專利名稱：在植物中生產(chǎn)肽/蛋白質(zhì)的方法以及用該方法生產(chǎn)的肽/蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在植物中生產(chǎn)融合肽、多肽和蛋白質(zhì)的新方法，用于這些方法中的核酸構(gòu)建物，以及根據(jù)這些方法生產(chǎn)的產(chǎn)物。所述方法總體上涉及表達(dá)被所述植物糖基化的肽、多肽或作為融合蛋白的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，將基于植物的信號(hào)肽作為融合蛋白的一部分進(jìn)行表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，產(chǎn)生了新的糖蛋白。
背景技術(shù)：
對(duì)于幼小的成長(zhǎng)中植物組織的支撐主要取決于受具有彈性的細(xì)胞壁限制的細(xì)胞膨脹度(turgidity)，而細(xì)胞壁則包括三種互相貫穿的網(wǎng)狀構(gòu)造，即纖維質(zhì)-木葡聚糖(cellulosic-xyloglucan)、膠質(zhì)和富含羥脯氨酸的糖蛋白(HRGP)。當(dāng)這些網(wǎng)狀構(gòu)造松弛時(shí)，膨脹驅(qū)使細(xì)胞伸展。值得注意的是，HRGP沒(méi)有動(dòng)物同系物，從而強(qiáng)調(diào)了植物特異性的功能。
就數(shù)量而言，大多數(shù)的細(xì)胞表面上的HRGP(伸展蛋白)形成共價(jià)交聯(lián)的細(xì)胞壁網(wǎng)狀構(gòu)造。與伸展蛋白不同，另一類型的HRGP——阿拉伯半乳聚糖-蛋白質(zhì)(AGP)以被阿拉伯半乳聚糖多糖過(guò)糖基化的單體形式存在。AGP最初由脂質(zhì)錨定物束縛于原生質(zhì)表面，而所述錨定物的斷裂使得AGP從周質(zhì)中移動(dòng)穿過(guò)細(xì)胞壁到達(dá)外部。AGP涉及到植物生長(zhǎng)和發(fā)育中的多個(gè)方面，但是仍不清楚其確切的功能。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種在植物中生產(chǎn)糖蛋白的新方法。所述糖蛋白包括糖基化位點(diǎn)元件和核心蛋白元件。在某些實(shí)施方式中，所述核心蛋白元件可為哺乳動(dòng)物(包括人)來(lái)源，且在某些實(shí)施方式中，所述核心蛋白元件可為生物活性蛋白。在某些情況下，所述蛋白質(zhì)可為獲得FDA批準(zhǔn)的用于治療的重組蛋白，例如重組人生長(zhǎng)激素(″hGH″)。所述糖基化位點(diǎn)是作為植物進(jìn)行糖基化的靶點(diǎn)的氨基酸序列。
本方法的一個(gè)特征是蛋白質(zhì)產(chǎn)率的增加。與在植物中表達(dá)不含有糖基化位點(diǎn)和信號(hào)肽序列的同種蛋白質(zhì)相比，通過(guò)在表達(dá)的蛋白質(zhì)中包含入糖基化位點(diǎn)和信號(hào)肽序列，重組蛋白的產(chǎn)率得到了極大的提高。
根據(jù)本方法生產(chǎn)的糖蛋白顯示出超過(guò)其野生型對(duì)應(yīng)物的其它優(yōu)點(diǎn)，這些優(yōu)點(diǎn)包括溶解性的提高、對(duì)蛋白水解酶抗性的提高以及穩(wěn)定性的提高。與野生型蛋白質(zhì)相比，其另一重要的特性為具有提高的生物半衰期。
在下文的描述中將揭示本發(fā)明的部分其它特征和優(yōu)點(diǎn)，而其它部分通過(guò)說(shuō)明書將變得顯而易見或可通過(guò)實(shí)踐本發(fā)明而獲知?？赏ㄟ^(guò)在所附權(quán)利要求中指出的元素和組合知道并獲得本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明提供了用于在植物中表達(dá)至少一種生物活性蛋白的核酸構(gòu)建物，所述構(gòu)建物包括a)至少一種編碼在植物中使用的糖基化位點(diǎn)的核酸序列，和b)至少一種編碼生物活性蛋白的核酸序列。
本發(fā)明還提供了植物來(lái)源的生物活性融合蛋白，其包含a)至少一個(gè)糖組件，其共價(jià)連接于b)生物活性蛋白。在某些實(shí)施方式中，所述至少一種糖組件包括選自下組的糖基化位點(diǎn)i)X-Pro-Hypn，其中n為2-約1000；ii)X-Hypn，其中n為2-約1000；和iii)(X-Hyp)n，其中n為1-約1000；其中X選自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val，但更佳為選自Ser、Thr、Val和Ala。在某些實(shí)施方式中，所述至少一種糖組件共價(jià)連接于選自蛋白質(zhì)N端和/或C端的位點(diǎn)。在某些實(shí)施方式中，所述至少一種糖組件在所述生物活性哺乳動(dòng)物蛋白的內(nèi)部。雖然在上文中對(duì)于X具體指出了Lys、Ser、Thr、Val、Gly和Ala，但相信任何氨基酸均可服務(wù)于該目的，且該基序?qū)⒃谥参镏斜惶腔?br> 所述生物活性哺乳動(dòng)物蛋白可選自下組生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng)激素拮抗物、生長(zhǎng)激素釋放激素、生長(zhǎng)激素抑制素、饑餓激素(ghrelin)、來(lái)普汀、催乳素、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、白介素-10、多效素、白介素-7、白介素-8、干擾素Ω、干擾素-α2a和2b、干擾素γ、白介素-1、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子6，IFG-1、胰島素樣生長(zhǎng)因子1、胰島素、促紅細(xì)胞生成素素、GMCSF以及任何人源化單克隆抗體或單克隆抗體，其中所述糖組件包括選自下組的糖基化位點(diǎn)i)X-Pro-Hypn，其中n為2-約1000；ii)X-Hypn，其中n為2-約1000；和iii)(X-Hyp)n，其中n為1-約1000；且其中X選自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val，且優(yōu)選Ser、Ala、Thr和Val。在某些實(shí)施方式中，所述糖組件包含(X-Hyp)n，X選自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val，更優(yōu)選Ser、Ala、Thr和Val，且n＝1-1000。在某些實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)為人生長(zhǎng)激素，且所述糖組件包括(Ser-Hyp)10。雖然在上文中對(duì)于X具體指出了Lys、Ser、Thr、Val、Gly和Ala，但相信任何氨基酸均可服務(wù)于該目的，且該基序?qū)⒖稍谥参镏斜惶腔?br> 在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明植物來(lái)源的生物活性哺乳動(dòng)物融合糖蛋白共價(jià)結(jié)合于至少一種碳水化合物(carbohydrate)分子。在某些實(shí)施方式中，所述碳水化合物是阿拉伯半乳聚糖部分，而在某些實(shí)施方式中其為阿拉伯次黃苷基(arabinosyl)部分。
本發(fā)明還提供了提高蛋白質(zhì)分子水溶性的方法，其中制備了編碼a)至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)和b)至少一種肽或蛋白質(zhì)的核酸構(gòu)建物；并將所述核酸構(gòu)建物表達(dá)為糖蛋白；其中，糖蛋白的碳水化合物部分占所述糖蛋白分子量的大于或等于約10％。所述糖蛋白的碳水化合物部分可占所述糖蛋白分子量的大于或等于約50％、約75％或約90％。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)生物活性融合糖蛋白的方法，所述方法包括在植物中表達(dá)至少一種核酸構(gòu)建物，所述構(gòu)建物包括a)至少一種編碼糖基化位點(diǎn)的核酸序列和b)至少一種編碼作為糖蛋白的生物活性蛋白的核酸序列；其中所述糖蛋白分子量大于或等于約10kD，且其中所述糖蛋白的碳水化合物部分占糖蛋白分子量的大于或等于約10％。在某些實(shí)施方式中，所述糖蛋白的分子量大于或等于約35kD、約40kD、約45kD、約50kD或約55kD。在某些實(shí)施方式中，所述糖蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)半衰期大于相應(yīng)的野生型蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)半衰期。在某些實(shí)施方式中，所述至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)選自i)X-Pron，其中n為2-約1000，和ii)(X-Pro)n，其中n為2-約1000；其中X為任何氨基酸或選自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val，或更佳為選自Ser、Ala、Thr和Val。當(dāng)然，n可為4-200、6-100、8-50或10-25，或其中的任何數(shù)字或任何組合。在某些實(shí)施方式中，所述生物活性蛋白是人生長(zhǎng)激素且所述糖蛋白包括(Ser-Hyp)10，且在某些實(shí)施方式中，所述(Ser-Hyp)10共價(jià)連接于人生長(zhǎng)激素蛋白的C端。
本發(fā)明還提供了注射用藥物制劑，所述制劑包含糖基化人生長(zhǎng)激素，且不含用于使蛋白質(zhì)溶劑化或提高所述蛋白質(zhì)溶解性通常所需的其它賦形劑。在某些實(shí)施方式中，所述制劑不含選自下組的至少一種賦形劑甘露醇、山梨醇、海藻糖、葡萄糖、甘氨酸、亮氨酸、三亮氨酸、組氨酸和磷脂。在某些實(shí)施方式中，所述糖基化人生長(zhǎng)激素包含選自下組的糖組件i)X-Pro-Hypn，其中n為2-約100，且其中X為任何氨基酸，或選自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val，或更佳為選自Ser、Ala、Thr和Val；ii)X-Hypn，其中n為2-約100，且其中X為任何氨基酸，或選自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val，或更佳為選自Ser、Ala、Thr和Val；和iii)(X-Hyp)n，其中n為1-約100；其中X為任何氨基酸或選自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val，或更佳為選自Ser、Ala、Thr和Val。所述糖基化的生長(zhǎng)激素可包括X-Hypn，其中n為2-約20；其中X選自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val，或更佳為選自Ser、Ala、Thr和Val。
本發(fā)明還提供了溶解度大于或等于約10mg/ml的糖基化人生長(zhǎng)激素的凍干粉制劑，其中所述制劑不含提高肽溶解性所需的其它賦形劑。在某些實(shí)施方式中，所述賦形劑選自甘露醇、山梨醇、海藻糖、葡萄糖、甘氨酸、亮氨酸、三亮氨酸、組氨酸和磷脂。
本發(fā)明還提供了提高在植物中生產(chǎn)蛋白質(zhì)的產(chǎn)率的方法，所述方法包括制備核酸構(gòu)建物，所述構(gòu)建物包含a)至少一種編碼分泌信號(hào)肽的核酸序列，b)至少一種編碼糖基化位點(diǎn)的核酸序列，和c)至少一種編碼蛋白質(zhì)的核酸序列；以及在植物中或植物細(xì)胞培養(yǎng)物中將所述核酸構(gòu)建物表達(dá)為糖蛋白。在某些實(shí)施方式中，所述至少一種HRGP糖基化位點(diǎn)選自i)X-Pron，其中n為2-約1000；和ii)(X-Pro)n，其中n為1-約1000；其中X為任何氨基酸，或選自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val，或更佳為選自Ser、Ala、Thr和Val。所述核酸構(gòu)建物還可包含或不包含編碼綠色熒光蛋白的核酸序列。本發(fā)明還提供了根據(jù)這些方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了共價(jià)連接于包含糖組件的氨基酸序列的生長(zhǎng)激素分子，其中所述糖組件選自i)X-Pro-Hypn，其中n為2-約100；ii)X-Hypn，其中n為2-約100，和ii)(X-Hyp)n，其中n為1-約100；其中X選自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val，或更佳為選自Ser、Ala、Thr和Val。
