇、氯化鈉和檸檬酸鈉。對(duì)于注射劑或其它液體施用制劑，優(yōu)選含有至少一種或多種緩沖組分的水，并且也可以使用穩(wěn)定劑、防腐劑和增溶劑。對(duì)于固體施用制劑，可以使用多種增稠劑、填料、填充劑和載體添加劑中的任一種，如淀粉、糖、脂肪酸等。對(duì)于局部施用制劑，可以使用多種乳膏劑、軟膏劑、凝膠劑、洗劑等中的任一種。對(duì)于絕大多數(shù)藥物制劑，按照重量或體積，非活性成分將構(gòu)成制劑的主要部分。對(duì)于藥物制劑，也構(gòu)思可以使用多種定量釋放的、緩釋的或定時(shí)釋放的制劑和添加劑中的任一種，從而可以配制出這樣的劑量，以實(shí)現(xiàn)在一段時(shí)間內(nèi)送遞本發(fā)明的構(gòu)建體。例如可以包括明膠、羧甲基纖維素鈉和/或其它纖維素類賦形劑以提供定時(shí)釋放制劑或緩釋制劑，尤其對(duì)于通過(guò)皮下和肌內(nèi)注射施用。
通常，施用至患者的構(gòu)建體的實(shí)際量將在相當(dāng)寬泛的范圍內(nèi)變化，這取決于施用模式、使用的制劑和想要的反應(yīng)。
在實(shí)際使用中，構(gòu)建體可以根據(jù)常規(guī)藥學(xué)復(fù)合技術(shù)作為摻合劑中的活性成分與藥用載體組合。載體可以采取種類繁多的形式，這取決于施用(例如口服、胃腸道外(包括靜脈內(nèi))、尿道、陰道、鼻、皮膚、經(jīng)皮、肺、肺深部、吸入、口頰、舌下等)所需要的制劑形式。在制備用于口服劑量形式的組合物中，可以使用任何常見的藥用介質(zhì)，例如在口服液體制劑例如混懸劑、酏劑和溶液劑的情況下，使用水、二醇、油、醇、增香劑、防腐劑、著色劑等；或如在口服固體制劑例如粉劑、硬膠囊劑和軟膠囊劑和片劑的情況下，使用載體，如淀粉、糖、微晶纖維素、稀釋劑、造粒劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑、崩解劑等。
因?yàn)槠湟子谑┯?，片劑和膠囊劑代表有利的口服劑量單位形式。若需要，包括本發(fā)明構(gòu)建體的組合物可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的含水或不含水技術(shù)加以包衣。此類治療用組合物中的活性構(gòu)建體的量是這樣的，以至于將獲得有效劑量。在另一種有利的劑量單位形式中，可以使用舌下藥物組合物，如薄片(sheet)、糯米紙囊劑、片劑等。活性構(gòu)建體也可以作為例如液態(tài)滴劑或噴霧劑作鼻內(nèi)施用。
片劑、丸劑、膠囊劑等也可以含有粘合劑如黃芪樹膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑如磷酸氫二鈣；崩解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或藻酸；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂；和甜味劑如蔗糖、乳糖或糖精。當(dāng)劑量單位形式是膠囊劑時(shí)，除以上類型的材料之外，它還可以含有液態(tài)載體如動(dòng)物油. 多種其它材料可以用作包衣層或用來(lái)修飾劑量單位的物理形式。例如，片劑可以用紫膠、糖或這兩者加以包衣。糖漿劑或酏劑除活性成分外可以含有蔗糖作為甜味劑、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯作為防腐劑、染料和香料如櫻桃或橙味。構(gòu)建體也可以作胃腸道外施用。這些活性肽的溶液劑或混懸劑可以在水中與表面活性劑(如羥丙基纖維素)適度混合而制備。也可以在甘油、液態(tài)聚乙二醇及其在油內(nèi)的混合物中制備分散體。這些制劑可以任選地含有防止微生物生長(zhǎng)的防腐劑。也可以使用凍干的單個(gè)單位劑量，如其在緊鄰施用前用鹽水重構(gòu)，并且因此不需要防腐劑。
適于可注射用途的藥物形式包括，例如，用于臨時(shí)制備無(wú)菌可注射溶液劑或分散體的無(wú)菌水溶液或分散體和無(wú)菌粉末，如凍干制劑。在所有情況下，該形式必須是無(wú)菌的并且必須具有流動(dòng)性，使得其可以通過(guò)注射器施用。該形式必須在制造和儲(chǔ)存條件下是穩(wěn)定的，并且必須保存避免微生物(如細(xì)菌和真菌)污染作用。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇)或液態(tài)聚乙二醇、其合適混合物及植物油的溶劑或分散體介質(zhì)。
如本文中公開的構(gòu)建體可以通過(guò)鼻施用方式治療性地應(yīng)用?！氨鞘┯谩币庵副莾?nèi)施用本發(fā)明的任何構(gòu)建體的任何形式。構(gòu)建體可以存在于水溶液(如包含鹽、檸檬酸鹽或其它常見賦形劑或防腐劑的溶液)中。構(gòu)建體也可以存在于干燥制劑或粉末制劑中。
在備選實(shí)施方案中，構(gòu)建體可以直接施用至肺內(nèi)。肺內(nèi)施用可以通過(guò)定量劑量吸入器(當(dāng)患者在呼吸期間開動(dòng)時(shí)允許自行施用本發(fā)明構(gòu)建體的定量大丸劑的一種裝置)而進(jìn)行?？梢允褂酶煞畚霘忪F劑和噴灑氣霧劑。
根據(jù)本發(fā)明的另一種實(shí)施方案，本發(fā)明的構(gòu)建體可以與增加藥物(包括肽藥物)的有效鼻吸收效果的多種藥劑中的任一藥劑一起配制。這些藥劑應(yīng)當(dāng)增加鼻吸收效果，而不對(duì)粘膜造成不可接受的損傷。美國(guó)專利5,693,608、5,977,070和5,908,825及其它美國(guó)專利教授了可以使用的包含吸收增強(qiáng)劑的眾多藥物組合物，并且前述每篇專利的教導(dǎo)及其中援引的全部參考文獻(xiàn)和專利通過(guò)引用的方式并入。
若在水溶液中，本發(fā)明的某些構(gòu)建體可以通過(guò)可以處于任何生理可接受性pH(一般約pH4-約pH7)的鹽水、乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽或其它緩沖劑而適度得到緩沖。也可以使用緩沖劑的組合，如磷酸鹽緩沖鹽水、鹽水和乙酸鹽緩沖劑等。在鹽水的情況下，可以使用0.9％鹽水溶液。在乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽等的情況下，可以使用50mM溶液。除了緩沖劑之外，還可以使用防止或限制細(xì)菌和其它微生物生長(zhǎng)的合適防腐劑。一種可以使用的如此防腐劑是0.05％苯扎氯銨。
也可以并構(gòu)思的是構(gòu)建體可以是干燥顆粒形式。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，顆粒大小為約0.5μm至6.0μm，從而所述顆粒具有足夠質(zhì)量以停留在肺表面上并且不被呼出，然而是足夠小的以至于它們?cè)诘诌_(dá)肺之前不沉積在氣道表面上。多種不同技術(shù)均可以用來(lái)產(chǎn)生干粉微粒，包括但不限于微碾磨法、噴霧干燥法和氣霧劑快速冷凍隨后凍干法。利用微粒子，構(gòu)建體可以沉積至肺深部，因而提供迅速及高效的進(jìn)入血流的吸收。此外，采用這種方法，則不需要滲透增強(qiáng)劑，正如有時(shí)在經(jīng)皮、鼻或口粘膜送遞途徑的情況。多種吸入器均可以使用，包括基于推進(jìn)劑的氣霧劑、霧化吸入器、單次劑量干粉吸入器和多劑量干粉吸入器。當(dāng)前使用的常見裝置包括定量劑量吸入器，其用來(lái)送遞用于治療哮喘、慢性閉塞性肺病等的藥物。優(yōu)選的裝置包括干粉吸入器，其設(shè)計(jì)旨在形成具有總是小于約6.0μm粒度的細(xì)微粉末的云霧或氣霧劑。
可以通過(guò)制造方法控制微粒大小，包括平均大小分布。對(duì)于微碾磨法，碾磨頭的尺寸、轉(zhuǎn)子速度、加工時(shí)間等控制微粒大小。對(duì)于噴霧干燥法，噴嘴尺寸、流速、干燥器熱度等控制微粒大小。對(duì)于通過(guò)氣霧劑快速冷凍隨后凍干法的產(chǎn)生而言，噴嘴尺寸、流速、氣霧化溶液的濃度等控制微粒大小。這些參數(shù)和其它參數(shù)可以用來(lái)控制微粒大小。
本發(fā)明的構(gòu)建體可以通過(guò)注射定時(shí)釋放的可注射制劑而治療性地施用，其中所述的注射一般是深部肌內(nèi)注射，如在臀肌或三角肌中。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的構(gòu)建體與PEG如聚乙二醇3350和任選一種或多種其它賦形劑和防腐劑(包括但不限于賦形劑如鹽、聚山梨醇酯80、調(diào)節(jié)pH的氫氧化鈉或氫氯酸等)一起配制。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的構(gòu)建體與聚(原酸酯)和任選地一種或多種其它賦形劑一起配制，其中所述的聚(原酸酯)可以是在聚合物主鏈中具有任何可變百分含量乳酸的自催化性聚(原酸酯)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)聚合物(PLGA聚合物)，優(yōu)選地使用具有親水端基的PLGA聚合物，如來(lái)自BoehringerIngelheim，Inc.(Ingelheim，Germany)的PLGA RG502H。此類制劑可以例如通過(guò)將合適溶劑(如甲醇)中的本發(fā)明構(gòu)建體與PLGA的二氯甲烷溶液合并，并在反應(yīng)器中于適宜混合條件下向其添加聚乙烯醇的連續(xù)相溶液而產(chǎn)生。通常，眾多可注射及生物可降解的聚合物均可以在定時(shí)釋放的可注射制劑中使用，所述的聚合物優(yōu)選地也是粘性聚合物。美國(guó)專利4,938,763、6,432,438和6,673,767的教導(dǎo)及其中公開的生物可降解聚合物及配制方法通過(guò)引用的方式并入本文。制劑可以是這樣的，以至需要基于周、月或其它周期基礎(chǔ)提供注射，這取決于構(gòu)建體的濃度和量、聚合物的生物降解速率和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素。
施用途徑。如果通過(guò)注射施用，則注射可以是靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或本領(lǐng)域已知的其它方式。本發(fā)明的構(gòu)建體可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法配制為，包括但不限于以下的制劑，如片劑、膠囊劑、小膠囊、混懸劑、粉劑、凍干制劑、栓劑、滴眼劑、皮膚貼劑、口服可溶性制劑、噴霧劑、氣霧劑等，并可以與緩沖劑、粘合劑、賦形劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑和本領(lǐng)域已知的其它添加劑混合及配制。通常，可以使用經(jīng)表皮細(xì)胞層導(dǎo)入本發(fā)明構(gòu)建體的任何施用途徑。施用方法可以因此包括經(jīng)粘膜施用、口頰施用、口服施用、皮膚施用、吸入施用、肺施用、鼻施用、尿道施用、陰道施用等。
在一個(gè)方面，本發(fā)明的構(gòu)建體通過(guò)定時(shí)釋放的可注射制劑(如與PEG、聚(原酸酯)或PLGA聚合物一起配制的本發(fā)明構(gòu)建體)而施用。在另一方面，本發(fā)明的構(gòu)建體通過(guò)提供連續(xù)或間歇式皮下送遞的自動(dòng)送遞裝置而施用。任何前述方法和制劑特別適用于治療慢性病癥或綜合征，包括慢性充血性心力衰竭并且特別是慢性代償失調(diào)性充血性心力衰竭。
在一個(gè)方面，本發(fā)明的構(gòu)建體均可以通過(guò)皮下施用(包括在美國(guó)專利6,586,396中公開的全部方法)。在另一方面，患者，尤其相對(duì)得到補(bǔ)償或作為門診患者環(huán)境下充血性心力衰竭患者的患者，可以通過(guò)如美國(guó)專利申請(qǐng)公開2004/0077537和國(guó)際專利申請(qǐng)公開WO 2003/079979中公開的方法、并以其中公開的劑量而施用本發(fā)明的構(gòu)建體。在另一方面，患者可以通過(guò)如美國(guó)專利申請(qǐng)公開2005/0113286中公開的方法施用本發(fā)明的構(gòu)建體。在又一方面，可以通過(guò)如美國(guó)專利申請(qǐng)公開2006/0019890中公開的方法為心臟重塑而治療已經(jīng)遭受心肌損傷的患者。
本發(fā)明的構(gòu)建體也可以經(jīng)皮施用，包括通過(guò)如美國(guó)專利申請(qǐng)公開2006/0034903中公開的裝置和方法的送遞系統(tǒng)。類似地，在其中公開的水凝膠制劑和固態(tài)制劑可以改進(jìn)以與本發(fā)明的構(gòu)建體一起使用。
治療有效量。通常，施用至患者的本發(fā)明構(gòu)建體的實(shí)際量將在相當(dāng)寬泛的范圍內(nèi)變化，這取決于施用模式、使用的制劑和想要的反應(yīng)。通過(guò)前述任何方法或本領(lǐng)域已知的任何其它方法而施用治療用劑量，即足以產(chǎn)生想要的治療作用的量。因此，治療有效量包括足以誘導(dǎo)預(yù)期效果(具體包括抗高血壓、抗心血管效果、抗腎臟效果和/或抗內(nèi)分泌效果)的本發(fā)明構(gòu)建體或藥物組合物的量。在一個(gè)方面，治療有效量是產(chǎn)生想要的鈉尿排泄、利尿和/或血管舒張的量。
通常，本發(fā)明的構(gòu)建體具有高度活性。例如，構(gòu)建體可以按照約0.001、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10或100μg/kg體重施用，這取決于所選的具體構(gòu)建體、想要的治療反應(yīng)、施用途徑、制劑和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素。
聯(lián)合療法 也可以和構(gòu)思根據(jù)本發(fā)明數(shù)個(gè)實(shí)施方案的構(gòu)建體與其它藥物或藥劑組合地使用，尤其在充血性心力衰竭的治療中。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供用于治療充血性心力衰竭的方法。所述方法包括向患有充血性心力衰竭的患者施用與治療有效量的另一種化合物組合的治療有效量的如本文中所公開的構(gòu)建體，其中所述的化合物用于治療充血性心力衰竭，或備選地用于延長(zhǎng)本發(fā)明構(gòu)建體在患者中的生物利用度。在一個(gè)方面，可以向患者施用與利尿藥組合的本發(fā)明構(gòu)建體，如借助美國(guó)專利申請(qǐng)公開2004/0063630中公開的方法和利尿藥。可以組合使用的利尿藥包括噻嗪類、髓袢利尿藥和留鉀利尿藥，包括而不限于下列利尿藥如氫氯噻嗪

氯噻酮、呋塞米

螺內(nèi)酯

和氨苯蝶啶(triamterine)。
在本發(fā)明的另一方面，通過(guò)施用與治療有效量的抗高血壓藥而非利尿藥組合的治療有效量的如本文中所公開構(gòu)建體，提供用于治療充血性心力衰竭的方法。此類抗高血壓藥一般包括鈣通道阻滯劑(包括二氫吡啶類和非二氫吡啶類)、抗交感神經(jīng)藥、非特異性腎上腺素能阻滯劑、α-腎上腺素能拮抗劑(包括非選擇性和選擇性α1-阻滯藥)、β-阻滯劑(包括非選擇性以及選擇性阻滯劑和具有內(nèi)在擬交感活性的那些阻滯劑)、血管擴(kuò)張劑(用于治療頑固性高血壓和急癥高血壓)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制物和血管緊張素II拮抗劑?？梢越M合使用的抗高血壓藥包括混合的α和β拮抗劑如拉貝洛爾

血管擴(kuò)張劑如肼屈嗪

米諾地爾

硝普鹽

或二氮嗪(Hyperstat

)；鈣阻滯劑如硝苯地平

地爾硫卓

或維拉帕米

交感神經(jīng)阻滯藥如可樂定

甲基多巴

利血平

或胍乙啶

ACE抑制劑如卡托普利

恩納普利

或賴諾普利

α-腎上腺素能拮抗劑如酚妥拉明

或哌唑嗪

血管緊張素II拮抗劑如氯沙坦

或β-腎上腺素能拮抗劑如普萘洛爾

納多洛爾

甲氧乙心安

或吲哚洛爾。
其它說(shuō)明 盡管本發(fā)明構(gòu)建體的主要用途是治療和改善充血性心力衰竭、急性腎衰竭及腎高血壓的癥狀，然而本發(fā)明的構(gòu)建體可以用于促鈉尿排泄性化合物、利尿化合物和/或血管擴(kuò)張化合物提供治療益處的任何治療方案或形式中。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明的構(gòu)建體可以作為添加劑用于腹膜透析溶液，如美國(guó)專利5,965,533中公開。在另一方面，本發(fā)明的構(gòu)建體可以用于眼科應(yīng)用，如國(guó)際專利申請(qǐng)WO 00/18422中公開。
氨基酸替代物的合成方法 合成本發(fā)明氨基酸替代物的以下方法實(shí)例意圖是示例性的，并將理解本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)所述方法進(jìn)行變化，并且這樣的意圖包括在本文中。
合成模擬無(wú)官能化R側(cè)鏈的氨基酸的哌嗪酮支架(方法A和B) 構(gòu)建體通過(guò)如方法A和B中描述的多種方法制備。
方法A二肽(3)通過(guò)混合酐法，使用Boc-絲氨酸(OBn)-OH(1)和α-氨基酯(2)形成。該二肽以高產(chǎn)率獲得并且通常無(wú)需純化。使用乙硼烷-四氫呋喃還原甲基酯和酰胺基團(tuán)，其中保護(hù)仲胺以產(chǎn)生二-Boc保護(hù)的氨基醇中間體(4)。用重鉻酸吡啶鎓(PDC)氧化該醇并伴隨環(huán)化而在一個(gè)步驟中產(chǎn)生哌嗪-2-酮(5)。通過(guò)氫化除去二芐醚，隨后交換保護(hù)基團(tuán)，產(chǎn)生Fmoc保護(hù)的哌嗪-2-酮(6)。最后，將伯醇通過(guò)眾多不同方法(PDC、Jones氧化法、氯化釕-高碘酸鈉法、2，2，6，6-四甲基-1-哌啶氧自由基(TEMPO)氧化法)中的任一種氧化成酸以產(chǎn)生終產(chǎn)物(7)。
方法A
2-(3-芐氧基-2-叔丁氧羰基氨基-丙酰氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(3)的合成向保持在-20℃于氮?dú)庀碌脑?0mL無(wú)水四氫呋喃中的10mmol Boc絲氨酸二芐醚(1)溶液添加22mmol三乙胺，隨后緩慢添加11.4mmol氯甲酸異丁酯。白色固體析出。漿液攪拌15分鐘，并且隨后以一個(gè)份額添加11.1mmolα-氨基酯(2)。漿液在-20℃攪拌30分鐘，并隨后升溫至室溫，攪拌2小時(shí)，并隨后濃縮至干燥。混合物隨后在50mL乙酸乙酯/30mL1N氫氯酸溶液之間分配。使各層分離，并且有機(jī)層用1×20mL 1N氫氯酸和1×20mL飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮?；衔?3)通常以高于90％的產(chǎn)率獲得，并且無(wú)需純化。

雙-Boc-2-取代-(2-氨基-3-芐氧基-丙基-氨基)-乙醇(4)的合成向保持在室溫于氮?dú)庀碌脑?0mL無(wú)水四氫呋喃中的35mmol(3)溶液添加在四氫呋喃中的200mL 1N乙硼烷溶液。溶液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，并且隨后緩慢傾倒在200mL1N氫氯酸的冰冷溶液上。雙相溶液隨后用固體氫氧化鈉中和。添加140mL飽和碳酸氫鈉溶液，隨后添加70mmol二-叔丁基-二碳酸酯，并且將混合物在室溫?cái)嚢?日，用200mL乙酸乙酯稀釋并使各層分離。有機(jī)層經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。產(chǎn)物(4)通過(guò)硅膠柱層析法純化。

1，4-二-Boc-6-芐氧基甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(5)的合成70mmol(4)和在300mL無(wú)水二甲基甲酰胺中的400mmol重鉻酸吡啶鎓的溶液在48℃于氮?dú)庀聰嚢?小時(shí)，冷卻至室溫，傾倒至1500mL水中，并用4×500mL乙醚提取。將醚層合并、經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。產(chǎn)物(5)通過(guò)硅膠柱層析法純化。

4-Fmoc-6-羥甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(6)的合成19mmol(5)和在200mL乙醇中的2g10％鈀碳的混懸液在室溫及常壓下氫化過(guò)夜?；鞈乙航?jīng)硅藻土過(guò)濾并濃縮。殘余物重溶解在二氯甲烷中的40mL50％三氟乙酸中。溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，并且隨后濃縮。殘余物重溶解在60mL四氫呋喃/40mL水中，并用固體碳酸氫鈉中和，隨后添加40mmol固體碳酸氫鈉以及20mmol芴甲氧羰酰氯?；旌衔镫S后在室溫?cái)嚢?小時(shí)，用300mL乙酸乙酯稀釋，并使各層分離。有機(jī)層經(jīng)硫酸鎂干燥、濃縮并通過(guò)硅膠柱層析法純化。

