專利名稱：：利尿鈉多肽的制作方法利尿鈉多肽相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2007年7月20日提交的美國臨時(shí)申請系列號60/951,117的優(yōu)先權(quán)益。聯(lián)邦贊助研究的聲明本發(fā)明由政府支持，在美國國家心臟、肺和血液研究所(NationalInstitutesofHeart,Lung,andBloodInstitute)授予的基金HL036634支持下進(jìn)行。在本發(fā)明中，政府具有某些權(quán)利。背景入#頓'本文件涉及利尿鈉多肽。例如，本文件提供涉及利尿鈉多肽的方法和材料以及利尿鈉多肽治療心血管和腎臟疾患的用途。么^;f/t惑利尿鈉多肽是可以引起尿鈉排泄(增加尿的鈉排泄)的多肽。腦、心臟、腎和/或血管組織可以產(chǎn)生所述多肽。概述本文件涉及利尿鈉多肽。例如，本文件提供涉及利尿鈉多肽的方法和材料以及利尿鈉多肽治療心血管疾患、腎臟疾患或心血管疾患和腎臟疾患兩者的用途。在一些實(shí)例中，本文提供的多肽可以具有利尿活性、排鈉利尿活性、活化cGMP的能力、增加腎小球過濾率的能力、減少腎素產(chǎn)生的能力、減少血管緊縮肽產(chǎn)生的能力、減少醛甾酮產(chǎn)生的能力、減少異常升高的心臟填充壓的能力、優(yōu)化腎臟血液流動(dòng)的能力或其組合。在一些實(shí)例中，本文提供的多肽可以增加內(nèi)源ANP、BNP和CNP水平。在一些實(shí)例中，本文提供的多肽可以缺少降低血壓的能力并且可以缺少引起全身性低血壓的能力。在一些實(shí)例中，本文提供的多肽可以是利尿鈉肽受體A、利尿鈉肽受體B或利尿鈉肽受體A和利尿鈉肽受體B兩者的激動(dòng)劑。通常，本文件的一個(gè)方面特征為少于44個(gè)氨基酸殘基長度的多肽，其中所述多肽包括(以從氨基末端到錄末端的順序)(a)SEQIDNO:1所列的序列或SEQIDNO:1所列的且不超過三個(gè)添加、缺失(subtraction)或取代的序列；(b)SEQIDNO:2所列的序列或SEQIDNO:2所列的且不超過五個(gè)添加、缺失或取代的序列；以及(c)SEQIDNO:3所列的序列或SEQIDNO:3所列的且不超過三個(gè)添加、缺失或取代的序列。多肽可以包括排鈉利尿活性。多肽可以缺少誘導(dǎo)全身性低血壓的能力。多肽可以包括SEQIDNO:1所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:2所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:3所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:1所列的序列、SEQIDNO:2所列的序列和SEQIDNO:3所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:1所列的且不超過三個(gè)保守氨基酸取代的序列。多肽可以包括SEQIDNO:2所列的且不超過五個(gè)保守氨基酸取代的序列。多肽可以包括SEQIDNO:3所列的且不超過三個(gè)保守氨基酸取代的序列。多肽可以是基本純多肽。在另一個(gè)方面中，本文件特征為編碼少于44個(gè)氨基酸殘基長度的多肽的分離的核酸，其中所述多肽包括(以從氨基末端到羧基末端的順序)(a)SEQIDNO:1所列的序列或SEQIDNO:1所列的且不超過三個(gè)添加、缺失或取代的序列；(b)SEQIDNO:2所列的序列或SEQIDNO:2所列的且不超過五個(gè)添加、缺失或取代的序列；以及(c)SEQIDNO:3所列的序列或SEQIDNO:3所列的且不超過三個(gè)添加、缺失或取代的序列。多肽可以包括排鈉利尿活性。多肽可以缺少誘導(dǎo)全身性低血壓的能力。多肽可以包括SEQIDNO:所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:2所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:3所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:1所列的序列、SEQIDNO:2所列的序列和SEQIDNO:3所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:1所列的且不超過三個(gè)保守氨基酸取代的序列。多肽可以包括SEQIDNO:2所列的且不超過五個(gè)保守氨基酸取代的序列。多肽可以包括SEQIDNO:3所列的且不超過三個(gè)保守氨基酸取代的序列。多肽可以是基本純多肽。在另一個(gè)方面中，本文件特征為含有編碼多肽的核酸的載體，所述多肽少于44個(gè)氨基酸殘基長度，其中所述多肽包括(以從氨基末端到羧基末端的順序)(a)SEQIDNO:1所列的序列或SEQIDNO:1所列的且不超過三個(gè)添加、缺失或取代的序列；(b)SEQIDNO:2所列的序列或SEQIDNO:2所列的且不超過五個(gè)添加、缺失或取代的序列；以及(c)SEQIDNO:3所列的序列或SEQIDNO:3所列的且不超過三個(gè)添加、缺失或取代的序列。多肽可以包括排鈉利尿活性。多肽可以缺少誘導(dǎo)全身性低血壓的能力。多肽可以包括SEQIDNO:1所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:2所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:3所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:1所列的序列、SEQIDNO:2所列的序列和SEQIDNO:3所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:1所列的且不超過三個(gè)保守氨基酸取代的序列。多肽可以包括SEQIDNO:2所列的且不超過五個(gè)保守氨基S吏取代的序列。多肽可以包括SEQIDNO:3所列的且不超過三個(gè)保守氨基酸取代的序列。多肽可以是基本純多肽。在另一個(gè)方面中，本文件特征為含有編碼多肽的核酸的宿主細(xì)胞，所述多肽少于44個(gè)氨基酸殘基長度，其中所述多肽包括(以從氨基末端到羧基末端的順序)(a)SEQIDNO:1所列的序列或SEQIDNO:1所列的且不超過三個(gè)添加、缺失或取代的序列；(b)SEQIDNO:2所列的序列或SEQIDNO:2所列的且不超過五個(gè)添加、缺失或取代的序列；以及(c)SEQIDNO:3所列的序列或SEQIDNO:3所列的且不超過三個(gè)添加、缺失或取代的序列。多肽可以包括排鈉利尿活性。多肽可以缺少誘導(dǎo)全身性低血壓的能力。多肽可以包括SEQIDNO:1所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:2所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:3所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:1所列的序列、SEQIDNO:2所列的序列和SEQIDNO:3所列的序歹'J。多肽可以包括SEQIDNO:1所列的且不超過三個(gè)保守氨基酸取代的序列。多肽可以包括SEQIDNO:2所列的且不超過五個(gè)保守氨基酸取代的序列。多肽可以包括SEQIDNO:3所列的且不超過三個(gè)保守氨基酸取代的序列。多肽可以是基本純多肽。宿主細(xì)胞可以是真核宿主細(xì)胞。在另一個(gè)方面中，本文件特征為含有藥學(xué)可接受載體和少于44個(gè)氨基酸殘基長度的多肽的藥物組合物，其中所述多肽包括(以從氨基末端到羧基末端的順序)(a)SEQIDNO:1所列的序列或SEQIDNO:1所列的且不超過三個(gè)添加、缺失或耳又代的序列；(b)SEQIDNO:2所列的序列或SEQIDNO:2所列的且不超過五個(gè)添加、缺失或取代的序列；以及(c)SEQIDNO:3所列的序列或SEQIDNO:3所列的且不超過三個(gè)添加、缺失或取代的序列。多肽可以包括排鈉利尿活性。多肽可以缺少誘導(dǎo)全身性低血壓的能力。多肽可以包括SEQIDNO:1所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:2所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:3所列的序歹'J。