專利名稱：含有高表達(dá)分泌胰島素前體的融合蛋白、編碼該融合蛋白的dna和胰島素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼含有高表達(dá)分泌胰島素前體的融合蛋白的DNA 、 以及使用該DNA制備胰島素的方法。其中所述高表達(dá)分泌胰島素前 體用于制備基因重組胰島素。
背景技術(shù)：
胰島素是使生物體內(nèi)血糖4直降低的唯 一 的激素。由于某些原因胰 島素的分泌功能降低，則可能導(dǎo)致胰島素依賴性糖尿病(IDDM)。胰島 素是具有胰島素分泌功能低下的患者的治療中所必須的藥物。
人的胰島素是由含有21個氨基酸的A鏈和含有30個氨基酸的B 鏈形成的多肽，A鏈內(nèi)具有l(wèi)個、A鏈和B鏈之間具有2個二;5危鍵。 胰島素首先是在胰臟胰島的B細(xì)胞中，以含有24個氨基酸的信號肽 (SP)、 B鏈(B)、含有31個氨基酸的C肽(C)、 A鏈(A)按該順序串聯(lián)排 列而成的前胰島素原(SP-B-C-A)的形式在細(xì)胞內(nèi)的核糖體中合成。前 胰島素原在進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)時信號肽被切離，形成胰島素原(B-C-A)。在 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)、在胰島素原的鏈內(nèi)生成二硫鍵，胰島素原形成立體結(jié)構(gòu)。 然后，通過激素原轉(zhuǎn)化酶PC1/3切斷B-C鍵，通過PC2切斷C-A鍵。 最后，在PCl/3切斷時，殘留在B鏈的C末端的2個堿性氨基酸被羧 基肽酶H切除，形成功能性的胰島素。
治療用的胰島素最初是從?；蜇i等動物的胰臟中提取的，目前幾 乎都是基因重組胰島素。
一直以來，基因重組胰島素是用含有編碼胰島素原的DNA的載 體轉(zhuǎn)化微生物，表達(dá)胰島素原，形成二硫鍵，然后通過轉(zhuǎn)換為胰島素的操作而生成。上述制備方法目前已經(jīng)開發(fā)有多種。例如EliLilly公 司開發(fā)了使用大腸桿菌使胰島素原表達(dá)，體外形成二疏鍵，用胰蛋白 酶和羧基肽酶B切取C肽，制備胰島素的方法(專利文獻(xiàn)1和2)。
Novo Nordisk公司開發(fā)了將B鏈和A鏈用2個堿性氨基酸連接， 使得到的小胰島素原(miniproinsulin)在酵母中表達(dá)，體外進(jìn)行胰蛋白 酶處理，從而制備胰島素的方法(專利文獻(xiàn)3-5)。該方法的優(yōu)點是 表達(dá)并分泌已經(jīng)形成二硫鍵的胰島素前體，因此無需體外進(jìn)行形成二 硫鍵的操作。并且，胰島素前體分泌在培養(yǎng)基中，因此容易分離純化。
基因重組胰島素的新型制備方法的開發(fā)在這之后也取得了積極 進(jìn)展，Hoechist(專利文獻(xiàn)6~12)或BIO-TECHNOLOGY GENERAL CORP(專利文獻(xiàn)13)開發(fā)了使用大腸桿菌的新型的制備方法。
如上所述，基因重組胰島素的制備方法已經(jīng)有多條途徑，但從表 達(dá)效率、二硫鍵的形成效率、變換為胰島素的方法方面還需要進(jìn)一步 改善。
從操作容易性和適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的角度考慮，作為生產(chǎn)基因重組 蛋白的宿主，尤其是微生物最容易被利用。特別是大腸桿菌和酵母是 已經(jīng)熟知的宿主。近年開發(fā)的^f吏用短芽孢桿菌屬(BreW&"7/w力的短短 芽孢桿菌(&ev凸ac!7/w ^"ev&)的基因重組蛋白的表達(dá)體系中，在功能 性的狀態(tài)下，具有二>5克鍵的多肽(人上皮細(xì)胞生長因子)以在培養(yǎng)基中 具有活性的狀態(tài)、即以形成了二碌"定的狀態(tài)大量分泌表達(dá)，因此作為 基因重組蛋白的大量生產(chǎn)體系受到人們的關(guān)注(專利文獻(xiàn)14和15、非 專利文獻(xiàn)1-4)。
嘗試在短短芽孢桿菌的基因表達(dá)體系中表達(dá)胰島素前體，開發(fā)了 胰島素原(專利文獻(xiàn)16)和突變型胰島素原(專利文獻(xiàn)17)的表達(dá)分泌方 法。由此顯示了以短短芽孢桿菌為宿主的基因重組胰島素生產(chǎn)的可能 性。
之后，為了使使用該表達(dá)體系的胰島素生產(chǎn)工業(yè)化，在通過蛋白 質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的共表達(dá)使表達(dá)量增加方面作了很多研究(專利文獻(xiàn)
518)。
專利文獻(xiàn)1:日本特公平1-48278號公報 專利文獻(xiàn)2:日本特許第2634176號公報 專利文獻(xiàn)3:日本特公平7-121226號公報 專利文獻(xiàn)4:日本特公平8-8871號公才艮 專利文獻(xiàn)5:日本特許第2553326號公報 專利文獻(xiàn)6:日本特開平2-195896號公報 專利文獻(xiàn)7:日本特開平2-225498號公報 專利文獻(xiàn)8:日本特開平2-233698號公報 專利文獻(xiàn)9:日本特開平3-169895號公報 專利文獻(xiàn)10:日本特開平4-2582%號公才艮 專利文獻(xiàn)11:日本特開平6-228191號公報 專利文獻(xiàn)12:日本特開平7-265092號公報 專利文獻(xiàn)13:國際公開第96/20724號小冊子 專利文獻(xiàn)14:日本特許第2082727號公報 專利文獻(xiàn)15:日本特開昭62-201583號公報 專利文獻(xiàn)16:日本特許第3313083號公報 專利文獻(xiàn)17:日本特許第3406244號公報 專利文獻(xiàn)18:國際公開第01/068884號小冊子
非專利文獻(xiàn)1: Yamagata, H.等人，J. Bacteriol. 169,1239 ~ 1245 (1987) 非專利文獻(xiàn)2:鵜高重三，日本農(nóng)藝化學(xué)會志61，669~676(1987) 非專利文獻(xiàn)3: Takao， M.等人，Appl. Microbiol. Biotechnol. 30, 75 ~ 80, 1989
非專利文獻(xiàn)4: Yamagata, H.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3589 ~ 3593 (1989)
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題
本發(fā)明的目的在于為了可工業(yè)化生產(chǎn)重組胰島素而特別提供可在使用芽孢桿菌屬(^7"'〃W》或短芽孢桿菌屬細(xì)菌的基因表達(dá)體系中進(jìn) 一步高表達(dá)分泌的、最佳的胰島素前體的序列。
解決課題的手段
因此，本發(fā)明人反復(fù)進(jìn)行試差法，在含有胰島素前體的融合蛋白
中插入含有芽孢桿菌屬或短芽孢桿菌屬細(xì)菌的胞壁蛋白(CWP)的N末 端起的5、 6、 7或12個氨基酸殘基的序列(前導(dǎo)肽)、插入前導(dǎo)肽和胰 島素B鏈之間的連接肽、使用胰島素B鏈(除去C末端的Thr)與A鏈 的融合體、向胰島素B鏈和A鏈之間插入連接肽等，可以在芽孢桿菌 屬或短芽孢桿菌屬的表達(dá)體系中實現(xiàn)胰島素前體的高表達(dá)分泌，從而 完成了本發(fā)明。并且確認(rèn)了可以以高收量由該前體制備胰島素。 即，本發(fā)明提供以下內(nèi)容。
(1) DNA，該DNA編碼融合蛋白，該融合蛋白是來自芽孢桿菌屬 或短芽孢桿菌屬細(xì)菌的胞壁蛋白(CWP)之一的MWP的信號肽；含有 來自芽孢桿菌屬或短芽孢桿菌屬細(xì)菌的CWP的5 ~ 7或12個氨基酸 的前導(dǎo)肽；具有以下通式(Asp、 Leu或Gly) (Gly、 Asn、 Ser或Leu) (Asp、 Ser或Pro) (Arg或Ala或無)Arg (SEQ ID N0.51或52)所示的 氨基酸序列的連接肽；以及胰島素前體的氨基酸序列按該順序連接而 成。
(2) 上迷(l)所述的DNA,其中上述連接肽具有SEQ ID NO.l ~ 6 中任一項表示的氨基酸序列。
(3) 上迷(1)或(2)所述的DNA，其中上述前導(dǎo)肽來自MWP。
(4) 上迷(1)~(3)中任一項所述的DNA，其中上述胰島素前體具有 SEQ ID NO.8或9表示的氨基酸序列。
(5) 上迷(1)~(4)中任一項所述的DNA,其中上述融合蛋白具有 SEQ IDNO.10~ 18中任一項表示的氨基酸序列。
這里，SEQIDNO.10~ 18的氨基酸序列具有下式的結(jié)構(gòu)。
式MWPsp-MWPmp5-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain (SEQ ID NO. 10)
MWPsp-MWPmp6-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain (SEQ ID NO. 11)
MWPsp-MWPmp6-LeuAsnSerAlaArg-Bchain(desThr)畫Achain (SEQ ID NO. 12)
MWPsp-MWPmp6-GlySerProArg-Bchain(desThr)-Achain (SEQ ID NO. 13)
MWPsp-MWPmp7-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain (SEQ ID NO. 14)