本發(fā)明還提供了共價(jià)連接于包含糖組件的氨基酸序列的生長(zhǎng)激素拮抗物分子，其中所述糖組件選自i)X-Pro-Hypn，其中n為2-約100；ii)X-Hypn，其中n為2-約100；和ii)(X-Hyp)n，其中n為1-約100；其中X選自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val，或更佳為選自Ser、Ala、Thr和Val。
還提供了治療罹患生長(zhǎng)激素缺乏或機(jī)能不全的患者的方法，所述方法包括給予治療有效量的糖基化人生長(zhǎng)激素。
還提供了治療罹患人生長(zhǎng)激素過(guò)量或生長(zhǎng)激素活性過(guò)度的患者的方法，所述方法包括給予治療有效量的糖基化人生長(zhǎng)激素拮抗物。
應(yīng)理解的是上文的總體描述和下文的詳細(xì)描述僅是示范性和說(shuō)明性的，而并非用于限制所要求的本發(fā)明。
所附結(jié)合本發(fā)明說(shuō)明書且作為說(shuō)明書一部分的附圖可用于圖解本發(fā)明的實(shí)施方式，并與說(shuō)明書共同用于解釋本發(fā)明的原則。
附圖簡(jiǎn)述

圖1所示為用于通過(guò)相互引發(fā)和延伸以建立(a)[Gum]n(n＝8、20)m，和(b)[HP]m(m＝2、4、8)人工合成基因的寡核苷酸系列。重疊部分用下劃線標(biāo)示。限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為粗斜體。
圖2所示為構(gòu)建于pUC18質(zhì)粒中位于信號(hào)序列(下劃線)和GFP基因間的(a)[Gum]3、(b)[Gum]8和[Gum]20人工合成基因的DNA序列。限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為粗斜體。
圖3所示為構(gòu)建于pUC18質(zhì)粒中位于信號(hào)序列(下劃線)和GFP基因間的(a)[HP]4、(b)[HP]8人工合成基因的DNA序列。限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為粗斜體。
圖4所示為構(gòu)建于pUC18質(zhì)粒中位于信號(hào)序列(下劃線)和GFP基因間的[Gum]8[HP]2和[Gum]8[HP]4人工合成基因的DNA序列。限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為粗斜體。
圖5所示為hGH-(SP)10-EGFP基因盒的構(gòu)建示意圖。
圖6所示為hGH-(SP)10基因盒的構(gòu)建示意圖。
圖7所示為INF-(SP)10基因盒的構(gòu)建示意圖。
圖8所示為HSA-(SP)10基因盒的構(gòu)建示意圖。
圖9所示為結(jié)構(gòu)域1-(SP)10基因盒的構(gòu)建示意圖。
圖10A所示為用于表達(dá)附有(Ser-Hyp)10基序的人生長(zhǎng)激素(hGH)的基因構(gòu)建物。圖10B所示為如何通過(guò)引物延伸來(lái)構(gòu)建(SP)10基因。
圖11所示為表達(dá)與綠色熒光蛋白連接的人生長(zhǎng)激素(hGH)的基因構(gòu)建物，由(Ser-Hyp)10基序連接綠色熒光蛋白和人生長(zhǎng)激素。
圖12(A和B)所示為用于表達(dá)附有(Ser-Hyp)10基序的人血清白蛋白(HSA)的基因構(gòu)建物。
圖13所示為用于表達(dá)附有(Ser-Hyp)10基序的人血清白蛋白結(jié)構(gòu)域I的基因構(gòu)建物。
圖14所示為用于表達(dá)附有(Ser-Hyp)10基序的干擾素α2a(INF2a)的基因構(gòu)建物。
圖15所示為對(duì)分泌入用hGH-(SO)10或hGH轉(zhuǎn)化的十個(gè)煙草細(xì)胞系的培養(yǎng)基中hGH等效物的檢測(cè)結(jié)果。
圖16所示為用hGH-(SP)10轉(zhuǎn)化的煙草細(xì)胞培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)和hGH等效物的產(chǎn)生的時(shí)間進(jìn)程。
圖17所示為用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)的培養(yǎng)基中的hGH-(SO)10(左格)和hGH-(SO)10-EGFP。
圖18所示為通過(guò)反相HPLC分離hGH-(SO)10和hGH-(SO)10-EGFP的色譜圖。
圖19所示為SStob-hGH-(SP)1構(gòu)建物的基因序列。限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為粗斜體。
圖20所示為SStob-hGH-(SP)2構(gòu)建物的基因序列。限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為粗斜體。
圖21所示為SStob-hGH-(SP)5構(gòu)建物的基因序列。限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為粗斜體。
圖22所示為基因序列ofSStob-hGH-(SP)20構(gòu)建物的基因序列。限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為粗斜體。
圖23所示為SStob-(SP)10-hGH-(SP)10構(gòu)建物的基因序列。限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為粗斜體。
圖24所示為SStob-hGHA-(SP)10構(gòu)建物的基因序列。限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為粗斜體。
圖25所示為SStob-INF-(SP)5構(gòu)建物的基因序列。限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為粗斜體。
圖26所示為SStob-(SP)5-INF-(SP)5構(gòu)建物的基因序列。限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為粗斜體。
圖27所示為SStob-(SP)5-INF構(gòu)建物的基因序列。限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為粗斜體。
圖28所示為SStob-INF-(SP)20構(gòu)建物的基因序列。限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為粗斜體。
圖29所示為SStob-(SP)10-INF-(SP)10構(gòu)建物的基因序列。限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為粗斜體。
圖30所示為hGH-(SP)10-EGFP的結(jié)合曲線。
圖31所示為市售hGH的結(jié)合曲線。
圖32所示為hGH-(SP)10的結(jié)合曲線。
圖33所示為將市售hGH和hGH-(SP)10各自單次給予小鼠后的血清濃度。
圖34所示為單次給予小鼠市售hGH和hGH-(SP)10后的血清IGF-1濃度。
圖35所示為單次給予小鼠市售hGH和hGH-(SP)10后hGH等效物的血液濃度。
圖36所示為每日兩次給予小鼠市售hGH和hGH-(SP)10(以及PBS對(duì)照)5日后的血清濃度。
圖37所示為每日兩次給予小鼠市售hGH和hGH-(SP)10(以及PBS對(duì)照)5日后的的血清IGF-1濃度。
圖38所示為每日一次給予較低濃度(1μg/gm)市售hGH和hGH-(SP)10(以及PBS對(duì)照)5日的生長(zhǎng)激素水平。
圖39所示為每日一次給予較低濃度(1μg/gm)市售hGH和hGH-(SP)10(以及PBS對(duì)照)5日后的血清IGF-1濃度。
圖40所示為為期兩周的市售hGH和hGH-(SP)10治療后體重的增加。
實(shí)施方式的描述結(jié)構(gòu)與功能間的聯(lián)系是生物學(xué)中一個(gè)深?yuàn)W的課題。在富含羥脯氨酸的糖蛋白(HRGP)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)中至少有2個(gè)方面似乎具有功能上的重要性糖基化和共價(jià)交聯(lián)。由于HRGP傾向于延伸的重復(fù)基序糖蛋白，得出該觀點(diǎn)的研究致力于將HRGP功能特性一個(gè)組件接一個(gè)組件地分解。設(shè)計(jì)了人工合成基因來(lái)作為各推定組件的擬似物。該研究使很多發(fā)現(xiàn)成為可能糖基化密碼的揭示、糖取代基的結(jié)構(gòu)闡明、交聯(lián)基序的識(shí)別以及新糖蛋白的設(shè)計(jì)，包括獲得改良的生物醫(yī)藥產(chǎn)品。
本研究在最初由Kieliszewski等提出的Hyp鄰接假說(shuō)(Hyp-contiguityhypothesis)的基礎(chǔ)上擴(kuò)展并延伸。目前已發(fā)現(xiàn)該O-Hyp糖基化密碼預(yù)測(cè)了糖基化位點(diǎn)以及HRGP的取代基。本發(fā)明以多種方式應(yīng)用了該發(fā)現(xiàn)。
某些實(shí)施方式涉及用于提高植物中蛋白質(zhì)生產(chǎn)產(chǎn)率的方法。某些實(shí)施方式涉及根據(jù)本發(fā)明的揭示產(chǎn)生的經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)可具有整體改良的特性以及體內(nèi)的特殊優(yōu)點(diǎn)，其中包括延長(zhǎng)的生物學(xué)半衰期和提高的生物利用度。
現(xiàn)參考更為詳細(xì)的實(shí)施方式并不時(shí)參考附圖來(lái)描述本發(fā)明。然而，本發(fā)明可用其它形式實(shí)施，且不應(yīng)被本文所列的實(shí)施方式所述限制。更正確的理解是，提供這些實(shí)施方式是為了使得本發(fā)明的揭示徹底而完全，并將本發(fā)明的范圍完全傳達(dá)給本領(lǐng)域的技術(shù)人員。
除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。在本文中描述本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)只是用于描述具體的實(shí)施方式，而并非為了限制本發(fā)明。如本發(fā)明說(shuō)明書和所附的權(quán)利要求書中所用，單數(shù)形式″一(a)″、″一個(gè)(an)″和″該(the)″還將包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文清楚地顯示并非如此。本文所提到的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)明確地以其全文納入。
除非另有說(shuō)明，用于說(shuō)明書和權(quán)利要求書中表示成分的量、反應(yīng)條件等的所有數(shù)值應(yīng)理解為在所有情況下均被術(shù)語(yǔ)“約”所修飾。因此，除非有相反的說(shuō)明，以下說(shuō)明書和所附權(quán)利要求書中所列的數(shù)值參數(shù)均為近似值，且可根據(jù)按本發(fā)明所要得到的特性而改變。至少，且并非為了將等同原則的應(yīng)用限制到權(quán)利要求書的范圍，應(yīng)根據(jù)主要數(shù)位的數(shù)字和常規(guī)的舍入方法來(lái)解釋各數(shù)值參數(shù)。
盡管提出本發(fā)明廣泛范圍的數(shù)值范圍和參數(shù)是約數(shù)，在具體實(shí)施例中闡明的數(shù)值是盡可能地精確報(bào)道的。然而任何數(shù)值固有地包含了由它們相應(yīng)的試驗(yàn)測(cè)定中的標(biāo)準(zhǔn)偏差所致的某些誤差。在本說(shuō)明書全文中給出的每一數(shù)值范圍將包括落于該較寬數(shù)值范圍中的每一較窄數(shù)值范圍，就如同該較窄數(shù)值范圍在本文中直接表達(dá)出一樣。
在本說(shuō)明書全文中，將參考根據(jù)本發(fā)明化合物。在說(shuō)明書和權(quán)利要求書中對(duì)此類化合物的參考包括此類化合物的酯和鹽類。因此即便未明確地記敘，通過(guò)參考這些化合物本身即可得出考慮并包含了這些酯類和鹽類。