多肽可以包括SEQIDNO:1所列的序列、SEQIDNO:2所列的序列和SEQIDNO:3所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:1所列的且不超過三個(gè)保守氨基酸取代的序列。多肽可以包括SEQIDNO:2所列的且不超過五個(gè)保守氨基酸取代的序列。多肽可以包括SEQIDNO:3所列的且不超過三個(gè)保守氨基酸取代的序列。多肽可以是基本純多肽。在另一個(gè)方面中，本文件特征為增加哺乳動(dòng)物排鈉利尿活性且不降低血壓的方法。所述方法包括向哺乳動(dòng)物施用少于44個(gè)氨基酸殘基長度的多肽，其中所述多肽包括(以從氨基末端到羧基末端的順序)(a)SEQIDNO:1所列的序列或SEQIDNO:1所列的且不超過三個(gè)添加、缺失或取代的序列；(b)SEQIDNO:2所列的序列或SEQIDNO:2所列的且不超過五個(gè)添力口、缺失或取代的序列；以及(c)SEQIDNO:3所列的序列或SEQIDNO:3所列的且不超過三個(gè)添加、缺失或取代的序列。多肽可以包括排鈉利尿活性。多肽可以缺少誘導(dǎo)全身性低血壓的能力。多肽可以包括SEQIDNO:1所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:2所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:3所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:1所列的序列、SEQIDNO:2所列的序列和SEQIDNO:3所列的序歹'J。多肽可以包括SEQIDNO:1所列的且不超過三個(gè)保守氨基酸取代的序列。多肽可以包括SEQIDNO:2所列的且不超過五個(gè)保守氨基酸取代的序列。多肽可以包括SEQIDNO:3所列的且不超過三個(gè)保守氨基酸取代的序列。多肽可以是基本純多肽。在另一個(gè)方面中，本文件特征為治療具有心血管疾患或腎臟疾患的哺乳動(dòng)物的方法。所述方法包括在其中降低心血管疾患或腎臟疾患表現(xiàn)的嚴(yán)重性的條件下，向哺乳動(dòng)物施用少于44個(gè)氨基酸殘基長度的多肽，其中所述多肽包括(以從氨基末端到羧基末端的順序)(a)SEQIDNO:1所列的序列或SEQIDNO:1所列的且不超過三個(gè)添加、缺失或取代的序列；(b)SEQIDNO:2所列的序列或SEQIDNO:2所列的且不超過五個(gè)添加、缺失或取代的序列；以及(c)SEQIDNO:3所列的序列或SEQIDNO:3所列的且不超過三個(gè)添加、缺失或取代的序列。多肽可以包括排鈉利尿活性。多肽可以缺少誘導(dǎo)全身性低血壓的能力。多肽可以包括SEQIDNO:1所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:2所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:3所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:所列的序列、SEQIDNO:2所列的序列和SEQIDNO:3所列的序列。多肽可以包括SEQIDNO:1所列的且不超過三個(gè)保守氣基酸取代的序列。多肽可以包括SEQIDNO:2所列的且不超過五個(gè)保守氨基酸取代的序列。多肽可以包括SEQIDNO:3所列的且不超過三個(gè)保守氨基酸取代的序列。多肽可以是基本純多肽?？梢詫Σ溉閯?dòng)物施用多肽且使其不降低哺乳動(dòng)物血壓。除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的意思。盡管與本文描述的那些相似或相當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧峡梢杂糜趯?shí)踐本發(fā)明，仍然在下文描述了合適的方法和材料。本文提到的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)通過引用整體并入。在沖突時(shí)，以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例僅為證明性的且不打算限制。本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的細(xì)節(jié)列于附圖和以下的描述中。本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將通過說明書和附圖以及權(quán)利要求而明顯。圖1是32個(gè)氨基酸殘基長度的CU-NP多肽(SEQIDNO:4)的示意圖。SEQIDNO:4的前十個(gè)氨基酸殘基相應(yīng)于人尿舒張肽(urodilatin)氨基酸殘基1到10并且被指定為SEQIDNO:1。SEQIDNO:4的氨基酸殘基11到27相應(yīng)于人成熟CNP的氨基酸殘基6到22并且被指定為SEQIDNO:2。SEQIDNO:4的氨基酸殘基28到32相應(yīng)于人尿舒張肽氨基酸殘基28到32并且被指定為SEQIDNO:3。圖2是繪制用提到的CU-NP或URO處理的正常麻醉狗的腎灌注壓(用RPP=MAP—RAP評估)的圖(平均值±SEM;*=P<0.05vs.基線；*=PO.05,各組之間)。圖3是繪制在分離的狗腎小球中cGMP應(yīng)答等摩爾濃度CU-NP、CNP和UR()的圖(n二3-7為空白，即對照；11=5-8為腎小球，t=P<0.0001vs.空白；*=P<0.01vs.空白)。圖4是繪制在存在或缺少NPR-A拮抗物(lpMA71915)、NPR-B拮抗物(l(iMP19)或這兩個(gè)拮抗物(先A71915再P:19，兩者最終濃度為l(iM)下在分離的狗腎小球中評估cGMP應(yīng)答等摩爾濃度CU-NP的圖(n-2-4為空白；！1=3-6為腎小^求；*=PO.05vs.空白；t=P<0.01vs.空白；*=P<0.0001vs.空白)。圖5是繪制在缺少或存在NPR-B抗體(l:100)下在人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中評估cGMP應(yīng)答CNP或CU-NP的圖。詳述本文件涉及利尿鈉多肽。例如，本文件提供涉及利尿鈉多肽的方法和材料以及利尿鈉多肽治療心血管疾患(例如，急性失代償性心力衰竭、急性冠狀動(dòng)脈綜合征和心肌梗塞后心室重構(gòu))和腎臟疾患(例如手術(shù)期間的腎功能障礙、心臟衰竭繼發(fā)性腎功能障礙和糖尿病性腎病)的用途。在一些實(shí)例中，本文提供的多肽可以具有利尿活性、排鈉利尿活性、活化cGMP的能力、增加腎小球過濾率的能力、減少腎素產(chǎn)生的能力、減少血管緊縮肽產(chǎn)生的能力、減少醛甾酮產(chǎn)生的能力、減少異常升高的心臟填充壓的能力、優(yōu)化腎臟血液流動(dòng)的能力或其組合。在一些實(shí)例中，本文提供的多肽可以增加內(nèi)源ANP、BNP和CNP水平。在一些實(shí)例中，本文提供的多肽可以缺少降低血壓和SI起全身性低血壓的能力。在一些實(shí)例中，本文提供的多肽可以是利尿鈉肽受體A、利尿鈉肽受體B或利尿鈉肽受體A和利尿鈉肽受體B兩者的激動(dòng)劑。本文提供的多肽可以具有任何序列并且可以具有任何長度。例如，本文提供的多肽可以包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所列的序列。在一些實(shí)例中，本文提供的多肽可以包括(a)與SEQIDNO:1所列的序列比對有三個(gè)或更少(如兩個(gè)或更少、一個(gè)或零)的氨基酸添加、缺失、取代或其組合的氨基酸序列；(b)與SEQIDNO:2所列的序列比對有五個(gè)或更少(如四個(gè)或更少、三個(gè)或更少、兩個(gè)或更少、一個(gè)或零)的氨基酸添加、缺失、取代或其組合的氨基酸序列；以及(c)與SEQIDNO:3所列的序列比對有三個(gè)或更少(如兩個(gè)或更少、一個(gè)或零)的氨基酸添加、缺失、取代或其組合的氨基酸序列。例如，本文提供的多肽可以含有SEQIDNO:1所列的序列，除了SEQIDNO:1的第一個(gè)蘇氨酸殘基或最后的絲氨酸殘基被缺失(deleted)或用不同的氨基酸殘基取代。