MWPsp-MWPmp7-AspLeuAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain (SEQ ID NO. 15)
MWPsp-MWPmp7-AspAsnAspArgArg-Bchain(desThr)誦Achain (SEQ ID NO. 16)
MWPsp-MWPmp 12-AspGlyAspArgArg-Bchain(desrhr)-Achain (SEQ ID NO. 17)
MWPsp-MWPmp7-AspGlyAspArg-Bchain-ArgAspGlyAspArg-Ach ain (SEQ ID NO. 18)。
(6) 上述(1) (S)中任一項所述的DNA，其中該DNA具有由SEQ IDN0.19~27中任一項表示的核苷酸序列。
(7) 載體，該載體含有上述(1)~(6)中任一項所述的DNA。
(8) 上述(7)所述的載體，其中上述DNA與來自細(xì)菌的啟動子序
列的下游功能性連接。
(9) 上述(8)所述的載體，其中上述啟動子來自芽孢桿菌屬或短芽 孢桿菌屬細(xì)菌。
(10) 上述(7)~(9)中任一項所述的載體，該載體進(jìn)一步含有編碼 蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)的DNA。
8(11) 宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有上述(7)~(10)中任一項所述的栽體。
(12) 上述(ll)所述的宿主細(xì)胞，其中上述宿主細(xì)胞是芽孢桿菌屬 或短芽孢桿菌屬細(xì)菌。
(13) 上述(12)所迷的宿主細(xì)胞，其中上述細(xì)菌是短短芽孢桿菌。
(14) 胰島素的制備方法，該制備方法包含以下步驟培養(yǎng)上述 (11)~(13)中任一項所述的宿主細(xì)胞的步驟；由宿主細(xì)胞表達(dá)所需融合 蛋白的步驟；將表達(dá)的多肽從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收的步驟。
(15) 上述(14)所迷的方法，該方法進(jìn)一步包含將回收的多肽進(jìn)行 酶解處理的步驟。
(16) 上述(15)所述的方法，其中上述酶解處理通過胰蛋白酶進(jìn)行 處理。
(17) 上述(14)~(16)中任一項所迷的方法，該方法是從培養(yǎng)基中 回收上述多肽。
(18) 融合蛋白，該融合蛋白具有SEQIDNO.10 18中任一項表 示的氨基酸序列。
本說明書中使用的"芽孢桿菌屬或短芽孢桿菌屬細(xì)菌"的術(shù)語是指 被分類為革蘭氏陽性桿菌的芽孢桿菌屬或短芽孢桿菌屬的任何細(xì)菌。 上述細(xì)菌有短短芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌(^^7/"^^"/&)、地衣形 芽孢桿菌C6ac〃/us /z'c/ em》rm&)、 多粘芽孑包桿菌C6acz7/ws j: o/ymy;ca)等, 優(yōu)選短短芽孢桿菌。
本說明書中使用的"MWP，，的術(shù)語是指具有含三層的細(xì)胞壁的細(xì) 菌的胞壁蛋白(CWP)中所含的中壁蛋白(middle wall protein)。
本說明書中使用的"胰島素前體"的術(shù)語是指通過適當(dāng)?shù)奶幚?例 如酶解處理)可轉(zhuǎn)換為功能性的胰島素、至少含有B鏈或C末端缺失 Thr的B鏈以及A鏈的多肽。發(fā)明效果
根據(jù)本發(fā)明，通過使用新型的融合蛋白，可以制備比以往的在芽
孢桿菌屬中表達(dá)胰島素前體的例子高1.5-3倍表達(dá)分泌量的重組胰 島素。該重組胰島素前體可以變換為胰島素，且在表達(dá)分泌時可正確 地形成胰島素的生物活性所必須的二斬at
附圖簡述
圖l表示MWPsp-MWPmp5-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain的核香酸序列(SEQ ID N0.19)。
圖2表示MWPsp-MWPmp5-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)-A chain的氨基酸序列(SEQ ID NO. 10)。
圖3表示W(wǎng)Psp畫MWPmp6-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)國 Achain的核苷酸序列(SEQ ID NO.20)。
圖4表示W(wǎng)Psp-MWPmp6-AspGlyAsp ArgArg畫Bchain(desThr)陽 Achain的氨基,列(SEQ ID NO. 11);
圖5表示MWPsp-MWPmp6-LeuAsnSerAlaArg畫Bchain(desThr)-Achain的核苷酸序列(SEQ ID NO.21)。
圖6表示M曹sp-MWPmp6-LeuAsnSerAlaArg-Bchain(desThr)-Achain的氨基辦列(SEQ ID NO. 12)。
圖7表示MWPsp-M曹mp6-GlySerProArg-Bchain(desThr)-Achain 的核苷酸序列(SEQ ID N0.22)。
圖8表示MWPsp-MWPmp6畫GlySerProArg-Bchain(desThr)-Achain 的氨基酸序列(SEQ ID NO. 13)。
圖9表示MWPsp-MWPmp7-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain的核苷M"列(SEQIDNO,23)。
圖10表示MWPsp隱M曹mp7陽AspGlyAsp ArgArg-Bchain(desThr)-Achain的氨基酸序列(SEQ ID NO. 14)。
圖1 l表示M曹sp-M曹mp7-AspLeuAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain的核苷酸序列(SEQ ID N0.24)。
圖12表示MWPsp-MWPmp7-AspLeuAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain的氨基,列(SEQ ID NO. 15)。
圖13表示MWPsp-MWPmp7腸AspAsnAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain的核苦i^列(SEQ ID N0.25)。
圖14表示MWPsp-MWPmp7-AspAsnAspArgArg隱Bchain(desThr)-Achain的氨基酸序列(SEQ ID NO,16)。
圖15表示MWPsp-MWPmp 12-AspGlyAspArgArg曙Bchain(desThr)-Achain的核苷酸序列(SEQ ID N0.26)。
圖16表示MWPsp-MWPmp 12-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain的氨基齡列(SEQ ID NO. 17)。
圖17表示MWPsp-MWPmp7-AspGlyAspArg-Bchain誦ArgAspGly AspArg-Achain的核苷酸序列(SEQ IDN0.27)。
圖18表示MWPsp-MWPmp7-AspGlyAspArg-Bchain-ArgAspGly AspArg-Achain的氨基崎列(SEQ ID NO. 18)。
圖19表示將融合DNA重組短芽孢桿菌的表達(dá)載體(pNU211R2L5) 的方法的概略圖。
圖20表示融合蛋白的表達(dá)量。
圖21是表示Des-Thr胰島素的肽圖的HPLC洗脫圖譜。 圖22表示成熟胰島素的HPLC洗脫圖譜。
實施發(fā)明的最佳方式
根據(jù)本發(fā)明，通過使編碼上述融合蛋白(以下根據(jù)情況可稱為"小 胰島素原，，或"MINIPINS，，)的DNA在芽孢桿菌屬或短芽孢桿菌屬細(xì)菌 中表達(dá)，胰島素前體可以在培養(yǎng)基中高產(chǎn)量分泌。將其分離純化，通 過胰蛋白酶切斷、以及使用Bchain(desThr)時進(jìn)行Thr的附加，可以 獲得具有天然型的所需結(jié)構(gòu)的"夷島素。
使胰島素前體高表達(dá)分泌的第一條件是在上述融合蛋白中，在分
ii泌所必須的信號肽和胰島素前體之間配置含有特定氨基酸序列的前 導(dǎo)肽和連接肽。
根據(jù)本發(fā)明的實施方案，適合胰島素前體的高表達(dá)分泌的前導(dǎo)肽
是芽孢桿菌屬或短芽孢桿菌屬細(xì)菌的胞壁蛋白(CWP)的N末端的5、6、 7或12個氨基酸殘基。CWP可使用例如來自短短芽孢桿菌林、47 (FERMP-7224:日本特開昭60-58074號公報、專利文獻(xiàn)15)、 HPD31 (FERM BP-1087:日本特開平4-278091號公報)等的CWP，但并不限 于此。前導(dǎo)肽具體可使用以下所例舉的序列(將引用了該序列的文獻(xiàn)表 示在括號內(nèi))
MWPmpl2: AlaGluGluAlaAlaThrThrThrAlaProLysMet (SEQ ID NO.28; Biotechnol" Genet. Eng. Rev" 7: 278 ~ 311, 1989)
OWPmpl2: AlaProLysAspGlylleTyrlleGlyGlyAsnlle (SEQ ID NO: 29; J. Bacteriol., 170: 935 ~ 945, 1988)
HWPmpl2: AlaGluAspThrThrThrAlaProLysMetAspAla (SEQ ID NO: 30; J. Bacteriol.， 172: 1312 ~ 1320, 1990)。