此外，如本文所用，″肽″、″多肽″和″蛋白質(zhì)″可以且將被互換使用。將偶爾使用″肽/多肽/蛋白質(zhì)″來(lái)指三類中的任何一類，但對(duì)三類中任何一類的描述均包括了其它兩類。即，并不打算對(duì)可用本發(fā)明來(lái)表達(dá)的氨基酸聚合物(肽、多肽或蛋白質(zhì))的尺寸進(jìn)行限制。此外，使用″蛋白質(zhì)″這種描述是為了強(qiáng)調(diào)酶、激素、受體、通道、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子和具有其它功能的蛋白質(zhì)。也可根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)多亞基蛋白質(zhì)。
雖然在本揭示的全文中討論了天然存在的氨基酸，也考慮并在本發(fā)明的范圍中包含了非天然存在的氨基酸、或修飾的氨基酸。事實(shí)上，如本文所用，″氨基酸″是指天然氨基酸、非天然存在的氨基酸和氨基酸類似物，均為它們的D和L立體異構(gòu)體形式。天然氨基酸包括丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷胺酰胺(Q)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、賴氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、纈氨酸(V)、羥脯氨酸(O和/或Hyp)、異二酪氨酸(IDT)和二異二酪氨酸(di-IDT)。羥脯氨酸、異二酪氨酸和二異二酪氨酸是翻譯后形成的。優(yōu)選使用天然氨基酸，尤其是20種遺傳編碼的氨基酸。
非天然存在的氨基酸包括但不限于鈴蘭氨酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基戊酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-二氨基異丁酸、鎖鏈素(desmosine)、2，2′-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羥賴氨酸、別-羥賴氨酸(allo-hydroxylysine)、3-羥脯氨酸、4-羥脯氨酸、異鎖鏈素、別-異亮氨酸、三亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基異亮氨酸、N-甲基纈氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸、鳥氨酸和六氫哌啶羧酸。
此外，雖然具體參考的是分泌肽、多肽和/或蛋白質(zhì)，也具體包含那些肽或蛋白質(zhì)的突變體或變體。如本文所用，″變體″是指氨基酸序列類似于參考肽/多肽/蛋白質(zhì)，卻并未100％等同于所述對(duì)應(yīng)的肽/多肽/蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)(或肽或多肽)。變體肽/多肽/蛋白質(zhì)具有改變的序列，其中參考序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失或被取代，或者是在參考氨基酸序列中插入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸。變體可具有缺失、取代或插入的任何組合。作為變化的結(jié)果，變體肽/多肽/蛋白質(zhì)的氨基酸序列可與參考序列具有至少約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更高百分比的相同性。也可接受較低百分比的相同性，該相同性可低至20％。
為了確定突變多肽是否基本上與任何脊椎動(dòng)物多肽相似，可將突變多肽序列與第一參考脊椎動(dòng)物多肽序列相比對(duì)(align)。比對(duì)的一種方法是通過(guò)BlastP，使用用于評(píng)分矩陣(scoring matrix)和缺口罰分(gap penalty)的默認(rèn)設(shè)置。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第一參考脊椎動(dòng)物多肽是一種采用其進(jìn)行比對(duì)會(huì)得到最低E值的多肽，即僅通過(guò)偶然性發(fā)生的、與該比對(duì)分值相同或具有更好結(jié)果的比對(duì)存在的可能性最低?；蛘?，所述第一參考脊椎動(dòng)物多肽是該比對(duì)的結(jié)果具有最高的相同性百分比。
取代可為保守和/或非保守的。在保守氨基酸取代中，被取代的氨基酸與參考序列中的對(duì)應(yīng)氨基酸具有類似結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)特性。舉例而言，保守取代(置換)定義為在下述基團(tuán)間進(jìn)行的交換I小的脂族、非極性或微極性殘基——Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)II帶負(fù)電荷的殘基以及它們的酰胺——Asn、Asp、Glu、GlnIII帶正電荷的殘基——His、Arg、LysIV大的脂族、非極性殘基——Met、Leu、Ile、Val(Cys)V大的芳香族殘基——Phe、Tyr、Trp三種殘基是加上括號(hào)的，這是由于它們?cè)诘鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)中起到特殊的作用。Gly是僅有的一種不帶有側(cè)鏈的殘基，由此可為鏈帶來(lái)柔韌性。Pro具有不尋常的幾何結(jié)構(gòu)，牢牢地限制了鏈。Cys可參與形成二硫鍵，而二硫鍵則使蛋白質(zhì)保持特定的折疊；bGH中的4個(gè)半胱氨酸是高度保守的。采用保守突變，即便是具有低水平相同性的變體也能具有與未經(jīng)修飾的肽/多肽/蛋白質(zhì)類似的活性。
應(yīng)注意的是本發(fā)明中的″變體″包括具有多于或少于野生型形式中氨基酸數(shù)量的肽/多肽/蛋白質(zhì)。例如，對(duì)于生長(zhǎng)激素，野生型的分子量是約22kDa，但也存在20和17kDa的變體。明確地包含了這些可能為天然或非天然類型的變體。生長(zhǎng)激素拮抗物，其近似分子量為22kDa，也可以20和17kDa的形式存在，也明確包含了這些形式的生長(zhǎng)激素拮抗物。
″生物活性″物質(zhì)是指被攝入細(xì)胞后能在細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能或組成上引起可觀察到的變化的物質(zhì)，例如任何肽、多肽或蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，所述物質(zhì)為動(dòng)物的蛋白質(zhì)，在某些實(shí)施方式中為哺乳動(dòng)物的蛋白質(zhì)，而在某些實(shí)施方式中則為人的蛋白質(zhì)?？捎^察到的變化包括但不限于一種或多種mRNA表達(dá)的上升或下降、一種或多種蛋白質(zhì)表達(dá)的上升或下降、蛋白質(zhì)或其它細(xì)胞成分的磷酸化或脫磷酸化、酶的抑制或活化、結(jié)合對(duì)成員間結(jié)合的抑制或活化、代謝物合成速率的提高或降低、細(xì)胞增殖的提高或降低以及對(duì)有機(jī)體外在表型影響的提高或降低等。例如，將hGH給予GH缺乏的兒童可顯著地刺激生長(zhǎng)?；蛘撸瑢⑷薌H拮抗物給予肢端肥大的個(gè)體可得到較低水平的IGF-1，并在臨床上治愈此種失調(diào)。明確包含了生物活性蛋白片段，所述片段保持了生物活性。
應(yīng)注意的是本方法可用于在植物中生產(chǎn)融合蛋白。在融合蛋白中被修飾的基本蛋白質(zhì)可為任何來(lái)源，植物來(lái)源或動(dòng)物來(lái)源均可。動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)包括哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物。當(dāng)然，哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)包括人的蛋白質(zhì)。在本文件的通篇中時(shí)常參考人中的蛋白質(zhì)形式。應(yīng)認(rèn)識(shí)到在參考人的蛋白質(zhì)時(shí)，其它非人的哺乳動(dòng)物中也經(jīng)常會(huì)存在相同的蛋白質(zhì)。明確包含了這些其它非人的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)。
糖基化作用本發(fā)明總體上涉及采用新的方法在植物中表達(dá)糖蛋白。所述方法總體上包括利用植物中驅(qū)動(dòng)糖基化翻譯后修飾的密碼子，將編碼糖基化位點(diǎn)的核酸序列經(jīng)遺傳工程化插入編碼非HRGP蛋白質(zhì)/肽/多肽的基因中。所述用于糖基化的序列可作為連接于基因一端或另一端的分離的單元而構(gòu)建，以形成融合蛋白。還可將這些基因工程化使其編碼植物信號(hào)肽序列，從而靶向基因產(chǎn)物使其分泌。
糖基化類型包括但不限于阿拉伯次黃苷基化和阿拉伯半乳聚糖-多糖加成。阿拉伯次黃苷基化通常涉及短(例如通常約1-5個(gè))阿拉伯寡糖(通常為L(zhǎng)-阿拉伯糖呋喃糖殘基)鏈的加成。另一方面，阿拉伯半乳聚糖-多糖較大，且通常從核心β-1，3-D-半乳聚糖骨架形成，該骨架周期性修飾有1，6加成的小側(cè)鏈的D-半乳糖和L-阿拉伯糖，并偶爾修飾有其它糖(例如L-鼠李糖)和糖酸(例如D-葡萄糖醛酸及其4-o-甲基衍生物)。阿拉伯半乳聚糖-多糖也可以核心β-1，6-D-半乳聚糖骨架的形式存在，該骨架周期性修飾有1，6加成的小側(cè)鏈阿拉伯糖呋喃糖。請(qǐng)注意這些加合物是由植物的天然酶系統(tǒng)加入到包含糖基化靶位點(diǎn)(即糖基化位點(diǎn))的蛋白質(zhì)/肽/多肽上的。存在的糖基化的實(shí)際分子結(jié)構(gòu)可存在變化?；旧希捎芍参锛?xì)胞加入任何糖，包括但不限于寡糖鏈可包括可由宿主細(xì)胞提供的任何糖，這些糖不受限制地包括Gal、GaINAc、Glc、GlcNAc、和Fuc，均可用于形成寡糖鏈。應(yīng)注意到的是糖基化可在體外獲得。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)″糖組件″是指包含至少一個(gè)經(jīng)羥基化和經(jīng)糖基化的脯氨酸殘基的氨基酸序列。如本文所用，術(shù)語(yǔ)″糖基化位點(diǎn)″是指包含至少一個(gè)作為羥基化和后續(xù)的糖基化位點(diǎn)的脯氨酸殘基的氨基酸序列。糖基化通常發(fā)生在該位點(diǎn)中一個(gè)或多個(gè)脯氨酸羥基化之后。因此，在糖基化位點(diǎn)中，脯氨酸殘基可被羥基化以形成羥脯氨酸。
根據(jù)本發(fā)明通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)導(dǎo)入肽/多肽/蛋白質(zhì)，可獲得兩種主要的糖基化類型。糖基化通常有兩種類型1)阿拉伯半乳聚糖化糖組件，其包含成簇的非鄰接羥脯氨酸(Hyp)殘基，而其中的Hyp殘基與阿拉伯半乳聚糖加合物發(fā)生O-糖基化(其結(jié)構(gòu)如上所述)；以及2)阿拉伯次黃苷基化糖組件，其包含連續(xù)的Hyp殘基，而其中的一些或全部Hyp殘基被1-5個(gè)殘基長(zhǎng)度的阿拉伯糖鏈阿拉伯次黃苷基化(O-糖基化)?？蓞⒁娨韵旅绹?guó)專利和公開的申請(qǐng)以獲得對(duì)糖基化靶位點(diǎn)以及Hyp鄰接理論的更詳細(xì)討論專利號(hào)6,548,642、6,570,062、6,639,050和申請(qǐng)?zhí)?004/0009555和2004/0009557。將這些專利和專利申請(qǐng)中的全部揭示納入本文作為參考。
具體而言，可如下所述導(dǎo)入糖基化位點(diǎn)。對(duì)于阿拉伯半乳聚糖化糖組件(其中所述糖基化位點(diǎn)為成簇的非鄰接Hyp殘基)，所述基因?qū)⒕幋a(Pro-X)n和(X-Pro)n的變異體，其中n＝1-1000，和(X-Pro-X1-9)，其中X可為L(zhǎng)ys、Ala、Ser、Thr、Gly或Val，或更優(yōu)選Ser、Ala、Thr或Val。在另一實(shí)施方式中，n大于2、3、5、5、6、7、8、9、10、50、100或500，或小于999、998、997、996、995、994、993、992、991、990、900、800、700、600或500；n可為任何數(shù)值到1-1000范圍內(nèi)的任何數(shù)值。在某些實(shí)施方式中，n為1-100，或1-75，或1-50，或2-25，或2-10，或2-6。這些序列中的許多Pro殘基可被羥基化為羥脯氨酸(Hyp)，并隨后用阿拉伯半乳聚糖寡糖或多糖進(jìn)行O-糖基化。應(yīng)注意的是(X-Pro)n或(Pro-X)n重復(fù)可彼此交替分散和以其它氨基酸分散，也明確包含此類分散的重復(fù)組。雖然相對(duì)于X具體地指出了Lys、Ser、Thr、Val、Gly和Ala，相信任何氨基酸均可服務(wù)于此目的，且該基序?qū)⒃谥参镏斜惶腔?。如注明的，X更優(yōu)選為選自Ser、Ala、Thr或Val。