氨基酸取代可以是保守氨基酸取代。保守氨基酸取代可以是，例如作為酸性氨基酸的天門冬氨酸-谷氨酸；作為堿性氨基酸的賴氨酸/精氨酸/組氨酸；作為疏水氨基酸的亮氨酸/異亮氨酸、曱硫氨酸/纈氨酸、丙氨酸/纈氨酸；作為親水氨基酸的絲氨酸/甘氨酸/丙氨酸/蘇氨酸。保守氨基酸取代也包括基于側(cè)鏈的分組。例如，具有脂肪族側(cè)鏈的一組氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族-羥基側(cè)鏈的一組氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；具有含有酰胺的側(cè)鏈的一組氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族側(cè)鏈的一組氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的一組氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含硫側(cè)鏈的一組氨基酸是半胱氨酸和曱硫氨酸。進(jìn)行氨基酸取代后，使用本文所述的測定可以評估含有氨基酸取代的多肽的活性。在一些實(shí)例中，本文提供的多肽可以包括(a)SEQIDNO:1所列的或與SEQIDNO:1所列的序列比對有三個(gè)或更少(如兩個(gè)或更少、一個(gè)或零)的氨基酸缺失、取代或其組合的第一氨基酸序列；(b)SEQIDNO:2所列的或與SEQIDNO:2所列的序列比對有五個(gè)或更少(如四個(gè)或更少、三個(gè)或更少、兩個(gè)或更少、一個(gè)或零)的氨基酸添加、取代或其組合的第二氨基酸序列；以及(a)SEQIDNO:3所列的或與SEQIDNO:3所列的序列比對有三個(gè)或更少(如兩個(gè)或更少、一個(gè)或零)的氨基酸缺失、取代或其組合的第三氨基酸序列。例如，本文提供的多肽可以包括SEQIDNO:4所列的序列或由SEQIDNO:4所列的序列組成。本文提供的多肽可以具有任何長度。例如，本文提供的多肽可以是在25個(gè)和45個(gè)之間(如26個(gè)和44個(gè)之間、27個(gè)和43個(gè)之間、28個(gè)和42個(gè)之間、29個(gè)和41個(gè)之間、30個(gè)和40個(gè)之間、31個(gè)和39個(gè)之間或30個(gè)和35個(gè)之間)的氨基酸殘基長度。應(yīng)理解，25個(gè)或45個(gè)氨基酸殘基長度的多肽是具有25個(gè)和45個(gè)氨基酸殘基之間的長度的多肽。在一些實(shí)例中，本文提供的多肽可以是基本純多肽。如本文所用，涉及多肽的術(shù)語"基本純"是指多肽基本不含與其天然締合的其他多肽、脂質(zhì)、糖類和核酸。因此，基本純多肽是從其自然環(huán)境中分離并且有至少60%純度的任何多肽或任何化學(xué)合成多肽?；炯兌嚯目梢詾橹辽偌s60、65、70、75、80、85、90、95或99百分比純度。通常，基本純多肽將在非還原聚丙烯酰胺凝膠上產(chǎn)生單個(gè)主要條帶。編碼多肽的重組核酸的表達(dá)或化學(xué)合成(例如使用固相多肽合成方法或肽合成儀，如ABI431A肽合成儀；AppliedBiosystems;FosterCity,CA)可以獲得本文提供的多肽。例如，使用編碼本文提供的多肽的表達(dá)載體的標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)可以被應(yīng)用。然后可以使用諸如親和色譜技術(shù)和HPLC純化獲得的多肽。通過任何合適的方法可以測量純化的程度，包括且不限于柱色譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜?？梢栽O(shè)計(jì)或構(gòu)建本文提供的多肽使之含有標(biāo)志序列(tagsequence)，其允許多肽被純化(如捕獲到親和基質(zhì))。例如，可以使用諸如c-myc、紅細(xì)胞凝聚素、多組氨酸或FlagTM標(biāo)志(Kodak)的標(biāo)志來幫助多肽純化。所述標(biāo)志可以被插入到多肽的任何地方，包括在羧基或氨基末端?？梢允褂玫钠渌诤衔锇◣椭鷻z測多肽的酶，如堿性磷酸酶?？梢灾苽浔疚奶峁┑亩嚯氖怪腥齻€(gè)區(qū)，包括N末端(如來自人尿舒張多肽的N末端序列)的第一區(qū)、包括諸如人CNP多肽的成熟利尿鈉多肽環(huán)狀結(jié)構(gòu)的第二區(qū)和包括C末端(如來自人尿舒張多肽的C末端序列)的第三區(qū)。可以使用本文提供的多肽治療心血管疾病、充血性心力衰竭、心肌梗塞、冠心病、腎病、肝病、癌癥、代謝疾病或其組合。例如，在其中減輕ii人冠心病癥狀的嚴(yán)重性的條件下，具有SEQIDNO:4所列的氨基酸序列的CU-NP多肽可以被施用于具有冠心病的人。通過與藥學(xué)可接受無毒賦形劑或載體混合，可以將本文提供的多肽配制成藥物組合物?？梢砸杂行е委熤T如心、肝、腎或其他鈉殘留疾患的量向需要其的受治療者施用所述組合物?？梢灾苽渌幬锝M合物用于腸胃外施用，特別是生理學(xué)緩沖水溶液中的液體溶液或懸浮液的形式；用于口服施用，特別是片劑或膠嚢劑的形式；或用于鼻內(nèi)施用，特別是粉劑、滴鼻劑或氣溶膠的形式?？梢允褂煤线m的方法按照需要制備用于其他途徑施用的組合物。用于腸胃外施用的制劑可以包括普通的賦形劑、無菌水、鹽水、諸如聚乙二醇的聚烷撐二醇、植物源油、氫化萘和其組合。在一些實(shí)例中，生物相容的、生物可降解的交酯聚合物、交酯/乙交酯共聚物、聚氧乙烯(polyoxethylene)-聚氧丙烯共聚物或其組合可以被用作體內(nèi)多肽控釋的賦形劑。可以使用的其他合適的腸胃外給藥系統(tǒng)包括但不限于乙烯醋酸乙烯酯共聚物顆粒、滲透泵、可移植輸注系統(tǒng)、脂質(zhì)體和其組合。用于吸入施用的制劑可以包括諸如乳糖的賦形劑。吸入制劑可以是含有諸如聚氧乙烯-9-月桂醚、甘膽酸鹽、脫氧膽酸鹽或其組合的水溶液，或者它們可以是以滴鼻劑形式施用的油溶液。如果需要，含有本文提供的多肽的組合物可以配制成凝膠以在鼻內(nèi)應(yīng)用。用于腸胃外施用的制劑可以包括口腔施用的甘膽酸鹽。為了口服施用，可以使用合適的方法和藥學(xué)可接受賦形劑制備片劑或膠嚢劑，所述賦形劑如粘合劑(例如預(yù)膠化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基曱基纖維素)；填料(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(如硬脂酸鎂、滑石或二氧化硅)；崩解劑(如馬鈴薯淀粉或淀粉羥乙酸鈉(sodiumstarchglycolate));或潤濕劑(例如月才圭碌b酸鈉(sodiumlaurylsulfate))。4吏用合適的方法可以包衣片劑。可以配制口服施用的制品以提供多肽的控釋。鼻制品可以以液體形式或干燥產(chǎn)品提供。霧化含水懸浮液或溶液可以包括載體或賦形劑以調(diào)節(jié)pH和/或張力。薦竭,應(yīng)W裙凝本文件還提供了編碼一種或多種本文提供的多肽的分離的核酸。如本文所用，涉及核酸的術(shù)語"分離的"是指自然存在的核酸，其沒有直接鄰(一個(gè)在5'末端并且一個(gè)在3'末端)。例如，分離的核酸可以是但不限于任何長度的重組DNA分子，條件是通常發(fā)現(xiàn)直接在自然存在的基因組中的所述重組DNA分子側(cè)翼的核IM列之一被移除或不存在。因此，分離的核酸包括但不限于作為獨(dú)立于其他序列的單獨(dú)分子(例如PCR或限制核酸內(nèi)切酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)存在的重組DNA以及被整合入載體、自主復(fù)制質(zhì)粒、病毒(如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或皰滲病毒)或原核生物或真核生物基因組DNA的重組DNA。此外，分離的核酸可以包括是雜交或融合核酸序列的部分的重組DNA分子。如本文所用，涉及核酸的術(shù)語"分離的"還包括任何非自然存在的核酸，這是由于在自然界中找不到非自然存在的核酸序列并且其沒有在自然存在的基因組中直接鄰接的序列。例如，諸如構(gòu)建核酸的非自然存在的核酸被認(rèn)為是分離的核酸。使用普通分子克隆或化學(xué)核酸合成技術(shù)可以制備構(gòu)建核酸(例如編碼多肽的核酸，所述多肽含有SEQIDNO:4所列的氨基酸序列或由SEQIDNO:4所列的氨基酸序列組成)。