自N末端起的氨基酸殘基數(shù)只要可高表達(dá)該融合蛋白即可，沒有 限定，優(yōu)選5、 6、 7或12個。其它的例子可以是8、 10或11個(專利 文獻(xiàn)16)。
在緊鄰胰島素前體的B鏈或C末端缺失Thr的B鏈(B鏈(desThr)) 之前、以及在B鏈和A鏈之間任意配置的連接肽具有兩種功能。其一 是由胰島素前體變換為胰島素時作為被胰蛋白酶切斷的部位的功能。 另 一功能是使胰島素前體高表達(dá)分泌。被胰蛋白酶切斷的部位是堿性 氨基酸Arg或Lys。因此，優(yōu)選在緊鄰B鏈或B鏈(besThr)之前的連 接肽的C末端、B鏈和A鏈之間的連接肽的N末端和C末端含有1 個或2個Arg?；蛘?，在C末端缺失Thr的B鏈直接與A鏈連接的狀 態(tài)下，B鏈的自C末端起第2號Lys為切斷部位。
含有1個以上氨基酸殘基的連接肽通常存在于蛋白質(zhì)中的功能域 之間，對各域的功能沒有影響地與域連接。本發(fā)明中，連接肽在前導(dǎo)肽和B鏈或B鏈(desThr)之間、以及在任意B鏈和A鏈之間分別經(jīng)由 胰蛋白酶切斷部位配置，且連接肽起到使B鏈和A鏈之間和/或A鏈 內(nèi)的二硫鍵形成、胰蛋白酶的切斷、以及該融合蛋白的表達(dá)容易地進(jìn) 行的作用。只要滿足上述功能，連接肽可以是1個以上的氨基酸，無 需是特定的氨基酸序列。如果上述連接肽位于(i)前導(dǎo)肽和B鏈之間， 則優(yōu)選通式(Asp、 Leu或Gly) (Gly、 Asn、 Ser或Leu) (Asp、 Ser或 Pro) (Arg或Ala或無)Arg (SEQ ID NO.51或52)所示的氨基酸序列， 更優(yōu)選AspGlyAspArgArg (SEQ ID NO. 1)、 LeuAsnSerAlaArg (SEQ ID N0.2)、 GlySerProArg (SEQ ID N0.3)、 AspLeuAspArgArg (SEQ ID N0.4)、 AspAsnAspArgArg (SEQ ID NO,5)或AspGlyAspArg (SEQ ID N0.6);如果位于(ii) B鏈和A鏈之間，則是ArgAspGlyAspArg (SEQ ID N0.7)。為B鏈(desThr)時，B鏈和A鏈之間可以不存在連接肽。
本發(fā)明的DNA可以結(jié)合本領(lǐng)域公知的技術(shù)進(jìn)行制備，例如，通 過化學(xué)合成法或克隆法分別制備構(gòu)成要素的各DNA序列，用連接酶 將這些構(gòu)成要素依次連接，結(jié)合PCR擴增法，可以制備目標(biāo)DNA。 具體可參照實施例來理解其詳細(xì)內(nèi)容，其中的各種技術(shù)可采用 Maniatis, T.等人，Molecular Cloning第2版，A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)、 Innis， M. A.等人，PCR Protocols, A guide to methods and applications, Academic Press (1990)等中記載的常 規(guī)技術(shù)。
編碼含有胰島素的B鏈、C肽、A鏈的人胰島素原的DNA可使 用市售的cDNA First Strand Synthesis Kit等，從市售的人胰臟的mRNA 中獲得。并且，如果根據(jù)已知的DNA序列(GenBank登記號 NM_000207),使用市售的DNA合成儀可以合成作為引物的短鏈 DNA,則通過常規(guī)的聚合iW反應(yīng)(PCR)，可以擴增編碼B鏈、A鏈 等的所需的DNA片段。此時，優(yōu)選以DNA的變性(94。C、 30秒~ 2 分鐘)、與引物的退火(55。C、 30秒-l分鐘)、以及伸長反應(yīng)(72。C、 30 秒 1分鐘)作為一個循環(huán)，重復(fù)20個循環(huán)以上。本發(fā)明進(jìn)一步提供含有本發(fā)明的上述DNA的載體?？墒褂玫妮d 體必須至少具有以下的性質(zhì)具有可以重組本發(fā)明的DNA的適當(dāng)插 入位點(即限制酶切位點)；可以-使該DNA在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；并且可 在該宿主細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制等。載體可以含有啟動子、復(fù)制起點、終止 子序列，還可以含有抗藥性基因、與營養(yǎng)缺陷型互補的基因等選擇標(biāo) 志。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，編碼該融合蛋白的DNA與來自芽孢桿 菌屬或短芽孢桿菌屬的含有啟動子區(qū)域的DNA序列的3，末端功能性 連接。本發(fā)明中，"功能性連接"是指各功能性核苷酸序列(啟動子等) 可發(fā)揮其功能地連接?？墒褂玫膯幼永缬刑墙徒庀祮幼?、組 織特異性啟動子、病毒啟動子、誘導(dǎo)性啟動子等。啟動子優(yōu)選為來自 短短芽孢桿菌47的MWP啟動子(日本特公平1-58950號公報、曰本 特公平7-108224號公報)、來自短短芽孢桿菌HPD31的HWP啟動子 (曰本特開平4-278091號公報、曰本特開平6-133782號公報)等，但并 不限于此。選擇標(biāo)志的例子例如有氨節(jié)青霉素抗性基因、卡那霉素 抗性基因、紅霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因等抗藥性基因。
本發(fā)明的載體例如有保持在適合性的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞、例 如細(xì)菌細(xì)胞、菌類細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物和動物細(xì)胞等宿 主細(xì)胞中并可表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的任意的DNA載體。優(yōu)選本發(fā)明的載 體是可在芽孢桿菌屬或短芽孢^f干菌屬細(xì)菌中復(fù)制的質(zhì)粒。例如可使用 pNU200、 pHY500 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 3589 ~ 3593, 1989)、 pHY4831 (J. Bacteriol., 169: 1239 - 1245, 1987)、 pNU100 (Appl. Microbiol. Biotechnol,， 30: 75 ~ 80， 1989)、 pNU211 (J. Biochem.， 112: 488 - 491, 1992)、 pNU211R2L5 (日本特開平7-170984號公報)、 pHY700 (日本特開平4-278091號公報)、pHT210 (日本特開平6-133782 號公報)、pHT110R2L5 (Appl. Microbiol. Biotechnol,， 42: 358 -363, 1994),但并不限于此。本發(fā)明的具體例子中，可以按照圖19所示的 構(gòu)建法制備表達(dá)載體pNU-MINIPINS~hPDI*。
本發(fā)明提供除上述DNA之外，還進(jìn)一步包含編碼蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)的DNA。在上述具體例子中所例舉的表達(dá)載體 pNU-MIMPINS hPDP擔(dān)載PDI基因，因此可用于上述載體的構(gòu)建。 通過上述載體，PDI基因與目標(biāo)融合蛋白共表達(dá)。
使PDI與所需蛋白質(zhì)共表達(dá)的優(yōu)點如下。例如，來自哺乳動物的 功能性的多肽在細(xì)菌表達(dá)體系中表達(dá)時，細(xì)菌表達(dá)體系中大多難以正 確的形成為了使該多肽具有功能性的折疊而必須的二硫4建。上述細(xì)菌 表達(dá)體系中，在不能正確地形成或者難以形成二碌u鍵的多肽表達(dá)時， 通過使PDI共表達(dá)，可以構(gòu)建目標(biāo)多肽與PDI共存的環(huán)境，由此可以 具有正確的二硫鍵，因而可以*提高具有所需功能的多肽的生產(chǎn)效率。
上述嘗試詳細(xì)記載于國際7>開第WO01/068884號中。
本發(fā)明中，編碼PDI的DNA可以使用來自以人為代表的哺乳動 物DNA，來自昆蟲、酵母等真核生物的DNA。來自哺乳動物的PDI 基因的核苷酸序列例如有人(NM—000918)、小鼠(NMJ)l 1032)、大 鼠(NMJ)12998),均登記于數(shù)據(jù)庫中。另外，來自酵母的PDI例如記 載于WO98/035049等中。
適合使用上述PDI共表達(dá)體系的宿主是芽孢桿菌屬或短芽孢桿菌 屬的細(xì)菌，最優(yōu)選的宿主是短短芽孢桿菌。
本發(fā)明進(jìn)一步提供用上述定義的載體轉(zhuǎn)化的例如細(xì)菌細(xì)胞、菌類 細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、纟直物和動物細(xì)胞等的宿主細(xì)胞。優(yōu)選該 宿主細(xì)胞是芽孢桿菌屬或短芽孢桿菌屬細(xì)菌。作為宿主的芽孢桿菌屬 或短芽孢桿菌屬細(xì)菌例如有短短芽孢桿菌林、47 (FERM P-7224:曰本 特開昭60-58074號公報、專利文獻(xiàn)15)、 (日本特開平^"7876 號公報)、31-OK (日本特開平6-296485號公報)和HPD31 (FERM BP-1087，日本特開平4-278091號公報)等，但并不限于此。