4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-羧酸(7)的合成通過(guò)幾種方法制備化合物(7)。
(a)向冷卻至0℃的在180mL乙腈中的10mmol(6)、180mL四氯化碳和240mL水的雙相溶液添加112mmol固體高碘酸鈉，隨后添加340mg氯化釕。使反應(yīng)升溫至室溫，攪拌2小時(shí)并且隨后經(jīng)硅藻土過(guò)濾。使各層分離，并且水層用2×75mL乙酸乙酯再提取。將有機(jī)層合并，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。
(b)在48℃于氮?dú)庀聰嚢柙?0mL無(wú)水二甲基甲酰胺中的12mmol(6)和59mmol PDC的溶液約5小時(shí)，冷卻至室溫并且傾倒在600mL水上，并用3×200mL二氯甲烷提取。將有機(jī)層合并，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。
(c)向在室溫保持的在350mL丙酮中的17mmol(6)的溶液添加(從8.0g鉻酸、17.4mL水和6.9mL濃硫酸中制備的)25mL Jones試劑?；旌衔飻嚢?小時(shí)，添加150mL異丙醇并將混合物經(jīng)硅藻土過(guò)濾。硅藻土用乙酸乙酯洗滌。將有機(jī)層合并及濃縮。殘余物溶解在250mL乙酸乙酯中并用2×50mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。
(d)向在室溫保持的在810mL乙腈中的81mmol醇(6)的溶液添加磷酸鹽緩沖液(用7.2g磷酸二氫鈉和14.3g磷酸氫二鈉在295mL水中制備)，隨后添加3.3g(20.7mmol)TEMPO和18.6g(164.4mmol)亞氯酸鈉，并將雙相溶液置于維持在43℃的油浴中，并且隨后緩慢添加(通過(guò)混合19.3mL10-13％次氯酸鈉溶液與24mL水所制備的)43.3mL(25.9mmol)次氯酸鈉溶液。反應(yīng)在43℃攪拌4小時(shí)。溶液冷卻至室溫，并添加200mL 10％亞硫酸氫鈉溶液，攪拌10分鐘，用500mL乙酸乙酯稀釋，并使各層分離。有機(jī)層用1×100mL鹽水、1×160mL 1N氫氯酸溶液洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，并濃縮。
產(chǎn)物(7)通過(guò)硅膠柱層析法純化。

方法B使用TEMPO/異氰尿酸試劑，將如方法A中所述而制備的中間體雙-Boc-2-取代-(2-氨基-3-芐氧基-丙基-氨基)-乙醇(4)氧化成酸，并且隨后用碘甲烷酯化以產(chǎn)生完全受保護(hù)的還原二肽類似物(8)。Boc基團(tuán)和二芐醚的脫保護(hù)產(chǎn)生3-取代的5-羥甲基-哌嗪-2-酮，其被保護(hù)為Fmoc衍生物以產(chǎn)生(6)，后者被氧化成如方法A中所述的終產(chǎn)物。
方法B
二-Boc-(2-氨基-3-芐氧基-丙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(8)的合成向保持在0℃的在680mL丙酮中的76mmol(4)和210mL飽和碳酸氫鈉溶液的混懸液添加21mmol固體溴化鈉和2.9mmol TEMPO，隨后緩慢添加156mmol三氯異氰尿酸。反應(yīng)在0℃攪拌30分鐘，并且隨后在室溫過(guò)夜，用1N氫氯酸溶液酸化，并用2×300mL乙酸乙酯萃取。有機(jī)層用3 x 50mL的1N氫氯酸洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。殘余物重溶解在40mL無(wú)水二甲基甲酰胺和95mmol固體碳酸氫鈉中，并添加112mmol碘甲烷，并將混合物在室溫于氮?dú)庀聰嚢柚敝罤PLC顯示反應(yīng)結(jié)束；溶液隨后用200mL乙醚稀釋，并用2×100mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。產(chǎn)物(8)通過(guò)硅膠柱層析法純化。

4-Fmoc-6-羥甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(6)的合成將二氯甲烷中的40mL50％三氟乙酸中36mmol(8)的溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，并且隨后傾倒在200mL飽和碳酸氫鈉溶液內(nèi)。使各層分離，并且將有機(jī)層濃縮。殘余物重溶解在100mL乙酸乙酯中，并用2×50mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。殘余物溶解在100mL乙醇中，并且添加5g的10％鈀碳和35mL的1N氫氯酸溶液，并將混合物在室溫及常壓下氫化直至HPLC顯示反應(yīng)結(jié)束；溶液隨后經(jīng)硅藻土過(guò)濾并濃縮。殘余物重溶解在80mL乙酸乙酯中，添加在30mL水中的70mmol碳酸氫鈉，并且混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。除去乙酸乙酯并添加100mL四氫呋喃，隨后添加178mmol固體碳酸氫鈉和43mmol芴甲氧羰酰氯，并且將混合物攪拌直至HPLC顯示反應(yīng)結(jié)束，用300mL乙酸乙酯稀釋，并使各層分離。有機(jī)層用2×50mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。產(chǎn)物(6)通過(guò)硅膠柱層析法純化。
4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-羧酸(7)的合成化合物(7)如方法A中所述那樣制備。
用于制備適用于具有或沒有官能化R側(cè)鏈的化合物的哌嗪酮支架的一般常見合成方案(方法C、E、F) 方法C(2-Fmoc-氨基-3-R′-O-丙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(10)通過(guò)使用氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作為還原劑，以α-氨基酯(2)使Fmoc O-保護(hù)的絲氨醛(9)還原氨化而制備。還原氨化所需要的Fmoc O-保護(hù)的絲氨醛(9)根據(jù)方法D通過(guò)用二-異丁基氫化鋁還原酯(12)，通過(guò)用Dess-Martin高價(jià)碘化合物(periodinane)氧化Fmoc O-保護(hù)的絲氨醇(13)或通過(guò)用氫化鋰鋁還原Fmoc O-保護(hù)的絲氨酸Weinreb酰胺(14)而制備。用于制備Fmoc O-保護(hù)的絲氨醛(9)的優(yōu)選方法是Weinreb酰胺類似物還原法。(2-Fmoc-氨基-3-R′-O-丙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(10)隨后進(jìn)行N和O脫保護(hù)、環(huán)化和Fmoc保護(hù)，以產(chǎn)生3-取代的6-羥甲基-哌嗪-2-酮(6)，后者隨后氧化成如方法A中所述的終產(chǎn)物。
合成中所用在Fmoc-O-保護(hù)的絲氨醛(9)的羥基上的保護(hù)基團(tuán)(R′)取決于氨基酯的側(cè)鏈R的性質(zhì)。當(dāng)R不含官能團(tuán)時(shí)，將Fmoc絲氨酸的側(cè)鏈保護(hù)為tBu醚。當(dāng)R含有官能團(tuán)時(shí)，將Fmoc絲氨酸的側(cè)鏈保護(hù)為三苯甲基醚。
方法C
方法D
方法D多種Fmoc-O-保護(hù)的絲氨醛(9)的合成。Fmoc-O-R′絲氨酸甲基酯(12)的合成將保持在氮?dú)庀碌脑?0mL無(wú)水二甲基甲酰胺中的80mmol Fmoc O-R′絲氨酸(11)、10.0g(120mmol)固體碳酸氫鈉和10.0mL(160mmol)碘甲烷的輕度混懸液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。反應(yīng)混合物隨后傾倒在500mL水上，并濾出固體。將該固體重溶解在800mL乙酸乙酯中，并用1×200mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。無(wú)需純化. Fmoc-O-R′絲氨醇(13)的合成向保持在-20℃于氮?dú)庀碌脑?0mL無(wú)水四氫呋喃中10.0mmol Fmoc O-R′絲氨酸(11)的溶液添加1.77mL(12.7mmol)三乙胺，隨后緩慢添加1.57mL(12.0mmol)氯甲酸異丁酯。混合物攪拌30分鐘，并且隨后緩慢地傾倒在10mL水中的3.77g(99.6mmol)硼氫化鈉的冰冷溶液上，維持溫度低于5℃。反應(yīng)在0℃攪拌15分鐘，并且隨后用1N氫氯酸溶液猝滅。反應(yīng)混合物用100mL乙酸乙酯稀釋，并使各層分離。有機(jī)層用2×25mL 1N氫氯酸溶液，2×25mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。化合物通過(guò)硅膠柱層析法純化。
Fmoc-O-R′絲氨酸Weinreb酰胺(14)的合成80mL無(wú)水二氯甲烷中的20.2mmol Fmoc O-R′絲氨酸(11)、6.98g(21.6mmol)2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和2.5mL(22.7mmol)N-甲基-嗎啉的混懸液在室溫于氮?dú)庀聰嚢?0分鐘，并且隨后添加3.02g(31mmol)N，O-二-甲基-羥胺鹽酸鹽和3.3mL(30mmol)N-甲基-嗎啉，并且該混懸液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。將形成的溶液隨后濃縮至干燥，在200mL乙酸乙酯與100mL水之間再分配，用2×40mL 1N氫氯酸溶液并且隨后用2×40mL飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。無(wú)需純化。
從酯(12)合成Fmoc-O-R′絲氨醛(9)向保持在-78℃于氮?dú)庀碌脑?mL四氫呋喃中的3.5mmol(12)的溶液緩慢添加10mL 1N二異丁基氫化鋁(DIBAL)溶液，攪拌15分鐘并通過(guò)緩慢添加酒石酸鉀鈉飽和溶液被猝滅。將反應(yīng)升溫至室溫，用50mL乙酸乙酯稀釋，并且添加50mL酒石酸鉀鈉飽和溶液。使各層分離，并且水層用1×50mL乙酸乙酯再萃取。將有機(jī)層合并，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。化合物(9)用于以下步驟中，無(wú)需進(jìn)一步純化。
從醇(13)合成Fmoc-O-R′絲氨醛(9)向保持在室溫于氮?dú)庀碌脑?00mL無(wú)水二氯甲烷中的80mmol Fmoc-O-R’絲氨醇(13)的溶液添加88mmolDess-Martin高價(jià)碘化合物，并且反應(yīng)攪拌2.5小時(shí)并通過(guò)添加400mL 10％硫代硫酸鈉水溶液被猝滅。使各層分離，并且將有機(jī)層濃縮，用300mL乙醚稀釋并用含有10％硫代硫酸鈉的飽和碳酸氫鹽水溶液洗滌三次，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。
從Weinreb酰胺(14)合成Fmoc-O-R′絲氨醛(9)向冷卻至-78℃于氮?dú)庀碌脑?0mL無(wú)水四氫呋喃中的8.8g(20.2mmol)粗制Fmoc-O-R′絲氨酸Weinreb酰胺中間體(14)的溶液添加四氫呋喃中的30mL 1N氫化鋰鋁溶液。將溶液攪拌15分鐘并且隨后通過(guò)緩慢添加30mL 1.4N硫酸氫鉀溶液被猝滅。升溫至室溫后，濾除固體并濃縮濾液至干燥。殘余物在50mL乙酸乙酯與25mL 1N氫氯酸溶液之間再分配。使各層分離，并且將有機(jī)層經(jīng)硫酸鎂干燥、過(guò)濾并濃縮。
(2-Fmoc-氨基-3-R′-O-丙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(10)的合成化合物(10)使用氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作為還原劑，通過(guò)還原氨化法制備。
氰基硼氫化鈉法向保持在室溫于氮?dú)庀碌脑?0mL甲醇中的8.5mmol(2)氫氯酸鹽的溶液添加2.3mmol固體氫氧化鉀，并將混合物攪拌25分鐘。將10mL甲醇中的Fmoc-O-R′絲氨醛(9)溶液添加至上述混懸液中，并且將反應(yīng)混合物攪拌1小時(shí)。緩慢添加在四氫呋喃中的8.5mL1N氰基硼氫化鈉溶液，并將反應(yīng)攪拌另外1小時(shí)，過(guò)濾并濃縮。殘余物在水與乙酸乙酯之間分配，并且有機(jī)層用1×20mL飽和碳酸氫鈉洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，并濃縮。
三乙酰氧基硼氫化鈉法21mmol(2)氫氯酸鹽與在50mL無(wú)水四氫呋喃中的2.9mL(21mmol)三乙胺的混懸液在室溫?cái)嚢?5分鐘，并且隨后添加在30mL四氫呋喃中的約20mmol粗制Fmoc-(O-R′)-絲氨醛(9)的溶液，隨后添加1.7g的4A粉末狀分子篩，并將此混懸液攪拌另外2小時(shí)。添加6.4g(30mmol)固體三乙酰氧基硼氫化鈉并將此混懸液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜?；鞈乙河眉状枷♂?，用分子篩過(guò)濾，并濃縮濾液。殘余物在100mL乙酸乙酯與50mL水之間分配。有機(jī)層經(jīng)硫酸鈉干燥、過(guò)濾并濃縮。
化合物(10)通過(guò)硅膠柱層析法純化。


4-Fmoc-6-羥甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(6)的合成為制備化合物(6)，需要三個(gè)步驟(a)伴隨環(huán)化的Fmoc脫保護(hù)、(b)Fmoc保護(hù)和(c)羥基脫保護(hù)。
除去Fmoc基團(tuán)及環(huán)化將乙酸乙酯溶液中30mL 30％二乙胺中的10mmol環(huán)狀化合物的溶液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜并隨后濃縮至干燥。
(a)Fmoc保護(hù)向在20mL四氫呋喃和10mL水中的10mmol化合物的雙相溶液添加2.52g(30mmol)固體碳酸氫鈉，隨后添加3.36g(13mmol)Fmoc-Cl?；旌衔飻嚢?小時(shí)，用乙酸乙酯稀釋，使各層分離，并且有機(jī)層用水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。
(b)羥基脫保護(hù)對(duì)于含有tBu醚保護(hù)基團(tuán)的化合物化合物用在二氯甲烷中的90％三氟乙酸的溶液脫保護(hù)1-2小時(shí)，并隨后濃縮至干燥。殘余物溶解在乙酸乙酯中并用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并隨后濃縮。對(duì)于含有Trt醚保護(hù)基團(tuán)的化合物化合物通過(guò)添加在含有2-10％三異丙基硅烷的二氯甲烷中的1-10％三氟乙酸的溶液加以脫保護(hù)。反應(yīng)是瞬時(shí)作用的。溶液隨后通過(guò)傾入飽和碳酸氫鈉溶液進(jìn)行中和。使各層分離，經(jīng)硫酸鈉干燥，并濃縮。
化合物(6)通過(guò)硅膠柱層析法純化。


4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-羧酸(7)的合成化合物(7)如方法A中所述那樣制備。化合物(7)通過(guò)硅膠柱層析法純化。


方法E(2-Fmoc-氨基-3-羥丙基-Cbz-氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(15)通過(guò)使用氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作為還原劑，以α氨基酯(2)使Fmoc絲氨醛(OR′)(9)還原氨化而制備。仲胺用氯甲酸芐酯保護(hù)，并且隨后羥基用三氟乙酸溶液脫保護(hù)?；衔?15)隨后進(jìn)行Fmoc脫保護(hù)。氨基酯中間體立即環(huán)化以形成4-Cbz-3-取代的6-羥甲基-哌嗪-2-酮(16)。Fmoc3-取代的6-羥甲基-哌嗪-2-酮(6)通過(guò)保護(hù)基團(tuán)交換而制備，并且隨后被氧化成如方法A中所述的預(yù)期產(chǎn)物(7)。
方法E

(2-Fmoc-氨基-3-羥丙基-Cbz-氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(15)的合成67mmol氫氯酸氨基酯(2)和在80mL甲醇中的20.9mmol固體氫氧化鉀的混懸液在室溫?cái)嚢?5分鐘，并且隨后添加至在250mL甲醇中的(9)的混懸液內(nèi)。反應(yīng)混合物攪拌1.5小時(shí)，隨后緩慢添加在四氫呋喃中的70mL1N氰基硼氫化鈉的溶液。反應(yīng)攪拌過(guò)夜并且隨后濃縮。殘余物在300mL四氫呋喃與50mL 1N氫氯酸溶液之間分配。使各層分離，并且有機(jī)層用在50mL水中的239mmol碳酸氫鈉的溶液中和，并且隨后緩慢添加66mmol氯甲酸芐酯，并且將反應(yīng)攪拌3小時(shí)，用200mL乙酸乙酯稀釋并使各層分離。有機(jī)層經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。殘余物溶解在二氯甲烷中的三氟乙酸的溶液中并在室溫?cái)嚢?小時(shí)。將溶液傾倒在200mL飽和碳酸氫鈉溶液上。使各層分離，并且有機(jī)層經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。化合物(15)通過(guò)硅膠柱層析法純化。

4-Cbz-6-羥甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(16)的合成在乙酸乙酯中的100mL30％二乙胺中的24mmol(15)的溶液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，并隨后濃縮至干燥。化合物通過(guò)硅膠柱層析法純化。

4-Fmoc-6-羥甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(6)的合成將50mL乙醇中的15mmol(16)和1.8g10％鈀碳的混懸液在室溫及常壓下氫化，直至HPLC顯示反應(yīng)結(jié)束。混合物隨后經(jīng)硅藻土過(guò)濾，濃縮并且殘余物溶解在35mL四氫呋喃和10mL水中，并且隨后添加62mmol固體碳酸氫鈉，隨后添加16mmol Fmoc-Cl，并且將混合物攪拌3小時(shí)，用100mL乙酸乙酯和10mL水稀釋。使各層分離，并且將有機(jī)層經(jīng)硫酸鎂干燥及濃縮?；衔?6)通過(guò)硅膠柱層析法純化。

4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-羧酸(7)的合成化合物(7)如方法A中所述那樣制備并通過(guò)硅膠柱層析法純化。

方法F(2-Cbz-氨基-3-芐氧基-丙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(20)通過(guò)使用氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作為還原劑，以α-氨基酯(2)使Cbz絲氨醛(OBn)(19)還原氨化而制備。對(duì)于還原氨化所需要的Cbz O-芐基絲氨醛(19)通過(guò)用Dess-Martin高價(jià)碘化合物氧化Cbz絲氨醇(OBn)(18)而制備。(20)的氫化及隨后環(huán)化產(chǎn)生了3-取代的6-羥甲基-哌嗪-2-酮，后者隨后經(jīng)Fmoc保護(hù)成為4-Fmoc-3-取代的6-羥甲基-哌嗪-2-酮(6)。終產(chǎn)物(7)如方法A中所述而獲得。
方法F
Cbz-絲氨醇(OBn)(18)的合成化合物(18)如對(duì)化合物(13)所述那樣制備?；衔?18)在硅膠柱層析純化后以79％產(chǎn)率獲得。1H NMR δ(CDCl3)3.57-3.74(兩個(gè)m，3H，CHN，和CH2O)，3.76-3.96(兩個(gè)m，2H，CH2O)，4.50(s，2H，CH2O)，5.10(s，2H，CH2O)，5.40-5.50((br.d，1H，NH)，7.22-7.38(m，10H，Ph)；HPLC tR＝5.33min，(M++Na+)＝337.64. Cbz絲氨醛(OBn)(19)的合成化合物(19)如對(duì)化合物(9)所述那樣制備。向保持在室溫于氮?dú)庀碌脑?00mL無(wú)水二氯甲烷中的80mmol Cbz-O-Bn絲氨醇(18)的溶液添加88mmol Dess-Martin高價(jià)碘化合物，并且反應(yīng)攪拌2.5小時(shí)，并隨后通過(guò)添加400mL 10％硫代硫酸鈉水溶液被猝滅。使各層分離，并且將有機(jī)層濃縮，用300mL乙稀釋并用含有10％硫代硫酸鈉的飽和碳酸氫鹽水溶液洗滌三次，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮?；衔?19)以99％粗產(chǎn)率獲得并且無(wú)需進(jìn)一步純化即可使用。1H NMR δ(CDCl3)3.69-3.78(dd，1H，CH2O)，3.99-4.06(dd，1H，CH2O)，4.37-4.46(m，1H，CHN)，4.47-4.52(d，2H，CH2O)，5.14(s，2H，CH2O)，5.65-5.75((間斷的d，1H，NH)，7.14-7.48(一連串m，9H，Ph)，7.98-8.08(dd，1H，Ph)，9.63(s，1H，CHO)。
(2-Cbz-氨基-3-芐氧基-丙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(20)的合成化合物(20)如對(duì)化合物(10)所述那樣制備，不過(guò)使用Cbz絲氨醛(19)作為醛。化合物(20)通過(guò)硅膠柱層析法純化。

4-Fmoc-6-羥甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(6)的合成將160mL乙醇中的38mmol(20)、38mL 1N氫氯酸和20g 10％鈀碳的混懸液在室溫及常壓下氫化直至HPLC顯示反應(yīng)結(jié)束?；旌衔镫S后經(jīng)硅藻土過(guò)濾并濃縮至干燥。殘余物用75mL四氫呋喃稀釋并用飽和碳酸氫鈉溶液中和。添加106mmol固體碳酸氫鈉和53mmol芴甲氧羰酰氯，并且反應(yīng)在室溫?cái)嚢柚敝罤PLC顯示反應(yīng)結(jié)束，用300mL乙酸乙酯和300mL鹽水稀釋。使各層分離，并且有機(jī)層用鹽水洗滌兩次，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。產(chǎn)物(6)通過(guò)硅膠柱層析法純化。
4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-羧酸(7)的合成化合物(7)如方法A中所述那樣制備。
模擬無(wú)官能化側(cè)鏈的氨基酸的2，2-雙取代哌嗪酮支架的合成(方法G) 使用方法G實(shí)施模擬無(wú)官能化側(cè)鏈的氨基酸的4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-甲基-2-羧酸支架的合成。2-Boc-氨基-3-甲氧羰基-1-取代-甲基氨基-2-甲基-丙酸叔丁基酯(23)通過(guò)使用氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作為還原劑，以α-氨基酯(2)使2-Boc-氨基-2-甲基-3-氧代-丙酸甲基酯(22)還原氨化而制備。對(duì)于還原氨化所需要的化合物(22)通過(guò)用Dess-Martin高價(jià)碘化合物氧化α-甲基-Boc絲氨酸叔丁基酯(21)而獲得。用二噁烷中的2N氯化氫除去(23)的Boc基團(tuán)，并且將氨基酯環(huán)化成非保護(hù)的5-取代-6-氧代-哌嗪-2-甲基-2-羧酸叔丁基酯(24)，后者用芴甲氧羰酰氯保護(hù)以產(chǎn)生4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-甲基-2-羧酸叔丁基酯，其用三氟乙酸脫保護(hù)以產(chǎn)生終產(chǎn)物(25)。
方法G
2-Boc-氨基-2-甲基-3-氧代-丙酸叔丁基酯(22)的合成Boc α-甲基絲氨酸叔丁基酯(21)的氧化使用如前所述的Dess-Martin高價(jià)碘化合物進(jìn)行，以96％粗產(chǎn)率產(chǎn)生目的產(chǎn)物(22)?；衔镉糜谝韵虏襟E中，無(wú)需進(jìn)一步純化。1H NMR δ(CDCl3)1.44(s，18H，tBu)，1.46(s，3H，CH3)，5.63-5.70(br.s，1H，NH)，9.5(s，1H，CHO) 2-Boc-氨基-3-甲氧羰基-1-取代-甲基氨基-2-甲基-丙酸叔丁基酯(23)的合成使用與對(duì)化合物(10)所述方法相似的方法制備化合物(23)，不過(guò)使用化合物(22)作為醛。化合物(23)通過(guò)硅膠柱層析法純化。