分離的非自然存在的核酸可以獨(dú)立于其他序列或整合入載體、自主復(fù)制質(zhì)粒、病毒(如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或皰滲病毒)或原核生物或真核生物基因組DNA。此外，非自然存在的核酸可以包括雜交或融合核酸序列的部分的核酸分子。認(rèn)為存在于諸如cDNA庫或基因組庫中的數(shù)百至數(shù)百萬的其他核酸中或含有基因組DNA限制酶切消化液的凝膠切片中的核酸不是分離的核酸。如本文所用，術(shù)語"核酸"是指RNA和DNA,包括mRNA、cDNA、基因組DNA、合成(例如化學(xué)合成的)DNA和核酸類似物。核酸可以是雙鏈的或單鏈的，并且在單鏈時(shí)可以是有義鏈或反義鏈。此外，核酸可以是環(huán)狀或線性的?？梢栽趬A基部分、糖部分或磷酸主鏈修飾核酸類似物以提高諸如核酸的穩(wěn)定性、雜交或溶解性。堿基部分的修飾包括脫氧尿苷替換脫氧胸苷以及5-曱基-2，-脫氧胞苷和5-溴-2，-脫氧胞苷替換脫氧胞苷。糖部分的修飾可以包括修飾核糖的2'羥基以形成2，-0-曱基或2，-0-烯丙基糖?？梢孕揎椕撗鹾颂橇姿嶂麈溡灾苽鋯徇怂?，其中將每個(gè)堿基部分連接到六元嗎啉環(huán)或肽核酸，其中假肽主鏈取代脫氧磷酸主鏈并且保留四個(gè)堿基。參見例^口,Summerton和WellerJwi&ewseiVwc'/e/cyic/di>wgDev.，7:187-195(1997);和Hymp等人，5/ow取".C/^附.，4:5-23(1996)。此外，可以用諸如硫代磷酸或二硫代磷酸主鏈、氨基磷酸酯(phosphoroamidite)或烷基磷酸三酯主鏈取代脫氧磷酸主鏈。本文提供的核酸可以包括編碼SEQIDNO:4所列的氨基酸序列的序列或由編碼SEQIDNO:4所列的氨基酸序列的序列組成。例如，所述核酸可以包括CNP和尿舒張肽的人核酸序列，其被構(gòu)建為編碼SEQIDNO:4所列的氛基酸序列。通常，本文提供的分離的核酸為至少IO個(gè)核苷酸長度(例如10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、200、300、350、400或更多的核苷酸長度)。少于全長的核酸分子作為諸如診斷目的的引物或探針可以是有用的。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以制備分離的核酸分子，包括但不限于普通分子克隆和化學(xué)核酸合成技術(shù)。例如，可以使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)。PCR指一種規(guī)程或技術(shù)，其中酶促擴(kuò)增目標(biāo)核酸。使用來自關(guān)注區(qū)域的末端或通常更多的序列信息設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，其序列與被擴(kuò)增的模板的相反鏈相同?？墒褂肞CR從DNA以及RNA(包括來自總基因組DNA或總細(xì)胞RNA的序列)擴(kuò)增具體序列。引物通常是15至50個(gè)核苷酸長度，但是其范圍可以從10個(gè)核苷酸到數(shù)百核苷酸長度。例如，引物可以是12、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40或45個(gè)核苷酸長度。傳統(tǒng)方法可以從限制酶切消化液中純化引物，或可以化學(xué)合成引物。為了擴(kuò)增中的最大效率，引物通常是單鏈的，但是引物可以是雙鏈的。在用于擴(kuò)增以前，首先使雙鏈引物變性(例如加熱處理)以分離鏈。普通PCR技術(shù)參見，例如PCRPrimer:ALaboratoryManual(PCR引物:實(shí)-驗(yàn)室手冊)Dieffenbach和Dveksler編，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995。當(dāng)使用RNA作為模板資源時(shí)，可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA(cDNA)鏈。也可以使用連接酶鏈反應(yīng)、鏈置換擴(kuò)增、自主序列復(fù)制或基于核酸序列的增擴(kuò)以獲得如其他地方所述的分離的核酸(Lewis，Ge"e"c五"g^ee"'"gA^ws，12(9):1(1992);Guatelli等人，尸rac.Wa".爿cW.87:1874-1878(1990);以及Weiss,5We"ce，254:1292(1991))。還可以將分離的核酸化學(xué)合成為單核酸分子(例如使用3，到5'方向的自動(dòng)化DNA合成，所述合成使用亞磷酰胺技術(shù))或系列寡核苷酸。例如，可以合成一對或多對長寡核苷酸(例如>100個(gè)核苷酸)，其包含需要的序列，且每對含有互補(bǔ)短區(qū)段(例如約15個(gè)核苷酸)以致當(dāng)寡核苷酸對退火時(shí)形成雙鏈體。使用DNA聚合酶擴(kuò)展寡核苷酸，產(chǎn)生每個(gè)寡核苷酸對的單、雙鏈核酸分子，其然后可以連接到載體。誘變也可以獲得分離的核酸。例如，使用諸如通過PCR的寡核苦酸定向誘變和/或定點(diǎn)誘變的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以突變編碼多肽的核酸序列，所述多肽具有SEQIDNO:l、2、3或4所列的序列。參見ShortProtocolsinMolecularBiologyChapter8，(精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南第8章)，GreenPublishingAssociates和JohnWiley&Sons,Ausubel等人編輯，1992。所述突變包括添加、缺失、取代和其組合。戎謬，^fi勿/^本文件還提供了含有本文提供的核酸的載體。如本文所用，"載體"是復(fù)制子，如質(zhì)粒、噬菌體或粘粒，其中可以插入另一個(gè)DNA區(qū)段以導(dǎo)致插入?yún)^(qū)段的復(fù)制。載體可以是表達(dá)載體。"表達(dá)載體"是含有一個(gè)或多個(gè)表達(dá)控制序列的載體，并且"表達(dá)控制序列"是控制和調(diào)節(jié)另一個(gè)DNA序列轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的DNA序列。在本文提供的表達(dá)載體中，所述核酸可以可操作地連接到一個(gè)或多個(gè)表達(dá)控制序列。如本文所用，"可操作地連接"是指整合入基因組構(gòu)建體以至表達(dá)控制序列有效地控制關(guān)注的編碼序列的表達(dá)。表達(dá)控制序列的例子包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。啟動(dòng)子是包括DNA分子區(qū)的表達(dá)控制序列，通常在轉(zhuǎn)錄啟始點(diǎn)上游的100個(gè)核苷酸內(nèi)(通常在RNA聚合酶II的啟始位點(diǎn)附近)。為了使啟動(dòng)子控制編碼序列，必須將多肽翻譯閱讀框架的翻譯啟始位點(diǎn)置于啟動(dòng)子下游的一個(gè)和約五十個(gè)核苷酸之間。增強(qiáng)子提供有關(guān)時(shí)間、位置和水平的表達(dá)特異性。不像啟動(dòng)子，增強(qiáng)子在位于與距離轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)不同距離時(shí)，增強(qiáng)子可以具有作用。增強(qiáng)子也可以位于轉(zhuǎn)錄啟始位點(diǎn)的下游。當(dāng)RNA聚合酶能夠?qū)⒕幋a序列轉(zhuǎn)錄成mRNA時(shí)，編碼序列在細(xì)胞中"可操作地連接"并且在表達(dá)控制序列的"控制下"，然后將所述mRNA翻譯成編碼序列編碼的多肽。15合適的表達(dá)載體包括但不限于源自諸如噬菌體、桿狀病毒、煙草花葉病毒、皰滲病毒、巨細(xì)l包病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘病毒、&泉病毒和腙_伴隨病毒的質(zhì)粒和病毒載體。