上述所得的表達(dá)載體導(dǎo)入感受態(tài)的宿主細(xì)胞中，在可表達(dá)的條件 下、在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)該細(xì)胞，在細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)、優(yōu)選在細(xì)胞 外生產(chǎn)目標(biāo)重組多肽。接著按照常規(guī)方法回收并純化多肽。
載體的導(dǎo)入方法可例舉疇酸鈣法、電穿孔法(Methods in Enzymol.,217:23 -33,1993)、原生質(zhì)球融合法、原生質(zhì)體融合法、顯微注射法、 農(nóng)桿菌法、基因槍法等。
關(guān)于具有表達(dá)載體的上述細(xì)胞的培養(yǎng)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù) 細(xì)胞的種類選擇公知的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和培養(yǎng)條件。例如，宿主細(xì)胞為 芽孢桿菌屬或短芽孢桿菌屬細(xì)菌時，宿主細(xì)胞的培養(yǎng)可以在T2培養(yǎng) 基中、在37。C下培養(yǎng)一天，然后將T2培養(yǎng)基中的菌懸浮液的一部分 轉(zhuǎn)移至M-5YC培養(yǎng)基中，將該培養(yǎng)基在30。C下振蕩培養(yǎng)4天。
由細(xì)胞外回收多肽，例如可從培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中進(jìn)行。由細(xì)胞 內(nèi)回收多肽，例如可通過離心回收細(xì)胞，破壞該細(xì)胞，回收該多肽來 進(jìn)行。
另外，所得多肽的純化例如可將凝膠過濾色譜、離子交換色譜、 親和層析、疏水性相互作用色譜、電泳、等電點電泳等方法單獨或組 合實施。
接著，可將上述得到的多肽通過胰蛋白酶處理制成desThr-胰島 素，再在叔丁基-Thr的存在下實施胰蛋白酶處理，由此可獲得胰島素。 因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供胰島素的制備方法，該制備方法包含將上述 轉(zhuǎn)化的芽孢桿菌屬或短芽孢桿菌屬細(xì)菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使含有胰島 素序列的多肽在菌體外蓄積，對回收的多肽進(jìn)行胰蛋白酶處理，獲得 胰島素。
上述得到的重組胰島素具有與天然型胰島素完全相同的二硫鍵、 HPLC洗脫圖譜，可用作胰島素依賴型糖尿病的治療用藥物。
實施例
以下通過實施例，更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實 施例的限定。
在制備編碼融合蛋白的DNA時，采用了通過使用DNA連接酶的 連接反應(yīng)，將PCR反應(yīng)(聚合酶鏈反應(yīng))擴增的DNA片段連接的方法。 本說明書中，MWPsp是指MWP蛋白質(zhì)的信號肽，MWPmp是指MWP成熟蛋白質(zhì)的N末端肽,之后接續(xù)的數(shù)字表示自N末端起的氨基酸數(shù) 目。
實施例I
1.各種DNA片段的獲得
(1) DNA片段MWPsp-MWPmp5的獲得
a. 模板DNA
按照公知的方法(Molecular Cloning第2版，A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)),由短短芽孢桿菌(47-5Q林)提取 的基因組DNA(840 ng)
b. 引物
正向引物5，-ACACGCGCTTGCAGGATTCG-3， (SEQ ID NO.31) 反向引物5，-TGCTGCTTCTTCTGCTGC-3， (SEQ ID NO.32) 引物是以由Yamagata， H.等人(J. Bacteriol.， 169, 1239 ~ 1245, 1987) 和Tsuboi， A,等人(J. Bacteriol., 170, 935 ~ 945, 1988)確定的MWP蛋白 質(zhì)的核苦酸序列為基礎(chǔ)進(jìn)行有4幾化學(xué)合成而獲得的，以其在反應(yīng)液的 終濃度為0.1 ;wmol/L加入。
c. TaqDNA聚合酶
每一反應(yīng)加入5U市售的產(chǎn)品(GIBCO BRL公司制備)。
d. 其它
加入Tris-HCl (終濃度20 mmol/L， pH8)、 MgCl2 (終濃度2.5 mmol/L)、 dNTPs (dATP、 dGTP、 dCTP和dTTP:終濃度分別為50 戶ol/L)。
將a ~ d以反應(yīng)液量100 〃L加入到0.5 mL管中，通過公知的方法 (Innis, M. A.等人，PCR Protocols, A guide to methods and applications, Academic Press, (1990))進(jìn)行PCR反應(yīng)(變性94°C 1分鐘，退火50°C 1分鐘，DNA鏈延伸72°C 1分鐘，以此作為1個循環(huán)，共進(jìn)行30 個循環(huán))。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用苯酚濃縮，然后應(yīng)用于0.8%的瓊脂糖凝膠上，在常規(guī)條件下進(jìn)行電泳，使用MilliporeUltrafree-C3H 從瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物，即DNA片段MWPsp-MWPmp5?；?收的PCR產(chǎn)物用苯酚提取，然后用乙醇沉淀，真空干燥，溶解于適量 的蒸餾水中。使用DNA平端試劑盒(DNA blunting kit)(寶酒造公司制 備)，按照使用說明書進(jìn)行平端化反應(yīng)。
(2) DNA片段MWPsp-MWPmp6的獲得
除以下幾點之外，按照與(l)同樣的順序獲得平端的DNA片段 MWPsp-MWPmp6。
使用反向引物5'畫AGTTGCTGCTTCTTCTGC-3， (SEQ ID N0.33)。
-PCR的反應(yīng)條件是，變性94°C l分鐘，退火50°C 1分鐘， DNA鏈延伸72。C30秒，以此作為1個循環(huán)，共進(jìn)行25個循環(huán)。
(3) DNA片段MWPsp-MWPmp7的獲得
除以下幾點之外，按照與(l)同樣的順序獲得平端的DNA片段 M，sp-MWPmp7。
.使用反向引物5，-AGTAGTTGCTGCTTCTTC-3， (SEQ ID NO,34)。
.PCR的反應(yīng)條件是，變性溫度94°C l分鐘，退火50°C l分 鐘，DNA鏈延伸72°C 30秒，以此作為1個循環(huán)，共進(jìn)行25個循環(huán)。
(4) DNA片段MWPsp-MWPmp12的獲得
除以下幾點之外，按照與(l)同樣的順序獲得平端的DNA片段 MWPsp-MWPmp 12。
.使用反向引物5，-CATTTTTGGAGCTGTAGT-3， (SEQ ID NO,35)。
.PCR的反應(yīng)條件是，變性溫度94°C l分鐘，退火50°C l分 鐘，DNA鏈延伸72°C 30秒，以此作為1個循環(huán)，共進(jìn)行25個循環(huán)。
(5) DNA片段胰島素原的獲得
除以下幾點之外，按照與(l)同樣的順序獲得平端的DNA片段胰島素原。
'模板DNA使用10 ng重組了人前胰島素原DNA的質(zhì)粒載體。重 組了人前胰島素原DNA的質(zhì)粒載體的獲得如下進(jìn)行。使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Pharmacia 司)，按照使用說明書，由市售的人 胰臟mRNA (CLONTECH公司制備)合成人胰臟cDNA。以該cDNA 為模版，使用以Bell. G. I等人(Nature， 282， 525 ~ 527, (1979))確定的人 前胰島素原基因的核苷酸序列為基礎(chǔ)合成的正向引物5，-ATGGCCC TGTGGATGCGCC-3， (SEQ ID N0.36)和反向引物5，-CTAGTTG CAGTAGTTCTCC-3，(SEQIDN0.37)，進(jìn)行PCR反應(yīng)(條件以94°C l分鐘，60°C l分鐘、72°C l分鐘為l個循環(huán)，進(jìn)行35個循環(huán))，將 所得PCR產(chǎn)物、即人前胰島素原DNA克隆到pGEM-T載體(Promega 公司制備)中。
-引物使用正向引物5，-TTTGTGAACCAACACCTG-3， (SEQ ID NO,38)和反向引物5，-CTAGTTGCAGTAGTTCTCC-3， (SEQ ID NO,37)。
-PCR的反應(yīng)條件是，變性94°C l分鐘，退火47°C 1分鐘， DNA鏈延伸72。C30秒，以此作為1個循環(huán)，共進(jìn)行25個循環(huán)。
(6) DNA片段DGDR-Bchain-R的獲得
除以下幾點之外，按照與(l)同樣的順序獲得平端的DNA片段 DGDR-Bchain-R。
'模板DNA使用10ng由(5)得到的胰島素原PCR產(chǎn)物。
引物使用正向引物5，-GACGGTGATCGCTTTGTGAACCAACA CCTG-3， (SEQ ID NO,39)和反向引物5，-GCGGGTCTTGGGTGTG TAGAA-3， (SEQ ID NO.40)。