2-甲基-6-氧代-5-取代-哌嗪-2-羧酸(25)的合成8mL二噁烷中的2N氯化氫的4mmol(23)的溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，并隨后濃縮至干燥。殘余物在20mL四氫呋喃中懸浮，用10mmol三乙胺中和，并在60℃攪拌2日。隨后將殘余物濃縮至干燥，在20mL四氫呋喃和10mL水中重懸，添加固體碳酸氫鈉以調(diào)節(jié)pH至堿性，隨后添加5.6mmol固體芴甲氧羰酰氯，并將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，用1N氫氯酸溶液調(diào)節(jié)pH，用100mL乙酸乙酯稀釋，并使各層分離。有機(jī)層用2×100mL鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。殘余物溶解在二氯甲烷中的10mL 50％三氟乙酸中，并且將溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)。濃縮溶劑并且產(chǎn)物(25)通過(guò)硅膠柱層析法純化。

模擬具有官能化側(cè)鏈的氨基酸的2，2-雙取代哌嗪酮支架的合成(方法H) 使用方法H實(shí)施模擬具有官能化側(cè)鏈的氨基酸的4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-甲基-2-羧酸支架的合成。2-烯丙氧羰基-氨基-3-甲氧羰基-1-取代-甲基氨基-2-甲基-丙酸甲基酯(30)通過(guò)使用氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作為還原劑，以α-氨基烯丙基酯(29)使2-烯丙氧羰基-氨基-2-甲基-3-氧代-丙酸甲基酯(28)還原氨化，隨后用氯甲酸芐酯保護(hù)仲胺而制備。對(duì)于還原氨化所需要的化合物(28)通過(guò)用Dess-Martin高價(jià)碘化合物氧化(27)而獲得。類似物(30)的烯丙基酯和烯丙氧羰基使用四(三苯膦)鈀(0)予以除去，并且氨基酸通過(guò)與肽偶聯(lián)試劑反應(yīng)被環(huán)化以產(chǎn)生5-取代-6-氧代-哌嗪-2-甲基-2-羧酸甲基酯(31)。4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-甲基-2-羧酸(25)通過(guò)使甲基酯皂化，隨后交換保護(hù)基團(tuán)而獲得。
方法H
烯丙氧羰基α-甲基絲氨酸甲基酯(27)的合成將保持于氮?dú)庀碌脑?mL無(wú)水二甲基甲酰胺中的8mmol Boc α-甲基絲氨酸(26)、1.0g(12mmol)固體碳酸氫鈉和1.0mL(16mmol)碘甲烷的溶液攪拌過(guò)夜。反應(yīng)混合物隨后傾倒在50mL水上并用50mL二乙醚萃取，并用1×20mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。殘余物溶解在20mL二氯甲烷中的90％三氟乙酸中，并且溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，并隨后濃縮至干燥。殘余物溶解在35mL四氫呋喃和10mL水中，隨后添加30mmol固體碳酸氫鈉，并且緩慢添加12mmol氯甲酸烯丙酯。混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)，用50mL乙酸乙酯稀釋，并使各層分離。有機(jī)層隨后用1×10mL飽和碳酸氫鈉和1×10ml的1N氫氯酸和1×10mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮?；衔?27)通過(guò)硅膠柱層析法純化。
2-烯丙氧羰基-氨基-2-甲基-3-氧代-丙酸甲基酯(28)的合成用如上所述的Dess-Martin高價(jià)碘化合物進(jìn)行烯丙氧羰基α-甲基絲氨酸甲基酯(27)的氧化以產(chǎn)生目的產(chǎn)物(28)。
2-烯丙氧羰基-氨基-3-甲氧羰基-1-取代-甲基-Cbz-氨基-2-甲基-丙酸烯丙基酯(30)的合成化合物(30)使用與對(duì)化合物(15)所述方法相似的方法而制備，不過(guò)使用化合物(28)作為醛。
4-Cbz-2-甲基-6-氧代-5-取代-哌嗪-2-羧酸甲基酯(31)的合成向保持在室溫于氮?dú)庀碌脑?0mL二氯甲烷中的10mmol化合物(30)的溶液添加2當(dāng)量苯基硅烷和0.3當(dāng)量四(三苯基膦)鈀(O)，并且溶液攪拌2小時(shí)，并隨后添加11mmol TBTU和14mmol N-甲基-嗎啉，并且溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，并隨后濃縮至干燥。
4-Fmoc-2-甲基-6-氧代-5-取代-哌嗪-2-羧酸(25)的合成向保持在室溫于氮?dú)庀碌脑?5mL甲醇中的10mmol化合物(31)的溶液緩慢添加11mmol1N氫氧化鈉溶液，并且反應(yīng)在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，用21mL 1N氫氯酸溶液中和，添加1g 10％鈀碳，并且混懸液在室溫及常壓下氫化3小時(shí)。混懸液經(jīng)硅藻土過(guò)濾并濃縮。殘余物重溶解在25mL四氫呋喃和10mL水中，隨后添加30mmol固體碳酸氫鈉和10mmol芴甲氧羰酰氯，并且反應(yīng)在室溫于氮?dú)庀聰嚢?小時(shí)。隨后將反應(yīng)用50mL乙酸乙酯稀釋并用1N氫氯酸溶液酸化。隨后使各層分離并且有機(jī)層用1×20mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。化合物(25)通過(guò)硅膠柱層析法純化。
(5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸支架的合成(方法I、J、K) 通過(guò)幾種方法實(shí)施(5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸支架的合成 方法I(叔丁基3-保護(hù)-氨基-4-(甲氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(35)通過(guò)使用氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作為還原劑，以α-氨基酯(2)使叔丁基3-保護(hù)-氨基-4-氧代-丁酸酯(34)還原氨化而制備。對(duì)于還原氨化所需要的叔丁基3-保護(hù)-氨基-4-氧代-丁酸酯(34)通過(guò)氫化鋰鋁(LAH)使Weinreb酰胺衍生物(33)還原而制備。叔丁基(3-保護(hù)-氨基-4-(甲氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯類似物(35)隨后進(jìn)行脫保護(hù)、環(huán)化和Fmoc保護(hù)以產(chǎn)生叔丁基(5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸酯(36)，后者隨后經(jīng)脫保護(hù)以產(chǎn)生終產(chǎn)物(37)。
方法I
氨基保護(hù)的Asp-(OtBu)Weinreb酰胺(33)的合成化合物(33)使用與對(duì)化合物(14)所述方法相似的方法而制備。
叔丁基3-氨基保護(hù)的-氨基-4-氧代-丁酸酯(34)的合成化合物(34)使用與對(duì)化合物(9)所述方法相似的方法而制備。
叔丁基3-保護(hù)-氨基-4-(甲氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(35)的合成化合物(35)使用與對(duì)化合物(10)所述方法相似的方法而制備，不過(guò)使用化合物(34)作為醛。


叔丁基(4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸酯(36)的合成對(duì)于含有Fmoc氨基保護(hù)基團(tuán)的化合物，將乙酸乙酯溶液中的在30mL30％二乙胺中的10mmol化合物(35)的溶液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，并隨后濃縮至干燥。對(duì)于含有Cbz氨基保護(hù)基團(tuán)的化合物，將30mL乙醇中的10mmol化合物(35)的溶液在室溫及常壓下氫化2小時(shí)，經(jīng)硅藻土過(guò)濾并濃縮至干燥。為進(jìn)行Fmoc保護(hù)，殘余物溶解在20mL四氫呋喃中和10mL水中并添加2.52g(30mmol)固體碳酸氫鈉，隨后添加3.3g(13mmol)Fmoc-Cl。將混合物攪拌3小時(shí)并用乙酸乙酯稀釋。使各層分離并且有機(jī)層用水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮?；衔?36)通過(guò)硅膠柱層析法純化。


(4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸酯(37)的合成對(duì)化合物(36)用二氯甲烷中的90％三氟乙酸溶液脫保護(hù)持續(xù)3小時(shí)，并隨后濃縮至干燥。終產(chǎn)物(37)通過(guò)硅膠柱層析法純化。

方法J二苯基甲基3-Fmoc-氨基-4-(甲氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(41)通過(guò)使用氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作為還原劑，以α-氨基酯(2)使二苯基甲基3-Fmoc-氨基-4-氧代-丁酸酯(40)還原氨化而制備。對(duì)于還原氨化所需要的二苯基甲基3-Fmoc-氨基-4-氧代-丁酸酯(40)通過(guò)氫化鋰鋁還原Weinreb酰胺衍生物(39)而制備，其中Weinreb酰胺衍生物(39)通過(guò)在Mitsunobu條件下保護(hù)β-酯而從市售的Fmoc-天冬氨酸α-烯丙基酯衍生物(38)形成。使用鈀(0)催化劑除去烯丙基酯，隨后使用TBTU作為偶聯(lián)劑形成Weinreb酰胺。隨后二苯基甲基3-Fmoc-氨基-4-(甲氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(41)經(jīng)Fmoc脫保護(hù)、環(huán)化、通過(guò)氫化除去二苯基甲基酯，隨后進(jìn)行Fmoc保護(hù)以產(chǎn)生終產(chǎn)物(4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸(37)。
方法J
Fmoc-Asp-(OCHPh2)Weinreb酰胺(39)的合成向保持在0℃于氮?dú)庀碌?0mL無(wú)水四氫呋喃中的5.1g(13.0mmol)Fmoc-天冬氨酸α-烯丙基酯(38)的溶液緩慢添加2.6mL(13.4mmol)偶氮二甲酸二異丙酯，其中所述的溶液含有3.4g(13mmol)三苯基膦和2.41g(13.1mmol)二苯基甲醇。撤去冰浴，并且反應(yīng)在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，濃縮至干燥并且隨后通過(guò)硅膠柱層析法純化。1H NMR δ(CDCl3)2.96-3.06(dd，1H，CH2CO)，3.15-3.26(dd，1H，CH2CO)，4.18-4.76(一系列m，3H，CH，CH2)，5.14-5.32(m，1H，CHN)，5.76-5.86(m，1H，CHO)，7.20-7.80(一系列m，18H，富烯，和Ph)；HPLC tR＝7.68min，(M++Na+)＝583.90。
該產(chǎn)物(9.8mmol)隨后溶解在含有1.5g(1.3mmol)四(三苯基膦)鈀(O)的40mL二氯甲烷:乙酸:N-甲基嗎啉37:2:1的溶液中，并且溶液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，濃縮至干燥并在100mL乙酸乙酯和30mL水之間分配。使各層分離，并且有機(jī)層用1×50mL水洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，并濃縮。殘余物懸浮在20mL無(wú)水二氯甲烷中，并添加1.65mL(15mmol)N-甲基嗎啉和4.07g(12.7mmol)TBTU，并且混懸液在室溫?cái)嚢?0分鐘，隨后添加1.65mL(15mmol)N-甲基嗎啉和1.52g(15.6mmol)N，O-二甲基羥胺氫氯酸鹽?；鞈乙涸谑覝?cái)嚢?小時(shí)，濃縮，在100mL乙酸乙酯與50mL水之間分配。有機(jī)層用1×30mL水、1×30mL飽和碳酸氫鈉溶液和1×30mL 1N氫氯酸溶液洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，并濃縮。產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱層析法純化。1H NMR δ(CDCl3)2.76-2.88(dd，1H，CH2CO)，2.89-3.00(dd，1H，CH2CO)，3.16(s，3H，CH3N)，3.70(s，3H，CH3O)，4.14-4.22(dd，1H，CH)，4.28-4.40(t，2H，CH2)，5.07-5.16(dd，1H，CHN)，5.69-5.76(d，1H，CHO)，7.24-7.8(一系列m，18H，富烯，和Ph)；HPLC tR＝7.08，(M++Na+)＝587.03。
二苯基甲基3-Fmoc-氨基-4-氧代-丁酸酯(40)的合成化合物(40)使用與對(duì)化合物(9)所述方法相似的方法而制備。
二苯基甲基3-Fmoc-氨基-4-(甲氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(41)的合成化合物(41)使用與對(duì)化合物(10)所述方法相似的方法而制備，不過(guò)使用化合物(40)作為醛.
(4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸(37)的合成將30mL乙酸乙酯中的30％二乙胺中的10mmol化合物(41)的溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)。該溶液隨后濃縮至干燥，重溶解在2×30mL乙酸乙酯中并再濃縮。殘余物溶解在50mL乙醇和20mL1N氫氯酸溶液中，并且在室溫及常壓下氫化過(guò)夜，經(jīng)硅藻土過(guò)濾并濃縮至干燥。殘余物溶解在20mL四氫呋喃和10mL水中，并添加2.52g(30mmol)固體碳酸氫鈉，隨后添加3.3g(13mmol)Fmoc-Cl。混合物攪拌3小時(shí)，用100mL乙酸乙酯稀釋，使層分離并且有機(jī)層用2×50mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱層析法純化。

方法K從市售Fmoc-天冬氨酸α叔丁基酯(42)開始進(jìn)行(5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸支架的合成。Fmoc-天冬氨酸α叔丁基酯通過(guò)混合酐用硼氫化鈉還原成Fmoc-高絲氨酸α叔丁基酯，隨后用溴化芐保護(hù)醇，以產(chǎn)生Fmoc-高絲氨酸二芐醚α叔丁基酯(43)。隨后用三氟乙酸除去叔丁基酯，并且將酸用硼氫化鈉通過(guò)混合酐法還原成醇，以產(chǎn)生2-Fmoc-氨基-4-芐氧基-1-丁醇(44)。醇(44)隨后使用如前所述的Dess-Martin高價(jià)碘化合物轉(zhuǎn)化成2-Fmoc-氨基-4-芐氧基丁醛(45)。2-Fmoc-氨基-4-芐氧基丁醛(45)和α-氨基酯(2)的還原氨化產(chǎn)生了(2-Fmoc-氨基-4-芐氧基-丁基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(46)。用二乙胺的Fmoc脫保護(hù)產(chǎn)生了自發(fā)環(huán)化成6-芐氧乙基-3-取代-哌嗪-2-酮的游離伯胺。通過(guò)氫化作用除去二芐醚，并且將仲胺作為其Fmoc衍生物加以保護(hù)，以產(chǎn)生4-Fmoc-6-羥甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(47)。最后，將伯醇氧化成酸，以如方法A中所述產(chǎn)生終產(chǎn)物(48)。
方法K
Fmoc-高絲氨酸(OBn)α叔丁基酯(43)的合成向保持在-20℃于氮?dú)庀碌脑?0mL無(wú)水四氫呋喃中的10.0mmol Fmoc Asp-OtBu(42)的溶液添加1.77mL(12.7mmol)三乙胺，隨后緩慢添加1.57mL(12.0mmol)氯甲酸異丁酯。將混合物攪拌30分鐘并且隨后緩慢傾倒在10mL水中的3.77g(99.6mmol)硼氫化鈉的冰冷溶液上，維持溫度低于5℃。反應(yīng)在0℃攪拌15分鐘，并且隨后用1N氫氯酸溶液猝滅。反應(yīng)混合物用100mL乙酸乙酯稀釋并使各層分離。有機(jī)層用2×25mL 1N氫氯酸溶液，2×25mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮，并且通過(guò)硅膠柱層析法純化。純化的化合物隨后溶解在30mL四氫呋喃中，并添加在礦物油中的12mmol 60％氫化鈉分散體，隨后添加0.2mmol四丁基碘化銨和12mmol溴化芐，并且混合物攪拌過(guò)夜，用50mL飽和碳酸氫鈉水溶液猝滅，并用100mL乙酸乙酯萃取?；衔镫S后通過(guò)硅膠柱層析法純化。
2-Fmoc-氨基-4-芐氧基-1-丁醇(44)的合成如對(duì)方法I中化合物(37)所述，使用90％三氟乙酸對(duì)叔丁基酯脫保護(hù)，隨后將酸如對(duì)化合物(13)所述通過(guò)混合酐中間體用硼氫化鈉還原成所述醇。
2-Fmoc-氨基-4-芐氧基-丁醛(45)的合成如對(duì)(9)合成所述，使用Dess-Martin高價(jià)碘化合物將2-Fmoc-氨基-4-芐氧基-1-丁醇(44)氧化成所述醛。
(2-Fmoc-氨基-4-芐氧基-丁基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(46)的合成如對(duì)(10)合成所述，使用氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作為還原劑，以α-氨基酯(2)使2-Fmoc-氨基-4-芐氧基-丁醛(45)還原氨化。
4-Fmoc-6-羥甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(47)的合成以伴隨環(huán)化對(duì)(2-Fmoc-氨基-4-芐氧基-丁基氨基)-2-取代乙酸甲基酯(46)進(jìn)行Fmoc脫保護(hù)，隨后如對(duì)方法J中化合物(37)所述進(jìn)行去芐化作用和Fmoc再保護(hù)。
4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基-乙酸(37)的合成如方法A中所述將4-Fmoc-6-羥甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(47)氧化成所述的酸。所用酸的選擇基于5-位的基團(tuán)的性質(zhì)。
2-取代的3-氧代-[1，4]-二氮雜卓-5-羧酸支架的合成(方法L、M、N) 使用幾種方法進(jìn)行2-取代的3-氧代-[1，4]-二氮雜卓-5-羧酸支架的合成。
方法L叔丁基2-Cbz-氨基-4-(芐氧羰基-取代-甲基-Boc氨基)-丁酸酯(52)通過(guò)使用氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作為還原劑，以氨基酯(51)使叔丁基Cbz-2-氨基-4-氧代-丁酸酯(50)還原氨化，隨后進(jìn)行仲胺的Boc保護(hù)而制備。對(duì)于還原氨化所需要的叔丁基Cbz-2-氨基-4-氧代-丁酸酯(50)通過(guò)氫化鋰鋁還原Weinreb酰胺衍生物(49)而制備。二氮雜卓環(huán)通過(guò)除去保護(hù)基團(tuán)形成，隨后與肽形成試劑環(huán)化以產(chǎn)生(53)。最后，4-Fmoc-2-取代的3-氧代-[1，4]-二氮雜卓-5-羧酸(54)通過(guò)保護(hù)基團(tuán)交換而形成。
方法L
Cbz-Asp-(Weinreb酰胺)-OtBu(49)的合成化合物(49)使用與對(duì)化合物(14)所述方法相似的方法而制備。
叔丁基3-Cbz-氨基-4-氧代-丁酸酯(50)的合成化合物(50)使用與對(duì)化合物(9)所述方法相似的方法而制備。
叔丁基2-Cbz-氨基-4-(芐氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(52)的合成還原氨化用與對(duì)化合物(10)所述方法相似的方法進(jìn)行。仲胺通過(guò)粗制混合物與在四氫呋喃中的2當(dāng)量Boc二碳酸酯反應(yīng)而得以保護(hù)。
叔丁基1-Boc 2-取代-3-氧代-[1，4]-二氮雜卓-5-羧酸酯(53)的合成30mL乙醇中的10mmol化合物(52)的溶液在室溫及常壓下氫化2小時(shí)，經(jīng)硅藻土過(guò)濾并濃縮至干燥。殘余物溶解在100mL二氯甲烷和1.2當(dāng)量TBTU中并且添加2.6當(dāng)量N-甲基-嗎啉。溶液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，并且隨后濃縮。殘余物在50mL乙酸乙酯與25mL1N氫氯酸溶液之間分配，用1×20mL飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。
1-Fmoc 2-取代-3-氧代-[1，4]-二氮雜卓-5-羧酸(54)的合成在二氯甲烷中的10mL 90％三氟乙酸中的10mmol化合物(53)的溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，并且隨后將溶液濃縮至干燥。殘余物溶解在20mL四氫呋喃和10mL水中，并且添加2.52g(30mmol)固體碳酸氫鈉，隨后添加3.36g(13mmol)Fmoc-Cl。將混合物攪拌3小時(shí)并且隨后用乙酸乙酯稀釋。使各層分離，并且有機(jī)層用2×50mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。
方法M還原的二肽類似物(60)通過(guò)使用氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作為還原劑，以氨基酯(29)使二苯基甲基烯丙氧羰基-2-氨基-4-氧代-丁酸酯(59)還原氨化，隨后進(jìn)行仲胺的Cbz保護(hù)而制備。對(duì)于還原氨化所需要的二苯基甲基烯丙氧羰基-2-氨基-4-氧代-丁酸酯(59)通過(guò)氫化鋰鋁還原Weinreb酰胺衍生物(58)而制備，其中Weinreb酰胺衍生物(58)通過(guò)Weinreb酰胺衍生物(57)的保護(hù)基團(tuán)交換而制備。二氮雜卓環(huán)隨后通過(guò)除去烯丙基和烯丙氧羰基，隨后在肽形成試劑存在下的環(huán)閉合而形成。2-取代的3-氧代-[1，4]-二氮雜卓-5-羧酸支架(54)通過(guò)保護(hù)基團(tuán)交換而形成。
方法M