許多載體和表達(dá)系統(tǒng)可以從諸如Novagen(Madison,WI)、ClontechLaboratories(MountainView,CA)、Stratagene(LaJolla,CA)和Invitrogen/LifeTechnologies(Carlsbad,CA)的公司商業(yè)獲得。表達(dá)載體可以包括設(shè)計(jì)用于促進(jìn)表達(dá)核酸序列的隨后操作(如純化或定位)的標(biāo)志序列。標(biāo)志序列，諸如綠色焚光蛋白(GFP)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、多組氨酸、c-myc、紅細(xì)胞凝聚素或FlagTM標(biāo)志(Kodak,NewHaven:CT)序列，通常表達(dá)為與編碼多肽的融合。所述標(biāo)志可以插入到多肽的任何位置，包括羧基或氨基末端。術(shù)語"宿主細(xì)胞，，是指可以引入核酸分子或載體的原核細(xì)胞和真核細(xì)胞?？梢允褂萌魏畏椒▽⒑怂嵋爰?xì)胞。例如，可以使用磷酸鈣沉淀、電穿孔、熱激、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、顯微注射和病毒介導(dǎo)的核酸轉(zhuǎn)移將核酸引入細(xì)胞。此外，在體內(nèi)可以如其他地方所述將棵DNA直接傳送到細(xì)胞(美國專利第5,580,859和5,589,466號)。本文件提供了檢測本文提供的多肽的方法和材料?？梢允褂盟龇椒ê筒牧媳O(jiān)測接受作為治療物的多肽的哺乳動(dòng)物的多肽水平。例如，使用一種或多種抗體可以免疫檢測本文提供的多肽(例如含有SEQIDNO^所列的氨基酸序列的CU-NP多肽)。如本文所用，術(shù)語"抗體"包括完整的分子和其片段，其能夠結(jié)合到本文提供的多肽的表位決定子。術(shù)語"表位"是指抗體互補(bǔ)位結(jié)合的抗原上的抗原決定子。表位決定子通常由諸如氨基酸或糖側(cè)鏈的分子的化學(xué)活性表面組群組成，并且通常具有特定三維結(jié)構(gòu)特征和特定的電荷特征。表位通常具有至少五個(gè)連續(xù)的氨基酸(連續(xù)表位)，或者可選地，可以是限定特定結(jié)構(gòu)的一組非連續(xù)氨基酸(例如構(gòu)象表位)。術(shù)語"抗體，，包括多克隆抗體、單克隆抗體、人源化的或嵌合的抗體、單鏈Fv抗體片段、Fab片段和F(ab)2片段。多克隆抗體是免疫動(dòng)物的血清包含的抗體分子的異源種群。單克隆抗體是抗原特定表位的抗體的同源種群。對本文提供的多肽(例如含有SEQIDNO:4所列的氨基酸序列的CU-NP多肽)具有特異性結(jié)合親和力的抗體片段可以通過已知技術(shù)制備。例如，抗體分子的胃蛋白酶消化可以制備F(ab')2片段；減少F(ab')2片段的二硫鍵可以制備Fab片段。在一些實(shí)例中，可以構(gòu)建Fab表達(dá)庫。參見，例如Huse等人，5We"ce,246:1275(1989)。一旦制備抗體或其片段，可以用標(biāo)準(zhǔn)免疫測定方法(包括ELISA技術(shù)、放射性免疫測定和蛋白質(zhì)印跡)^r測抗體或其片段對本文提供的多肽的識別。參見ShortProtocolsinMolecularBiology,Chapter11,(精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南，第11章)GreenPublishingAssociates和JohnWiley&Sons,Ausubel,F.M等人編輯，1992。在免疫學(xué)測定中，可以直接或間接標(biāo)記對本文提供的多肽具有特異性結(jié)合親和力的抗體或結(jié)合到所述抗體的次級抗體。合適的標(biāo)記包括但不限于放射性核素(例如125I、131I、35S、3H、32P、"P或"C)、熒光部分(例如熒光素、FITC、PerCP、若丹明或PE)、發(fā)光部分(例如Invitrogen(Carlsbad,CA)提供的Qd0tTM納米粒)、吸收確定波長的光的化合物或酶(例如-成性磷酸酶或辣根過氧化物酶)。通過與生物素結(jié)合可以間接標(biāo)記抗體，然后用以上描述的分子標(biāo)記的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素檢測。檢測或量化標(biāo)記的方法依賴于標(biāo)記的性質(zhì)并為本領(lǐng)域所知。檢測器的例子包括但不限于x射線膠片、放射性計(jì)數(shù)器、閃爍計(jì)數(shù)器、分光光度計(jì)、色度計(jì)、熒光計(jì)、照度計(jì)和比重計(jì)。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的這些方法的組合(包括"多層"測定)力。強(qiáng)測定的靈敏度。檢測本文提供的多肽的免疫學(xué)測定可以以多種已知形式執(zhí)行，包括夾心式測定、竟?fàn)帨y定(竟?fàn)幮訰IA)或橋免疫測定。參見，例如，美國專利第5,296,347、4,233,402、4,098,876和4,034,074號。檢測本文提供的多肽的方法通常包括用結(jié)合到本文提供的多肽的抗體接觸生物樣品并且檢測多肽與抗體的結(jié)合。例如，通過本領(lǐng)域所知的多種方法中的任何一種，可以將對本文提供的多肽具有特異性結(jié)合親和力的抗體固定于固相基質(zhì)，然后將其暴露于生物樣品。通過利用表面等離子共振現(xiàn)象可以檢測固相基質(zhì)上多肽與抗體的結(jié)合，結(jié)合后導(dǎo)致表面等離子共振強(qiáng)度的變化，可以通過合適的i殳備(例長口Biacore4義(BiacoreInternationalAB,Rapsgatan,Sweden))定性地或定量地檢測結(jié)合。在一些實(shí)例中，可以如上所述地標(biāo)記和檢測抗體?？梢灾谱魇褂靡阎獢?shù)量的本文提供的多肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線幫助量化多肽水平。在一些實(shí)施方案中，"夾心式"測定可以被用于檢測本文提供的多肽的存在、缺失或水平，在"夾心式"測定中捕獲抗體被固定于固相基質(zhì)?？梢杂蒙飿悠方佑|固相基質(zhì)以至樣品中關(guān)注的任何多肽可以結(jié)合到固定抗體。使用對多肽具有特異性結(jié)合親和力的"檢測"抗體可以確定結(jié)合到抗體的多肽的存在、缺失或水平。在一些實(shí)施方案中，可以使用捕獲抗體，其對CNP或尿舒張肽以及本文提供的多肽具有結(jié)合親和力。在這一實(shí)施方案中，可以使用檢測抗體，其對本文提供的特定多肽(例如含有SEQIDNO:4所列的氨基酸序列的CU-NP多肽)具有特異性結(jié)合親和力。應(yīng)理解在夾心式測定中，捕獲抗體與檢測抗體不應(yīng)該結(jié)合到相同的表位(或多克隆抗體的實(shí)例中的系列表位)。因此，如果使用單克隆抗體作為捕獲抗體，那么檢測抗體可以是另一種單克隆抗體(其結(jié)合于與捕獲單克隆抗體結(jié)合的表位物理分離的或僅部分重疊的表位)或結(jié)合到不同于或除了捕獲單克隆抗體結(jié)合的表位以外的表位的多克隆抗體。如果使用多克隆抗體作為捕獲抗體，那么檢測抗體可以是單克隆抗體(其結(jié)合于與捕獲多克隆抗體結(jié)合的任何表位物理分離的或部分重疊的表位)或結(jié)合到不同于或除了捕獲多克隆抗體結(jié)合的表位以外的表位的多克隆抗體。夾心式測定可以被執(zhí)行為夾心式ELISA測定、夾心式蛋白質(zhì)印跡測定或夾心式免疫磁性檢測測定?？梢越Y(jié)合抗體(例如捕獲抗體)的合適固相基質(zhì)包括但不限于微量滴定板、管、諸如尼龍或硝化纖維膜的膜，以及珠或顆粒(如瓊脂糖、纖維素、玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、磁性或可磁化的珠或顆粒)。當(dāng)使用自動(dòng)化免疫測定系統(tǒng)時(shí)，磁性或可磁化顆粒可以特別有用。通過標(biāo)準(zhǔn)方法可以制備對本文提供的多肽具有特異性結(jié)合親和力的抗體。例如，多肽可以按以上所述來重組制備；可以從生物樣品純化(例如異源表達(dá)系統(tǒng))；或可以被化學(xué)合成，并且用于免疫宿主動(dòng)物，包括兔、雞、小鼠、豚鼠(guineapig)或大鼠。