-PCR的反應(yīng)條件是，變性94°C l分鐘，退火52°C 1分鐘， DNA鏈延伸72。C30秒，以此作為1個循環(huán)，共進(jìn)行25個循環(huán)。
(7) DNA片段DGDRR-Bchain(desThr)的獲得
除以下幾點之外，按照與(l)同樣的順序獲得平端的DNA片段DGDRR-Bchain(desThr)，再進(jìn)行磷酸化反應(yīng)(使用T4多核普酸激酶
(Nippon Gene公司制備)，方法是4姿照使用說明書),得到磷酸化的DNA
片段DGDRR-Bchain(desThr)。
'模板DNA使用10 ng由(5)得到的胰島素原PCR產(chǎn)物。
引物使用正向引物5 ，-GACGGTGATCGTCGCTTTGTGAACCA
ACAC-3， (SEQ ID NO: 41)和反向引物5，-CTTGGGTGTGTAGAAG
AA-3，(SEQ ID NO: 42)。
'PCR的反應(yīng)條件是，變性溫度94°C l分鐘，退火52°C l分
鐘，DNA鏈延伸72°C 30秒，以此作為1個循環(huán)，共進(jìn)行25個循環(huán)。
(8) DNA片段DLDRR-Bchain(desThr)的獲得
除以下幾點之外，按照與(l)同樣的順序獲得平端的DNA片段 DLDRR-Bchain(desThr)。
'模板DNA使用10 ng由(5)得到的胰島素原PCR產(chǎn)物。
引物使用正向引物5'-GACTTGGATCGTCGCTTTGTGAAC CAACACCTG-3， (SEQ ID NO,43)和反向引物5'-CTTGGGTGTG TAGAAGAA畫3， (SEQ ID N0.42)。
'PCR的反應(yīng)條件是，變性94°C l分鐘，退火52°C 1分鐘， DNA鏈延伸72。C30秒，以此作為1個循環(huán)，共進(jìn)行25個循環(huán)。
(9) DNA片段DNDRR-Bchain(desThr)的獲得
除以下幾點之外，按照與(l)同樣的順序獲得平端的DNA片段 DNDRR-Bchain(desThr)。
.模板DNA使用10ng由(5)得到的胰島素原PCR產(chǎn)物。
引物使用正向引物5，-GACAATGATCGTCGCTTTGTGAA CCAACACCTG-3， (SEQ ID NO,44)和反向引物5，-CTTGGGTGTGTA GAAGAA-3， (SEQ ID N0.42)。
'PCR的反應(yīng)條件是，變性溫度94°C l分鐘，退火52°C l分 鐘，DNA鏈延伸72°C 30秒，以此作為1個循環(huán)，共進(jìn)行25個循環(huán)。
(10) DNA片段LNSAR-Bchain(desThr)的獲得除以下幾點之外，按照與(l)同樣的順序獲得平端的DNA片段 LNSAR-Bchain(desThr)。
.模板DNA使用10ng由(S)得到的胰島素原PCR產(chǎn)物。
引物使用正向引物5'-CTGAACAGCGCTCGCTTTGTGAA CCAACACCTG-3， (SEQ ID N0.45)和反向引物5'-CTTGGGTGT GTAGAAGAA-3， (SEQ ID NO: 42)。
'PCR的反應(yīng)條件是，變性94°C l分鐘，退火52°C 1分鐘， DNA鏈延伸72。C30秒，以此作為1個循環(huán)，共進(jìn)行25個循環(huán)。
(11) DNA片段GSPR-Bchain(desThr)的獲得
除以下幾點之外，按照與(l)同樣的順序獲得平端的DNA片段 GSPR-Bchain(desThr)。
'模板DNA使用10 ng由(5)得到的胰島素原PCR產(chǎn)物。
.引物使用正向引物 5'畫GGTTCTCCTCGCTTTGTGAACC AACACCTG-3， (SEQ ID N0.46)和反向引物5'畫CTTGGGTGTGTA GAAGAA-3 (SEQ ID NO: 42)。
'PCR的反應(yīng)條件是，變性94°C l分鐘，退火52°C 1分鐘， DNA鏈延伸72。C30秒，以此作為1個循環(huán)，共進(jìn)行25個循環(huán)。
(12) DNA片段Achain的獲得
除以下幾點之外，按照與(l)同樣的順序獲得平端的DNA片段 Achain,再進(jìn)行磷酸化反應(yīng)(使用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene公司 制備)，方法是按照使用說明書)，得到磷酸化的DNA片段Achain。
.模板DNA使用10 ng由(5)得到的胰島素原PCR產(chǎn)物。
'引物使用正向引物5 ，匿GGCATTGTGGAACAATGCTGT-3 ， (SEQ ID N0.47)和反向引物5'-CTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTGGTA-3， (SEQ ID NO,48)。
-PCR的反應(yīng)條件是，變性94°C l分鐘，退火55°C 1分鐘， DNA鏈延伸72。C30秒，以止M乍為1個循環(huán)，共進(jìn)行25個循環(huán)。
(13) DNA片段DGDR-Achain的獲得除以下幾點之外，按照與(l)同樣的順序獲得平端的DNA片段 DGDR-Achain，再進(jìn)行磷酸化反應(yīng)(使用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene 公司制備)，方法是按照使用i^明書)，得到磷酸化的DNA片段 DGDR-Achain 。
'模板DNA使用10 ng由(12)得到的DNA片斷Achain的PCR產(chǎn)物。
引物使用正向引物5，-GATGGCGACCGTGGCATTGTGG AACAATGCTGT-3， (SEQ ID NO,49)。
'PCR的反應(yīng)條件是，變性94°C l分鐘，退火55°C 1分鐘， DNA鏈延伸72。C30秒，以此作為1個循環(huán)，共進(jìn)行25個循環(huán)。
2. MWPsp-MWPmp5、 6、 7或12與各種Bchain的DNA片段之間的 融合DNA的獲得
(1) MWPsp-MWPmp7-DGDR-Bchain-R融合DNA的獲得
除以下幾點之外，均按照與l(l)同樣的順序獲得平端的融合 DNA—MWPsp-MWPmp7-DGDR-Bchain-R。
.模板DNA使用將1(3)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp7與 1(6)中得到的DNA片段DGDR-Bchain-R各適量混合，使用DNA連 接試劑盒(寶酒造公司制備)，在16。C下反應(yīng)30分鐘獲得的產(chǎn)物。
'使用反向引物5'畫GCGGGTCTTGGGTGTGTAGAA-3， (SEQ ID NO.40)。
接著，進(jìn)行平端化的PCR產(chǎn)物的磷酸化反應(yīng)(使用T4多核苷酸激 酶(Nippon Gene公司制備)，方法按照使用說明書)。將生成物重組到 用Hindi切斷的Blue Script質(zhì)粒載體(Stratagene)中，然后確定DNA 核苷酸序列，確認(rèn)形成了適當(dāng)?shù)娜诤螪NA。
(2) MWPsp-MWPmp5畫DGDRR-Bchain(desThr)融合DNA的獲得
除以下幾點之外，均按照與l(l)同樣的順序獲得平端的融合 DNA—M曹sp-MWPmp5-DGDRR-Bchain(desThr)。'模板DNA使用將l(l)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp5與 1(7)中得到的DNA片段DGDRR-Bchain(desThr)各適量混合，使用 DNA連接試劑盒(寶酒造公司制備)，在16。C下反應(yīng)30分鐘獲得的產(chǎn) 物。
-使用反向引物5'-CTTGGGTGTGTAGAAGAA陽3， (SEQ ID N0.42)。
與2(1)同樣，確認(rèn)形成了適當(dāng)?shù)娜诤螪NA
(3) MWPsp-MWPmp6-DGDRR-Bchain(desThr)融合DNA的獲得
除以下幾點之外，均按照與l(l)同樣的順序獲得平端的融合 DNA—MWPsp-MWPmp6-DGDRR-Bchain(desThr)。
.模板DNA使用將1(2)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp6與 1(7)中得到的DNA片段DGDRR-Bchain(desThr)各適量混合，使用 DNA連接試劑盒(寶酒造公司制備)，在16'C下反應(yīng)30分鐘獲得的產(chǎn) 物。
.使用反向引物5'-CTTGGGTGTGTAGAAGAA-3， (SEQ ID N0.42)。
與2(1)同樣，確認(rèn)形成了適當(dāng)?shù)娜诤螪NA
(4) WPsp-MWPmp7-DGDRR-Bchain(desThr)融合DNA的獲得
除以下幾點之外，均按照與l(l)同樣的順序獲得平端的融合 DNA—MWPsp-MWPmp7-DGDRR-Bchain(desThr)。
'模板DNA使用將1(3)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp7與 1(7)中得到的DNA片段DGDRR-Bchain(desThr)各適量混合，使用 DNA連接試劑盒(寶酒造公司制備)，在16。C下反應(yīng)30分鐘獲得的產(chǎn) 物。
.使用反向引物5，-CTTGGGTGTGTAGAAGAA-3， (SEQ ID NO,42)。