Fmoc-Asp-(Weinreb酰胺)-CHPh2(57)的合成化合物(57)使用與對(duì)化合物(39)所述方法相似的方法而制備。
烯丙氧羰基-Asp-(Weinreb酰胺)-OCHPh2(58)的合成將乙酸乙酯中的20mL30％二乙胺中的10mmol化合物(56)的溶液攪拌2小時(shí)并濃縮至干燥。殘余物溶解在20mL四氫呋喃和10mL水中，并添加2.52g(30mmol)固體碳酸氫鈉，隨后添加13mmol烯丙氧羰基-Cl?；旌衔飻嚢?小時(shí)，并且隨后用乙酸乙酯稀釋。使各層分離，并且有機(jī)層用水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮?；衔?58)通過(guò)硅膠柱層析法純化。
二苯基甲基3-烯丙氧羰基-氨基-4-氧代-丁酸酯(59)的合成化合物(59)使用與對(duì)化合物(9)所述方法相似的方法而制備。
二苯基甲基2-烯丙氧羰基-氨基-4-(烯丙氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(60)的合成化合物(60)通過(guò)還原氨化，使用與對(duì)化合物(15)所述方法相似的方法而制備，不過(guò)使用化合物(59)作為醛。產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱層析法純化。
二苯基甲基1-Cbz 2-取代-3-氧代-[1，4]-二氮雜卓-5-羧酸酯(61)的合成向保持在室溫于氮?dú)庀碌脑?0mL二氯甲烷中的10mmol化合物(60)的溶液添加2當(dāng)量苯基硅烷和0.3當(dāng)量四(三苯基膦)鈀(O)，并且溶液攪拌2小時(shí)，并且隨后添加1.2當(dāng)量TBTU和1.3當(dāng)量N-甲基-嗎啉。溶液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜并濃縮。殘余物在50mL乙酸乙酯與25mL1N氫氯酸溶液之間分配，用1×20mL飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。
1-Fmoc 2-取代-3-氧代-[1，4]-二氮雜卓-5-羧酸(54)的合成30mL乙醇中的10mmol化合物(61)的溶液在室溫氫化2小時(shí)，經(jīng)硅藻土過(guò)濾，并隨后將溶液濃縮至干燥。殘余物溶解在20mL四氫呋喃和10mL水中，并添加2.52g(30mmol)固體碳酸氫鈉，隨后添加3.36g(13mmol)Fmoc-Cl?；旌衔飻嚢?小時(shí)并隨后用乙酸乙酯稀釋。使各層分離并且有機(jī)層用水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。
方法NFmoc-天冬氨酸β叔丁基酯通過(guò)混合酐用硼氫化鈉還原成Fmoc-天冬氨醇(Aspartanol)β叔丁基酯(63)，隨后用烯丙基溴保護(hù)該醇以產(chǎn)生Fmoc-天冬氨醇烯丙基醚β叔丁基酯(64)。隨后用三氟乙酸除去叔丁基酯，并將該酸用硼氫化鈉通過(guò)混合酐法還原成醇以產(chǎn)生3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-1-丁醇(65)。醇(65)隨后使用如前所述的Dess-Martin高價(jià)碘化合物轉(zhuǎn)化成3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基丁醛(66)。將3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基丁醛(66)和α氨基酯(51)還原氨化，隨后在仲胺上進(jìn)行烯丙氧羰基保護(hù)，產(chǎn)生(3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-丁基-烯丙氧羰基-氨基)-2-取代的乙酸芐基酯(67)。烯丙氧羰基7-烯丙氧基甲基-3-取代-[1，4]-二氮雜卓-2-酮(68)通過(guò)芐基酯的皂化，隨后用二乙胺進(jìn)行Fmoc脫保護(hù)以產(chǎn)生游離伯胺而形成，其中所述的游離伯胺使用肽形成試劑如TBTU而環(huán)化。終產(chǎn)物(54)通過(guò)保護(hù)基團(tuán)交換而形成通過(guò)鈀(0)除去烯丙基醚和烯丙氧羰基并且將仲胺作為其Fmoc衍生物加以保護(hù)，以產(chǎn)生4-Fmoc-7-芐氧基甲基-3-取代-[1，4]-二氮雜卓-2-酮，隨后使伯醇氧化成酸以產(chǎn)生終產(chǎn)物(54)。所用氧化劑的選擇基于2-位的基團(tuán)的性質(zhì)。
方法N
Fmoc-天冬氨醇β叔丁基酯(63)的合成使用Fmoc-天冬氨酸β叔丁基酯(62)作為起始材料，如對(duì)化合物(13)的合成所述而制備化合物(63)。
3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-丁酸叔丁基酯(64)的合成向保持在室溫于氮?dú)庀碌脑?0mL四氫呋喃中的10mmol(63)的溶液添加在礦物油中的12mmol60％氫化鈉分散體、2mmol四丁基碘化銨和13mmol烯丙基溴，并且混合物攪拌過(guò)夜，用10mL飽和碳酸氫鈉水溶液猝滅并用50mL乙酸乙酯萃取。
3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-1-丁醇(65)的合成化合物(65)如對(duì)化合物(44)的合成所述而制備。
3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-丁醛(66)的合成如對(duì)(9)的合成所述，使用Dess-Martin高價(jià)碘化合物將3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-1-丁醇(65)氧化成醛。
(3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-丁基-烯丙氧羰基-氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(67)的合成如對(duì)化合物(15)所述，使用如對(duì)化合物(10)所述的氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作為還原劑，以α-氨基酯(51)使3-Fmoc-氨基-4-芐氧基-丁醛(66)還原氨化，隨后將仲胺保護(hù)為烯丙氧羰基衍生物，不過(guò)使用氯甲酸烯丙酯代替氯甲酸芐酯。
4-烯丙氧羰基-7-烯丙氧基甲基-3-取代-[1，4]-二氮雜卓-2-酮(68)的合成將10mmol(3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-丁基-烯丙氧羰基-氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(67)、在20mL甲醇中的20mmol碳酸鉀和10mL水的溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，用21mL 1N氫氯酸溶液中和，并隨后濃縮至干燥。殘余物溶解在乙酸乙酯中的20mL 30％二乙胺中并攪拌3小時(shí)，并且隨后濃縮至干燥。殘余物溶解在100mL二氯甲烷中，并且添加12mmol TBTU和24mmol N-甲基嗎啉，并且溶液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，并隨后濃縮至干燥。殘余物在30mL乙酸乙酯與30mL 1N氫氯酸溶液之間分配，并且隨后使層分離。有機(jī)層用30mL飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并通過(guò)硅膠柱層析法純化。
4-Fmoc-2-取代-3-氧代-[1，4]-二氮雜卓-5-羧酸(54)的合成向保持在室溫于氮?dú)庀碌脑?0mL二氯甲烷中的10mmol化合物(68)的溶液添加2當(dāng)量苯基硅烷和0.3當(dāng)量四(三苯基膦)鈀(O)，并且溶液隨后攪拌2小時(shí)，并濃縮至干燥。仲胺溶解在20mL四氫呋喃和10mL水中，隨后添加2.52g(30mmol)固體碳酸氫鈉和1.2當(dāng)量Fmoc-Cl，并且雙相溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，用30mL乙酸乙酯稀釋，并使各層分離。將4-Fmoc-7-羥甲基-3-取代-[1，4]-二氮雜卓-2-酮如方法A中所述氧化成終產(chǎn)物(54)。所用氧化劑的選擇基于2-位的基團(tuán)的性質(zhì)，如方法A中對(duì)(6)轉(zhuǎn)化成(7)那樣。
6-取代-5-氧代-哌嗪-2-羧酸支架的合成(方法O) 如方法O中概述，合成含有6-位非官能化側(cè)鏈的6-取代-5-氧代-哌嗪-2-羧酸支架，從使用Dess-Martin高價(jià)碘化合物氧化成酮(70)的市售3-Fmoc-氨基-1，2-丙二醇1-氯-三苯甲基樹脂(69)開始而進(jìn)行。以氨基酯(2)對(duì)酮(70)的還原氨化產(chǎn)生了結(jié)合樹脂的(1-氨基甲基-2-氯-三苯甲基氧-乙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(71)，后者在胺的脫保護(hù)后環(huán)化成5-氯三苯甲基氧甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(72)。仲胺受到再保護(hù)，隨后從樹脂上切下，產(chǎn)生Fmoc-5-羥甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(73)，后者使用方法A中所述的兩種方法之一而氧化成6-取代-5-氧代-哌嗪-2-羧酸(74)。
方法O
1-氨基-3-氯三苯甲基氧-2-丙酮(70)的合成結(jié)合樹脂的醇(69)的氧化通過(guò)三氧化硫氧化、NMO/TPAP(N-甲基嗎啉-N-氧化物/高錸酸四丙基銨)氧化或PDC氧化而進(jìn)行。對(duì)于三氧化硫氧化，使用與Parikh，J.R.和Doering，W.V.，J.Am.Chem.Soc.895505-5507(1967)中所述方法相似的方法。對(duì)于NMO/TPAP氧化，向0.3mmol結(jié)合樹脂的醇添加在10mL無(wú)水二甲基甲酰胺中的3mmol N-甲基嗎啉N-氧化物的溶液，并且隨后將0.06mmol高錸酸四丙基銨(TPAP)添加至樹脂混懸液中。反應(yīng)振搖80分鐘。排干溶劑，將樹脂用四氫呋喃和二氯甲烷洗滌并且隨后在真空下干燥。對(duì)于PDC氧化，將二甲基甲酰胺中的0.2M重鉻酸吡啶鎓中的結(jié)合樹脂的醇的混懸液在37℃振搖4小時(shí)，排干溶劑并且將樹脂用二甲基甲酰胺、四氫呋喃和二氯甲烷洗滌。
(1-氨基甲基-2-氯-三苯甲基氧-乙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(71)的合成用氨基酯對(duì)結(jié)合樹脂的酮(70)的還原氨化通過(guò)兩種不同方法之一進(jìn)行。在一種方法中，向二甲基甲酰胺中的20mL1％乙酸中的2.6mmolα氨基酯(2)的溶液添加2.6mmol三乙酰氧基硼氫化鈉，隨后立即添加0.5mmol酮衍生化樹脂(70)，并且混合物振搖60分鐘，用甲醇、10％二異丙基乙胺、二甲基甲酰胺和甲醇漂洗。在第二種方法中，將含有0.05M氰基硼氫化鈉的甲醇中的0.05mmol酮衍生化樹脂(70)和2.0M氫氯酸α氨基酯(2)的混懸液在室溫振搖5小時(shí)，排干并洗滌。
5-氯三苯甲基氧甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(72)的合成將二甲基甲酰胺中的10mL20％哌啶中的0.05mmol樹脂的混懸液在室溫振搖2小時(shí)。
Fmoc-5-羥甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(73)的合成將含有0.25mmolFmoc-Cl和0.25mmol三乙胺的10mL二氯甲烷中的0.05mmol(72)的混懸液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，排干并用二氯甲烷洗滌。樹脂重懸在二氯甲烷中的10mL 95％三氟乙酸中，并將混懸液振搖2小時(shí)過(guò)濾，并濃縮濾液。
Fmoc-6-取代-5-氧代-哌嗪-2-羧酸(74)的合成將(73)氧化成目的產(chǎn)物通過(guò)對(duì)方法A所述的任何方法進(jìn)行。
α，α-雙取代氨基酸的合成(方法P和Q) 在某些本發(fā)明的構(gòu)建體中，可以并構(gòu)思利用雙取代氨基酸殘基，如其中取代基相同或不同的α，α-雙取代氨基酸。在一個(gè)方面，在Aaa1或Aaa8位置利用α，α-雙取代氨基酸，其中α，α-雙取代氨基酸的至少一個(gè)側(cè)鏈?zhǔn)荖le、Ala、Leu、Ile、Val、Nva、Met(O)或Met(O2)的側(cè)鏈。以下合成方法P和Q描述α，α-二-正丁基甘氨酸(2-氨基-2-丁基-己酸)的產(chǎn)生，其中每個(gè)側(cè)鏈?zhǔn)?(CH2)3-CH3，并且因此每個(gè)側(cè)鏈與Nle的側(cè)鏈相同。然而，將理解的是相似方法和方案可以用于其中取代基相同或不同的其它α，α-雙取代氨基酸的產(chǎn)生中。此外，產(chǎn)生α，α-雙取代氨基酸的任何方法可以用于本發(fā)明的實(shí)施中，并且本發(fā)明的實(shí)施不限于以下合成方案的方法。因此，用于合成α，α-雙取代氨基酸的本領(lǐng)域已知任何方法可以用于本發(fā)明的實(shí)施中。下文教授用于產(chǎn)生α，α-雙取代氨基酸的替代方法Clark J.S.和Middleton M.D.Synthesis of novel alpha-substituted and alpha，alpha-disubstituted amino acidsby rearrangement of ammonium ylides generated from metal carbenoids.Org.Lett.4(5)765-8(2002)；Guino M.，Hii K.K.Wang-aldehyde resin as arecyclable support for the synthesis of alpha，alpha-disubstituted amino acidderivatives.Org Biomol.Chem.3(17)3188-93(2005)和Kotha S.，Behera M.Synthesis and modification of dibenzylglycine derivatives via theSuzuki-Miyaura cross-coupling reaction.J.Pept.Res.64(2)72-85(2004)。
方法P
苯甲酰二-正丁基甘氨酸(80)的合成向保持在0℃于氮?dú)庀碌脑?0mL二氯甲烷中的10mmol苯甲酰甘氨酸(75)的溶液緩慢添加12mmol N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，并且反應(yīng)攪拌2小時(shí)以產(chǎn)生化合物(76)。濾除固體并濃縮濾液。殘余物溶解在15mL四氫呋喃中，冷卻至0℃，并且隨后添加24mmol氫化鈉，隨后添加30mmol正丁基溴。混懸液在0℃攪拌2小時(shí)，并且隨后升溫至室溫，并將溶液濃縮至干燥以產(chǎn)生化合物(77)?；蛘?，除使用12mmol氫化鈉和15mmol正丁基溴之外，化合物(77)也可以按照相似方式從苯甲酰正亮氨酸(78)制備?；衔?77)溶解在甲醇中，添加50mL 1N氫氯酸溶液，并且將此溶液攪拌2小時(shí)并濃縮?；衔?80)通過(guò)硅膠柱層析法純化。
Fmoc二-正丁基甘氨酸(81)的合成10mmol化合物(80)溶解在30mL二噁烷中，并添加10mL6N氫氯酸溶液，并使溶液回流過(guò)夜。將反應(yīng)冷卻至室溫、濃縮至干燥，重溶解在30mL四氫呋喃中，并添加10mL水和30mmol碳酸氫鈉，隨后添加15mmol Fmoc-Cl。攪拌雙相溶液1小時(shí)并且在真空下除去四氫呋喃。水溶液用1×50mL二乙醚提取，用1N氫氯酸溶液酸化，并用2×50mL乙酸乙酯萃取。將乙酸乙酯層合并，經(jīng)硫酸鈉干燥，并濃縮?；衔?81)通過(guò)硅膠柱層析法純化。
相似的方法可以通過(guò)始自(與化合物78相似的)任何適宜的氨基酸衍生物而使用，并且通過(guò)使用適宜的烷基丁基、芳基丁基或芳烷基丁基試劑，該方案將產(chǎn)生其中R和R′不同的多種雙取代(R，R′)氨基酸替代物。
方法Q
Fmoc-α，α二-正丁基甘氨酸(87)的合成向室溫下保持的40mL無(wú)水四氫呋喃中的20mmol甘氨酸甲基酯氫氯化物(82)和2g粉末狀分子篩的混懸液添加24mmol氫氧化鉀，隨后添加22mmol苯甲醛?；鞈乙簲嚢?小時(shí)，過(guò)濾，并濃縮濾液。殘余物重溶解在40mL無(wú)水甲苯中，并且隨后添加至在甲苯中的60mmol氫化鈉的混懸液內(nèi)，隨后添加60mmol正丁基溴?；鞈乙簲嚢?2小時(shí)，隨后添加30mL 6N氫氯酸溶液，在室溫?cái)嚢?小時(shí)，并且隨后使層分離。因此獲得的(84)的氫氯酸鹽原位地用于制備(87)。為分離作為氫氯酸鹽的(84)，將水層濃縮至干燥，并使產(chǎn)物從無(wú)水甲醇-醚中結(jié)晶。
或者，化合物(84)可以使用相似的合成方法從正亮氨酸甲基酯氫氯化物制備，除了30mmol氫化鈉和30mmol正丁基溴用于將(86)轉(zhuǎn)化成(84)。
將如上文獲得的化合物(84)的氫氯酸化物形式的水性混合物加熱至回流1小時(shí)并且隨后冷卻至室溫。該混合物用固體氫氧化鈉中和，并且隨后用30mL四氫呋喃稀釋。添加碳酸氫鈉(30mmol)，隨后添加15mmolFmoc-Cl。將雙相溶液攪拌1小時(shí)，并將四氫呋喃在真空下除去。水溶液用1×50mL二乙醚提取，用1N氫氯酸溶液酸化，并用2×50mL乙酸乙酯萃取。將乙酸乙酯層合并，經(jīng)硫酸鈉干燥，并濃縮?；衔?87)通過(guò)硅膠柱層析法純化。
相似的方法可以通過(guò)始自(與化合物85相似的)任何適宜的氨基酸衍生物而使用，并且通過(guò)使用適宜的烷基丁基、芳基丁基或芳烷基丁基試劑，該方案將產(chǎn)生其中R和R′不同的多種雙取代(R，R′)氨基酸替代物。
雙取代(R，R′)支架的合成(方法R) 本發(fā)明還提供其中使用具有兩種R基團(tuán)即R和R′的氨基酸替代物的構(gòu)建體。以下方法描述Fmoc保護(hù)的(R)-5，5-二丁基-6-氧代-哌嗪-2-羧酸的合成，其中R和R′分別是對(duì)應(yīng)于正亮氨酸側(cè)鏈部分的基團(tuán)?？梢悦靼紫挛姆椒梢圆糠只谇笆龇椒右哉{(diào)整以產(chǎn)生相似的雙取代(R，R′)氨基酸替代物。相似的方法可以通過(guò)始自(與化合物84相似的)任何適宜的氨基酸衍生物而使用，該方案將產(chǎn)生其中R和R′不同的多種雙取代(R，R′)氨基酸替代物。
方法R
(2-Fmoc-氨基-3-叔丁氧基-丙基氨基)-2，2，二-正丁基乙酸甲基酯(88)的合成21mmol(84，方案Q)和50mL無(wú)水四氫呋喃中的2.9mL(21mmol)三乙胺的混懸液在室溫?cái)嚢?5分鐘，并且隨后添加30mL四氫呋喃中的約20mmol粗制Fmoc-(O-叔丁基)-絲氨醛(9，方案D)的溶液，隨后添加1.7g的