例如，具有SEQIDNO:4所列的氨基酸序列的多肽或其片段(至少六個(gè)氨基酸長度)可以被用于免疫動(dòng)物?？梢杂糜谠黾用庖邞?yīng)答的各種佐劑依賴于宿主的種類并且包括弗氏佐劑(完全和不完全)、諸如氫氧化鋁的礦物凝膠、表面活性物質(zhì)(例如溶血卵磷脂、聚氧丙烯多元醇(pluronicpolyol)、聚陰離子、肽、油乳劑、鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白和二硝基酚)。使用本文提供的多肽和標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)可以制備單克隆抗體。特別是，通過用于由培養(yǎng)基中的連續(xù)細(xì)胞系(例如Kohler等人，Atow'e，256:495(1975)描述的)制備抗體分子的任何技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等人，/w附wwofogv7bdqy,4:72(1983);Cole等人，Prac.Ato/80:2026(1983))和EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等人，"MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,"(單克隆抗體和癌癥治療)AlanR.Liss，Inc.,pp.77-96(1983))可以獲得單克隆抗體。所述抗體可以是任何免疫球蛋白類，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其任何亞類。制備單克隆抗體的雜交瘤可以在體內(nèi)和體外培養(yǎng)。電離(ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)。參見，例如Gevaert等人，五/e"rop/zoms'&,22(9):1645-51(2001);Chaurand等人，J!爿m.Soc.S/e"raw.，10(2):91-103(1999)。對所述應(yīng)用有用的質(zhì)譜儀可獲自AppliedBiosystems(FosterCity,CA);BrukerDaltronics(Billerica,MA)和AmershamPharmacia(Sunnyvale,CA)。本發(fā)明將被進(jìn)一步描述于以下的實(shí)施例，其不限制描述于權(quán)利要求的本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1一CU-NP的合成使用ABI431A肽合成儀設(shè)計(jì)和合成含有圖1所列的序列的多肽。所述多肽被稱為CU-NP多肽(圖1)。通過高效液相色譜/質(zhì)諳確定合成的CU-NP多肽。其分子量為3535.09并且其氨基酸序列是Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Met-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Sei'-Phe-Arg-Tyr(SEQIDNO:4)具有連接Cys殘基的二硫鍵(圖1)。實(shí)施例2—CU-NP的體內(nèi)效應(yīng)評估三只正常麻醉的狗的心腎功能。在輸注前、在以每個(gè)劑量水平45分鐘靜脈內(nèi)輸注10、50和100ngCU-NP/kg/分鐘期間(即每只狗獲得連續(xù)45分鐘輸注10、50和100ng/kg/分鐘)和在輸注后獲得清除率。分別通過Li+和菊粉的清除率評估腎小管(tubular)Na+的重吸收和GFR。通過放射性免疫測定定量神經(jīng)激素。通過重復(fù)測量的方差分析(ANOVA)，隨后通過Dunnett檢驗(yàn)來分析數(shù)據(jù)。結(jié)果(平均值土SEM)列在表1中。此外，血漿腎素活性從9±2減少到5土]，到3±l卞到3士卞ng/mL/小時(shí),并且血管緊縮肽II的水平從18士1減少到10土0.4卞到5士0.4卞到7士l卞pg/mL。與輸注前(323±6)比較，輸注100ng/kg/分鐘(329±5)結(jié)束時(shí)沒有觀察到QTc間隔(ms)的顯著變化。這些結(jié)果證明含有CNP和尿舒張肽氨基酸序列的多肽可以以依賴劑量的方式(l)增加排鈉利尿、利尿和GFR;(2)減少心臟填充壓；以及(3)抑制腎素和血管緊縮肽且不誘導(dǎo)明顯的低血壓。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*=P<0.05;t=P<0.01;GFR=腎小球過濾率；PFRNa^鈉的近端部分重吸收；0卩^^+=鈉的遠(yuǎn)端部分重吸收；PCWP-肺毛細(xì)血管楔壓；RAP-右房壓；MAP:平均動(dòng)a永壓。實(shí)施例3—CU-NP的進(jìn)一步生物效應(yīng)CU-NP或CNP多肽以50ng/kg/分鐘的速率75分鐘靜脈內(nèi)輸注于正常麻醉的狗。在輸注前(pre-I),輸注30和60分鐘時(shí)以及輸注后(post-I)收集血液和尿液樣品。使用菊粉清除率評估腎小球過濾率(GFR)。使用鋰清除技術(shù)測量Na+的近端和遠(yuǎn)端部分重吸收(分別為PFR他和DFRNa)。對比后三個(gè)時(shí)間點(diǎn)與pre-I。當(dāng)比較兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果時(shí)，使用Student'st檢驗(yàn)，而使用重復(fù)測量的方差分析比較四個(gè)時(shí)間點(diǎn)。結(jié)果(平均值士SEM)列在表2A和表2B中。CU-NP多肽顯著增加了血漿cGMP和尿cGMP的排泄。CU-NP也增加了尿流量和尿的Na+排泄，并且導(dǎo)致增加的腎小球過濾率。肺毛細(xì)血管楔壓和右房壓被降低且不減少全身性低血壓。肺動(dòng)脈壓也顯著降低，并且保持心輸出量。CU-NP輸注期間，血漿腎素活性、血管緊縮肽n的水平和醛甾酮水平被抑制，但是接著在CU-NP輸注停止后升高或"反彈"。這些數(shù)據(jù)表明長期作用形式的CU-NP可以用于連續(xù)的抑制神經(jīng)激素。CU-NP還顯著地增加cGMP的腎臟產(chǎn)生和尿的K+排泄。PFR他+和DFRN針均顯著減少。這些發(fā)現(xiàn)與重量調(diào)節(jié)的腎血流量的增加和腎血管阻力的減少有關(guān)。還觀察到血細(xì)胞比容的增加。增加了血漿ANP、血漿BNP和血漿CNP,和ANP、BNP和CNP的尿排泄。這些結(jié)果證明CU-NP多肽可具有cGMP活化、利尿、排鈉利尿、GFR增強(qiáng)、腎素-血管緊縮肽-醛甾酮系統(tǒng)(RAAS)抑制、心臟卸載(cardiac-unloading)和良好的腎血液動(dòng)力學(xué)的活性，而缺少降低血壓和引起全身性低血壓的能力。此外，這些結(jié)果證明CU-NP多肽可以增加內(nèi)源ANP和BNP的水平。合成的CU-NP多肽的腎小管效應(yīng)與近端小管和內(nèi)骨髓收集管道細(xì)胞的水平的作用一致。表2ACt/-7VP的薩;^心J&^炎條輸注前30分鐘60分鐘ir注后GFR(mL/min)38.4±3.650.7±2.6'53.8±2.8n50.1±3.5'尿流量(mL/min)0.13±0.021.28±0.25卞，；U4士0.22卞，0.33±0.04Na+排泄(pLEq/min)8.0±3.3216.4±42.3"'237.7±35.8t，151.2±9.4KT排泄(ueq/min)14.9±4.568.3±2.5T74.6±15.3T32.9±3.0PFR歸(%)84.9±2.562.4±4.0T6U士1.9卞70.4±2.8TDFRNa+'(%)99.2±0.292.4±I.2"192.2±1.1"97.7±0.4cGMP的腎產(chǎn)生469.0±55.42168±531TS2987±622"1394±185血漿cGMP(pmol/mL)8.2±0.726.2±3"129.8±1.5'n]3.0±0.9T尿cGMP排泄('pmol/min)770±483508±574卞14591士664"i2052±208PCWP(讓Hg)5.6±0.93.9±0.7'2.9±0.9T4.3±0.8RAP(mmHg)1.