與2(1)同樣，確認(rèn)形成了適當(dāng)?shù)娜诤螪NA
(5) MWPsp-MWPmpl2-DGDRR-Bchain(desThr)融合DNA的獲得除以下幾點之外，均按照與l(l)同樣的順序獲得平端的融合
DNA—MWPsp-MWPmpl2-DGDRR-Bchain(desThr)。
'模板DNA使用將1(4)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp12與 1(7)中得到的DNA片段DGDRR-Bchain(desThr)各適量混合，使用 DNA連接試劑盒(寶酒造公司制備)，在16。C下反應(yīng)30分鐘獲得的產(chǎn) 物。
'使用反向引物5'-CTTGGGTGTGTAGAAGAA-3， (SEQ ID N0.42)。
與2(l)同才"f，確認(rèn)形成了適當(dāng)?shù)娜诤螪NA
除以下幾點之外，均按照與l(l)同樣的順序獲得平端的融合 DNA—MWPsp-MWPmp6誦LNSAR-Behain(desThr)。
.模板DNA使用將1(2)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp6與 I(IO)中得到的DNA片段LNSAR-Bchain(desThr)各適量混合，使用 DNA連接試劑盒(寶酒造公司制備)，在16。C下反應(yīng)30分鐘獲得的產(chǎn) 物。
'使用反向引物5'-CTTGGGTGTGTAGAAGAA-3， (SEQ ID N0.42)。
與2(1)同樣，確認(rèn)形成了適當(dāng)?shù)娜诤螪NA (7) MWPsp-MWPmp6-GSPR-Bchain(desThr)融合DNA的獲得
除以下幾點之外，均按照與l(l)同樣的順序獲得平端的融合 DNA—MWPsp-MWPmp6-GSPR-Bchain(desThr)。
.模板DNA使用將1(2)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp6與 l(ll)中得到的DNA片段GSPR-Bchain(desThr)各適量混合，使用DNA 連接試劑盒(寶酒造公司制備)，在16。C下反應(yīng)30分鐘獲得的產(chǎn)物。
'使用反向引物5'-CTTGGGTGTGTAGAAGAA-3， (SEQ ID N0.42)。
與2(1)同樣，確認(rèn)形成了適當(dāng)?shù)娜诤螪NA
24(8) MWPsp-MWPmp7-DLDRR-Bchain(desThr)融合DNA的獲得
除以下幾點之外，均按照與l(l)同樣的順序獲得平端的融合 DNA~~MWPsp-MWPmp7-DLDRR-Bchain(desThr)。
'模板DNA使用將1(3)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp7與 1(8)中得到的DNA片段DLDRR-Bchain(desThr)各適量混合，使用 DNA連接試劑盒(寶酒造公司制備)，在16。C下反應(yīng)30分鐘獲得的產(chǎn) 物。
-使用反向引物5，-CTTGGGTGTGTAGAAGAA-3， (SEQ ID N0.42)。
與2(1)同樣，確認(rèn)形成了適當(dāng)?shù)娜诤螪NA
(9) MWPsp-MWPmp7-DNDRR-Bchain(desThr)融合DNA的獲得
除以下幾點之外，均按照與l(l)同樣的順序獲得平端的融合 DNA—MWPsp-MWPmp7-DNDRR-Bchain(desThr)。
'模板DNA使用將1(3)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp7與 1(9)中得到的DNA片段DNDRR-Bchaift(desThr)各適量混合，使用 DNA連接試劑盒(寶酒造公司制備)，在16。C下反應(yīng)30分鐘獲得的產(chǎn) 物。
.使用反向引物5'-CTTGGGTGTGTAGAAGAA-3， (SEQ ID N0.42)。
與2(1)同樣，確認(rèn)形成了適當(dāng)?shù)娜诤螪NA
3. MWPsp-MWPmp5、 6、 7或12與各種Bchain的DNA片段、各種
Achain的DNA片段之間的融合DNA (MINIPINS)的獲得
(1) MWPsp-MWPmp7-DGDR-Bchain-RDGDR-Achain融合DNA的獲
《曰
付
除以下幾點之外，均按照與l(l)同樣的順序獲得平端的融合 DNA""MWPsp-MWPmp7-DGDR畫Bchain-RDGDR畫Achain。
.模板DNA使用將2(1)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp7-DGDR-Bchain-R與1 (13)中得到的DNA片段DGDR-Achain 各適量混合，使用DNA連接試劑盒(寶酒造公司制備)，在16。C下反 應(yīng)30分鐘獲得的產(chǎn)物。
與2(1)同樣，確認(rèn)形成了適當(dāng)?shù)娜诤螪NA。
(2) MWPsp-M曹mp5-DGDRR-Bchain(desThr)-Achain融合DNA的獲 得
除以下幾點之外，均按照與l(l)同樣的順序獲得平端的融合 DNA—MWPsp-MWPmp5-DGDRR畫Bchain(desThr)-Achain。
.模板DNA使用將2(2)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp5-DGDRR-Bchain(desThr)與1(12)中得到的DNA片段Achain 各適量混合，使用DNA連接試劑盒(寶酒造公司制備)，在16。C下反 應(yīng)30分鐘獲得的產(chǎn)物。
與2(1)同樣，確認(rèn)形成了適當(dāng)?shù)娜诤螪NA。
(3) MWPsp-MWPmp6-DGDRR-Bchain(desThr)-Achain融合DNA的獲
得
除以下幾點之外，均按照與l(l)同樣的順序獲得平端的融合 DNA—M，sp-M曹mp6-DGDRR-Bchain(desThr)-Achain。
.模板DNA使用將2(3)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp6-DGDRR-Bchain(desThr)與1(12)中得到的DNA片段Achain 各適量混合，使用DNA連接試劑盒(寶酒造公司制備)，在16t)下反 應(yīng)30分鐘獲得的產(chǎn)物。
與2(1)同樣，確認(rèn)形成了適當(dāng)?shù)娜诤螪NA。
(4) MWPsp-MWPmp7-DGDRR-Bchain(desThr)-Achain
除以下幾點之外，均按照與l(l)同樣的順序獲得平端的融合 DNA—M，sp-MWPmp7-DGDRR-Bchain(desThr)-Achain。
模板DNA使用將2(4)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp7-DGDRR-Bchain(desThr)與1(12)中得到的DNA片段Achain 各適量混合，使用DNA連接試劑盒(寶酒造公司制備)，在16""C下反與2(1)同樣，確認(rèn)形成了適當(dāng)?shù)娜诤螪NA。
(5) MWPsp-MWPmpl2國DGDRR-Bchain(desThr)-Achain融合DNA的獲
《曰
付
除以下幾點之外，均按照與l(l)同樣的順序獲得平端的融合 DNA—MWPsp-M曹mp 12-DGDRR-Bchain(desThr)-Achain。
模板DNA使用將2(5)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp 12-DGDRR-Bchain(desThr)與1 (12)中得到的DNA片段Achain 各適量混合，使用DNA連接試劑盒(寶酒造公司制備)，在16-C下反 應(yīng)30分鐘獲得的產(chǎn)物。
與2(1)同樣，確認(rèn)形成了適當(dāng)?shù)娜诤螪NA。
(6) MWPsp-MWPmp6-LNSAR-Bchain(desThr)-Achain融合DNA的獲 得
除以下幾點之外，均按照與l(l)同樣的順序獲得平端的融合 DNA~~]Vn^Psp-MWPmp6-LNSAR-Bchain(desThr)-Achain。
.模板DNA使用將2(6)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp6-LNSAR-Bchain(desThr)與1(12)中得到的DNA片段Achain 各適量混合，使用DNA連接試劑盒(寶酒造公司制備)，在16'C下反 應(yīng)30分鐘獲得的產(chǎn)物。
與2(1)同樣，確認(rèn)形成了適當(dāng)?shù)娜诤螪NA。
(7) MWPsp-MWPmp6-GSPR-Bchain(desThr)-Achain融合DNA的獲得
除以下幾點之外，均按照與l(l)同樣的順序獲得平端的融合 DNA—MWPsp-MWPmp6-GSPR-Bchain(desThr)畫Achain。
.模板DNA使用將2(7)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp6-GSPR-Bchain(desThr)與1(12)中得到的DNA片#殳Achain各 適量混合，使用DNA連接試劑盒(寶酒造公司制備)，在16。C下反應(yīng) 30分鐘獲得的產(chǎn)物。
與2(1)同樣，確認(rèn)形成了適當(dāng)?shù)娜诤螪NA。(8) MWPsp-MWPmp7-DLDRR-Bchain(desThr)-Achain融合DNA的獲