對(duì)于阿拉伯次黃苷基化糖組件(其中的糖基化位點(diǎn)為連續(xù)的Hyp殘基)，特定用于表達(dá)的基因?qū)⒕幋a連續(xù)的Pro殘基(Pro)n，其中n＝2-1000。在另一實(shí)施方式中，n大于3、4、5、6、7、8、9、10、50、100或500，或小于999、998、997、996、995、994、993、992、991、990、900、800、700、600或500；n可為任何數(shù)值到2-1000范圍內(nèi)的任何數(shù)值。在某些實(shí)施方式中，n為1-100，或1-75，或1-50，或2-25，或2-10，或2-6。這些序列中的大部分Pro殘基將被羥基化為羥脯氨酸，并隨后用長(zhǎng)度為1-5個(gè)阿拉伯糖殘基的阿糖胞苷進(jìn)行O-糖基化。應(yīng)注意的是(Pro)n或(Pro-X)n重復(fù)可用其它氨基酸分散，也明確包含此類分散的重復(fù)組。
為了避免混淆，請(qǐng)注意參考核酸構(gòu)建物和基因是指所述核苷酸將編碼脯氨酸，而并非羥脯氨酸。因此，核酸構(gòu)建物、基因等是指Pro或P(單字符形式)。參考編碼重復(fù)單元的基因可看起來(lái)類似于(SP)10，其是指編碼10個(gè)重復(fù)單元的Ser-Pro的核酸構(gòu)建物。對(duì)于區(qū)別已在植物中生產(chǎn)的肽/多肽/蛋白質(zhì)，參考為羥脯氨酸或hyp、或O(單字符形式)。因此，一旦(SP)10在植物中表達(dá)，就被稱為(SO)10。
可在單個(gè)糖蛋白中制造任何糖組件組合。即，糖蛋白可包含阿拉伯次黃苷基化糖組件和阿拉伯半乳聚糖化糖組件。因此，單個(gè)基因構(gòu)建物可包括編碼一個(gè)或多個(gè)阿拉伯次黃苷基化位點(diǎn)和/或一個(gè)或多個(gè)阿拉伯半乳聚糖化多糖位點(diǎn)的核酸序列，在植物宿主中表達(dá)后這些位點(diǎn)發(fā)生羥基化和糖基化。
用于糖基化的位點(diǎn)可位于肽/多肽/蛋白質(zhì)的一端或兩端，和/或若希望的話，可位于分子的內(nèi)部。例如，在較小的分子中，可通過(guò)加入糖基化位點(diǎn)來(lái)修飾N-或C端；在較大的分子中，內(nèi)部取代可能更為理想。當(dāng)然，較小的分子可在其內(nèi)部進(jìn)行修飾，而較大的分子則可在其一端或兩端進(jìn)行修飾——選擇權(quán)在于實(shí)施者。
在跨膜或膜錨定的酶的情況下，可如下制備構(gòu)建物用后隨有糖基化序列(例如短的(Ser-Hyp)n或(Ala-Hyp)n重復(fù))的N端分泌信號(hào)序列置換跨膜或膜錨定結(jié)構(gòu)域(避免糖基化轉(zhuǎn)移酶的內(nèi)在傾向，例如與ER/高爾基體膜相結(jié)合)來(lái)修飾N端。[例如，可通過(guò)用信號(hào)序列和糖組件替換通常將酶錨定在膜上的N端跨膜序列來(lái)修飾某些酶(如糖基轉(zhuǎn)移酶)，從而使得該糖基轉(zhuǎn)移酶被糖基化，并分泌出而不是滯留在ER或高爾基體膜上。]將該轉(zhuǎn)移基因設(shè)計(jì)為編碼用于通過(guò)內(nèi)膜系統(tǒng)分泌的信號(hào)序列。采用分泌信號(hào)序列以使得整個(gè)分子分泌的策略可用于任何構(gòu)建物，且不限于正常情況下為膜束縛、跨膜或膜錨定蛋白的分泌。
糖基化位點(diǎn)的加入和其后的糖基化，不論是通過(guò)阿拉伯次黃苷基化和/或阿拉伯半乳聚糖化多糖加成來(lái)進(jìn)行，都可具有許多不同的效果。在某些情況下，肽/多肽/蛋白質(zhì)的糖基化與相同但非糖基化的產(chǎn)物相比可導(dǎo)致產(chǎn)率和表達(dá)產(chǎn)物分泌的提高。即，加入至少一個(gè)用于阿拉伯次黃苷基化或阿拉伯半乳聚糖化多糖加成的位點(diǎn)與不含所述加成的表達(dá)產(chǎn)物比較可導(dǎo)致分泌產(chǎn)物產(chǎn)率的提高。該產(chǎn)率可提高約10％、25％、50％、100％、200％、300％、400％、500％、或1000％、或提高更多。
糖基化可提供分離感興趣的肽/多肽/蛋白質(zhì)的另一種方法。例如，通過(guò)將糖基化位點(diǎn)導(dǎo)入某蛋白質(zhì)的基因并隨后在植物中表達(dá)該基因，可用親和層析或通過(guò)基于凝集素的層析來(lái)離析和/或分離所述產(chǎn)物。
阿拉伯寡糖或阿拉伯半乳聚糖多糖的加入可對(duì)肽/多肽/蛋白質(zhì)的物理化學(xué)活性產(chǎn)生影響。該加成可提高分子量、改變等電點(diǎn)以及改變肽/多肽/蛋白質(zhì)改善其它介質(zhì)效力的能力。例如，糖基化可提高蛋白質(zhì)作為乳化劑的能力。因此，根據(jù)本發(fā)明制備的糖蛋白可用作乳化劑。在某些實(shí)施方式中，在藥物組合物中將作為乳化劑的本發(fā)明的糖蛋白與其它乳化劑結(jié)合使用，從而改善所述糖蛋白的給藥或改善其它生物活性物質(zhì)的給藥。
糖基化作用可提高肽/多肽/蛋白質(zhì)的分子量。糖基化可占糖蛋白總重量的1％、2％、3％、4％、5％、8％、12％、16％、24％、33％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或更高百分比。糖基化可為肽/多肽/蛋白質(zhì)增加0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100kDa或更多。通常，糖基化可以任何百分比增量提高分子量。
根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)糖基化可使得不溶性蛋白質(zhì)可溶，并可提高已經(jīng)是可溶蛋白質(zhì)的溶解性。因此，在某些實(shí)施方式中，根據(jù)這些方法修飾的肽/多肽/蛋白質(zhì)可在水中分離或溶解，而野生型蛋白質(zhì)則需緩沖溶液。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，與一旦處理不當(dāng)會(huì)發(fā)生聚合或形成多聚體的野生型蛋白質(zhì)相比，所述糖蛋白更穩(wěn)定。
具體來(lái)說(shuō)，就生長(zhǎng)激素和生長(zhǎng)激素拮抗物的溶解性而言，溶解性提高并超出了非糖基化類型的溶解性。在缺乏溶解非糖基化形式所需的其它元素(例如緩沖液或其它添加劑)的條件下，觀察到了溶解度的增加。溶解度可為大于或等于約10、15、20、25、30、40、50或更大mg/ml。
根據(jù)本發(fā)明的肽/多肽/蛋白質(zhì)糖基化可具有理想的提高酶降解抗性的效果。雖然還不完全清楚這是為何發(fā)生的，似乎根據(jù)本發(fā)明加入的大量碳水化合物取代基阻滯或防止了酶降解所需進(jìn)入的位點(diǎn)。因此，當(dāng)肽酶特異性作用于特定末端或特定氨基酸序列時(shí)，該糖基化阻滯、阻止或妨礙了肽酶進(jìn)入那些位點(diǎn)。這一保護(hù)性效果具有許多現(xiàn)實(shí)實(shí)用性，包括提高保質(zhì)期、降低微生物降解以及提高通過(guò)胃腸道的可能性，并因此在某些情況下使得口服給藥成為可能。
在某些實(shí)施方式中，已冷凍干燥的本發(fā)明經(jīng)修飾肽/多肽/蛋白質(zhì)可很容易地溶解，而野生型肽/多肽/蛋白質(zhì)則更難以溶解。本發(fā)明的這一方面在以下實(shí)用中很重要且使本發(fā)明能夠用于這些用途，例如在注射(可為例如IM、SC、IV或IP)前對(duì)本發(fā)明凍干的經(jīng)修飾的肽/多肽/蛋白質(zhì)進(jìn)行重建。其中野生型肽/多肽/蛋白質(zhì)可能難以溶解，并需要緩沖液、鹽或其它溶解元素，而這些物質(zhì)能造成注射中的灼燒感或刺激作用，本發(fā)明某些經(jīng)修飾的肽/多肽/蛋白質(zhì)可避免那些不理想的添加劑。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，例如根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)經(jīng)修飾的人生長(zhǎng)激素、對(duì)其進(jìn)行配制并在不添加甘露醇的條件下包裝；得到凍干粉或溶液形式的不含甘露醇的注射劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)經(jīng)修飾的人生長(zhǎng)激素、對(duì)其進(jìn)行配制并在不添加甘氨酸的條件下包裝；得到凍干粉或溶液形式的不含甘氨酸的注射劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)經(jīng)修飾的人生長(zhǎng)激素、對(duì)其進(jìn)行配制并在不添加亮氨酸的條件下包裝；得到凍干粉或溶液形式的不含亮氨酸的注射劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)經(jīng)修飾的人生長(zhǎng)激素、對(duì)其進(jìn)行配制并在不加入磷脂的條件下包裝；得到凍干粉或溶液形式的不含磷脂的注射劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)經(jīng)修飾的人生長(zhǎng)激素、對(duì)其進(jìn)行配制并在不添加海藻糖的條件下包裝；得到凍干粉或溶液形式的不含海藻糖的注射劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)經(jīng)修飾的人生長(zhǎng)激素、對(duì)其進(jìn)行配制并在不加入組氨酸的條件下包裝；得到凍干粉或溶液形式的不含組氨酸的注射劑。實(shí)際上，本發(fā)明經(jīng)修飾的生長(zhǎng)激素制劑，例如可不含通常在其它生長(zhǎng)激素制劑中存在任何賦形劑。
可在影響這些生物化學(xué)特性的同時(shí)，不影響生物活性。然而，在某些情況下，糖基化還賦予了其它優(yōu)點(diǎn)。
由于溶解性的提高和易于溶出，本發(fā)明一些經(jīng)修飾的肽/多肽/蛋白質(zhì)可通過(guò)吸入肺部進(jìn)行傳遞以用于產(chǎn)生藥理學(xué)效應(yīng)。例如，不含添加劑時(shí)，野生型蛋白質(zhì)可能難于溶解。吸入凍干粉形式的野生型蛋白質(zhì)后，其在肺部膜中的溶出很低，這就a)使得攝入速率減慢；b)使得微粒物質(zhì)被吞噬；以及c)使得纖毛能將這些顆粒物質(zhì)向上傳遞并遞出肺部。然而，本發(fā)明經(jīng)修飾的肽/多肽/蛋白質(zhì)的溶出速度可快很多，從而提高攝入速率、降低吞噬的機(jī)率并防止通過(guò)纖毛運(yùn)動(dòng)而被排出。其凈效應(yīng)是創(chuàng)建了一種可通過(guò)吸入傳遞的藥物，而這種傳遞對(duì)于用野生型制成的藥物是不可行的。
在某些具有生物活性的肽/多肽/蛋白質(zhì)的實(shí)施方式中，所述阿拉伯次黃苷基化和/或阿拉伯半乳聚糖多糖的加成可改變生物活性。生物活性的改變可為，例如所述肽/多肽/蛋白質(zhì)的藥效學(xué)特性，即對(duì)所述肽/多肽/蛋白質(zhì)的促進(jìn)和/或拮抗活性進(jìn)行改變。例如，經(jīng)修飾的促效劑可具有拮抗活性；因此，可用促效劑來(lái)制備拮抗劑。在其它實(shí)例中，修飾使得受體親和力提高或降低。
生物活性的改變可為，例如，肽/多肽/蛋白質(zhì)藥代動(dòng)力學(xué)的改變，即改變所述肽/多肽/蛋白質(zhì)的吸收、分布、在組織中的定位、生物轉(zhuǎn)化和/或分泌。例如，糖基化的肽/多肽/蛋白質(zhì)相對(duì)于非糖基化肽/多肽/蛋白質(zhì)可具有提高的生物利用度或半衰期。生物利用度或半衰期可提高約10％、25％、50％、100％、200％、300％、400％、500％或1000％，或更多。