士0.60.3±0.5-0.1±0.5'0.7±0.4全身性低血壓(mm:Hg)135.9±3.9135.9±2.7]33.9±3.6142.3士2.7tPAP(mmHg)11.8±0.910.7±0.8'10.5±0.71"12.3±0.7心輸出量(L/tnin)3.1±0.33.4±0.53.0±0.52.8±0.5血漿腎素活性(ng/mL/hour)8.8±22.5±0.81.5±0.4T4.0±1.3卞血管緊縮肽II(pg/mL)〗3.9±2.06.9±0.7T4.5±0.3T22.6±1.6T醛甾酮(ng/dL)15.8±2.74.2±2.212.1±2.〗調(diào)節(jié)RBF(mL/kg/min)10.8±0.811.64±0.512.21±0.4T11.60±0.5RVR(xl(T5mmHg，min,L國1)0.55±0.050.50士0.040.47±0.03卞0.53±0.04血細(xì)胞比敘％)37.8±1.340.3±.3T4U±1.4T40.3±1.8T血漿ANP(pg/mL)R]±0.816.7±0.9'16.6±i.r15.2±0.6血漿BNP(pg/mL)8.2±0.921.0±1.8T17.0±2.2，'10.1±1.4血漿CNP(pg/mL)4.0士0.315.4±0.9卞15.1±1.41.3.2±0.2ANP排泄(pg/min)3.2±1.521.9±9.528.3±13.610.4±2.5BNP排泄(pg/min)13.9士1.518.2±1.519.3±1.220土5.4'CNP排泄(pg/min)2.0±0.44.0±1.29.1±3.921.5±17.4*=P<0.05vs.pre-I;t=P<0.01vs.pre畫I;i=P<0.05vs.CNP;§=P<0.01vs.CNP;1I=P<0.00]vs.CNP;GFR-腎小球過濾率；PFR他,鈉的近端部分重吸收；DFRN壯-鈉的遠(yuǎn)端部分重吸收；PCWP:肺毛細(xì)血管楔壓；RAP-右房壓；PAP=肺動(dòng)脈壓；R.BF-腎血流量；RVR^腎血管阻力。22表2B<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>*=P<0.05vs.pre-I;t=P<0.01vs.pre-I;GFR二腎小球過濾率；PFRNaf鈉的近端部分重吸收；DFR他+:鈉的遠(yuǎn)端部分重吸收。實(shí)施例3—人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中和體內(nèi)CU-NP的評估在人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)中檢測CU-NP，確定體內(nèi)cGMP活化的時(shí)間進(jìn)程。在C02培養(yǎng)箱中，CU-NP以l(T10、10-8或10^M與HAEC(傳代2-5,80-90%融合)培養(yǎng)10分鐘。將CU-NP(n=6)或CNP(n=3)以14pmol/kg/min75分鐘靜脈內(nèi)輸注于正常麻醉狗。在輸注前、輸注期間(I)的25、30、45、60、75分鐘和輸注后(post-I)的1、2、4、6、10、20、30、45、60分鐘收集血液。通過放射免疫測定定量環(huán)GMP。如表3所示，在HAEC中，CU-NP刺激了cGMP的產(chǎn)生(10-6]/[vs.未處理，PO.Ol)。此外，與pre-I相比，CU-NP增加了體內(nèi)血漿cGMP(I和post-I期間的所有時(shí)間點(diǎn)，PO.Ol，除了post-I的45分鐘，P<0.05)。與CNP比較，CU-NP更大程度地活化cGMP(PO.OOl，I的25分鐘至post-I的30分鐘)。因此，在HAEC中，CU-NP顯著活化cGMP，并且在體內(nèi)與CNP比較，CU-NP更大程度上顯著刺激cGMP。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>1(TSM0.03±0.021(T6M0.571±0.05卞未處理0.003±0.002'NPO.Olvs,未處理實(shí)施例4一分離的狗腎小球中CU-NP的cGMP刺激作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定在分離的腎小球中CU-NP是否直接刺激cGMP并比較CU-NP與CNP、URO和CNP-C的cGMP活化作用，所述CNP-C由CNP的全長22-AA和融合在C末端位置的N末端的復(fù)制物組成。在收獲正常狗的腎后分離腎小球。與對照比較，CU-NP、CNP、URO和CNP-C(1(T5M)與腎小球一起培養(yǎng)。用RIA和蛋白質(zhì)水平的修正測量環(huán)GMP。與各自的對照比較，CU-NP和URO表現(xiàn)出更大的cGMP應(yīng)答(PO.Ol)，但是組間沒有差異。與CNP和CNP-C比較，CU-NP和URO刺激更大的cGMP應(yīng)答(PO.OOl)。因此，與CNP相比，在腎小球中CU-NP更大程度地刺激cGMP,但是具有與URO相似的程度。CNP-C沒有活化cGMP。這些數(shù)據(jù)表明潛在地;陂活化的增強(qiáng)cGMP可能需要NP受體-A的配體的N和/或C末端。表4處理cGMP(平均值±SEM,finol/貼)CU-NP0.73±0.09卞$CNP0.0019±0.0005URO0.69±0.07卞$CNP-C0.00597±0.0053卞=P<0.01vs.相應(yīng)對照；*=P<0.001vs.CNP和CNP-C實(shí)施例5—CU-NP的血濃縮效應(yīng)研究三種人NP(BNP、CNP、URO和CU-NP)以評估它們對血管滲透性的效應(yīng)，其通過血細(xì)胞比容的增加表示。正常麻醉的狗接受以14pmol/kg/分鐘靜脈內(nèi)輸注BNP(n-7)、CNP(n=6)、URO(n=5)或CU-NP(n=6)。血液被收集到水上的EDTA管中并離心。報(bào)告了基線和輸注60分鐘后的數(shù)據(jù)。除了增加的血細(xì)胞比容(表5)，CU-NP減少了體內(nèi)PCW壓(基線6士0.9mmHg，60分鐘3±0.9mmHg;P<0.05)。因此，CU-NP的血濃縮效應(yīng)可以導(dǎo)致其體內(nèi)的心臟卸載作用。表5Cf7-iVP^/^勿_^^容時(shí)妓/處理血細(xì)胞比容(二卜均值土SEM;%)基線60minBNP36±140±2*CNP36±137±1URO37±140±1*CU-NP38±141±l卞(*=P<0.05;t=P<0.01)實(shí)施例6—狗的試驗(yàn)性心力衰竭中CU-NP的心腎和神經(jīng)元介質(zhì)作用在狗心力衰竭(HF)中評估CU-NP以確定CU-NP是否活化第二信使cGMP并發(fā)揮有益作用且沒有過度的低血壓。通過起搏(180bpm,持續(xù)10天)誘導(dǎo)溫和的HF。CU-NP以75ng/kg/分鐘靜脈內(nèi)輸注于6只麻醉的狗，持續(xù)75分鐘。通過菊粉清除率測量GFR。通過Li+清除率評估Na+的部分重吸收(FRNa)。在輸注前(pre-I)、I的30和60分鐘和post-I收集數(shù)據(jù)。還測量血漿腎素活性、血管緊縮肽II、醛甾酮和cGMP。結(jié)果(平均值土SEM)列在表6中。CU-NP增加血漿cGMP、尿的cGMP排泄、網(wǎng)狀(net)腎cGMP產(chǎn)生、尿流量和尿的Na+排泄。近端和遠(yuǎn)端FRNa減少。腎血流量和GFR增加，且MAP溫和的減少。CO和SVR沒有變化。PCWP和PAP減少。還抑制了血漿腎素活性、血管緊縮肽II和醛甾酮。因此，在狗的HF中CU-NP活化cGMP并且發(fā)揮腎素增強(qiáng)、心臟卸載和腎素-血管緊縮肽-醛甾酮系統(tǒng)抑制的作用，且沒有過度的低血壓。表6試-録朋CC/畫,^薩和心j^#炎拔25<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>*=P<0.05vs.pre-I;t=P<0.01vs.pre-I;GFR^腎小球過濾率；PFRNaf鈉的近端部分重吸收；DFR.Naf鈉的遠(yuǎn)端部分重吸收；PCWP:肺毛細(xì)血管楔壓；PAP-肺動(dòng)脈壓；RBF-腎血流量；MAP-平均動(dòng)脈壓；CC^心輸出量；SVR=全身性血管阻力。實(shí)施例7—CU-NP對腎灌注壓的體內(nèi)效應(yīng)由于RPP是腎功能的關(guān)鍵決定因素，因此進(jìn)行研究以確定CNP、CU-NP和URO對腎灌注壓(RPP，由MAP-RAP評估)的體內(nèi)作用。