得
除以下幾點之外，均按照與l(l)同樣的順序獲得平端的融合 DNA~~MWPsp-MWPmp7-DLDRR-Bchain(desThr)-Achain。
模板DNA使用將2(8)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp7-DLDRR-Bchain(desThr)與1(12)中得到的DNA片段Achain 各適量混合，使用DNA連接試劑盒(寶酒造公司制備)，在16。C下反 應(yīng)30分鐘獲得的產(chǎn)物。
與2(1)同樣，確認(rèn)形成了適當(dāng)?shù)娜诤螪NA。
(9) MWPsp-MWPmp7-DNDRR-Bchain(desThr)-Achain融合DNA的獲
《曰
付
除以下幾點之外，均按照與l(l)同樣的順序獲得平端的融合 DNA—MWPsp-MWPmp7-DNDRR-Bchain(desThr)-Achain。
.模板DNA使用將2(9)中得到的DNA片段MWPsp國 MWPmp7-DNDRR-Bchain(desThr)與1(12)中得到的DNA片段Achain 各適量混合，使用DNA連接試劑盒(寶酒造公司制備)，在16。C下反 應(yīng)30分鐘獲得的產(chǎn)物。
與2(1)同樣，確認(rèn)形成了適當(dāng)?shù)娜诤螪NA。各融合體的氨基酸序 列和DNA核苷酸序列如圖1 ~ 18所示。
4.上述3的融合DNA與MWPsp* - hPDI*的融合DNA的獲得
除以下幾點之外，均按照與l(l)同樣的順序獲得重組了下述融合 DNA的載體。
.模板DNA使用將3(1) ~ (9)中得到的各DNA片段和與專利文獻(xiàn) 18中記載的同樣的DNA片斷MWPsp* - hPDP各適量混合，使用DNA 連接試劑盒(寶酒造公司制備)，在16r下反應(yīng)30分鐘獲得的產(chǎn)物。
'使用反向引物5，-TTACAGTTCATCTTTCACAGCTTTCTG-3， (SEQ ID NO.50)。'PCR的反應(yīng)條件是，變性94°C l分鐘，退火55°C 1分鐘， DNA鏈延伸72°C 2分30秒，以此作為1個循環(huán)，共進(jìn)行25個循環(huán)。
與2(1)同樣，確認(rèn)形成了適當(dāng)?shù)娜诤螪NA。
這樣，得到了重組有各種融合DNA的pMINIPINS~hPDI*。這 些載體中除上述3所得的融合DNA (MINIPINS)之外，還擔(dān)載編碼PDI 的DNA。上述DNA片段MWPsp* - hPD"的MWPsp的5'—側(cè)附加 有SD (Shine-Dalgarno)序列(核糖體結(jié)合位點)。從這些載體 pMINIPINS ~ hPDI*中切取分別編碼MINIPINS和PDI的DNA的融合 物，將其重組到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，再用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。 可以預(yù)想，導(dǎo)入了這些表達(dá)載體的宿主細(xì)胞中，插入到該表達(dá)載體中 的一個啟動子的下游的目標(biāo)融合蛋白與PDI的融合DNA以一個 mRNA的形式轉(zhuǎn)錄。接著，通過分別存在于融合蛋白和PDI的各基因 5，一側(cè)的SD序列的功能，分別翻譯成兩種基因，結(jié)果，在該宿主中 發(fā)生目標(biāo)融合蛋白與PDI的共表達(dá)。
以下例舉所得融合DNA (MINIPINS)所編碼的融合蛋白的結(jié)構(gòu)。
001: M曹sp-M，mp5-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain (SEQ ID NO. 19)
002: MWPsp-MWPmp6-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain (SEQ ID NO.20)
003: MWPsp-M曹mp6-LeuAsnSerAlaArg-Bchain(desThr)-Achain (SEQ ID N0.21)
004 : M，sp-MWPmp6畫GlySerProArg-Bchain(desThr)-Achain (SEQ ID N0.22)
005: MWPsp-MWPmp7-AspGlyAspArgArg國Bchain(desThr)-Achain (SEQ ID NO.23)
006: MWPsp-MWPmp7-AspLeuAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain (SEQ ID NO.24)
007: M曹sp-M，mp7-AspAsnAspArgArg畫Bchain(desThr)-Achain (SEQ ID NO.25)008 : MWPsp-M曹mpl2-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)畫 Achain (SEQ IDNO.26)
009 : MWPsp畫MWPmp7-AspGlyAspArg匿Bchain-ArgAspGlyAsp Arg-Achain (SEQ ID N0.27)。
在以下的實施例II中，除了 No.001 ~009之外，對于具有其它結(jié) 構(gòu)的各種融合蛋白作為比較例也進(jìn)行了表達(dá)實驗。編碼這些其它融合 蛋白的融合DNA按照與上述同樣的方法制備。這些其它融合蛋白的 例子有以下
000: M曹mp9-GlySerLeuGlnProArg-Bchain-ArgGlyHisArgPro-C 肽-ProArg-Achain;
010: MWPsp-MWPmp6-GluLeuLeuArg-Bchain(desThr)-Achain;
011 : MWPsp-MWPmp7-AspGlyAspArgArg-Bchain-ArgAspGly AspArg-Achain
012: MWPsp-MWPmpO-Bchain(desThr)-Achain。
實施例II
融合DNA的表達(dá)分泌
1.融合蛋白的表達(dá)量的測定
進(jìn)行由實施例I所得的融合DNA編碼的融合蛋白的表達(dá)。將融 合DNA重組到表達(dá)載體中的方式如圖19所示。
即，將重組了上述融合DNA的載體pMINIPINS hPDP用限制 酶ApaLI和HindIII處理，進(jìn)行0.8%瓊脂糖電泳，接著，將含有各融 合DNA的DNA片段從凝膠中切取出來。將切取的融合DNA和用 ApaLI和Hindlll消化的短短芽孢桿菌用表達(dá)載體pNU211R2L5(日本 特開平7-170984號公報)各適量混合，使用DNA連接試劑盒(寶酒造 公司制備)，在16。C下反應(yīng)30分鐘，由此將融合DNA重組到表達(dá)載 體中。如上所述，獲得了分別重組了融合DNA的表達(dá)載體、 pNU-MINIPINS~hPDI*。 4安照^^知的方法(Methods in Enzymol.， 217: 23 -33， 1993),用這些表達(dá)載體轉(zhuǎn)化短短芽孢桿菌的47-5林(FERMBP-1664),在T2瓊脂培養(yǎng)基[l。/。聚胨、0.5%肉膏、0.2°/。酵母提取物、 0.1 mg/mL尿嘧啶、1%葡萄糖、10;t/g/mL紅霉素、1.5%瓊脂、pH7] 上進(jìn)行平板培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)化體。
將轉(zhuǎn)化體在T2培養(yǎng)基(組成除不含瓊脂之外與T2瓊脂培養(yǎng)基相 同)上、在37。C下培養(yǎng)一天，然后用公知的方法(Molecular Cloning第 2版，A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989))純4匕 質(zhì)粒DNA。將該質(zhì)粒DNA用ApaLI和Hindlll消化，確認(rèn)有目標(biāo)融 合DNA重組。對于確認(rèn)有融合DNA重組的轉(zhuǎn)化體，嘗試由重組的融 合DNA所編碼的融合蛋白的表達(dá)分泌。即，將50^L在T2培養(yǎng)基中、 在37。C下培養(yǎng)一天的菌懸浮液添加到50 mL的M-5YC培養(yǎng)基[2.050/0 聚胨、0.27。/。酵母提取物、3。/。葡萄糖、0.009% MgS04'7H20、 0.0009% MnS04.4H20、 27 〃g/mL尿嘧啶、10 〃g/mL紅霉素，pH8]中，用500 mL 三角燒瓶、在30。C下振蕩培養(yǎng)4天。
培養(yǎng)后，將1 mL培養(yǎng)基加入到1.5 mL的微管中，以15,000 rpm 離心20分鐘。在194pL所得培養(yǎng)上清中加入6^L的6N鹽酸，用膜 濾器(Millipore,孔徑0.22/mi，產(chǎn)品編號SLGVR04NL)過濾。將100 濾液供給采用HPLC柱(Waters， Symmetry300TMC185〃m， 4.6x250 mm) 的HPLC (Waters LC-Module 1),由此求出融合蛋白的表達(dá)量。洗脫以 及檢測條件如下。
A液0.1。/。TFA水溶液
B液含有0.1。/。TFA的乙腈
時間(分鐘)流量%A%B
起始0.87228
5.000.87228
30.000.86436
32.000.86436
33.000.81090
TEMP: 35。C SPRG: 30mL/分鐘波長220 nm