通?？赏ㄟ^(guò)曲線下面積(AUC)來(lái)測(cè)定生物利用度。所述曲線下面積是給藥后藥物血漿濃度(不是濃度的對(duì)數(shù)值)對(duì)時(shí)間的曲線。通常可通過(guò)″梯形規(guī)則″(trapezoidal rule)來(lái)測(cè)定所述面積，在該規(guī)則中用直線部分連接數(shù)據(jù)點(diǎn)，并從橫坐標(biāo)向各數(shù)據(jù)點(diǎn)作垂線，用計(jì)算機(jī)來(lái)處理由此構(gòu)建的三角形和梯形的面積總和?？捎萌魏伪绢I(lǐng)域已知的方法計(jì)算曲線下面積以算得這一數(shù)值。根據(jù)本發(fā)明，AUC可增加約10％、25％、50％、100％、200％、300％、400％、500％或1000％，或更多。
生物利用度的提高可用血漿濃度峰值(Cmax)的提高來(lái)反映。根據(jù)本發(fā)明，血漿濃度峰值可提高約10％、25％、50％、100％、200％、300％、400％、500％或1000％，或更多。
因此，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的生物活性蛋白可具有延長(zhǎng)的半衰期和/或生物利用度的優(yōu)點(diǎn)，并因此在體內(nèi)具有提高或延長(zhǎng)的效應(yīng)。雖然尚不完全清楚這種情況如何或?yàn)楹伟l(fā)生，其可能涉及到通過(guò)本發(fā)明的碳水化合物基序使得生物分子上的電荷發(fā)生變化和尺寸變大。
根據(jù)本發(fā)明的糖基化的另一效果是在免疫原性或抗原性上不發(fā)生變化。因此，通過(guò)根據(jù)本發(fā)明將肽/多肽/蛋白質(zhì)作為糖蛋白來(lái)生產(chǎn)，可保存它們的免疫原性或抗原性不變。在某些實(shí)施方式中，免疫原性或抗原性事實(shí)上是降低了。在無(wú)變化或降低了的情況下，這對(duì)于具有所需生物效應(yīng)但受其免疫原性/抗原性限制的疫苗或其它不經(jīng)胃腸道導(dǎo)入的分子而言是非常重要的。具體的例子包括但不限于β-淀粉狀肽。
相對(duì)于基本蛋白質(zhì)降低了的免疫原性(或變態(tài)反應(yīng)原性)是由抗體能或不能識(shí)別核心蛋白的能力造成的。然而，應(yīng)注意到的是碳水化合物部分也可作為抗體的表位，并由此可作為免疫原或變態(tài)反應(yīng)原來(lái)行使功能。雖然還不清楚需要什么使抗體將碳水化合物部分識(shí)別為外來(lái)物質(zhì)，但相信根據(jù)本發(fā)明制造的糖蛋白能作為過(guò)敏癥免疫療法中的敏化劑使用。即，根據(jù)本發(fā)明制備的糖蛋白可用于重復(fù)注射，并具有理想的降低過(guò)敏反應(yīng)的長(zhǎng)期效果。具體而言，相信包含糖組件X-Hypn的阿拉伯次黃苷基化糖蛋白(包括糖肽或甚至糖基化氨基酸，例如至少附著有一個(gè)阿拉伯糖的單個(gè)羥脯氨酸)可用于過(guò)敏癥的免疫療法中。
肽/多肽/蛋白質(zhì)根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行修飾的肽/多肽/蛋白質(zhì)可來(lái)自各種有機(jī)體，包括但不限于人和其它哺乳動(dòng)物和/或脊椎動(dòng)物、無(wú)脊椎動(dòng)物、植物、海綿動(dòng)物、細(xì)菌、真菌、藻類、古細(xì)菌等。此外，明確包含人工合成的蛋白質(zhì)和肽，它們是任何蛋白質(zhì)(例如拮抗劑、肽促效劑或拮抗劑或抗體)的衍生物和類似物。
所述肽/多肽/蛋白質(zhì)可為大或小、單體或多聚體、并可具有任何類型的用途。在某些實(shí)施方式中，所述肽/多肽/蛋白質(zhì)是小的，例如小于約25kDa。通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的糖基化作用，它們的分子量可提高到40kDa或更高。
在某些實(shí)施方式中，所述肽/多肽/蛋白質(zhì)不是翻譯后修飾的，除了形成二硫鍵或N-連接的糖基化。在某些實(shí)施方式中，避免使用具有許多作為羥基化和隨后的糖基化靶位的脯氨酸殘基的肽。
可用本發(fā)明表達(dá)的肽/多肽/蛋白質(zhì)包括但不限于生長(zhǎng)激素超家族中的那些分子，包括但不限于生長(zhǎng)激素、催乳素、胎盤催乳素以及其它的白介素。其它具體的例子包括但不限于單核細(xì)胞趨化蛋白-1、白介素-10、多效素、白介素-7、白介素-8、干擾素Ω、干擾素-α2a和2b、干擾素γ、白介素-1、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子6、IGF-1、胰島素樣生長(zhǎng)因子I和II、促腎上腺皮質(zhì)激素、β-淀粉狀蛋白、糊精、心房利鈉肽(例如α)、蛙皮素、緩激肽、腦利鈉肽、降鈣素、降鈣素基因相關(guān)肽、促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素、力啡肽、內(nèi)啡肽、內(nèi)皮素(例如-1、-2和-3)、腦啡肽、表皮生長(zhǎng)因子、抑胃肽、胃泌素、胃泌素釋放肽、生長(zhǎng)激素釋放激素、HIV-1包膜蛋白、鈣抑肽、促黃體激素釋放激素、神經(jīng)激肽(例如A和B)、神經(jīng)介素(例如B和C)、神經(jīng)肽Y、神經(jīng)降壓素、催產(chǎn)素、胰多肽、胰泌素(pancreastin)、胰抑素、甲狀旁腺素、腸促胰液素、生長(zhǎng)激素抑制素、Phe物質(zhì)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(例如α)、血管活性腸肽、抗利尿激素、8-精催產(chǎn)素、高血糖素和高血糖素樣肽、促紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子、PORF-1和-2(視交叉前調(diào)節(jié)因子)以及PYY3-36。還包括任何蛋白質(zhì)生長(zhǎng)因子、激素、抗體、細(xì)胞因子、癌蛋白(引起腫瘤的蛋白質(zhì))、淋巴因子、或其衍生物。還包括涉及代謝過(guò)程的蛋白質(zhì)、包括但不限于胰島素、ghrelin、來(lái)普汀、脂聯(lián)素(adiponectin)、抵抗素等。
例如，本發(fā)明可用于表達(dá)經(jīng)修飾的生長(zhǎng)激素。生長(zhǎng)激素(GH)由腦垂體腺分泌。其為具有多種生物活性的約22-kDa的蛋白質(zhì)。生長(zhǎng)激素分泌過(guò)少會(huì)導(dǎo)致侏儒癥，而過(guò)度表達(dá)則會(huì)造成巨人癥和/或肢端肥大癥?？芍苽渲亟MDNA構(gòu)建物，其包括編碼hGH的核酸、編碼羥脯氨酸糖基化位點(diǎn)的核酸以及編碼植物信號(hào)序列的核酸。所述編碼羥脯氨酸糖基化位點(diǎn)的核酸可編碼X-Pron(或Pron-X)，其中X為L(zhǎng)ys、Ser、Thr、Ala、Gly、Val或任何氨基酸，或更優(yōu)選為Ser、Ala、Thr或Val，且n為2-1000；或者，所述核酸可編碼(X-Pro)n(或(Pro-X)n)，其中X為任何氨基酸，例如Lys、Ser、Thr、Ala、Gly或Val，或更優(yōu)選為Ser、Ala、Thr或Val，且n為1-1000。對(duì)于大量的氨基酸，XPPPPP系列中的第一個(gè)Pro可不被羥基化，但其它的將被羥基化。在一個(gè)實(shí)施方式中，例如，所述核酸編碼(Ser-Pro)10。在這一實(shí)施方式中，hGH以GH-(Ser-Pro)10(在N-或C端上修飾)的形式表達(dá)；由植物對(duì)Pro進(jìn)行羥基化，并隨后用阿拉伯半乳聚糖鏈對(duì)其進(jìn)行糖基化。產(chǎn)物為包含(Ser-Hyp)10的hGH糖蛋白。所述糖蛋白具有與野生型hGH相同的活性，但具有顯著提高的藥代動(dòng)力學(xué)半衰期。(本實(shí)施方式的產(chǎn)物和測(cè)試在實(shí)施例6中有更詳細(xì)的描述，請(qǐng)見下文。)在單次皮下(SC)注射后，根據(jù)本發(fā)明修飾的HGH可產(chǎn)生高于約8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24，或更多小時(shí)的血漿濃度峰值。這大大超出野生型生長(zhǎng)激素的半衰期，所述野生型生長(zhǎng)激素的半衰期僅為約20-30分鐘。
在一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)編碼hGH的核酸進(jìn)行工程化以產(chǎn)生hGH拮抗劑，并在C末端加上了糖基化位點(diǎn)。例如，可用除丙氨酸以外的任何氨基酸置換第119位的Gly(在多種野生型動(dòng)物生長(zhǎng)激素中存在)或第120位的Gly(hGH的)，并產(chǎn)生拮抗劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，用Lys置換hGH的Gly120，從而產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素拮抗物。同樣，將(Ser-Hyp)10基序連接到C末端。得到具有hGH拮抗活性和延長(zhǎng)的半衰期(與非糖基化hGH20-30分鐘的半衰期相比)的糖蛋白。
當(dāng)然，也可用生長(zhǎng)激素的20-kD變體來(lái)產(chǎn)生具有類似效果的類似構(gòu)建物。例如，可用除丙氨酸以外的任何氨基酸置換第104位的Gly(存在于20kDa的野生型動(dòng)物生長(zhǎng)激素變體中)或(20-kDa人生長(zhǎng)激素的)第105位Gly，以產(chǎn)生拮抗劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，用Lys置換(20-kDa形式)hGH的Gly105，從而產(chǎn)生hGH拮抗劑。同樣，可在C末端附有(Ser-Hyp)10基序。
在一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)編碼hGH的核酸進(jìn)行工程化以在該蛋白的內(nèi)部插入羥脯氨酸糖基化位點(diǎn)。在22-kDa GH的情況下，例如通常位于第119位或120位的Gly缺失，而在這些位置插入Ser-Pro-Pro-Pro-Pro。采用這一構(gòu)建物，脯氨酸將會(huì)被羥基化，然后再發(fā)生阿拉伯次黃苷基化。所得將會(huì)是具有延長(zhǎng)的半衰期的拮抗劑。
以下更為廣泛地描述的是關(guān)于可按本發(fā)明制備的生長(zhǎng)激素超家族融合肽/蛋白質(zhì)的信息。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的融合蛋白包括如下所述的a)至少一種糖組件，和b)屬于GH-PRL-PL超家族的天然存在的脊椎動(dòng)物激素。尤其令人感興趣的是脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素、催乳素或胎盤催乳素。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的融合蛋白包括a)至少一種糖組件，和b)與天然存在的脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素、催乳素或胎盤催乳素基本上相同但并不完全相同的生物活性突變多肽。
術(shù)語(yǔ)″天然存在的″是指假定為無(wú)人為干涉的，即用遺傳工程化的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生外來(lái)蛋白這一事實(shí)并不意味該受討論的外來(lái)蛋白在小鼠中本身就存在。
這一突變體可為促效劑，即它具有脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素、催乳素或胎盤催乳素中的至少一種生物活性。應(yīng)注意的是生長(zhǎng)激素可經(jīng)修飾而變?yōu)楦训拇呷樗鼗蛱ケP催乳素促效劑，而反之亦然。如果用BlastP比對(duì)后，該突變體與脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素具有比與任何已知脊椎動(dòng)物催乳素或胎盤催乳素更高百分比的相同性，則該突變體可被劃分為生長(zhǎng)激素突變體。對(duì)催乳素和胎盤催乳素突變體也有類似定義。