考慮到CU-NP的GFR增強(qiáng)作用，還進(jìn)行體外研究以檢驗(yàn)CU-NP(不像CNP)還活化NPR-A(—種強(qiáng)力的腎作用NP受體)的假設(shè)。以14.14pmol/kg/分鐘向17只正常麻醉的狗靜脈內(nèi)輸注等摩爾劑量的CU-NP、人CNP或人URO,持續(xù)75分鐘。在基線和輸注60分鐘評估RPP。數(shù)據(jù)用平均值±SEM表示。測量肽輸注開始后從第16分鐘到第45分鐘和從第46分鐘到第75分鐘的清除率。在每組中，使用雙尾配對t檢驗(yàn)比較肽輸注60分鐘和基線的RPP。通過兩因子方差分析和隨后的Bonferroni后檢驗(yàn)(post-test)進(jìn)行各組之間的比較。在存在或缺少NPR-A拮抗物(A71.9153(l，M))或NPR-B拮抗物(P194(UiM)),或兩種拮抗物依序加入(A71915接著是P194,兩者最終濃度為1pM)下，在收獲后從狗腎分離的腎小球中還評估了cGMP對3種肽的應(yīng)答。為了確定NPR-B參與cGMP對CU-NP的應(yīng)答，使用人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)進(jìn)行附加實(shí)驗(yàn)。在缺少或存在NPR-B配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體下，通過持續(xù)10分鐘培養(yǎng)CU-NP(10"，M)確定環(huán)GMP應(yīng)答。通過單因子方差分析和隨后的Bonferroni后;f企驗(yàn)分析體外數(shù)據(jù)(平均值±SEM)。統(tǒng)計(jì)顯著定義為P<0.05。將GraphPadPrism4(GraphPadSoftware,SanDiego,CA)用于統(tǒng)計(jì)分析。在體內(nèi)研究中，與URO比較，CU-NP維持了RPP(mmHg)。當(dāng)比較兩組時(shí)，在肽輸注60分鐘時(shí)，使用URO的RPP顯著低于CU-NP(P<0.05,圖2)。CNP不改變RPP。表7Ct/-,,力i^尸^ti<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>承二P:0.05vs.基線體外，10-5MCU-NP7倍增加了cGMPvs.CNP(0.76±0.05*fmol/^igvs.0.11±0.05fmol/嗎)，其具有甚至超過URO的活化cGMP的趨勢(0.54±0.10fmolg;P=0.086)。這些結(jié)果表述于圖3中。如圖4所示，通過用A71915(0.31±0.05卞fmol/嗎)阻斷NPR陽A、用P19(0.28±0.04卞fmol4ig)阻斷NPR-B或用A71915和P19(0.23±0.05卞fmol4ig)阻斷NPR-A和NPR-B削弱CU陽NP的cGMP刺激作用。在HAEC中，1(T6MCU-NP和CNP分別將cGMP增加到0.30±0.02pmol/mL和0.17±0.04pmol/mL(CU-NPvs.CNP的P<0.01;CU-NPvs.對照的P〈0.001;CNPvs.對照的PO.OOl)。在存在NPR-B抗體(l:IOO)下，CU-NP的cGMP應(yīng)答被削弱到0.19±0.02pmol/mL并且CNP的cGMP應(yīng)答被削弱到0.08±0.01pmol/mL(CU-NPvs.無抗體的PO.01并且CNPvs.無抗體的P<0.05)。結(jié)果繪制于圖5。這些數(shù)據(jù)表明NPR-B至少部分地參與了cGMP對CU-NP的應(yīng)答。因此，在腎增強(qiáng)劑量下，CU-NP維持了RPP，相反，URO降低了RPP。此外，在分離的腎小球中，CU-NP的作用涉及NPR-A和NPR-B的共活化，代表腎中新型二元NP受體活化劑。在人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中，NPR-B部分參與了cGMP對CU-NP的應(yīng)答。因此，CU-NP代表新穎的新肽技術(shù)，其能夠活化二元NPR-A和NPR-B。其他實(shí)施方案應(yīng)理解，雖然已經(jīng)結(jié)合其詳迷描述了本發(fā)明，但先前的描述意在說明并且不限制本發(fā)明的范圍，所述范圍由所附權(quán)利要求的范圍限定。其他方面、優(yōu)點(diǎn)和調(diào)整屬于以下權(quán)利要求的范圍。權(quán)利要求1.一種少于44個(gè)氨基酸殘基長度的多肽，其中所述多肽以從氨基末端到羧基末端的順序包括(a)SEQIDNO1所列的序列或SEQIDNO1所列的且不超過三個(gè)添加、缺失或取代的序列；(b)SEQIDNO2所列的序列或SEQIDNO2所列的且不超過五個(gè)添加、缺失或取代的序列；以及(c)SEQIDNO3所列的序列或SEQIDNO3所列的且不超過三個(gè)添加、缺失或取代的序列。2.如權(quán)利要求l所述的多肽，其中所述多肽包含排鈉利尿活性。3.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽缺乏誘導(dǎo)全身性低血壓的能力。4.如權(quán)利要求l所述的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:1所列的序列。5.如權(quán)利要求l所述的多肽，其中所述多肽包含SEQlDNO:2所列的序列。6.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:3所列的序列。7.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:1所列的序列、SEQIDNO:2所列的序列和SEQIDNO:3所列的序列。8.如權(quán)利要求l所述的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:1所列的且有不超過三個(gè)保守氨基酸取代的序列。9.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:2所列的且有不超過五個(gè)保守氨基酸取代的序列。10.如權(quán)利要求l所述的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:3所列的且有不超過三個(gè)保守氨基酸取代的序列。11.如權(quán)利要求l所述的多肽，其中所述多肽是基本純多肽。12.—種編碼權(quán)利要求1所述的多肽的分離的核酸。13.—種載體，其包含編碼權(quán)利要求1所述的多肽的核酸。14.一種宿主細(xì)胞，其包含編碼權(quán)利要求1所述的多肽的核酸。15.如權(quán)利要求14所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是真核宿主細(xì)胞。16.—種藥物組合物，其包括藥學(xué)可接受載體和權(quán)利要求1所述的多肽。17.—種增加哺乳動(dòng)物排鈉利尿活性且不降低血壓的方法，其中所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物施用權(quán)利要求1的多肽。18.—種治療具有心血管疾患或腎臟疾患的哺乳動(dòng)物的方法，其中所述方法包括在其中降低所述心血管疾患或腎臟疾患表現(xiàn)的嚴(yán)重性的條件下，向所述哺乳動(dòng)物施用權(quán)利要求1的多肽。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中向所述哺乳動(dòng)物施用所述多肽不降低所述哺乳動(dòng)物的血壓。全文摘要本文件提供利尿鈉多肽。例如，本文件提供具有排鈉利尿活性的多肽。在一些實(shí)例中，本文提供的多肽可以具有排鈉利尿活性，而缺乏降低血壓的能力。本文件還提供了在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)排鈉利尿活性的方法和材料。文檔編號C12N15/00GK101541957SQ200880000708公開日2009年9月23日申請日期2008年7月18日優(yōu)先權(quán)日2007年7月20日發(fā)明者C·Y·W·李,J·C·小伯內(nèi)特申請人:梅約醫(yī)學(xué)教育與研究基金會