粉末狀分子篩，并且混懸液攪拌額外2小時(shí)。添加6.4g(30mmol)固態(tài)三乙酰氧基硼氫化鈉，并且混懸液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。混懸液用甲醇稀釋，濾除分子篩，并濃縮濾液。殘余物在100mL乙酸乙酯與50mL水之間分配。有機(jī)層經(jīng)硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。化合物(88)通過(guò)硅膠柱層析法純化。
4-Fmoc-6-羥甲基-3，3-二-正丁基-哌嗪-2-酮(89)的合成在乙酸乙酯中的30mL 30％二乙胺內(nèi)的10mmol化合物(88)的溶液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，并隨后濃縮至干燥。殘余物溶解在20mL四氫呋喃和10mL水中，添加2.52g(30mmol)固體碳酸氫鈉，隨后添加3.36g(13mmol)Fmoc-Cl。將混合物攪拌3小時(shí)，用50mL乙酸乙酯稀釋，使各層分離，并且有機(jī)層用30mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮。粗制混合物溶解在二氯甲烷中的10mL 90％三氟乙酸溶液中，攪拌2小時(shí)，并隨后濃縮至干燥。殘余物在乙酸乙酯溶解中并用50mL飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并濃縮?；衔?89)通過(guò)硅膠柱層析法純化。
4-Fmoc-5，5-二-正丁基-6-氧代-哌嗪-2-羧酸(90)的合成向在室溫保持的在81mL乙腈中的8mmol醇(89)的溶液添加磷酸鹽緩沖液(用0.72g磷酸二氫鈉和1.43g磷酸氫二鈉在29.5mL水中制備)，隨后添加0.33g(2.1mmol)TEMPO及1.86g(16.5mmol)亞氯酸鈉，并將雙相溶液置于維持在43℃的油浴中。緩慢添加(通過(guò)混合1.9mL 10-13％次氯酸鈉溶液與2.4mL水而制備的)4.3mL(2.6mmol)次氯酸鈉溶液。反應(yīng)在43℃攪拌4小時(shí)，冷卻至室溫，添加20mL 10％亞硫酸氫鈉，攪拌10分鐘，用50mL乙酸乙酯稀釋，并使各層分離。有機(jī)層用1×10mL鹽水、1×10mL 1N氫氯酸溶液洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，并濃縮?；衔?90)通過(guò)硅膠柱層析法純化。
本發(fā)明構(gòu)建體的合成 如本發(fā)明幾個(gè)實(shí)施方案中公開的構(gòu)建體可以通過(guò)用于形成氨基酸之間肽鍵的任何已知常規(guī)方法而容易地合成。此類常規(guī)方法包括例如任何液相方法，其中所述的液相方法允許其羧基或其它反應(yīng)基受保護(hù)的氨基酸殘基的游離α氨基與其羧基或其它反應(yīng)基受保護(hù)的另一種氨基酸殘基的游離伯羧基之間縮合。在優(yōu)選的常規(guī)方法中，本發(fā)明的構(gòu)建體可以通過(guò)固相合成法合成并根據(jù)本領(lǐng)域的已知方法純化。本發(fā)明的氨基酸替代物可以通過(guò)與對(duì)于殘基所用方法基本上相似或相同的方法而摻入本發(fā)明的構(gòu)建體。利用多種樹脂和試劑的眾多熟知方法均可以用來(lái)制備本發(fā)明的構(gòu)建體。
用于合成構(gòu)建體的過(guò)程可以通過(guò)其中所需序列內(nèi)每個(gè)氨基酸或氨基酸替代物一次一個(gè)連續(xù)地向另一種氨基酸殘基或氨基酸替代物添加的方法，或通過(guò)首先常規(guī)地合成具有所需氨基酸序列的肽片段(其可以包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代物)并隨后縮合以提供所需構(gòu)建體的方法而實(shí)施。使產(chǎn)生的構(gòu)建體環(huán)化，以產(chǎn)生本發(fā)明的環(huán)狀構(gòu)建體。
固相肽合成方法是眾所周知的并在本領(lǐng)域中實(shí)施。在此類方法中，本發(fā)明構(gòu)建體的合成可以根據(jù)固相方法的一般原理，通過(guò)將想要的氨基酸殘基或氨基酸替代物一次一個(gè)依次并入增長(zhǎng)的肽鏈而實(shí)施。這些方法在眾多參考文獻(xiàn)中公開，所述文獻(xiàn)包括Merrifield R.B.，Solid phase synthesis(Nobellecture).Angew.Chem.24799-810(1985)和Barany等，The Peptides，Analysis，Synthesis and Biology，第2卷，Gross E.和Meienhofer J.編輯.Academic Press，1-284(1980)。
在構(gòu)建體的化學(xué)合成中，用合適的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)多種氨基酸殘基或氨基酸替代物的活性側(cè)鏈基團(tuán)，其中所述的保護(hù)基團(tuán)防止化學(xué)反應(yīng)在該位點(diǎn)上發(fā)生直至除去該保護(hù)基團(tuán)為止。還常見是保護(hù)氨基酸殘基或氨基酸替代物的α氨基，同時(shí)該實(shí)體在羧基處發(fā)生反應(yīng)，隨后選擇性地除去α氨基保護(hù)基團(tuán)以允許后續(xù)反應(yīng)在該位點(diǎn)上發(fā)生。具體的保護(hù)基團(tuán)已經(jīng)公開并且在固相合成法和溶液相合成法中是已知的。
α氨基可以由合適的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，包括氨基甲酸乙酯型保護(hù)基團(tuán)如芐氧羰基(Z)和取代的芐氧羰基如對(duì)氯芐氧羰基、對(duì)硝基芐氧羰基、對(duì)溴芐氧羰基、對(duì)聯(lián)苯基-異丙氧羰基、9-芴甲氧羰基(Fmoc)和對(duì)甲氧基芐氧羰基(Moz)；脂族氨基甲酸乙酯型保護(hù)基團(tuán)，如叔丁氧羰基(Boc)、二異丙基甲氧羰基、異丙氧羰基和烯丙氧羰基。Fmoc優(yōu)選用于α氨基保護(hù)。
胍基可以由合適的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，如硝基、對(duì)甲苯磺?；?Tos)、Z、五甲基色烷磺?；?Pmc)、金剛烷氧羰基、五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?Pbf)、Fmoc和Boc。Pbf是用于Arg的一種優(yōu)選保護(hù)基團(tuán)。其它優(yōu)選的保護(hù)基團(tuán)包括Z、Fmoc和Boc。尤其將理解的是胍基保護(hù)基團(tuán)可以在合成過(guò)程期間被切除并除去，或可以備選地不被切除或除去，此時(shí)帶保護(hù)基團(tuán)的側(cè)鏈形成如本文中所定義的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物。特別在保護(hù)基團(tuán)是不穩(wěn)定的以及可能在施用至患者時(shí)因某種機(jī)制而被除去的情況下，構(gòu)建體變成“前藥”，也就是說(shuō)作為藥物前體的構(gòu)建體，其中所述的藥物前體在施用至患者后通過(guò)某些化學(xué)或生理過(guò)程在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成所需藥物形式(例如前藥在接觸于生理pH時(shí)或因酶作用而轉(zhuǎn)化成想要的藥物形式)。
本文中所述的本發(fā)明構(gòu)建體可以使用固相合成法，手工地或通過(guò)自動(dòng)肽合成儀(使用如由制造商提供的編程模塊并遵循由制造商描述的方案)，或通過(guò)改良制造商的方案以改善苛刻偶聯(lián)的產(chǎn)率而制備。
固相合成通過(guò)受保護(hù)的α-氨基酸、α-氨基酸替代物或α-氨基醇模擬物偶聯(lián)至合適樹脂而始自構(gòu)建體的羧基端。通過(guò)如下方式如此制備這種起始材料，即通過(guò)酯鍵將α-氨基-受保護(hù)氨基酸或α-氨基-受保護(hù)氨基酸替代物連接至對(duì)芐氧基芐醇(Wang)樹脂或2-氯三苯甲基氯樹脂，通過(guò)Fmoc-接頭如對(duì)-[(R，S)-α-[1-(9H-芴-9-基)-甲氧基甲酰氨基]-2，4-二甲氧基芐基]-苯氧乙酸(Rink接頭)之間的酰胺鍵連接至二苯甲基胺(BHA)樹脂，或通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的其它方法，如通過(guò)將α-氨基-保護(hù)的醇模擬物連接至與氯甲基聚苯乙烯樹脂連接的3，4-二氫-2H-吡喃-2基-甲醇接頭。Fmoc-接頭-BHA樹脂支持物是市售的并且通常在可行時(shí)使用。根據(jù)需要在整個(gè)重復(fù)循環(huán)期間攜帶這些樹脂以依次添加氨基酸。在堿性條件下除去α氨基Fmoc保護(hù)基團(tuán)。為此目的可以使用在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的哌啶、哌嗪、二乙胺或嗎啉(20-40％v/v)。
在除去α氨基保護(hù)基團(tuán)后，后繼保護(hù)的氨基酸或氨基酸替代物以想要的次序逐步偶聯(lián)以獲得中間態(tài)的保護(hù)的肽-樹脂。用于肽固相合成中偶聯(lián)氨基酸的活化試劑是本領(lǐng)域眾所周知的。在合成構(gòu)建體后，根據(jù)需要，可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法除去正交保護(hù)的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，以便將構(gòu)建體進(jìn)一步衍生化。
構(gòu)建體中的反應(yīng)基團(tuán)可以在固相合成期間或從樹脂除去后選擇性地加以修飾。例如，構(gòu)建體可以在樹脂上時(shí)進(jìn)行修飾以獲得氨基端修飾，如乙?；?，或可以通過(guò)使用切除試劑從樹脂除去并且隨后加以修飾。用于氨基端修飾(如乙?；?或羧基端修飾(如酰胺化)或?qū)隢-乙酰基的方法是本領(lǐng)域已知的。類似地，用于修飾氨基酸側(cè)鏈的方法是肽合成領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。對(duì)構(gòu)建體上存在的反應(yīng)基修飾的選擇部分地由構(gòu)建體中想要的特征決定。
在一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)建體在從樹脂切割之前被環(huán)化。對(duì)于通過(guò)活性側(cè)鏈部分的環(huán)化，使想要的側(cè)鏈脫保護(hù)，并將構(gòu)建體懸浮在合適的溶劑中并添加環(huán)化偶聯(lián)劑。合適的溶劑包括例如DMF、二氯甲烷(DCM)或1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。合適的環(huán)化偶聯(lián)試劑包括例如2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)、苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸鹽(BOP)、苯并三唑-1-基-氧基-三(吡咯烷基)磷鎓六氟磷酸鹽(PyBOP)、2-(7-氮雜-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TATU)、2-(2-氧代-1(2H)-吡啶基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TPTU)或N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺/1-羥基苯并三唑(DCCl/HOBt)。偶聯(lián)常規(guī)通過(guò)使用合適的堿如N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)、均三甲基吡啶(sym-collidine)或N-甲基嗎啉(NMM)而啟動(dòng)。
合成后，從固相切下構(gòu)建體之后，構(gòu)建體可以通過(guò)任何數(shù)目的方法如反相高效液相色譜法(RP-HPLC)，使用合適的柱(如C18柱)純化。也可以使用其它的分離或純化方法，如基于構(gòu)建體大小或電荷的方法。一旦純化，則構(gòu)建體可以通過(guò)任何數(shù)目的方法如高效液相色譜(HPLC)、氨基酸分析法、質(zhì)譜法等表征。
具有取代的酰胺衍生物羧基端(一般是N-烷基)的本發(fā)明構(gòu)建體通過(guò)固相合成法制備，其中所述的固相合成法通過(guò)將保護(hù)的α氨基酸或氨基酸替代物偶聯(lián)至合適樹脂而始自化合物的羧基端。此類用于固相制備取代的酰胺衍生物的方法已經(jīng)在本領(lǐng)域中描述。見，例如Barn D.R.，Morphy J.R.，Rees D.C.Synthesis of an array of amides by aluminum chloride assistedcleavage of resin-bound esters.Tetrahedron Lett.37，3213-3216(1996)；DeGrado W.F.Kaiser E.T.Solid-phase synthesis of protected peptides on apolymer bound oximePreparation of segments comprising the sequences of acytotoxic 26-peptide analogue.J.Org.Chem.473258-3261(1982)。此類起始材料可以通過(guò)熟知方法，將α氨基受保護(hù)的氨基酸或氨基酸替代物經(jīng)酯鍵連接至對(duì)芐氧基芐醇(Wang)樹脂而制備。按照想要的氨基酸或氨基酸替代物序列增長(zhǎng)肽鏈，使產(chǎn)物環(huán)化并用二氯甲烷中的適宜胺和氯化鋁(如甲胺、二甲胺、乙胺等)的溶液處理樹脂。產(chǎn)生的酰胺衍生物構(gòu)建體從樹脂中釋放在溶液內(nèi)。濾除樹脂，并將酰胺衍生物構(gòu)建體通過(guò)濃縮溶劑隨后用醚沉淀進(jìn)行回收。將粗制構(gòu)建體干燥并使用三氟乙酸(TFA)在水和三異丙基硅烷(TIS)存在下切除仍存在的氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。終產(chǎn)物通過(guò)添加冷醚進(jìn)行沉淀并通過(guò)過(guò)濾收集。通過(guò)RP-HPLC，使用C18柱開展最終純化。
在一個(gè)優(yōu)選的方法中，實(shí)施例1的構(gòu)建體通過(guò)以下方法合成。每種構(gòu)建體具有一個(gè)或兩個(gè)基于酮-哌嗪結(jié)構(gòu)的氨基酸替代物。該氨基酸替代物如上文所述合成。構(gòu)建體使用Fmoc化學(xué)合成。使用手工合成方法以在摻入酮-哌嗪氨基酸替代物之前和之后立即偶聯(lián)。
以下方案用來(lái)將氨基酸替代物連接至樹脂，例如氨基酸替代物位于末端位置。Rink酰胺樹脂(以0.3mmol/g載量，Advanced ChemTech)在DMF中溶脹30分鐘。使用20％哌啶/DMF持續(xù)20分鐘實(shí)現(xiàn)樹脂的Fmoc脫保護(hù)。該樹脂與所選Fmoc-保護(hù)的酮-哌嗪氨基酸替代物(2當(dāng)量)的偶聯(lián)通過(guò)在DMF中與PyBop(2當(dāng)量)和DIEA(4當(dāng)量)過(guò)夜溫育而實(shí)現(xiàn)。若Kaiser檢驗(yàn)后，獲得陽(yáng)性結(jié)果，則進(jìn)行第二次偶聯(lián)反應(yīng)。使用DMF中的Ac2O(10當(dāng)量)和吡啶(20當(dāng)量)實(shí)施乙?；?br> 以下方案用來(lái)連接酮-哌嗪氨基酸替代物至肽-樹脂。偶聯(lián)通過(guò)混合在DMF中的Fmoc-保護(hù)的酮哌嗪氨基酸替代物(2當(dāng)量)，TBTU(2當(dāng)量)和DIEA(4當(dāng)量)并使其溫育過(guò)夜而實(shí)施，若Kaiser檢驗(yàn)后獲得陽(yáng)性結(jié)果，則再次進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。使用DMF中的Ac2O(10當(dāng)量)和吡啶(20當(dāng)量)實(shí)施乙酰化。
以下方案用來(lái)將Fmoc-保護(hù)的氨基酸偶聯(lián)至固相上的酮-哌嗪氨基酸替代物。在大多數(shù)情況下，需要至少兩個(gè)偶聯(lián)循環(huán)，并且往往使用三個(gè)循環(huán)。在常見循環(huán)中，F(xiàn)moc-保護(hù)的氨基酸(4當(dāng)量)與DMF中的HOAt(4當(dāng)量)和DIC(4當(dāng)量)混合。產(chǎn)生的混合物隨后在SPE管中與酮-哌嗪氨基酸替代物混合過(guò)夜，所述替代物與樹脂直接連接或經(jīng)中間體連接。
使用固相肽合成的標(biāo)準(zhǔn)方案實(shí)施序列中與酮-哌嗪氨基酸替代物不直接相鄰的氨基酸之間的偶聯(lián)。使用以下保護(hù)基團(tuán)Boc用于Lys和Orn，叔丁基用于Tyr和Ser，三苯甲基用于Cys和His，O-叔丁基用于Asp和Pbf用于Arg。
使用TFA/苯甲硫醚/苯酚/H2O/DTT/TIS(87.5/2.5/2.5/5/2.5/11)的混合物(5mL)3小時(shí)而從樹脂上切下構(gòu)建體。產(chǎn)生的材料經(jīng)過(guò)濾并在冷凍條件下持續(xù)1小時(shí)而從冷醚中析出。析出的半胱氨酰肽在用于氧化步驟中之前用冷醚洗滌至少三次。
為通過(guò)空氣氧化而環(huán)化以形成二硫鍵，將粗制半胱氨酰構(gòu)建體溶解在乙腈與水的混合物中。使用5％NH4OH調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物的pH至7-8。將得到的溶液隨150mg粒狀活性碳一起緩慢攪拌2日。環(huán)化的完成在進(jìn)入下個(gè)加工步驟之前由LC-MS分析證實(shí)。在環(huán)化后，從溶液中濾去固體碳。將濾液凍干或在speed-vac中干燥以獲得粗制環(huán)狀構(gòu)建體。
可以通過(guò)以下方案合成本發(fā)明的某些構(gòu)建體，其中替代物與樹脂或其它肽固體支持物結(jié)合并且位于羧基端位置。以下方案由構(gòu)建體1-132的合成例示，但是將理解的是基本上相似的方法可以用于其中替代物與樹脂或其它肽固體支持物結(jié)合的任何構(gòu)建體。

替代物(7)通過(guò)上文方法A的方案或任何替代方法而制備。Fmoc保護(hù)的Sieber酰胺樹脂通過(guò)23.8g(0.63mmol/g置換，15mmol)該樹脂在二甲基甲酰胺和二氯甲烷1:1的200mL混合物中溶脹45分鐘，隨后濾出并用2×125mL二甲基甲酰胺洗滌進(jìn)行處理。洗滌的樹脂隨后用二甲基甲酰胺中的2×125mL20％哌啶脫保護(hù)15分鐘，濾出并用4×125mL二甲基甲酰胺洗滌。
將160mL二甲基甲酰胺中21.5g(分子量＝717，30mmol)Fmoc-保護(hù)的替代物(7)的溶液添加至如上所制備脫保護(hù)的Sieber酰胺樹脂，隨后添加15.6g(分子量＝520.3，30mmol)固體PyBop和10.4mL(分子量＝129.25，d＝0.742，60mmol)二異丙基乙胺，隨后又添加40mL二甲基甲酰胺。將混合物攪動(dòng)過(guò)夜并吹氮。將樹脂濾出并用4×130mL二甲基甲酰胺洗滌，用由二甲基甲酰胺:乙酸酐:吡啶的3:2:1溶液構(gòu)成的150mL封端溶液封端30分鐘，過(guò)濾并用4×130mL二甲基甲酰胺洗滌以提供與樹脂復(fù)合的替代物(7)。
所得的與樹脂復(fù)合的Fmoc-保護(hù)的替代物(7)用二甲基甲酰胺中的2×130mL20％哌啶脫保護(hù)15分鐘，濾出并用4×130mL二甲基甲酰胺洗滌以產(chǎn)生與樹脂復(fù)合的替代物(7)。二甲基甲酰胺中的27.6gFmoc-Tyr-(tBu)-OH(60mmol，4當(dāng)量)的溶液(200mL)添加至與樹脂復(fù)合的替代物(7)，隨后添加DMF中的24.8g HCTU(60mmol，4當(dāng)量)和20.8mL二異丙基乙胺(120mmol，8當(dāng)量)的溶液至終體積200mL并偶聯(lián)過(guò)夜，同時(shí)吹氮。產(chǎn)生的Fmoc-Tyr-(tBu)-替代物(7)-樹脂經(jīng)過(guò)濾分離并用2×130mL二甲基甲酰胺洗滌。為確保完全偶聯(lián)，產(chǎn)物再次用二甲基甲酰胺中的27.6gFmoc-Tyr-(tBu)-OH(分子量＝459.6，60mmol，4當(dāng)量)的溶液至終體積200mL處理，隨后用DMF中的24.8g HCTU(60mmol，4當(dāng)量)和二異丙基乙胺(20.8mL，120mmol，8當(dāng)量)的溶液至終體積200mL處理，并且偶聯(lián)過(guò)夜，同時(shí)吹氮。濾出樹脂并且用2×130mL二甲基甲酰胺洗滌。HPLC和LC/MS顯示在替代物(7)-樹脂與Fmoc-Tyr-(tBu)-OH之間的偶聯(lián)完成。
產(chǎn)生的Fmoc-Tyr-(tBu)-替代物(7)-樹脂隨后用如上文的150mL封端溶液封端30分鐘。隨后濾出樹脂，用4×130mL二甲基甲酰胺、4×130mL二氯甲烷、2×130mL MeOH、2×130mL二乙醚洗滌，并在真空下干燥以產(chǎn)生36.7g。
此后可以偶聯(lián)后繼的每種氨基酸。在偶聯(lián)第一種氨基酸之前，將產(chǎn)生的Fmoc-Tyr-(tBu)-替代物(7)-樹脂用二甲基甲酰胺:二氯甲烷1:1的200mL溶液溶脹45分鐘。通過(guò)重復(fù)以下循環(huán)來(lái)偶聯(lián)每種氨基酸(Fmoc-AA-OH)。末端氨基酸殘基用二甲基甲酰胺中的2×125mL 20％哌啶脫保護(hù)15分鐘，過(guò)濾并用4×125mL二甲基甲酰胺洗滌。珠用茚三酮試驗(yàn)檢驗(yàn)。將終體積200mL在二甲基甲酰胺中的Fmoc-AA-OH(60mmol，4當(dāng)量)的溶液添加至樹脂，隨后添加在DMF中的HBTU(60mmol，4當(dāng)量)和(120mmol，8當(dāng)量)N-甲基嗎啉的溶液至終體積200mL[Fmoc-AA-OH的濃度＝150mM溶液]并偶聯(lián)30分鐘，同時(shí)吹氮(偶聯(lián)反應(yīng)通過(guò)茚三酮試驗(yàn)檢驗(yàn))。當(dāng)茚三酮試驗(yàn)呈陰性時(shí)，濾出樹脂并用4×130mL二甲基甲酰胺洗滌。
在已經(jīng)偶聯(lián)全部氨基酸后，樹脂用4×130mL二氯甲烷、4×130mL甲醇、4×130mL二乙醚洗滌，并在真空下干燥以產(chǎn)生產(chǎn)物。重量增加是定量性的。
將由三氟乙酸:苯酚:苯甲硫醚:水:DDT:三異丙基硅烷的81.5:5:5:5:2.5:1溶液構(gòu)成的100mL切除試劑添加至32g(～6.4mmol)以下的線形構(gòu)建體
混懸液在室溫靜置5分鐘并且隨后過(guò)濾。向樹脂添加另一份100mL切除試劑，靜置5分鐘并過(guò)濾。重復(fù)這個(gè)過(guò)程。
產(chǎn)生的樹脂隨后用2×40mL三氟乙酸洗滌。合并濾液并將其在室溫?cái)嚢?.5小時(shí)，并且隨后在減壓下濃縮至約100mL體積。添加冷的二乙醚(1.5L，預(yù)冷至-20℃)至濾液中，并且隨后置于冷凍器內(nèi)(-20℃)1小時(shí)，經(jīng)垂熔玻璃漏斗過(guò)濾，并且固體用3×200mL冷的二乙醚洗滌，并且隨后在真空下干燥1小時(shí)，同時(shí)每隔15分鐘攪散固體以確保高效地除去溶劑。獲得以下構(gòu)建體(15.4g)(103％整體粗產(chǎn)率)
以上構(gòu)建體(15.4g，6.4mmol)溶解于在水中的16L 30％乙腈內(nèi)。使用5％氫氧化銨溶液調(diào)節(jié)pH至8.4。添加粉碎的活性碳(15.4g)，并將混懸液攪拌過(guò)夜。通過(guò)硅藻土過(guò)濾而除去碳。硅藻土用在水中的3 x 100mL 50％乙腈洗滌。濾液合并，用水稀釋至10％乙腈終濃度，并裝載于柱內(nèi)以純化。在下列條件下實(shí)施對(duì)所得構(gòu)建體的三氟乙酸鹽的純化 柱Luna C18，10μ，50 x 33mm 流速70mL/分鐘 溶劑A含有0.1％三氟乙酸的水 溶劑B含有0.1％三氟乙酸的乙腈 梯度5％溶劑B，5分鐘 26％B至52％B，30分鐘內(nèi) 將純級(jí)分合并并凍干，以產(chǎn)生純化的構(gòu)建體三氟乙酸鹽。Dowex SBR，LCNG-OH樹脂(450g)懸浮在2L水中，并溫和攪拌15分鐘，靜置15分鐘，并且隨后潷析。重復(fù)該過(guò)程，并且隨后添加0.5L水，并且將漿液轉(zhuǎn)移至6 x 60cm柱。排干水，用4L水洗滌，并且將離子與6.5L 20％乙酸溶液交換。樹脂在室溫靜置過(guò)夜，并且隨后用水洗滌直至濾液的pH是約4(使用8L水)。如上制備的以上構(gòu)建體的三氟乙酸鹽(11.1g)溶解在80mL水中，并裝載至離子交換樹脂上，并用水洗脫。合并含有79-1的級(jí)分，并添加20％乙酸溶液以調(diào)節(jié)終濃度至5％乙酸，并且隨后凍干。獲得以下的構(gòu)建體1-132(10.4g)
相似方法可以用于其中替代物與樹脂或其它肽固體支持物結(jié)合并且位于羧基端位置的任何構(gòu)建體。
可以按照任何方式(如下文所述的那些方式)實(shí)行本發(fā)明肽構(gòu)建體的任選PEG化。
通過(guò)在2mL二甲基亞砜中溶解0.005mmol純化的構(gòu)建體，隨后添加55.5mg(0.011mmol，2當(dāng)量)PEG-5K-OSu(帶琥珀酰亞胺丙酸酯反應(yīng)基的分子量5,000Da的甲氧基-PEG)，隨后添加17.7μL(0.13mmol，20當(dāng)量)三乙胺，并將略微渾濁的溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，而實(shí)現(xiàn)活性胺基(如賴氨酸或鳥氨酸側(cè)鏈、Aaa1位置的Ω氨基脂族基團(tuán)或在Aaa15處氨基酸替代物J中胺基)的PEG化。過(guò)量的PEG-5K-OSu通過(guò)添加7μL(0.111mmol，10當(dāng)量)乙醇胺被猝滅，并將反應(yīng)攪拌過(guò)夜。
通過(guò)將PEG-NH2(PEG-胺)偶聯(lián)至在Asp或Glu的側(cè)鏈中或在羧基端處含有羧基的化合物上，而實(shí)現(xiàn)活性羧基(如Asp或Glu側(cè)鏈或在殘基或替代物上Aaa15處的末端羧基)的PEG化。肽構(gòu)建體(0.005mmol)溶解在DMSO(2mL)中，隨后添加55.5mg(0.011mmol，2當(dāng)量)PEG-NH2和HOBt(0.01mmol)。通過(guò)添加0.0055mM偶聯(lián)試劑N-乙基-N’-(3-二甲胺基丙基)-碳二亞胺(EDAC)啟動(dòng)偶聯(lián)。將略微渾濁的溶液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。PEG化的肽構(gòu)建體隨后通過(guò)HPLC純化。
活性硫氫基(如Cys或Hcys側(cè)鏈)或在Aaa1處氨基酸替代物Q中硫氫基的PEG化通過(guò)在DMSO中用PEG-甲基-馬來(lái)酰亞胺試劑(SunBio，Orinda，California)處理肽構(gòu)建體過(guò)夜而實(shí)現(xiàn)。PEG化的肽構(gòu)建體隨后通過(guò)HPLC純化。
PEG化后，產(chǎn)生的粗制混合物隨后通過(guò)HPLC純化，產(chǎn)生包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代物的PEG衍生化構(gòu)建體。
體外和體內(nèi)檢驗(yàn)系統(tǒng) 所選的構(gòu)建體在測(cè)定法中檢驗(yàn)以確定結(jié)合狀態(tài)和功能狀態(tài)。使用了以下的測(cè)定法。
細(xì)胞培養(yǎng)。從Bio S&T Inc.(Montreal，Quebec)購(gòu)買編碼人利尿鈉肽受體A(NPRA)的cDNA克隆。將該cDNA克隆插入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA3.1(Invitrogen)并轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞。通過(guò)在硫酸G418存在下培養(yǎng)細(xì)胞而選擇穩(wěn)定的克隆。通過(guò)將[1251]-心房鈉尿肽([125I]-ANP)結(jié)合至從克隆細(xì)胞系制備的膜勻漿物而檢驗(yàn)NPRA的表達(dá)。HEK-hNPRA細(xì)胞維持在37℃于5％ CO2在補(bǔ)充有10％ FBS、硫酸G418(300μg/mL)、谷氨酸鈉(0.29mg/mL)、青霉素(100單位s/mL)和鏈霉素(100ug/mL)的Dulbecco改良Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)。
競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法。使用從HEK-hNPRA細(xì)胞制備的粗制膜勻漿物實(shí)施競(jìng)爭(zhēng)性抑制結(jié)合測(cè)定法。為制備膜勻漿物，細(xì)胞用磷酸鹽緩沖鹽水漂洗，并在4℃在低滲裂解緩沖液(10mM Tris，pH 7.4+5mM EDTA)中溫育15分鐘。將細(xì)胞從平板中轉(zhuǎn)移至聚丙烯管內(nèi)并均化。勻漿物在25,000×g離心20分鐘。沉淀重懸在由50mM Tris(pH 7.4)和1mM EDTA組成的緩沖液中，均化，并在25,000×g離心20分鐘。沉淀重懸在由100mM Tris(pH 7.4)和10mM MgCl2組成的緩沖液中，并在-80℃貯存直至需要時(shí)。在分析當(dāng)日，將勻漿物融化并均化。在含有25mM Hepes(pH 7.4)、100mM NaCl、2mMCaCl2、5mM MgCl2、0.1％ BSA和1mM 1，10-菲咯啉的緩沖液中實(shí)施[125I]-ANP的結(jié)合。勻漿(1-10μg蛋白質(zhì)/孔)在4℃與Millipore濾盤的[125I]-ANP(25-30pM)和遞增濃度的競(jìng)爭(zhēng)性配體溫育120分鐘。測(cè)定通過(guò)添加冷的洗滌緩沖液(磷酸鹽緩沖鹽水)而終止，隨后使用真空多歧管過(guò)濾。使用γ計(jì)數(shù)器測(cè)定結(jié)合的放射活性。非特異性結(jié)合由[I125]-hANP與非轉(zhuǎn)染的HEK293膜結(jié)合而定義。使用GraphPad