或者，所述突變體可為脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素、催乳素或胎盤催乳素的拮抗劑。通常而言，所考慮到的拮抗劑為受體拮抗劑，即是一種能結(jié)合受體但基本上不活化受體的分子，從而通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制機(jī)制拮抗了受體活性。編碼生物學(xué)活性GH受體拮抗劑的GH突變體的首次鑒定在以下文獻(xiàn)中有述Kopchick等人的美國(guó)專利5,350,836、5,681,809、5,958,879、6,583,115和6,787,336；以及Chen等人，1991年，《內(nèi)源性小鼠生長(zhǎng)激素(GH)和GH類似物間的功能性拮抗作用產(chǎn)生侏儒轉(zhuǎn)基因小鼠》(″Functional antagonism between endogenous mouse growthhormone(GH)and a GH analog results in dwarf transgenic mice″，Endocrinology1291402-1408)，Chen等人，1991年?！杜ＩL(zhǎng)激素第119位的甘氨酸對(duì)于生長(zhǎng)促進(jìn)活性是關(guān)鍵性的》(″Glycine 119 of bovine growth hormone is critical forgrowth promoting activity″，Mol.Endocrinology 51845-1852)，以及Chen等人，1991年，《牛生長(zhǎng)激素第三α螺旋的突變極大影響其體外的胞內(nèi)分布和在轉(zhuǎn)基因小鼠中的生長(zhǎng)促進(jìn)作用》(″Mutations in the third.α-helix of bovine growthhormone dramatically affect its intracellular distribution in vitro and growthenhancement in transgenic mice″，J.Biol.Chem.2662252-2258)。這些參考文獻(xiàn)(后文中稱為″Kopchick等人的上述文獻(xiàn)″)均以其全文納入本文作為參考。
為了確定上述突變多肽是否基本上與GH-PRL_PL超家族的任何脊椎動(dòng)物激素相同，可將上述突變多肽序列與該超家族中的第一參考脊椎動(dòng)物激素序列進(jìn)行比對(duì)。比對(duì)的一種方法是通過(guò)BlastP，使用用于評(píng)分矩陣和缺口罰分的默認(rèn)設(shè)置。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第一參考脊椎動(dòng)物激素是一種采用該比對(duì)會(huì)得到最低E值的多肽，即僅通過(guò)偶然性發(fā)生的、與該比對(duì)分值相同或具有更好結(jié)果的比對(duì)存在的可能性最低?；蛘?，所述第一參考脊椎動(dòng)物多肽是該比對(duì)的結(jié)果具有最高的相同性百分比。
通常而言，如果所有的區(qū)別均可判斷為如下結(jié)果，則認(rèn)為突變多肽促效劑基本上與參考脊椎動(dòng)物激素相同(1)已知氨基酸的保守取代為同源蛋白質(zhì)家族中優(yōu)選的交換；(2)已知或可確定(例如通過(guò)丙氨酸掃描遺傳突變，alaninescanning mutagenesis)氨基酸非保守取代位點(diǎn)不可能導(dǎo)致相關(guān)生物活性的喪失；或(3)在GH-PRL-PL超家族(或更具體為在相關(guān)的家族內(nèi))中觀察到的變體(取代、插入、缺失)。突變多肽拮抗劑還可因一種或多種受體拮抗突變而不同于參考脊椎動(dòng)物激素。
關(guān)于將上述第(3)點(diǎn)應(yīng)用于插入和缺失，需要將該突變多肽與至少2種不同的參考激素相比對(duì)。這可通過(guò)將各參考激素與該突變多肽作成對(duì)比較完成。
當(dāng)將兩種序列相互比對(duì)時(shí)，比對(duì)算法可將缺口引入一種序列或同時(shí)引入兩種序列。如果序列A中的一個(gè)缺口長(zhǎng)度相當(dāng)于序列B中的位置X，那么我們可以等同地認(rèn)為在與序列B的位點(diǎn)X-1和X+1比對(duì)的序列A的氨基酸之間，(1)由于(相應(yīng)于)序列B中X位點(diǎn)的氨基酸缺失，導(dǎo)致序列A不同于序列，或(2)由于序列B中X位點(diǎn)插入了氨基酸，導(dǎo)致序列B不同于序列A。
如果將突變序列與第一參考激素進(jìn)行比對(duì)在突變序列中產(chǎn)生了缺口，那么所述突變序列可被認(rèn)為通過(guò)在第一參考激素的該位點(diǎn)上發(fā)生氨基酸缺失而不同于第一參考激素，且如果另一參考激素以同樣的方式區(qū)別于第一參考激素，則根據(jù)上述第(3)條判斷該缺失。
同樣，如果將突變序列與第一參考激素進(jìn)行比對(duì)在參考序列中產(chǎn)生了缺口，那么所述突變序列可被認(rèn)為通過(guò)插入與缺口比對(duì)的氨基酸而不同于第一參考激素，且如果另一參考激素以同樣的方式區(qū)別于第一參考激素，則根據(jù)第(3)條判斷該插入。
本發(fā)明優(yōu)選的脊椎動(dòng)物GH-衍生的GH受體促效劑是包含多肽序列P的融合蛋白，而所述多肽序列P的氨基酸序列與第一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素氨基酸序列間如果存在任何差異的話，該差異獨(dú)立地選自下組(a)對(duì)相應(yīng)的第一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素殘基進(jìn)行氨基酸保守置換的取代；(b)對(duì)相應(yīng)的第一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素殘基進(jìn)行氨基酸非保守置換的取代，其中(i)存在另一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素，對(duì)該另一參考而言相應(yīng)的氨基酸是對(duì)相應(yīng)的第一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素殘基的非保守取代，和/或(ii)所述第一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素的單取代突變體的結(jié)合親和力至少為第一脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素對(duì)該第一脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素天然結(jié)合的脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素受體親和力的10％，其中不為丙氨酸的所述對(duì)應(yīng)殘基被丙氨酸所取代；
(c)所述第一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素中存在一個(gè)或多個(gè)殘基的缺失，但該殘基在另一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素中缺失；(d)將一個(gè)或多個(gè)殘基插入所述第一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素，插入位置為所述第一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素的鄰接氨基酸之間，其中存在另一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素，其與所述第一參考生長(zhǎng)激素的區(qū)別在于在所述第一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素的同樣位點(diǎn)進(jìn)行插入；以及(e)對(duì)所述第一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素中最先的1-8、1-6、1-4或1-3位殘基和/或最后的1-8、1-6、1-4或1-3位殘基的端部去除(″端部去除″是指在肽的N-或C-末端發(fā)生的缺失)；其中所述多肽序列的結(jié)合親和力為所述第一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素對(duì)脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素受體親和力的至少10％，所述受體優(yōu)選為所述第一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素天然結(jié)合的受體，且其中所述融合蛋白結(jié)合于脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素受體并由此活化該受體。
我們將融合蛋白表征為″GH-衍生的″，這是由于如上所述，所述多肽序列P定性為脊椎動(dòng)物GH或脊椎動(dòng)物GH突變體。
生長(zhǎng)激素天然結(jié)合存在于同一物種中的生長(zhǎng)激素受體，即人生長(zhǎng)激素天然結(jié)合人生長(zhǎng)激素受體、牛生長(zhǎng)激素、牛GH受體等。
基于對(duì)不同有機(jī)體的同源蛋白(例如列于Schulz和Schirmer的《蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)原理》(Principle of Protein Structure)的表1-2中，和Creighton的《蛋白質(zhì)》(Proteins)中的圖3-9中的同源蛋白)間氨基酸變化頻率的分析，我們將保守取代(置換)定義為在下組間的交換I小的脂族、非極性或微極性殘基——Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)II帶負(fù)電荷的殘基以及它們的酰胺——Asn、Asp、Glu、GlnIII帶正電荷的殘基——His、Arg、LysIV大的脂族、非極性殘基——Met、Leu、Ile、Val(Cys)V大的芳香族殘基——Phe、Tyr、Trp三種殘基是加上括號(hào)的，這是由于它們?cè)诘鞍踪|(zhì)中起到特殊的作用。Gly是僅有的一種不帶有側(cè)鏈的殘基，由此可為鏈帶來(lái)柔韌性。Pro具有不尋常的幾何結(jié)構(gòu)，牢牢地限制了鏈。Cys可參與形成二硫鍵，而二硫鍵則使蛋白質(zhì)保持特定的折疊；bGH中的4個(gè)半胱氨酸是高度保守的。
交換I/II或交換III/IV/V的突變體，可被認(rèn)為是半保守的，它是非保守突變體的亞類。可將特征不同于半保守突變的非保守突變體表征為″強(qiáng)烈的非保守性″。半保守突變體比強(qiáng)烈的非保守突變體更為優(yōu)選。
對(duì)于結(jié)合于人生長(zhǎng)激素受體，用Cunningham和Wells在《通過(guò)丙氨酸掃描遺傳突變法對(duì)hGH-受體相互作用進(jìn)行高分辨率圖譜分析》(″High-ResolutionMapping of hGH-Receptor Interactions by Alanine Scanning Mutagenesis″，Science2841081，1989年)中描述的方法測(cè)定結(jié)合親和力，并因此用hGHRbp作為靶標(biāo)。對(duì)于結(jié)合于人催乳素受體，用WO92/03478中描述的方法測(cè)定親和力，并因此用hPRLbp作為靶標(biāo)。對(duì)于結(jié)合于非人的脊椎動(dòng)物激素受體，優(yōu)選采用受體的胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域、純化的全受體和未純化的受體來(lái)源(例如膜制備物)來(lái)測(cè)定結(jié)合親和力。
結(jié)合受體的融合蛋白優(yōu)選在脊椎動(dòng)物中具有生長(zhǎng)促進(jìn)活性?？捎肒opchick等闡述的測(cè)定法來(lái)測(cè)定生長(zhǎng)促進(jìn)(或抑制)活性，所述測(cè)定法涉及GH促效劑或拮抗劑在小鼠中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)?；蛘咭部赏ㄟ^(guò)檢測(cè)將GH促效劑或拮抗劑給予人或非人脊椎動(dòng)物的藥學(xué)效果來(lái)測(cè)定。