將胰島素原(Sigma，產(chǎn)品編號P-4672)溶解于0.001 N的鹽酸中， 將lmg/mL所得溶液在相同條件下應(yīng)用于HPLC，制備校正曲線，根 據(jù)該校正曲線求出融合蛋白的相對量。
圖20表示各融合蛋白的相對表達(dá)量。與含有在WO01/068884中 公開的突變型胰島素原序列的融合蛋白、 MWPmp9畫GlySerLeuGlnProArg-Bchain畫ArgGlyHisArgPro曙C 肽 -ProArg-Achain (No.000)的表達(dá)量(102.8mg/L)相比，具有上述001-009結(jié)構(gòu)的含胰島素序列的各種融合蛋白的表達(dá)量高1.5 ~ 3倍，另夕卜， 與具有其它結(jié)構(gòu)的融合蛋白(No.010-012)相比顯著高。
實施例III 變換為胰島素
(1) 融合蛋白、MWPmp6-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain的
分離純化
將用pMINIPINS轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在37。C下培養(yǎng)1天，將1.1 mL該細(xì) 菌懸浮液添加到1.1 L的培養(yǎng)基(3。/。聚胨、0.4%酵母提取物、3%葡萄 糖、0.01% MgS04.7H20、 0.001% MnS04.4H20、 10pg/mL紅霉素，pH8) 中，在小型發(fā)酵罐中、在30。C下以200 rpm、 1.1 vvm通氣下培養(yǎng)4 天。將培養(yǎng)基用9,500 rpm離心20分鐘，用HC1將所得上清的pH調(diào) 節(jié)為3，在4。C下靜置1小時。再以9,500 rpm離心20分鐘，將所得 上清應(yīng)用于用50 mM乙酸平衡的陽離子交換樹脂中，用50 mM乙酸 鈉(pH5.5)洗脫融合蛋白。洗脫后，用NaOH將pH調(diào)節(jié)至7.5。然后 將洗脫液用20mMTris-HCl(pH8)進(jìn)行緩沖液交換，同時濃縮。
(2) 由融合蛋白轉(zhuǎn)換為胰島素
在含有胰蛋白酶的50 mM Tris-HCl (pH8)中，將濃縮的融合蛋白 在12。C下處理過夜，由此轉(zhuǎn)化為des-Thr胰島素(IOO mg融合蛋白， 2.4 mg TPCK胰蛋白酶/440 mL溶液)。添加10%TFA,中止反應(yīng)，應(yīng)用于用18%乙腈/0.05%曱酸平衡的樹脂(MCI GEL CHP2MGY, Mitsubishi Chemicals Japan)中，用27%乙腈/0.05%甲酸洗脫des-Thr胰 島素，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥固化。
接著，在反應(yīng)液中(10 mM des-Thr胰島素、0.8 M Thr-OBut-HCl 、 50。/oDMF/乙醇〈l:l〉、 20 /^M月夷蛋白酶、用氨水調(diào)節(jié)為pH6.1),對 des-Thr胰島素在15。C下處理8小時，在des-Thr胰島素上附加Thr， 制成胰島素酯。用TFA中止反應(yīng)，應(yīng)用于用22.5°/。乙腈/0.05%曱酸平 衡的樹脂中(MCI GEL CHP55Y， Mitsubishi Chemicals Japan),用29.3 %乙腈/0.05%甲酸洗脫胰島素酯。
最后，將洗脫的胰島素酯干燥固化，用茴香醚/TFA〈l:9〉進(jìn)行處 理，獲得胰島素。
(3) des-Thr胰島素的肽圖譜
將市售的胰島素(Intergen)用羧基肽酶A處理(25。C, 1小時，0.2 N NH4HC03， pH8.4，羧基肽酶A<0.3 U/mg胰島素〉)，得到des-Thr胰 島素(以下標(biāo)記為STD des-Thr胰島素)。將上述(2)所得的各5 nmole des-Thr胰島素(以下稱為ITOHAM des-Thr胰島素)和STD des-Thr胰 島素溶解于50//L0.1 M碳酸氫銨、2mMEDTA溶液(pH7.8)中，加入 1.35mLV8蛋白酶(和光純藥公司制備，2^g/mL)水溶液，在25。C下反 應(yīng)24小時。接著加入1。/。TFA，制成pH2，由此中止反應(yīng)。接著，將 反應(yīng)液應(yīng)用于Vydac218TP54 (4.6x250 mm, <:18柱)中，用5%乙腈、 0.1%TFA溶液平衡，然后通過最高至35%乙腈、0.1%TFA溶液的梯 度洗脫，洗脫圖譜如圖21所示。ITOHAM des-Thr胰島素與STD des-Thr胰島素顯示同樣的圖譜。由此得出兩者的des-Thr胰島素的二 硫鍵方式同等的結(jié)論。
(4) 胰島素的HPLC洗脫圖譜
將上述(3)所得的胰島素(以下標(biāo)記為ITOHAM胰島素)與市售的 胰島素(Intergen,以下標(biāo)記為STD胰島素)應(yīng)用于YMC的C4柱 (4.6x250 mm)，用25 ~ 35。/o乙腈/0.1。/。TFA洗脫。如圖22所示，兩者均有相同的洗脫圖譜。
即顯示，由在短短芽孢桿菌的表達(dá)體系中可見高表達(dá)的融合蛋白
之一可以由MWPmp6-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain形成 具有適當(dāng)?shù)亩蜴I的胰島素。
產(chǎn)業(yè)實用性
根據(jù)本發(fā)明，可以以工業(yè)化可接受的效率獲得可在糖尿病等疾病 的治療中使用的功能性胰島素的方法。
序列表自由文本
SEQIDN0.1~7:接頭 SEQIDN0.8、 9:胰島素前體 SEQIDNO.10 27:融合蛋白 SEQIDNO.28-30:前導(dǎo)肽 SEQIDN0.31—50:引物 SEQIDN0.51、 52:接頭
權(quán)利要求
1.DNA，該DNA編碼融合蛋白，該融合蛋白是來自芽孢桿菌屬(Bacillus)或短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)細(xì)菌的胞壁蛋白CWP之一的MWP的信號肽；含有來自芽孢桿菌屬或短芽孢桿菌屬細(xì)菌的CWP的5～7或12個氨基酸的前導(dǎo)肽；具有以下通式(Asp、Leu或Gly)(Gly、Asn、Ser或Leu)(Asp、Ser或Pro)(Arg或Ala或無)Arg(SEQ ID NO.51或52)所示的氨基酸序列的連接肽；以及胰島素前體的氨基酸序列按該順序連接而成。
2. 權(quán)利要求1所述的DNA，其中上述連接肽具有SEQ ID NO. 1 ~ 6中任一項表示的氨基酸序列。
3. 權(quán)利要求1或2所述的DNA，其中上述前導(dǎo)肽來自MWP。
4. 權(quán)利要求1-3中任一項所述的DNA,其中上述胰島素前體具 有SEQ ID NO.8或9表示的氨基酸序列。
5. 權(quán)利要求1 ~4中任一項所述的DNA，其中上述融合蛋白具有 SEQ ID NO. 10- 18中任一項表示的氨基酸序列。
6. 權(quán)利要求1~5中任一項所述的DNA，其中該DNA具有SEQ IDNO.19-27中任一項表示的沖亥苷酸序列。
7. 載體，該載體含有權(quán)利要求1 ~ 6中任一項所述的DNA。
8. 權(quán)利要求7所述的載體，其中上述DNA與來自細(xì)菌的啟動子 序列的下游功能性連接。
9. 權(quán)利要求8所述的載體，其中上述啟動子來自芽孢桿菌屬或 短芽孢桿菌屬細(xì)菌。
10. 權(quán)利要求7~9中任一項所述的載體，該載體進(jìn)一步含有編 碼蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶簡稱為PDI的DNA。
11. 宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求7~10中任一項所述的 載體。
12. 權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞，其中上述宿主細(xì)胞是芽孢桿菌屬或短芽孢桿菌屬細(xì)菌。
13. 權(quán)利要求12所述的宿主細(xì)胞，其中上述細(xì)菌是短短芽孢桿
14. 胰島素的制備方法，該制備方法包含以下步驟培養(yǎng)權(quán)利要 求11~13中任一項所述的宿主細(xì)胞的步驟；由宿主細(xì)胞表達(dá)所需融 合蛋白的步驟；將表達(dá)的多肽從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收的步驟。
15. 權(quán)利要求14所述的方法，該方法進(jìn)一步包含將回收的多肽 進(jìn)行酶解處理的步驟。
16. 權(quán)利要求15所述的方法，其中上述酶解處理是通過胰蛋白 酶進(jìn)^f于的處理。
17. 權(quán)利要求14-16中4t一項所述的方法，該方法是從培養(yǎng)基 中回收上述多肽。
18. 融合蛋白，該融合蛋白具有SEQ ID NO.10-18中任一項表 示的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼含有用于制備基因重組胰島素的高表達(dá)分泌胰島素前體的融合蛋白的DNA、以及使用該DNA制備胰島素的方法。
文檔編號C12P21/02GK101605889SQ20088000014
公開日2009年12月16日 申請日期2008年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月12日
發(fā)明者佐藤靜治, 工藤季之, 近藤雅昭, 遠(yuǎn)藤廣介 申請人:伊藤火腿株式會社;鵜高重三