曲線擬合軟件分析數(shù)據(jù)。
用于測(cè)定EC50的通用方法。構(gòu)建體的功能性評(píng)價(jià)通過(guò)測(cè)量胞內(nèi)cGMP在表達(dá)重組hNPR-A的HEK-293細(xì)胞中的聚積而實(shí)行。HEK-NPRA細(xì)胞通過(guò)在細(xì)胞解離緩沖液(Gibco，Life Technologies)中洗滌和離心而收獲。沉淀的細(xì)胞在含有10mM Hepes(pH7.4)、5mM MgCl2、200mM L-谷氨酰胺、1mM 1，10-菲咯啉和BSA(0.5mg/mL)的Hank氏平衡鹽溶液(HBSS)中重懸。在離心后，將細(xì)胞重懸在補(bǔ)充有0.5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)的以上緩沖液中。將細(xì)胞(約2×105/孔)添加至96孔平板的各孔中并在37℃溫育15分鐘。在預(yù)溫育時(shí)間后，將細(xì)胞在遞增濃度的構(gòu)建體存在下溫育額外15分鐘。反應(yīng)通過(guò)用溫度休克法裂解細(xì)胞而終止。反應(yīng)平板在干冰/乙醇浴中溫育15分鐘，隨后在90℃溫育10分鐘。使用cGMP FlashplateRIA(Perkin-Elmer)測(cè)量cGMP的聚積。通過(guò)使用非線性回歸分析用GraphPad

軟件確定數(shù)據(jù)分析和EC50值。
質(zhì)量測(cè)定和核磁共振分析。使用α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)作為基質(zhì)，通過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜法(正離子模式)分析PEG-綴合構(gòu)建體的質(zhì)量值。甲醇用于以構(gòu)建體對(duì)基質(zhì)比率分別是1:10、1:20和1:30的樣品制備?；蛘?，其它基質(zhì)如芥子酸(SA)和2，5-二羥基苯甲酸(DHB)和溶劑如乙腈-0.1％水性TFA可以用于樣品制備。使用Waters MicroMass ZQ裝置，利用陽(yáng)性模式進(jìn)行質(zhì)量值的其它測(cè)定。對(duì)于沒有PEG化的構(gòu)建體，將質(zhì)量測(cè)定值與計(jì)算值比較，并以質(zhì)量(mass weight)加二除以二((M+2)/2)的形式表述，除非另外說(shuō)明。
使用Bruker 300MHz分光計(jì)獲得質(zhì)子NMR數(shù)據(jù)。譜在構(gòu)建體于氘化溶劑如氯仿、DMSO或(如適合)甲醇中溶解后獲得。
使用帶YMC Pack Pro C18柱(4.6 x 50mm，3μ)的Waters Alliance HT進(jìn)行HPLC測(cè)量，其中所述的柱以逐步方法以1mL/分鐘進(jìn)行洗脫。使用溶劑A(含有0.1％三氟乙酸v/v的水)和溶劑B(含有0.1％三氟乙酸v/v的乙腈)作為流動(dòng)相。對(duì)于酮哌嗪中間體的分析，柱用10％B平衡并且隨后在8分鐘期間增加B至90％。對(duì)于肽的分析，柱用2％B平衡并且隨后在8分鐘期間增加B至90％。
動(dòng)物模型-血壓傳感器植入。大鼠用異氟烷誘導(dǎo)至麻醉的外科平面(surgical plane)并維持在熱墊上。剔除腹部毛發(fā)并用70％醇和聚維酮碘溶液擦洗。使用無(wú)菌技術(shù)，行正中線剖腹術(shù)以便暴露降主動(dòng)脈和腔靜脈。使用濕的無(wú)菌紗布和牽引器溫和地牽出腹部?jī)?nèi)容物。根據(jù)制造商說(shuō)明書(在DataSciences International′s Multiplus TL Series Device Surgical Manual 2000第3.1-3.10頁(yè)中描述)，將腹主動(dòng)脈小心地從周圍的脂肪和結(jié)締組織中剝離并插入血壓傳感器的導(dǎo)管。使用外科膠將該傳感器的導(dǎo)管固定就位，并且傳感器的本體通過(guò)縫合(4-0縫合絲線)至腹壁加以穩(wěn)定。小心確保在該操作期間保持止血并且血流不是有害的(例如主動(dòng)脈每次不被閉塞超過(guò)3分鐘)。使用無(wú)線電遙測(cè)信號(hào)驗(yàn)證傳感器的放置。在放置傳感器后，除去紗布海綿并且用無(wú)菌鹽水沖洗腹腔。隨后用不吸收性縫線(4-0縫合絲線)以單純間斷縫合方式縫合封閉腹部切口。使用吸收性縫線(4-0薇喬(vicryl))閉合皮膚。最后，從異氟烷移走動(dòng)物并置于溫暖環(huán)境中，同時(shí)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，直至動(dòng)物完全清醒。
手術(shù)誘導(dǎo)充血性心力衰竭(容量超負(fù)荷)。在這個(gè)操作中，降主動(dòng)脈和腔靜脈按照與遙測(cè)裝置植入操作中相同的方式進(jìn)行暴露。一旦接近腎臟和髂骨分叉之間的血管，用1.8mm針頭(外徑)穿刺降主動(dòng)脈。將該針頭推進(jìn)至下腔靜脈并回撤。用組織粘合劑密封降主動(dòng)脈內(nèi)的腹側(cè)穿刺部位。通過(guò)腔靜脈腫脹和靜脈血與動(dòng)脈血混合以肉眼方式證實(shí)旁路在主動(dòng)脈和腔靜脈之間的持續(xù)存在。在也植入壓力傳感器的情況下，同時(shí)進(jìn)行這兩個(gè)操作。在Flaim，S.F.、W.J.Minteer、S.H.Nellis和DP.ClarkChronic arteriovenousshuntevaluation of a model for heart failure in rat.Am.J.Physiol.236H698-H704(1979)以及Garcia，R.和S.DieboldSimple，rapid and effectivemethod of producing aortocaval shunts in the rat.Cardiovasc.Res.24430-432(1990)中描述的一般方法通過(guò)引用的方式并入本文。
血壓監(jiān)測(cè)。使用Dataquest A.R.T.Gold軟件3.0版(Data SciencesInternational)收集和分析來(lái)自血壓傳感器(型號(hào)TA11PA-C40，Data SciencesInternational，St Paul，MN)的遙測(cè)信號(hào)。大鼠每日在大體相同的時(shí)間上觀察。居住籠內(nèi)的每只大鼠置于觀察室中的接收器上并允許其對(duì)位置改變作出調(diào)整30分鐘。進(jìn)行基線記錄30分鐘，隨后立即進(jìn)行投藥，IV投藥后立即進(jìn)行治療記錄135分鐘，SC投藥后進(jìn)行治療記錄210分鐘。將數(shù)據(jù)與給予鹽水后的結(jié)果以如此方式進(jìn)行比較，其中所述的方式與先前在Clemens，L.E.，R.G.Almirez，K.A.Baudouin，E.B.Grossbard和A.A.ProtterHumanbrain natriuretic peptide reduces blood pressure in normotensive and acutenorepinephrine-induced hypertensive rabbits.Am.J.Hypertens.10654-661(1997)中發(fā)表的方法相似，該文獻(xiàn)通過(guò)引用的方式并入本文。
利尿和鈉尿排泄。大鼠用戊巴比妥鈉誘導(dǎo)至麻醉的外科平面并維持在熱墊上。剔除腹部毛發(fā)并用70％醇和聚維酮碘溶液擦洗。使用無(wú)菌技術(shù)，行正中線剖腹術(shù)以便暴露膀胱。向膀胱的腹表面引入荷包縫合并且在縫合區(qū)內(nèi)行細(xì)小切口。將導(dǎo)管的擴(kuò)口端插入該切口并且將荷包縫合在導(dǎo)管周圍收緊以確保導(dǎo)管就位。尿液在多個(gè)時(shí)間間隔上在投藥之前或之后以如此方式收集至預(yù)先稱重的微量離心管內(nèi)，其中所述的方式與Abassi，Z.A.、J.R.Powell、E.Golomb和H.R.KeiserRenal and systemic effects of urodilatin inrats with high-output heart failure.Am.J.Physiol.262F615-F621(1992)中發(fā)表的方法相似，該文獻(xiàn)通過(guò)引用的方式并入本文。尿量通過(guò)重量確定。
實(shí)施例1 以下構(gòu)建體使用一種或多種前述方法的氨基酸替代物而合成，純化并確定質(zhì)量，結(jié)果如下所示 表1

































實(shí)施例2 使用一種或多種前述方法的氨基酸替代物合成表2的以下構(gòu)建體，純化并確定質(zhì)量 表2



實(shí)施例3 如上所述測(cè)試具有以下結(jié)構(gòu)的構(gòu)建體1-1。

在受體結(jié)合研究中，該構(gòu)建體在測(cè)定系統(tǒng)中的平均Ki為0.3nM，其中hANP的Ki為0.05nM，mini-ANP的Ki為0.6nM。構(gòu)建體1-1在測(cè)定系統(tǒng)中的EC50為2nM，其中hANP的EC50為0.6nM，mini-ANP的EC50為3.3nM。
實(shí)施例4 如上所述測(cè)試具有以下結(jié)構(gòu)的構(gòu)建體1-9。

在受體結(jié)合研究中，該構(gòu)建體在測(cè)定系統(tǒng)中的平均Ki為0.9nM，其中hANP的Ki為0.05nM，mini-ANP的Ki為0.6nM。構(gòu)建體1-9在測(cè)定系統(tǒng)中的EC50為3.5nM，其中hANP的EC50為0.6nM，mini-ANP的EC50為3.3nM。
實(shí)施例5 如上所述測(cè)試具有以下結(jié)構(gòu)的構(gòu)建體1-8。

在受體結(jié)合研究中，該構(gòu)建體在測(cè)定系統(tǒng)中的平均Ki為0.2nM，其中hANP的Ki為0.05nM，mini-ANP的Ki為0.6nM。構(gòu)建體1-8在測(cè)定系統(tǒng)中的EC50為2nM，其中圖1的構(gòu)建體的EC50為0.6nM，mini-ANP的EC50為3.3nM。
實(shí)施例6 如上所述測(cè)試具有以下結(jié)構(gòu)的構(gòu)建體1-18。

在受體結(jié)合研究中，該構(gòu)建體在測(cè)定系統(tǒng)中的平均Ki為0.027nM，其中hANP的Ki為0.05nM，mini-ANP的Ki為0.6nM。構(gòu)建體1-18在測(cè)定系統(tǒng)中的EC50為0.2nM，其中hANP的EC50為0.6nM，mini-ANP的EC50為3.3nM。
構(gòu)建體1-18在大鼠和人血漿內(nèi)均穩(wěn)定，在37℃的T1/2約為2小時(shí)。當(dāng)IV施用時(shí)，在大鼠中的體內(nèi)T1/2是約20分鐘。當(dāng)通過(guò)皮下途徑施用時(shí)，大約25-50％的注射劑量在大鼠中是生物可利用的。圖2描述構(gòu)建體1-18在大鼠中隨時(shí)間的濃度，單位ng/mL，“SC”的曲線表示以劑量5mg/kg皮下施用，并且“IV”的曲線表示以劑量2mg/kg靜脈內(nèi)施用。
實(shí)施例7 將血壓傳感器如標(biāo)題“動(dòng)物模型-血壓傳感器植入”所述植入大鼠。研究如標(biāo)題“血壓監(jiān)測(cè)”所述實(shí)施。研究包括確定與鹽水相比，施用本發(fā)明構(gòu)建體后的收縮期血壓改變。在一項(xiàng)研究中，通過(guò)IV途徑以0.03mg/kg體重(n＝4)、0.1mg/kg(n＝7)或0.3mg/kg(n＝8)向大鼠施用構(gòu)建體1-63。在IV施用之前5分鐘并在施用后5、10和15分鐘監(jiān)測(cè)血壓，并且其后以15分鐘為間隔直至施用后135分鐘。在對(duì)于全部劑量的全部時(shí)間點(diǎn)上，測(cè)量的收縮期血壓一般以劑量依賴方式低于鹽水對(duì)照，血壓降低從最小約5％至最大約19％，并且在施用后10至45分鐘見到最大反應(yīng)。
在第二項(xiàng)研究中，通過(guò)皮下途徑以0.3mg/kg體重(n＝8)、1.0mg/kg(n＝7)或3.0mg/kg(n＝7)向大鼠施用構(gòu)建體1-63。在SC施用之前15分鐘和5分鐘并在施用后5、10和15分鐘監(jiān)測(cè)血壓，并且其后以15分鐘為間隔直至施用后210分鐘。在對(duì)于全部劑量的全部時(shí)間點(diǎn)上，測(cè)量的收縮期血壓低于鹽水對(duì)照。在0.3mg/kg SC上，收縮壓的降低在施用后2小時(shí)是2％的范圍內(nèi)，這屬于誤差范圍。然而在對(duì)于0.3mg/kg SC的其它時(shí)間點(diǎn)上，以及在對(duì)于1.0和3.0mg/kg的全部時(shí)間點(diǎn)上，降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并且低于鹽水對(duì)照。在3.0mg/kg上，在施用后45至120分鐘見到大約20％-23％的收縮壓最大降低，而在1.0mg/kg上，在相同時(shí)間段上見到17％-19％的收縮壓最大降低。
在第三項(xiàng)研究中，通過(guò)IV途徑以0.3mg/kg體重(n＝8)向大鼠施用構(gòu)建體1-18。在IV施用之前5分鐘并在施用后5、10和15分鐘監(jiān)測(cè)血壓，并且其后以15分鐘為間隔直至施用后135分鐘。在對(duì)于全部劑量的全部時(shí)間點(diǎn)上，測(cè)量的收縮期血壓低于鹽水對(duì)照，血壓降低從最小約5％至最大約13％，并且在施用后15分鐘時(shí)見到最大反應(yīng)。
在第四項(xiàng)研究中，通過(guò)皮下途徑以0.1mg/kg體重(n＝4)、0.3mg/kg(n＝7)或1.0mg/kg(n＝8)向大鼠施用構(gòu)建體1-18。在SC施用之前15分鐘和5分鐘并在施用后5、10和15分鐘監(jiān)測(cè)血壓，并且其后以15分鐘為間隔直至施用后225分鐘。在對(duì)于全部劑量的全部時(shí)間點(diǎn)上，測(cè)量的收縮期血壓低于鹽水對(duì)照。在0.1mg/kg SC上，收縮壓的降低在約2小時(shí)至1.5小時(shí)后不是統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)的。然而，在對(duì)于0.1mg/kg SC的全部其它時(shí)間點(diǎn)上，及在對(duì)于0.3的小于2小時(shí)至1.5小時(shí)的全部時(shí)間點(diǎn)上，以及在對(duì)于1.0mg/kg的全部時(shí)間點(diǎn)上，降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異并且低于鹽水對(duì)照。在1.0mg/kg上，在施用后45至120分鐘見到大約9％-13％的收縮壓最大降低。
實(shí)施例8 大鼠中的總尿排出量如標(biāo)題“利尿和鈉尿排泄”所述而測(cè)量。含四只動(dòng)物的組通過(guò)IV途徑施用構(gòu)建體1-18和1-63，動(dòng)物接受0.03mg/kg體重、0.1mg/kg和0.3mg/kg的構(gòu)建體1-18，以及接受0.1mg/kg體重、0.3mg/kg和1.0mg/kg的構(gòu)建體1-63。測(cè)量投藥后經(jīng)30分鐘的總尿排出量，結(jié)果如圖3中所示。
在獨(dú)立的研究中，類似地測(cè)量含四只動(dòng)物的組中的總尿量，其中所述的動(dòng)物通過(guò)SC途徑接受構(gòu)建體1-63的0.3、1.0和3.0mg/kg體重的劑量，以鹽水用作對(duì)照。測(cè)量投藥后45分鐘期間的總尿排出量。結(jié)果如圖4中所示。
實(shí)施例9 所選的本發(fā)明構(gòu)建體的藥物代謝動(dòng)力學(xué)在雄性Sprague-Dawley大鼠中在靜脈內(nèi)(IV)或皮下(SC)施用后加以研究。測(cè)定所選的構(gòu)建體在大鼠中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)并將它們?cè)诒?和表4中匯總。
將如表4和表5中所示的本發(fā)明構(gòu)建體制備為TFA鹽并溶解在鹽水中，以1mL/kg用于IV和SC投藥途徑。通過(guò)股動(dòng)脈插管以靶劑量0.3mg/kg和2mg/kg施用IV劑量。以靶劑量1mg/kg和5mg/kg施用SC劑量。動(dòng)物在投藥前不作過(guò)夜禁食。血液在預(yù)定時(shí)間間隔上從頸靜脈中先前植入的插管內(nèi)收集到含有EDTA二鉀的容器中。血漿通過(guò)對(duì)血液離心而獲得并貯存在-70℃直至分析。
數(shù)據(jù)分析利用LC-MS/MS系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括配備100μL進(jìn)樣環(huán)(injection loop)、兩臺(tái)Shimadzu泵和一臺(tái)Sciex API 4000質(zhì)譜儀的LeapTechnologies HTS-PAL自動(dòng)進(jìn)樣器。分析物的色譜分離以逐步方法在以1mL/分鐘洗脫的Luna C18柱(4.6 x 100mm；3μ)上實(shí)現(xiàn)。使用溶劑A(含有0.1％甲酸v/v的水)和溶劑B(含有0.1％甲酸v/v的乙腈)作為流動(dòng)相。最初，該柱用5％B平衡，并且在進(jìn)樣2分鐘后，B在0.5分鐘期間增加至60％并在該濃度上保持1.1分鐘。B的組成在1.4分鐘內(nèi)增加至80％并維持0.3分鐘。B的組成在0.2分鐘內(nèi)返回至5％?？傔\(yùn)行時(shí)間是6分鐘。使用在正離子模式下操作的Turbo Ionspray界面實(shí)現(xiàn)分析物的質(zhì)譜檢測(cè)。分析物應(yīng)答通過(guò)質(zhì)子化前體離子轉(zhuǎn)變至所選產(chǎn)物離子的多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)進(jìn)行測(cè)量。
血漿等分試樣(100μL)與內(nèi)標(biāo)物(IS)混合并以96孔模式，使用C8柱體(cartridage)進(jìn)行固相提取。用在水中的1mL甲醇和1mL 2％氫氧化銨預(yù)處理C8柱體后，將血漿樣品加載至柱體上。在用40％甲醇中的2％氫氧化銨洗滌柱體后，用1mL 60％甲醇中的2％乙酸將構(gòu)建體從柱體洗脫。將洗脫液轉(zhuǎn)移至清潔平板，在N2氣流下蒸發(fā)并將殘余物在LC-MS/MS分析之前重懸于100μL的20mM乙酸銨和乙腈(6:4，v:v)中。校正標(biāo)準(zhǔn)(2-1000ng/mL)以相同方式通過(guò)添加多種濃度的構(gòu)建體及其相應(yīng)IS至100μL未處理的大鼠血漿中而制備。類似地，質(zhì)控樣品通過(guò)以3個(gè)不同構(gòu)建體濃度(3.5、75和750ng/mL)添加構(gòu)建體和內(nèi)標(biāo)物至100μL對(duì)照血漿而制備。
通過(guò)Sciex Analyst 1.4.1軟件獲取并處理數(shù)據(jù)。將構(gòu)建體對(duì)內(nèi)標(biāo)物(IS)的峰面積比標(biāo)注為構(gòu)建體的標(biāo)稱濃度的函數(shù)。使用加權(quán)系數(shù)1/x的線性回歸來(lái)計(jì)算血漿樣品中構(gòu)建體的濃度。本測(cè)定法的定量下限(LLOQ)一般是2ng/mL或5ng/mL。
通過(guò)已建立的非房室方法(non-compartmental method)(Win-Nonlin版本2.1；Consulting Inc.，Palo Alto，CA)計(jì)算藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。使用上升斜率內(nèi)的線性梯形內(nèi)插法和下降斜率內(nèi)的對(duì)數(shù)梯形內(nèi)插法而確定血漿濃度對(duì)時(shí)間曲線下的面積(AUC)。從等式Ct/kel中估計(jì)出從最后的可測(cè)量濃度至無(wú)限大的AUC的部分，其中Ct代表最后的可測(cè)量濃度并且kel是消除速率常數(shù)。后者通過(guò)在半對(duì)數(shù)曲線圖的末端相處的線性回歸從濃度對(duì)時(shí)間的曲線中測(cè)定。
表3 IV施用后構(gòu)建體在SD大鼠中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)匯總 表4 SC施用后構(gòu)建體在SD大鼠中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)
實(shí)施例10 制備用于藥學(xué)用途的1-132的制劑。1-132以乙酸鹽形式使用。將該制劑置于加塞并密封的1mL小藥瓶?jī)?nèi)，每只小藥瓶含有 0.1mg 1-132乙酸鹽，基于乙酸鹽的肽凈重 1.181mg琥珀酸，NF 47.0甘露醇，USP 1N NaOH，USP，根據(jù)需要調(diào)節(jié)pH 1N HCl，USP，根據(jù)需要調(diào)節(jié)pH 注射用水，至1mL體積 終產(chǎn)物的pH根據(jù)需要用1N NAOH或1N HCl調(diào)節(jié)至pH4.00±0.05。產(chǎn)生的溶液在裝瓶前經(jīng)無(wú)菌0.22微米濾器過(guò)濾并貯存在5℃直至使用。
產(chǎn)生用于藥學(xué)用途的1-132的備選制劑，與上文的制劑相似，不過(guò)還包括約0.02mg與0.06mg之間的雙羥萘酸二鈉，以至于產(chǎn)生的溶液是雙羥萘酸鹽混懸劑。
實(shí)施例11 使用一種或多種前述方法的氨基酸替代物合成以下構(gòu)建體，純化并使其與PEG-5K-OSu綴合，并確定質(zhì)量，結(jié)果如下表5中所示 表5