優(yōu)選采用以下一種或多種其它條件(1)多肽序列P與所述第一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素具有的相同性為至少50％、更優(yōu)選至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或最優(yōu)選至少95％；(2)所述保守置換氨基酸為高度保守置換氨基酸；(3)(c)款下的任何缺失發(fā)生在不位于所述脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素家族的保守殘基位點(diǎn)的殘基上，且更優(yōu)選不為哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)激素亞家族的保守殘基位點(diǎn)；(4)所述第一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素為哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)激素，更優(yōu)選人或牛生長(zhǎng)激素，(5)(d)款下的任何插入的長(zhǎng)度為可使另一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素存在，該另一參考與所述第一參考生長(zhǎng)激素的不同在于在所述第一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素相同位置上有等長(zhǎng)度的插入；(6)差異限制于按照(a)和/或(b)款的取代；(7)如果第一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素是非人生長(zhǎng)激素，且其可能的用途是用于結(jié)合或活化人生長(zhǎng)激素受體，所述差異提高與人生長(zhǎng)激素的整體相同性；(8)所述一種或多種取代選自一種或多種特征為如下所述的hGH突變體B2024和/或B2036的突變；(9)所述多肽序列P與所述第一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素的相似性至少為50％、更優(yōu)選至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或如果是促效劑的話，最優(yōu)選100％；(10)采用BlastP(使用Blosum62矩陣、將缺口罰分-11用于缺口的產(chǎn)生和將缺口罰分-1用于各缺口延伸)對(duì)所述多肽序列P與第一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果中的E值小于e-10、更優(yōu)選小于e-20、e-30、e-40、e-50、e-60、e-70、e-80、e-90或最優(yōu)選e-100。
對(duì)于條件(1)，用BlastP方法學(xué)計(jì)算百分相似性，即相同性為比對(duì)覆蓋區(qū)域(包含內(nèi)部缺口)的百分比。對(duì)于條件(2)，高度保守的氨基酸置換如下Asp/Glu、Arg/His/Lys、Met/Leu/Ile/Val和Phe/Tyr/Trp。對(duì)于條件(3)，保守殘基位點(diǎn)為如下位點(diǎn)對(duì)申請(qǐng)時(shí)在公眾可獲得的序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素序列如本文所述進(jìn)行比對(duì)時(shí)，所述位點(diǎn)僅被屬于上文所述的相同保守取代交換組(I、II、III、IV或V)中的氨基酸所占據(jù)。所述非保守殘基位點(diǎn)為被屬于不同交換組的氨基酸所占據(jù)的位點(diǎn)，和/或在一種或多種脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素未被占據(jù)的位點(diǎn)(即缺失)。脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素家族的完全保守殘基位點(diǎn)是那些在所有所述脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素中被相同的氨基酸所占據(jù)的位點(diǎn)。(c)款不允許在完全保守殘基位點(diǎn)中的一個(gè)殘基上發(fā)生缺失。可類似地定義哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)激素家族的完全保守、保守和非保守殘基位點(diǎn)。
對(duì)于條件(4)，hGH優(yōu)選為對(duì)應(yīng)于所述Swiss-Prot SOMA_HUMAN，P01241，異構(gòu)體1(22kDa)序列的突變部分(AA 27-217)的hGH形式，且牛生長(zhǎng)激素優(yōu)選為對(duì)應(yīng)于所述Swiss-Prot SOMA BOVIN，P01246序列的突變部分(AA 28-217)的牛生長(zhǎng)激素形式(按照Miller W.L.、Martial J.A.、Baxter J.D.；《牛生長(zhǎng)激素mRNA互補(bǔ)DNA的分子克隆》″Molecular cloning of DNA complementary to Bovingrowth hormone mRNA.″；J.Biol.Chem.，2557521-7524，1980年)。這些參考文獻(xiàn)以其全文納入作為參考。對(duì)于條件(10)，用BlastP方法學(xué)計(jì)算了百分相似性，即將正得分(在Blosum62矩陣中評(píng)分為正的比對(duì)對(duì))作為包含內(nèi)部缺口的重疊區(qū)域的比對(duì)百分比。
可類似地定義本發(fā)明脊椎動(dòng)物GH-衍生的GH受體拮抗劑，除了所述多肽序列還必須在例如對(duì)應(yīng)于牛生長(zhǎng)激素Gly 119或人生長(zhǎng)激素Gly 120的位置不同于參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素的序列，從而將GH受體拮抗劑(結(jié)合但不活化)活性賦予所述多肽序列，并由此賦予融合蛋白。請(qǐng)注意目前認(rèn)為bGH Gly 119/hGH Gly120是脊椎動(dòng)物GH家族中的完全保守殘基位點(diǎn)。已報(bào)道了一種獨(dú)立地突變——R77C能導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制。參見Takahashi Y、Kaji H、Okimura Y、Goji K、Abe H、Chihara K的《簡(jiǎn)報(bào)由突變的生長(zhǎng)激素引起的矮身高》(″Brief reportshort staturecaused by a mutant growth hormone.″，N Engl J Med.，1996年2月15日；334(7)432-6)。
優(yōu)選地，所述GH受體拮抗劑具有生長(zhǎng)抑制活性。如果用某化合物處理的至少一種脊椎動(dòng)物物種的測(cè)試動(dòng)物(或經(jīng)基因工程化使這些動(dòng)物自身表達(dá)該化合物)的生長(zhǎng)比對(duì)照動(dòng)物的生長(zhǎng)顯著(置信度水平為0.95)減緩(術(shù)語(yǔ)″顯著″所用的是其統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義)，則認(rèn)為該化合物具有生長(zhǎng)抑制性。在某些實(shí)施方式中，其在多種物種中或至少在人和/或牛中具有生長(zhǎng)抑制性。
同樣，GH拮抗劑可包括基本上對(duì)應(yīng)于所述第一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素第三主要α螺旋的α螺旋，并且與其具有至少50％的相同性(更優(yōu)選至少80％的相同性)。然而，突變不限于第三主要α螺旋。
所考慮到的脊椎動(dòng)物GH拮抗劑包括，具體為融合蛋白，其中的多肽P對(duì)應(yīng)于如美國(guó)專利5,849,535中所述的hGH突變體B2024和B2036。請(qǐng)注意B2024和B2036均為hGH突變體，所述突變體包括尤其為G10K取代。此外，根據(jù)上述的原則我們考慮了B2024和B2036發(fā)生進(jìn)一步突變的GH拮抗劑，即其中將B2024或B2036代替天然存在的GH(例如HGH)用作參考脊椎動(dòng)物GH。
可用類似的方式定義促進(jìn)或拮抗脊椎動(dòng)物催乳素受體的脊椎動(dòng)物催乳素促效劑和拮抗劑以及脊椎動(dòng)物胎盤催乳素促效劑和拮抗劑。還可得到促進(jìn)或拮抗催乳素受體的脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素突變體(其保留或不保留對(duì)生長(zhǎng)激素受體的活性)，以及促進(jìn)或拮抗脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素受體的脊椎動(dòng)物催乳素或胎盤催乳素突變體(其保留或不保留對(duì)催乳素受體的活性)?？捎妙愃频姆绞蕉x為脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素-催乳素-胎盤催乳素激素超家族的兩種或多種參考激素的雜交體或雜交體的突變體的促效劑和拮抗劑，其保留了至少10％的對(duì)至少一種參考激素的至少一種受體的結(jié)合活性。
可用數(shù)種方式來(lái)定義這些雜交體。在一個(gè)實(shí)施方式中，我們只使用了第一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素和可為該超家族成員的任何脊椎動(dòng)物激素的另一參考脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素。在第二種實(shí)施方式中，上述突變體主要在一個(gè)家族(例如GH)的基礎(chǔ)上進(jìn)行定義，但在有限數(shù)目的位點(diǎn)上，例如少于P序列的10％或少于P序列的5％，允許選自其它家族。下文中Cunningham所述結(jié)合hGH的催乳素八突變體(prolactin octomutant)就屬于這一類型。在第三種實(shí)施方式中，上述雜交為區(qū)段性的雜交，例如形象化為包含由交替衍生自(a)脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素家族或(b)脊椎動(dòng)物催乳素家族的區(qū)段的雙雜交，其可起始于兩者中的任一者。區(qū)段的數(shù)目可為單數(shù)或雙數(shù)，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10。優(yōu)選含有不超過(guò)10個(gè)區(qū)段。在GH-衍生的區(qū)段中，參考激素是脊椎動(dòng)物GH，而在催乳素-衍生的區(qū)段中，參考激素則為脊椎動(dòng)物催乳素。優(yōu)選各區(qū)段的長(zhǎng)度至少具有10個(gè)相連的氨基酸。所述區(qū)段在長(zhǎng)度上可不等。在下文中Cunningham描述了數(shù)種具有形式為(GH-衍生)-(催乳素-衍生)-(GH衍生)的三個(gè)區(qū)段的GH/催乳素雜交體(或其突變體)。采用類似方式的區(qū)段雜交體可為GH/PL或PL/PRL雙雜交體或GH/PRL/PL三雜交體(在最后的情況下，規(guī)則是相鄰的區(qū)段衍生自不同的家族，不論是GH、PRL或PL)。
生長(zhǎng)激素-催乳素-胎盤催乳素家族生長(zhǎng)激素、胎盤催乳素和催乳素是同源蛋白，它們被認(rèn)為是從同一祖先分子發(fā)展而來(lái)。相信催乳素和生長(zhǎng)激素的分枝于約4億年前，因此在魚類中存在不同的催乳素和生長(zhǎng)激素。僅在哺乳動(dòng)物中觀察到胎盤催乳素，且已有假說(shuō)認(rèn)為靈長(zhǎng)類的PL是從生長(zhǎng)激素譜系進(jìn)化而來(lái)的，而非靈長(zhǎng)類的PL則源自催乳素。認(rèn)為hCS蛋白是從hGH通過(guò)基因復(fù)制而進(jìn)化得到的。在魚類中還存在生長(zhǎng)催乳素(somatolactin)，其序列介于催乳素和GH之間。
成熟的生長(zhǎng)激素、催乳素和胎盤催乳素通常包含190-200個(gè)殘基，其分子量為22,000-23,000道爾頓。然而，這些尺寸并未必需；例如，成熟鰈魚GH不超過(guò)173殘基長(zhǎng)。
這些蛋白質(zhì)的氨基酸序列太過(guò)類似而不能僅通過(guò)機(jī)率發(fā)生；以成熟hGH為詢問(wèn)序列進(jìn)行BlastP研究，采用默認(rèn)評(píng)分矩陣(Blosum62)和缺口罰分(11創(chuàng)建/1衍生)，且無(wú)低復(fù)雜性過(guò)濾，與人胎盤催乳素(prf 731144A)比對(duì)所得的E值為1e-106、9e-90，而與人催乳素(refNP 000939.1)比對(duì)則為6e-11。