實(shí)施例12 使用一種或多種前述方法的氨基酸替代物合成表6的以下構(gòu)建體，純化并使其與PEG-5K-OSu或另一種活性PEG綴合，并確定質(zhì)量 表6


實(shí)施例13 如上所述測(cè)試具有以下結(jié)構(gòu)的構(gòu)建體5-1。

在受體結(jié)合研究中，該構(gòu)建體在測(cè)定系統(tǒng)中的平均Ki為70nM，其中hANP的Ki為0.05nM，mini-ANP的Ki為0.6nM。
實(shí)施例14 如上所述測(cè)試具有以下結(jié)構(gòu)的構(gòu)建體5-9。

在受體結(jié)合研究中，該構(gòu)建體在測(cè)定系統(tǒng)中的平均Ki為大約2nM，其中hANP的Ki為0.05nM，mini-ANP的Ki為0.6nM。構(gòu)建體5-9在測(cè)定系統(tǒng)中的EC50為大約9.5nM，其中hANP的EC50為0.6nM，mini-ANP的EC50為3.3nM。
實(shí)施例15 將本發(fā)明的任何構(gòu)建體，包括而不限于構(gòu)建體1-1至1-248，2-1至2-21，5-1至5-18和6-1至6-12配制成定時(shí)釋放注射劑。將所述構(gòu)建體中的任一種與PEG如聚乙二醇3350和任選地一種或多種額外的賦形劑和防腐劑一起配制，其中所述的賦形劑和防腐劑包括但不限于賦形劑如鹽、聚山梨醇酯80、調(diào)節(jié)pH的氫氧化鈉或氫氯酸等。或者，將所述構(gòu)建體中的任一種與聚(原酸酯)和任選地一種或多種額外的賦形劑一起配制，其中所述的聚(原酸酯)包括在聚合主鏈中具有任何可變?nèi)樗岚俜趾康淖源呋跃?原酸酯)。可以使用聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)聚合物(PLGA聚合物)，優(yōu)選具有親水端的PLGA聚合物。
實(shí)施例16 患有充血性心力衰竭如伴有休息或最小活動(dòng)時(shí)呼吸困難的急性代償失調(diào)性充血性心力衰竭的患者通過(guò)皮下注射施用包括構(gòu)建體1-1至1-248、2-1至2-21、5-1至5-18和6-1至6-12中的任何一種或多種構(gòu)建體的制劑，包括如通過(guò)實(shí)施例10的任何方法所得的制劑。
實(shí)施例17 患有慢性充血性心力衰竭的患者通過(guò)例如在臀肌或三角肌內(nèi)注射如深部肌內(nèi)注射而施用實(shí)施例15的定時(shí)釋放的可注射制劑。
實(shí)施例18 申請(qǐng)人:也發(fā)現(xiàn)本發(fā)明構(gòu)建體的抗中性內(nèi)肽酶消化抗性與其藥物代謝動(dòng)力學(xué)清除率(CL)之間的反關(guān)聯(lián)性，如下表7中所示。中性內(nèi)肽酶(“NEP”)是活化并清除全部三種人利尿鈉肽的內(nèi)源性酶。NEP存在于腎小管細(xì)胞和血管細(xì)胞內(nèi)。NEP是在哺乳動(dòng)物之間高度同源的。在大鼠與小鼠之間的NEP同一性百分?jǐn)?shù)是98.5％，在人與小鼠之間的NEP同一性百分?jǐn)?shù)是93.6％，而在人與大鼠之間的NEP同一性百分?jǐn)?shù)是93.7％。
使用以下實(shí)驗(yàn)方法評(píng)估本發(fā)明各種構(gòu)建體的NEP抗性。全部構(gòu)建體在0.1M Tris-HCL緩沖液(pH7.4)中稀釋至100μM。將40μL稀釋的構(gòu)建體添加至各管并將全部管保持在冰上。將40μL稀釋的NEP(8ng/μL的人重組NEP(R&D Systems，Minneapolis，MN，目錄號(hào)1182-ZN)或2.5ng/μL的小鼠NEP(R&D Systems，目錄號(hào)1126-ZN))添加至各管。將管溫和地混合并轉(zhuǎn)動(dòng)。隨后將全部管在37℃溫育0、0.5、1、1.5和2小時(shí)。在溫育時(shí)間結(jié)束時(shí)，通過(guò)添加5μL 10％ TFA而終止反應(yīng)。構(gòu)建體用TCEP(三[2-羧乙基]膦線性化。隨后通過(guò)HPLC和/或LC/MS分析NEP對(duì)構(gòu)建體的活性程度。數(shù)據(jù)分析包括測(cè)定剩余起始材料(即未消化的肽構(gòu)建體)的百分?jǐn)?shù)和各蛋白酶裂解片段的百分?jǐn)?shù)和序列。
表7
因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供根據(jù)本發(fā)明任一式的構(gòu)建體，其在所述的hNEP抗性測(cè)定條件下1小時(shí)后留下至少80％的起始材料。本發(fā)明的相關(guān)實(shí)施方案提供根據(jù)本發(fā)明任一式的構(gòu)建體，其在所述的hNEP抗性測(cè)定條件下1小時(shí)后留下至少90％的起始材料。本發(fā)明的又一相關(guān)實(shí)施方案提供根據(jù)本發(fā)明任一式的構(gòu)建體，其在所述的hNEP抗性測(cè)定條件下1小時(shí)后留下至少95％的起始材料。在任一這些實(shí)施方案的變型中，構(gòu)建體還顯示在測(cè)定條件下2小時(shí)后留下至少80％的起始材料。在相關(guān)的變型中，構(gòu)建體還顯示在測(cè)定條件下2小時(shí)后留下至少90％的起始材料。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供根據(jù)本發(fā)明任一式的構(gòu)建體，其在所述的hNEP抗性測(cè)定條件下1小時(shí)后留下不超過(guò)90％的起始材料。本發(fā)明的相關(guān)實(shí)施方案提供根據(jù)本發(fā)明任一式的構(gòu)建體，其在所述的hNEP抗性測(cè)定條件下1小時(shí)后留下不超過(guò)80％的起始材料。本發(fā)明的又一相關(guān)實(shí)施方案提供根據(jù)本發(fā)明任一式的構(gòu)建體，其在所述的hNEP抗性測(cè)定條件下1小時(shí)后留下不超過(guò)95％的起始材料。在這兩種實(shí)施方案之一的變型中，構(gòu)建體還顯示在測(cè)定條件下2小時(shí)后留下不超過(guò)90％的起始材料。在相關(guān)的變型中，構(gòu)建體還顯示在測(cè)定條件下2小時(shí)后留下不超過(guò)80％的起始材料。
因此，本發(fā)明的構(gòu)建體可以基于它們顯示的NEP抗性程度而針對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行選擇。
前述實(shí)施例可以通過(guò)用本發(fā)明一般描述或具體描述的反應(yīng)物和/或操作條件替代先前實(shí)施例中使用的那些反應(yīng)物和/或操作條件而重復(fù)，獲得相似的成功。
盡管本發(fā)明已經(jīng)參考那些優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，然而其它實(shí)施方案可以達(dá)到相同的結(jié)果。本發(fā)明的變體和變型對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的并且本發(fā)明意圖覆蓋全部此類變型和等效物。上文援引和/或附件中的所有參考文獻(xiàn)、申請(qǐng)、專利和出版物的全部公開內(nèi)容和相應(yīng)申請(qǐng)的全部公開內(nèi)容因而通過(guò)引用的方式并入。
權(quán)利要求
1.具有氨基端和羧基端的環(huán)狀構(gòu)建體，其與利尿鈉肽受體結(jié)合并包含多個(gè)氨基酸殘基和至少一個(gè)式I的氨基酸替代物
其中
R和R′各自獨(dú)立地是H、或者天然或非天然氨基酸的側(cè)鏈部分、或者氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物；
x是1或2；
Y是CH2或C＝O；
W是CH2、NH或NR″′；
Z是H或CH3；
J是-C(＝O)-，除非所述替代物位于構(gòu)建體的羧基端位置處，在這種情況下J是-H、-OH、-C(＝O)-OH、-C(＝O)-NH2或羧基端封端基團(tuán)；
Q是鍵，除非所述替代物位于構(gòu)建體的氨基端位置處，在這種情況下Q是-H或胺封端基團(tuán)；
R″′是?；?、C1-C17直鏈或支鏈的烷基鏈、C2-C19直鏈或支鏈的烷基?；湣1-C17直鏈或支鏈的Ω氨基脂族基團(tuán)、或者C1-C17直鏈或支鏈的Ω氨基脂族?；?；
n是0、1或2；并且
用星號(hào)標(biāo)記的碳原子可以具有任何立體化學(xué)構(gòu)型；
其中至少一個(gè)式I的替代物與所述多個(gè)氨基酸殘基中的至少一個(gè)共價(jià)連接；并且
構(gòu)建體通過(guò)兩個(gè)非相鄰氨基酸殘基的側(cè)鏈之間、氨基酸殘基的側(cè)鏈與非相鄰氨基酸替代物之間、氨基酸殘基的端基與非相鄰氨基酸殘基的側(cè)鏈之間、氨基酸殘基的端基與非相鄰氨基酸替代物之間、或兩個(gè)非相鄰氨基酸替代物之間形成鍵而環(huán)化。
2.權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其還包含至少一個(gè)輔基，其共價(jià)連接至至少一個(gè)所述氨基酸殘基的側(cè)鏈或端基中的反應(yīng)基、當(dāng)替代物處于所述構(gòu)建體的氨基端位置處時(shí)其共價(jià)連接至胺封端基團(tuán)中的胺基或反應(yīng)基、或者當(dāng)替代物位于所述構(gòu)建體的羧基端位置處時(shí)其共價(jià)連接至羧基端封端基團(tuán)中的羧基、胺基或反應(yīng)基。
3.權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中所述替代物位于構(gòu)建體的羧基端位置處并且J是由以下基團(tuán)構(gòu)成的羧基端封端基團(tuán)
-(CH2)m-OH、
-C(＝O)-(CH2)m-N(v1)(v2)、
-C(＝O)-O-(CH2)m-CH3、
-O-(CH2)m-CH3、
-O-(CH2)m-N(v1)(v2)、
-O-(CH2)m-OH、
-C(＝O)-NH-(CH2)m-S(v1)、
-C(＝O)-NH-(CH2)m-CH3、
-C(＝O)-NH-(CH2)m-N(v1)(v2)、
-C(＝O)-NH-((CH2)m-N(v1)(v2))2、
-C(＝O)-NH-CH(-C(＝O)-OH)-(CH2)m-N(v1)(v2)、
C(＝O)-NH-(CH2)m-NH-C(＝O)-CH(N(v1)(v2))((CH2)m-N(v1)(v2))或
-C(＝O)-NH-CH((-C(＝O)-N(v1)(v2))-(CH2)m-N(v1)(v2)，
包括前述基團(tuán)的全部(R)或(S)構(gòu)型，其中v1和v2各自獨(dú)立地是H或C1-C17直鏈或支鏈的烷基鏈，并且m在每種情況下獨(dú)立地是0-17。
4.權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中所述替代物位于構(gòu)建體的羧基端位置處并且J是由Ω氨基脂族基團(tuán)、末端芳基或芳烷基或任何單個(gè)天然或非天然α-氨基酸、β-氨基酸、α，α-雙取代氨基酸、N-取代氨基酸構(gòu)成的羧基端封端基團(tuán)，包括前述基團(tuán)的全部(R)或(S)構(gòu)型，任選與如權(quán)利要求2中所定義的羧基端封端基團(tuán)組合。
5.權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中所述替代物位于構(gòu)建體的氨基端位置處并且Q是由下列基團(tuán)構(gòu)成的胺封端基團(tuán)
-(CH2)m-N(v3)(v4)、
-(CH2)m-CH3、
-(CH2)m-O(v3)、
-(CH2)m-C(＝O)-(v3)、
-(CH2)m-C(＝O)-O-(v3)、
-(CH2)m-S(v3)、
-C(＝O)-(CH2)m-CH3、
-C(＝O)-(CH2)m-N(v3)(v4)、
-C(＝O)-(CH2)m-C(＝O)-(v3)、
-C(＝O)-(CH2)m-O(v3)或
-C(＝O)-(CH2)m-S(v3)；
其中v3和v4各自獨(dú)立地是H、C1-C17直鏈或支鏈的烷基鏈或C2-C19直鏈或支鏈的烷基?；?，前提是若v3或v4之一是烷基?；?，則另一個(gè)v3或v4是H，并且m是0-17。
6.權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體包含至少一個(gè)式II的替代物
其中所述替代物位于除羧基端或氨基端之外的任何位置，并且虛線表示肽鍵。
7.權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中至少一個(gè)式I的替代物位于構(gòu)建體的羧基端處，并且通過(guò)肽鍵與該構(gòu)建體共價(jià)連接，從而所述替代物具有下式
其中虛線表示肽鍵。
8.權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中至少一個(gè)式I的替代物位于所述構(gòu)建體的氨基端處，并且通過(guò)一個(gè)肽鍵與該構(gòu)建體共價(jià)連接，從而所述替代物具有下式
其中虛線表示肽鍵。
9.權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中至少一個(gè)式I的替代物位于所述構(gòu)建體的羧基端處，Q是鍵，并且該構(gòu)建體的R和R′各自獨(dú)立地是H、或者天然或非天然氨基酸的側(cè)鏈部分、或者帶有包含至少一個(gè)氮原子的雜原子基團(tuán)的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物，前提是R和R′的至少之一不是H。
10.權(quán)利要求9所述的構(gòu)建體，其中帶有包含至少一個(gè)氮原子的雜原子基團(tuán)的R和R′的至少之一是式-(CH2)y-R＂，其中y是1-5并且R＂是包含至少一個(gè)氮原子的雜原子基團(tuán)。
11.權(quán)利要求10所述的構(gòu)建體，其中R＂是
-NH2、
-NH-C(＝NH)-NH2、
-NH-(CH2)y-NH2、
-NH-C(＝O)-NH2、
-C(＝O)-NH2、
-C(＝O)-NH-CH3、
-C(＝O)-NH-(CH2)y-NH2、
-NH-C(＝NH)-NH-Me、
-NH-C(＝NH)-NH-Et、
-NH-C(＝NH)-NH-Pr、
-NH-C(＝NH)-NH-Pr-i、
-NH-C(＝O)-CH3、
-NH-C(＝O)-CH2-CH3、
-NH-C(＝O)-CH-(CH3)2、
-NH-C(＝O)-O-CH3、
-NH-C(＝O)-O-CH2-CH3、
-NH-C(＝O)-O-C-(CH3)3、
-NH-C(＝O)-NH-CH3、
-NH-C(＝N-C(＝O)-O-C-(CH3)3)-NH-C(＝O)-O-C-(CH3)3、
-N(C(＝O)-O-C-(CH3)3)-C(＝NH)-NH-C(＝O)-O-C-(CH3)3、
或
其中y是1-5。
12.權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中所述利尿鈉肽受體是ANP、BNP、CNP、sCP、DNP、TNP-a、TNP-b或TNP-c的受體。
13.權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中所述多個(gè)氨基酸殘基包含天然或非天然的α-氨基酸、β-氨基酸、N-取代氨基酸或α，α-雙取代氨基酸，包括任一前述氨基酸殘基的全部(R)或(S)構(gòu)型，或前述氨基酸殘基的任何組合。
14.權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中所述多個(gè)氨基酸殘基中的至少兩個(gè)殘基由非肽鍵連接。
15.權(quán)利要求14所述的構(gòu)建體，其中至少一個(gè)所述非肽鍵是-CH2-NH-、-CH2-S-、-CH2-O-或-C(＝O)-CH2-、前述任一非肽鍵的電子等排物或-CH2-CH2-或-CH＝CH-。
16.權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其包含12至15個(gè)氨基酸殘基和1個(gè)式I的替代物。
17.權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其包含11至14個(gè)氨基酸殘基和2個(gè)式I的替代物。
18.權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其包含11至14個(gè)氨基酸殘基、1個(gè)式II的替代物和1個(gè)在氨基端或羧基端的式I的替代物。
19.權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體在施用至哺乳動(dòng)物時(shí)表現(xiàn)出相對(duì)于不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列的一種或多種優(yōu)勢(shì)，所述優(yōu)勢(shì)選自增加的抗酶降解性、增加的循環(huán)半壽期、增加的生物利用度、增加的效力和延長(zhǎng)的作用持續(xù)時(shí)間。
20.權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中對(duì)于至少一個(gè)替代物，R和R′之一是H，x是1，Y是C＝O，W是NH，Z是H并且n是0。
21.權(quán)利要求3所述的構(gòu)建體，其中所述替代物位于構(gòu)建體的羧基端位置處，并且J是-C(＝O)-NH2、-C(＝O)-OH、-CH2-OH、-C(＝O)-NH-(CH2)4-NH2、-C(＝O)-NH-(CH2)5-NH2、-C(＝O)-NH-(CH2)6-NH2、-C(＝O)-NH-(CH2)7-NH2或-C(＝O)-NH-(CH2)8-NH2。
22.權(quán)利要求2所述的構(gòu)建體，其中所述輔基包含至少一個(gè)聚合物序列，所述的聚合物序列包含重復(fù)單元，所述重復(fù)單元包含碳原子和氫原子。
23.權(quán)利要求22所述的構(gòu)建體，其中所述重復(fù)單元還包含其它原子。
24.權(quán)利要求22所述的構(gòu)建體，其中所述重復(fù)單元還包含氧原子。
25.權(quán)利要求22所述的構(gòu)建體，其中所述聚合物序列是水溶性聚合物序列。
26.權(quán)利要求22所述的構(gòu)建體，其中所述聚合物序列是聚醚、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚噁唑啉或聚(丙烯酰嗎啉)。
27.權(quán)利要求26所述的構(gòu)建體，其中所述聚醚是聚乙二醇(PEG)。
28.權(quán)利要求27所述的構(gòu)建體，其中包含PEG的輔基以連接基團(tuán)衍生化。
29.權(quán)利要求27所述的構(gòu)建體，其中所述PEG的分子量為約200MW至約40,000MW。
30.權(quán)利要求2所述的構(gòu)建體，其中所述輔基包含胺反應(yīng)基。
31.權(quán)利要求30所述的構(gòu)建體，其中所述輔基共價(jià)地連接至至少一個(gè)所述氨基酸殘基的側(cè)鏈中的活性胺。
32.權(quán)利要求30所述的構(gòu)建體，其中當(dāng)所述替代物位于構(gòu)建體的羧基端位置處時(shí)，所述輔基共價(jià)連接至羧基端封端基團(tuán)中的活性胺。
33.權(quán)利要求30所述的構(gòu)建體，其中當(dāng)所述替代物位于構(gòu)建體的氨基端位置處時(shí)，所述輔基共價(jià)連接至胺封端基團(tuán)中的活性胺。
34.權(quán)利要求30所述的構(gòu)建體，其中當(dāng)所述替代物位于構(gòu)建體的氨基端位置處時(shí)，所述輔基共價(jià)連接至所述替代物的胺基中的活性胺。
35.權(quán)利要求2所述的構(gòu)建體，其中所述輔基包含羧基反應(yīng)基。
36.權(quán)利要求35所述的構(gòu)建體，其中所述輔基共價(jià)連接至至少一個(gè)所述氨基酸殘基的側(cè)鏈中的活性羧基。
37.權(quán)利要求35所述的構(gòu)建體，其中當(dāng)所述替代物位于構(gòu)建體的羧基端位置處時(shí)，所述輔基共價(jià)連接至羧基端封端基團(tuán)中的活性羧基。
38.權(quán)利要求2所述的構(gòu)建體，其中所述輔基包含硫氫基反應(yīng)基。
39.權(quán)利要求38所述的構(gòu)建體，其中所述輔基共價(jià)連接至至少一個(gè)所述氨基酸殘基的側(cè)鏈中的活性硫氫基。
40.權(quán)利要求38所述的構(gòu)建體，其中當(dāng)所述替代物位于構(gòu)建體的氨基端位置時(shí)，所述輔基共價(jià)連接至胺封端基團(tuán)中的活性硫氫基，或者當(dāng)所述替代物位于構(gòu)建體的羧基端位置處是，所述輔基共價(jià)連接至羧基端封端基團(tuán)中的活性硫氫基。
41.構(gòu)建體，其包含11至13個(gè)氨基酸殘基和至少一個(gè)氨基酸替代物，所述替代物位于除羧基端位置之外的任何位置，并具有下式
其中Q、R、R′、Y、W、Z、x和n是如權(quán)利要求1中對(duì)式I所定義，且所述構(gòu)建體包含在羧基端位置上的下式的一個(gè)氨基酸替代物
其中對(duì)于在羧基端位置上的氨基酸替代物，Y、W、Z和x是如權(quán)利要求1中對(duì)式I所定義，J是如權(quán)利要求3中所定義，R和R′中的至少一個(gè)是包含至少一個(gè)氮原子的雜原子基團(tuán)并且具有式(CH2)y-R＂，其中y是1-5并且R＂是如權(quán)利要求11中所定義。
42.權(quán)利要求41所述的構(gòu)建體，其還包含至少一個(gè)輔基，其共價(jià)連接至至少一個(gè)所述氨基酸殘基的側(cè)鏈或端基中的反應(yīng)基、當(dāng)替代物處于所述構(gòu)建體的氨基端位置處時(shí)其共價(jià)連接至胺封端基團(tuán)中的胺基或反應(yīng)基、或者當(dāng)替代物位于所述構(gòu)建體的羧基端位置處時(shí)其共價(jià)連接至羧基端封端基團(tuán)中的羧基、胺基或反應(yīng)基。。
43.式III構(gòu)建體
其中
Aaa1是包括Nle、Ala、Leu、Ile、Val、Arg、Phe、Lys、Tyr、Asp、Nva、Met、Met(O)或Met(O2)的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體或是從Nle、Ala、Leu、Ile、Val、Arg、Phe、Lys、Tyr、Asp、Nva、Met、Met(O)或Met(O2)衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體，或是從Nle、Ala、Leu、Ile、Val、Arg、Phe、Lys、Tyr、Asp、Nva、Met、Met(O)或Met(O2)衍生的α，α-雙取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-雙取代氨基酸的全部(R)或(S)構(gòu)型，或Aaa1是包含C2-C18直鏈烷基、C3-C17支鏈烷基、C2-C18直鏈鏈烯基或炔基、或C3-C18支鏈鏈烯基或炔基的?；駻aa1是結(jié)構(gòu)如下的氨基酸替代物
其中虛線表示肽鍵；R和R′獨(dú)立地是H、直鏈或支鏈的C1-C6脂族鏈、-(CH2)y-S-CH3、-(CH2)y-S(＝O)-CH3、-(CH2)y-S(O2)-CH3、鍵和環(huán)丙烷、環(huán)丁烷、環(huán)戊烷或環(huán)己烷環(huán)，或C1-C3脂族鏈和環(huán)丙烷、環(huán)丁烷、環(huán)戊烷或環(huán)己烷環(huán)；x是1或2；Y是CH2或C＝O；W是CH2、NH或NR″′，Z是H或CH3；Q是-H、-(CH2)m-N(v3)(v4)、-(CH2)m-CH3、-(CH2)m-O(v3)、-(CH2)m-C(＝O)-(v3)、-(CH2)m-C(＝O)-O-(v3)、-(CH2)m-S(v3)、-C(＝O)-(CH2)m-CH3、-C(＝O)-(CH2)m-N(v3)(v4)、-C(＝O)-(CH2)m-C(＝O)-(v3)、-C(＝O)-(CH2)m-O(v3)或-C(＝O)-(CH2)m-S(v3)；R″′是?；?、C1-C17直鏈或支鏈的烷基鏈、C2-C19直鏈或支鏈的烷基酰基鏈、C1-C17直鏈或支鏈的Ω氨基脂族基團(tuán)、或者C1-C17直鏈或支鏈的Ω氨基脂族?；?；n是0、1或2；m是0-17；y是1-5；v3和v4各自獨(dú)立地是H、C1-C17直鏈或支鏈的烷基鏈、或C2-C19直鏈或支鏈的烷基?；?，前提是若v3或v4之一是烷基?；湥瑒t另一個(gè)v3或v4是H；并且用星號(hào)標(biāo)記的碳原子可以具有任何立體化學(xué)構(gòu)型；
Aaa2和Aaa13是相同或不同的，并且分別是經(jīng)過(guò)Aaa2和Aaa13的各自側(cè)鏈而形成環(huán)橋的L-或D-異構(gòu)體氨基酸殘基，其中該環(huán)橋的連接基團(tuán)是-S-S-、-S-CH2-S-、-S-CH2-、-CH2-S-、-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-、-CH2-NH-、-NH-CH2-、-CH2-S(O)n-其中n是1或2、-S(O)n-CH2-其中n是1或2、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(E或Z)、-C≡C-、-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-、-C(＝O)-CH2-、-CH2-C(＝O)-、-O-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-O-或-NH-C(＝O)-NH-；
Aaa3是包括His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Dap或Dab的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體或是從His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Dap或Dab衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體，或者是從His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Dap或Dab衍生的α，α-雙取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-雙取代氨基酸的全部(R)或(S)構(gòu)型，或Aaa3是結(jié)構(gòu)如下的氨基酸替代物
其中R和R′獨(dú)立地是H、或者His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Dap或Dab的氨基酸側(cè)鏈部分、或者His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Dap或Dab的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物；x是1或2；Y是CH2或C＝O；W是CH2、NH或NR″′；Z是H或CH3；R″′是?；1-C17直鏈或支鏈的烷基鏈、C2-C19直鏈或支鏈的烷基酰基鏈、C1-C17直鏈或支鏈的Ω氨基脂族基團(tuán)、或者C1-C17直鏈或支鏈的Ω氨基脂族酰基；并且n是0、1或2；
Aaa4是包括取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Nle、Nva或Tle的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體或是從取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Nle、Nva或Tle衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體，或是從取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Nle、Nva或Tle衍生的α，α-雙取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-雙取代氨基酸的全部(R)或(S)構(gòu)型，或Aaa4是如對(duì)Aaa3所述的氨基酸替代物，其中R和R′獨(dú)立地是H或是取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Nle、Nva或Tle的氨基酸側(cè)鏈部分，或是取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Nle、Nva或Tle的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物；
Aaa5是Gly、Sar、包括Ala的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體或從Ala衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體，或Aib，或Aaa5是如對(duì)Aaa3所述的氨基酸替代物，其中R和R′獨(dú)立地是H或-CH3；
Aaa6是Gly、Sar、包括Ala的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體或從Ala衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體，或Aib，或Aaa6是如對(duì)Aaa3所述的氨基酸替代物，其中R和R′獨(dú)立地是H或-CH3；
Aaa7是包括Arg、His、Ala、Ser、HSer、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Cit、Abu、Dap或Dab的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體或是從Arg、His、Ala、Ser、HSer、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Cit、Abu、Dap或Dab衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體，或是從Arg、His、Ala、Ser、HSer、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Cit、Abu、Dap或Dab衍生的α，α-雙取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-雙取代氨基酸的全部(R)或(S)構(gòu)型，或Aaa7是如對(duì)Aaa3所述的氨基酸替代物，其中R和R′獨(dú)立地是H或者Arg、His、Ala、Ser、HSer、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Abu、Dap或Dab的氨基酸側(cè)鏈部分，或者Arg、His、Ala、Ser、HSer、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Abu、Dap或Dab的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物；
Aaa8是Gly、包括Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Met(O)、Met(O2)或Tle的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體或是從Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Met(O)、Met(O2)或Tle衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體，或是從Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Met(O)、Met(O2)或Tle衍生的α，α-雙取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-雙取代氨基酸的全部(R)或(S)構(gòu)型，或Aaa8是如對(duì)Aaa3所述的氨基酸替代物，其中R和R′獨(dú)立地是H或者Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Met(O)、Met(O2)或Tle的氨基酸側(cè)鏈部分，或者Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Met(O)、Met(O2)或Tle的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物；
Aaa9是包括Asp、Glu、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Met(O2)、Orn、Dap或Dab的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體或是從Asp、Glu、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Met(O2)、Orn、Dap或Dab衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體，或是從Asp、Glu、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Met(O2)、Orn、Dap或Dab衍生的α，α-雙取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-雙取代氨基酸的全部(R)或(S)構(gòu)型，或Aaa9是如對(duì)Aaa3所述的氨基酸替代物，其中R和R′獨(dú)立地是H或者Asp、Glu、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Met(O2)、Orn、Dap或Dab的氨基酸側(cè)鏈部分，或者Asp、Glu、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Met(O2)、Orn、Dap或Dab的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物；
Aaa10是包括Arg、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Cit、Met(O)、Orn、Dap或Dab的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體或是從Arg、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Cit、Met(O)、Orn、Dap或Dab衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體，或是從Arg、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Orn、Dap或Dab衍生的α，α-雙取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-雙取代氨基酸的全部(R)或(S)構(gòu)型，或Aaa10是如對(duì)Aaa3所述的氨基酸替代物，其中R和R′獨(dú)立地是H或者Arg、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Cit、Met(O)、Orn、Dap或Dab的氨基酸側(cè)鏈部分，或者Arg、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Orn、Dap或Dab的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物；
Aaa11是Gly或包括Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Cys、HCys、Abu或Tle的α-氨基酸或β-氨基酸的D-或L-異構(gòu)體或是從Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Cys、HCys、Abu或Tle衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的D-或L-異構(gòu)體，或是從Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Cys、HCys、Abu或Tle衍生的α，α-雙取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-雙取代氨基酸的全部(R)或(S)構(gòu)型，或Aaa11是如對(duì)Aaa3所述的氨基酸替代物，其中R和R′獨(dú)立地是H或者Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Cys、HCys、Abu或Tle的氨基酸側(cè)鏈部分，或者Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Cys、HCys、Abu或Tle的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物；
Aaa12是Gly、包括Ser、Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Arg、Lys、Orn、Cys、HCys、Abu或Tle的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體或是從Ser、Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Arg、Lys、Orn、Cys、HCys、Abu或Tle衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體，或是從Ser、Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Arg、Lys、Orn、Cys、HCys、Abu或Tle衍生的α，α-雙取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-雙取代氨基酸的全部(R)或(S)構(gòu)型，或Aaa12是如對(duì)Aaa3所述的氨基酸替代物，其中R和R′獨(dú)立地是H或者Ser、Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Arg、Lys、Orn、Cys、HCys、Abu或Tle的氨基酸側(cè)鏈部分，或者Ser、Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Arg、Lys、Orn、Cys、HCys、Abu或Tle的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物；
Aaa14是包括取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Lys、Orn、Nle、Nva或Tle的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體或是從取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Lys、Orn、Nle、Nva或Tle衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的L-或D-異構(gòu)體，或是從取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Lys、Orn、Nle、Nva或Tle衍生的α，α-雙取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-雙取代氨基酸的全部(R)或(S)構(gòu)型，或Aaa14是如對(duì)Aaa3所述的具有式I1結(jié)構(gòu)的氨基酸替代物，其中R和R′獨(dú)立地是H或者取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Lys、Orn、Nle、Nva或Tle的氨基酸側(cè)鏈部分，或者取代或非取代的Phe、HPhe或Pgl或者Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Lys、Orn、Nle、Nva或Tle的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物；
Aaa15是包括Ala、Arg、Orn、Lys、Dap、Dab、HArg或HLys的α-氨基酸或β-氨基酸的D-或L-異構(gòu)體或是從Ala、Arg、Orn、Lys、Dap、Dab、HArg或HLys衍生的α-氨基酸或β-氨基酸的D-或L-異構(gòu)體，或是從Ala、Arg、Orn、Lys、Dap、Dab、HArg或HLys衍生的α，α-雙取代氨基酸，包括其中取代基不同的α，α-雙取代氨基酸的全部(R)或(S)構(gòu)型，或Aaa15是結(jié)構(gòu)如下的氨基酸替代物
其中虛線表示肽鍵；R和R′中的至少一個(gè)是(CH2)y-R＂，并且若一個(gè)具有此式，則R和R′中另一個(gè)是H，其中R＂是
-NH2、
-NH-C(＝NH)-NH2、
-NH-(CH2)y-NH2、
-NH-C(＝O)-NH2、
-C(＝O)-NH2、
-C(＝O)-NH-CH3、
-C(＝O)-NH-(CH2)y-NH2、
-NH-C(＝NH)-NH-Me、
-NH-C(＝NH)-NH-Et、
-NH-C(＝NH)-NH-Pr、
-NH-C(＝NH)-NH-Pr-i、
-NH-C(＝O)-CH3、
-NH-C(＝O)-CH2-CH3、
-NH-C(＝O)-CH-(CH3)2、
-NH-C(＝O)-O-CH3、
-NH-C(＝O)-O-CH2-CH3、
-NH-C(＝O)-O-C-(CH3)3、
-NH-C(＝O)-NH-CH3、
-NH-C(＝N-C(＝O)-O-C-(CH3)3)-NH-C(＝O)-O-C-(CH3)3、
-N(C(＝O)-O-C-(CH3)3)-C(＝NH)-NH-C(＝O)-O-C-(CH3)3、
或
x是1或2；Y是CH2或C＝O；W是CH2、NH或NR″′；Z是H或CH3；J是-H、-(CH2)m-OH、-C(＝O)-CH2)m-OH、-C(＝O)-CH2)m-N(V1)(v2)、-C(＝O)-O-(CH2)m-CH3、-O-(CH2)m-CH3、-O-(CH2)m-N(V1)(v2)、-O-(CH2)m-OH、-C(＝O)-NH-(CH2)m-CH3、-C(＝O)-NH-(CH2)m-N(V1)(v2)、-C(＝O)-NH-(CH2)m-S(V1)、-C(＝O)-N-((CH2)m-N(V1)(v2))2、-C(＝O)-NH-CH(-C(＝O)-OH)-(CH2)m-N(V1)(v2)、-C(＝O)-NH-(CH2)m-NH-C(＝O)-CH(N(v1)(v2))((CH2)m-N(v1)(v2))、-C(＝O)-NH-CH(-C(＝O)-N(v1)(v2))-(CH2)m-N(v1)(v2)、Ω氨基脂族基團(tuán)、末端芳基或芳烷基、與定義J的前述基團(tuán)之一組合的任何單個(gè)天然或非天然α-氨基酸、β-氨基酸或α，α-雙取代氨基酸，或任何單個(gè)天然或非天然α-氨基酸、β-氨基酸或α，α-雙取代氨基酸、包括任何前述項(xiàng)的全部(R)和(S)構(gòu)型；R″′是?；?、C1-C17直鏈或支鏈的烷基鏈、C2-C19直鏈或支鏈的烷基?；?、C1-C17直鏈或支鏈的Ω氨基脂族基團(tuán)、或者C1-C17直鏈或支鏈的Ω氨基脂族?；?；Vi和v2各自獨(dú)立地是H或C1-C17直鏈或支鏈的烷基鏈；n是0、1或2；m是0-17；y是1-5；并且用星號(hào)標(biāo)記的碳原子可以具有任何立體化學(xué)構(gòu)型；
前提是Aaa1、Aaa3至Aaa12、Aaa14或Aaa15中的至少一個(gè)是氨基酸替代物。
44.權(quán)利要求43所述的構(gòu)建體，其中Aaa1、Aaa3至Aaa12、Aaa14或Aaa15中的一個(gè)是氨基酸替代物。
45.權(quán)利要求43所述的構(gòu)建體，其中Aaa1、Aaa5和Aaa15中的一個(gè)是氨基酸替代物。
46.權(quán)利要求43所述的構(gòu)建體，其中Aaa1、Aaa3至Aaa12、Aaa14和Aaa15中的任何兩個(gè)Aaa是氨基酸替代物。
47.權(quán)利要求43所述的構(gòu)建體，其中Aaa1、Aaa5和Aaa15中的兩個(gè)Aaa是氨基酸替代物。
48.權(quán)利要求43所述的構(gòu)建體，其中Aaa1、Aaa3至Aaa12、Aaa14或Aaa15中的三個(gè)或更多個(gè)Aaa是氨基酸替代物。
49.權(quán)利要求43所述的構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體通過(guò)經(jīng)Aaa2和Aaa13的側(cè)鏈形成二硫鍵而環(huán)化。
50.權(quán)利要求49所述的構(gòu)建體，其中Aaa3、Aaa5、Aaa6、Aaa7、Aaa9、Aaa10或Aaa12中的至少一個(gè)是Ala的L-或D-異構(gòu)體。
51.權(quán)利要求43所述的構(gòu)建體，還包含至少一個(gè)輔基，其共價(jià)連接至至少一個(gè)所述氨基酸殘基的側(cè)鏈或端基中的反應(yīng)基、當(dāng)替代物處于所述構(gòu)建體的氨基端位置處時(shí)其共價(jià)連接至胺封端基團(tuán)中的胺基或反應(yīng)基、或者當(dāng)替代物位于所述構(gòu)建體的羧基端位置處時(shí)其共價(jià)連接至羧基端封端基團(tuán)中的羧基、胺基或反應(yīng)基。
52.式IV的構(gòu)建體
其中
Aaa3、Aaa4、Aaa5、Aaa6、Aaa7、Aaa8、Aaa9、Aaa10、Aaa11、Aaa12和Aaa14是如權(quán)利要求43中所定義的α-氨基酸、β-氨基酸或α，α-雙取代氨基酸；
Aaa2和Aaa13是相同或不同的，并且分別是經(jīng)各Aaa2和Aaa13側(cè)鏈形成環(huán)橋的氨基酸殘基，其中R1形成各Aaa2和Aaa13側(cè)鏈的一部分；
R1是-S-S-、-S-CH2-S-、-S-CH2-、-CH2-S-、-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-、-CH2-NH-、-NH-CH2-、-CH2-S(O)n-其中n是1或2、-S(O)n-CH2-其中n是1或2、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(E或Z)、-C≡C-、-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-、-C(＝O)-CH2-、-CH2-C(＝O)-、-O-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-O-或-NH-C(＝O)-NH-；
R2和R2′中的一個(gè)是H，并且另一個(gè)是H或直鏈或支鏈的C1-C6脂族鏈、-(CH2)y-S-CH3、-(CH2)y-S(＝O)-CH3、-(CH2)y-S(O2)-CH3、鍵和環(huán)丙烷、環(huán)丁烷、環(huán)戊烷或環(huán)己烷環(huán)，或C1-C3脂族鏈和環(huán)丙烷、環(huán)丁烷、環(huán)戊烷或環(huán)己烷環(huán)；
R3和R3′中的一個(gè)是H，并且另一個(gè)是(CH2)y-R5；
R4是OH、
或
R5是-NH2、
-NH-C(＝NH)-NH2、
-NH-(CH2)y-NH2、
-NH-C(＝O)-NH2、
-C(＝O)-NH2、
-C(＝O)-NH-CH3、
-C(＝O)-NH-(CH2)y-NH2、
-NH-C(＝NH)-NH-Me、
-NH-C(＝NH)-NH-Et、
-NH-C(＝NH)-NH-Pr、
-NH-C(＝NH)-NH-Pr-i、
-NH-C(＝O)-CH3、
-NH-C(＝O)-CH2-CH3、
-NH-C(＝O)-CH-(CH3)2、
-NH-C(＝O)-O-CH3、
-NH-C(＝O)-O-CH2-CH3、
-NH-C(＝O)-O-C-(CH3)3、
-NH-C(＝O)-NH-CH3、
-NH-C(＝N-C(＝O)-O-C-(CH3)3)-NH-C(＝O)-O-C-(CH3)3、
-N(C(＝O)-O-C-(CH3)3)-C(＝NH)-NH-C(＝O)-O-C-(CH3)3、
或
R6和R7各自獨(dú)立地是H、C1-C4直鏈或支鏈的烷基鏈；
x在每種情況下獨(dú)立地是1或2；
y是1-5；
z是1至7；并且
其中用星號(hào)標(biāo)記的碳原子可以具有任何立體化學(xué)構(gòu)型。
53.權(quán)利要求52所述的構(gòu)建體，其中R1是-S-S-，并且Aaa2和Aaa13各是Cys、Pen或HCys。
54.權(quán)利要求52所述的構(gòu)建體，其中R1是-C(＝O)-NH-或-NH-C(＝O)-，并且Aaa2或Aaa13中的一個(gè)是Asp或Glu，而Aaa2或Aaa13中的另一個(gè)是Lys、Orn、Dab或Dap。
55.式V的構(gòu)建體
其中Aaa2至Aaa14中的每一個(gè)、R1和x如權(quán)利要求43中所定義，并且R4是OH或NH2。
56.式VI的構(gòu)建體
其中Aaa2至Aaa14中的每一個(gè)和R1如權(quán)利要求43中所定義，并且R4是OH或NH2。
57.式VII、VIII、IX、X、XI或XII的構(gòu)建體
全文摘要
本發(fā)明涉及具有氨基端和羧基端的環(huán)狀構(gòu)建體，其與利尿鈉肽受體結(jié)合，并且包括多個(gè)氨基酸殘基、至少一個(gè)式I的氨基酸替代物(其中R、R′、Q、Y、W、Z、J、x及n如本說(shuō)明書中所定義)、和任選至少一個(gè)輔基；包括所述環(huán)狀構(gòu)建體的藥物組合物；以及治療充血性心力衰竭或需要產(chǎn)生抗高血壓、心血管、腎臟或內(nèi)分泌作用的其它狀況、綜合征或疾病的方法。
文檔編號(hào)A61K38/12GK101505784SQ200780019541
公開日2009年8月12日 申請(qǐng)日期2007年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月30日
發(fā)明者S·D·沙拉馬, M·巴斯托斯, 煒 楊, 蔡慧芝 申請(qǐng)人:帕拉丁科技公司