從功能角度的考慮也證明生長(zhǎng)激素-胎盤催乳素-催乳素超家族的定義。即便也存在不同的胎盤催乳素受體(參見Freemark，J.Clin.Investig.，83883-9，1989年)，胎盤催乳素對(duì)催乳素受體的影響是顯著的。傳統(tǒng)上，GH受體是GH的特異性受體，而催乳素(亦稱促黃體激素)受體是催乳素和胎盤催乳素的特異性受體。然而，靈長(zhǎng)類的GH可以高親和力結(jié)合催乳素受體，而某些非人哺乳動(dòng)物胎盤催乳素則可結(jié)合于生長(zhǎng)素(somatogen)(GH)受體。還可參考GH和催乳素受體蛋白的結(jié)構(gòu)相似性。參見Goffin等人的《哺乳動(dòng)物中催乳素、生長(zhǎng)激素、胎盤催乳素和相關(guān)蛋白擴(kuò)展家族中序列與功能的關(guān)系》(″Sequence-Function RelationshipsWithin the Expanding Family of Prolactin，Growth Hormone，Placental Lactogen，and Related Proteins in Mammals″，Endocrine Revs.，17(4)385-410，1996年)；Nicoll等的《可與催乳素和生長(zhǎng)激素生物特性相關(guān)的結(jié)構(gòu)特性》(″StructuralFeatures of Prolactins and Growth Hormones that Can Be Related to TheirBiological Properties″，Endocrine Revs.，7(2)169-203，1986年)。
為了本申請(qǐng)的目的，GH-PRL-PL超家族由符合以下條件的所有蛋白質(zhì)組成當(dāng)如上所述通過(guò)BlastP與hGH(refNP000506.2的成熟部分)比對(duì)時(shí)，所得比對(duì)的E值小于(即優(yōu)于)e-06。
生長(zhǎng)激素(GH)是具有約191個(gè)氨基酸殘基的脊椎動(dòng)物蛋白質(zhì)家族，其氨基酸數(shù)目隨物種的不同而不同。其中存在4個(gè)半胱氨酸殘基和2個(gè)二硫橋?？傮w上可參見Harvey等的《生長(zhǎng)激素》(″Growth Hormone″，CRC Press1995)。從多種脊椎動(dòng)物物種中分離的生長(zhǎng)激素的氨基酸序列是高度保守的。在前述的BlastP研究中，成熟的hGH與許多其它數(shù)據(jù)庫(kù)中的一些GH比對(duì)的E值如下(描述了對(duì)各物種的最佳比對(duì))1e-106(Pan troglodyte)、3e-97(Caallithrix jacchus，普通狨猴)、3e-68(Balaenoptera borealis，長(zhǎng)須鯨；Delphinus delphis，普通海豚；Hippopotamusamphibius)、4e-68(Canis familiaris，狗；Sus scrofa domestica，豬)、2e-67(Musmusculus)、1e-66(Rattus norvegicus，褐家鼠；Oryctolagus cuniculus，家養(yǎng)兔；Cavia porcellus，豚鼠)、2e-65(Capra hircus，山羊；Giraffa camelopardalis，長(zhǎng)頸鹿；Bos taurus，牛)；3e-65(Ovis aries，家養(yǎng)綿羊)；4e-59(Crocodulusnovaeguineae)、4e-58(Chelonia mydas)、5e-58(Gallus gallus，雞)；2e-55(Tarsiussyrichta，菲律賓跗猴)(對(duì)于哺乳動(dòng)物而言相對(duì)較高的E值)；1e-53(Lepisosteusosseus，硬骨魚)；8e-08(Torpedo californica)。生長(zhǎng)催乳素最佳的得分是spP20362，E值為2e-18。最佳的(最低)E值是在詢問(wèn)序列和數(shù)據(jù)庫(kù)序列相同(或其中的一者包含另一者)的情況下獲得的；在最近以成熟的HGH為詢問(wèn)序列的研究中，最佳的E值是將成熟HGH與數(shù)據(jù)庫(kù)中的HGH前體(refNP000506.2)比對(duì)而得到的1e-106。
如果比對(duì)的E值較低，則比對(duì)得分相對(duì)于僅由偶然而發(fā)生的那些必然較高。將由評(píng)分矩陣指定的單個(gè)氨基酸對(duì)的得分加合并扣除對(duì)任何缺口的適當(dāng)缺口罰分來(lái)計(jì)算各比對(duì)的比對(duì)得分。僅在缺口導(dǎo)致整個(gè)比對(duì)得分凈改善的情況下，比對(duì)算法才引入缺口。在所述評(píng)分矩陣中，相同性趨于得到較高的分值，并由此可見高比對(duì)得分也趨于表征為高百分比的相同性。然而，由比對(duì)得分來(lái)評(píng)定的比對(duì)不一定與這些比對(duì)用百分相同性來(lái)評(píng)分時(shí)得到的順序一樣。
在BlastP中，將百分相同性計(jì)算為具有相同性的氨基酸數(shù)目，表示為″重疊″——配對(duì)區(qū)域(aligned region)長(zhǎng)度的百分比。該區(qū)域起始和終止于配對(duì)的氨基酸對(duì)(不必相同)，且可在一個(gè)或兩個(gè)序列中包含一個(gè)或多個(gè)缺口。當(dāng)一個(gè)序列中的一個(gè)或多個(gè)相鄰氨基酸不能與另一序列中的氨基酸配對(duì)時(shí)(可通過(guò)用空記號(hào)對(duì)它們各自進(jìn)行比對(duì)來(lái)標(biāo)記，例如在所述另一序列中加入連字號(hào))則產(chǎn)生了缺口。計(jì)算所得的重疊長(zhǎng)度是配對(duì)的數(shù)目與缺口長(zhǎng)度的總和。如果一個(gè)序列突出于另一序列，該突出段為終止缺口，位于重疊之外且不計(jì)入對(duì)百分相同性的計(jì)算中。
以下是人GH(refNP000506.2)與其它GH-PRL-PL超家族成員的BlastP百分相同性的例子人胎盤催乳素(85％，161/189)；鯨魚、海豚和河馬GH(67％，130/192，缺口3/192)；豬GH(67％，130/193，缺口3/192)；小鼠GH(65％，126/192，缺口3/192)；牛GH(66％，127/192，缺口3/192)；鱷魚GH(59％，113/190，缺口3/190)；雞GH(57％，110/190，缺口3/190)，敘利亞地鼠GH(62％，108/172，缺口2/172)；雀鱔(Lepisosteus osseus)GH(54％，102/186，缺口3/186)；日本鰈魚(27％，53/190，缺口8/190)；人催乳素(23％，45/191，缺口12/191)。
牛生長(zhǎng)激素與其它非靈長(zhǎng)類哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)激素的總百分相同性極高豬(92％)、羊(99％)和大鼠(87％)。Watahiki等(J.Biol.Chem.，264312，1989年)比較了鰈魚、黃獅魚(yellowtail)、鮪魚、鮭魚、雞、大鼠、豬、羊、牛和人生長(zhǎng)激素的序列。Watahiki在圖3中列出了在GH中保守的殘基和被預(yù)測(cè)為對(duì)表現(xiàn)生長(zhǎng)促進(jìn)活性有重要作用的殘基。他鑒別出了5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，并將其標(biāo)識(shí)為GD1-GD5。在這些保守結(jié)構(gòu)域中的突變更可能影響活性。
已知兩種GH的三維結(jié)構(gòu)，它們極為相似。豬GH是單結(jié)構(gòu)域蛋白，排列為四螺旋束，其中的螺旋具有反向平行(上-上-下-下)關(guān)系。這四個(gè)螺旋由7-34、75-87、106-127和152-183殘基組成。參見Abdel-Meguid等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 846434(1987)。人生長(zhǎng)激素的特征是通過(guò)環(huán)(35-71、93-105和129-154)連接的一束螺旋，由4個(gè)主要螺旋組成(9-34、72-92、106-128和155-184)。環(huán)1(位于螺旋1和2間)在38-47和64-70處包含小螺旋，而環(huán)2(位于螺旋2和3之間)的一個(gè)(小螺旋)位于94-100。對(duì)hGH螺旋1-4的參考是對(duì)所述主螺旋的參考，而非對(duì)小螺旋的參考。螺旋2在Pro-89處紐結(jié)。參見DeVos等，Science，255306-312(1992)。
在二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)法、序列比對(duì)和pGH和/或hGH的三維結(jié)構(gòu)知識(shí)的基礎(chǔ)上，確信其它GH也為4-螺旋蛋白。例如，牛生長(zhǎng)激素在氨基酸序列水平上與豬生長(zhǎng)激素有92％的同源性，而bGH的結(jié)構(gòu)已通過(guò)對(duì)豬生長(zhǎng)激素的兩條序列和結(jié)構(gòu)的研究而推導(dǎo)出。已報(bào)道將其4-α螺旋假定為氨基酸4-33、66-80、108-127和150-179。bGH的第三α螺旋被定義為氨基酸106-129。然而，應(yīng)注意的是該螺旋末端不如中央?yún)^(qū)域(氨基酸殘基109-126)的α螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)明顯。第三α螺旋的確切邊界可能不同于其它GH的邊界，這取決于α螺旋成為″末端″氨基酸的傾向。該構(gòu)象與Chen和Sonenberg(Biochemistry，162110，1977年)用Chou和Fasman(Biochemistry，13222，1974年)的方法預(yù)測(cè)的構(gòu)象是適度一致的(AA10-34、66-87、111-127、186-191)。關(guān)于確定bGH三維結(jié)構(gòu)的初期工作，請(qǐng)見Bell等人的J.Biol.Chem.，2608520-25(1985)。
生長(zhǎng)激素可具有相當(dāng)大的種間交叉反應(yīng)性。通常而言，傾向于″較高等的″生長(zhǎng)激素″活化較低等的″GH受體”，反之則不然。人GH在非人哺乳動(dòng)物中具有活性，而非人、非靈長(zhǎng)類GH則通常在人中不具有活性。牛GH在馬中具有活性(參見De Kock等，J.Endocrinol.，171(1)163-171(2001))。哺乳動(dòng)物和鳥類的GH在魚類中具有活性，參見Gill等的Biotechnology，3643(1985)，其中報(bào)道了重組雞和牛生長(zhǎng)激素促進(jìn)幼年大西洋鮭魚的生長(zhǎng)。增加非人GH與人GH相似性的突變將使其更可能對(duì)人GH受體具有活性。關(guān)于GH或其受體的物種特異性的結(jié)構(gòu)起源的研究，可參見Liu等人的《生長(zhǎng)激素在靈長(zhǎng)類中的分段式進(jìn)化以及人生長(zhǎng)激素受體物種特異性的出現(xiàn)》(″Episodic Evolution of Growth Hormone inPrimates and Emergence of the Species Specificity of Human Growth Hormonereceptor″，Mol.Biology & Evolution，17945-53，2001年)；Allan等人的《羊生長(zhǎng)激素受體中涉及激素結(jié)合和賦予物種特異性的新位點(diǎn)的鑒別》(″Identificationof Novel Sites in the Ovine Growth Hormone receptor Involved in BindingHormone and Conferring Species Specificity″，Eur.J.Biochem.，261(2)555-62，1999年)。
人胎盤催乳素與hGH的全序列相同性為85％，但其與hGH bp的結(jié)合卻要弱約2,000倍。W097/11178第100頁(yè)。關(guān)于胎盤催乳素的比較，參見Forsyth，Exp.Clin.Endocrinol.，102(3)244-51(1994)。
人催乳素具有199個(gè)殘基(23kDa蛋白質(zhì))，與人GH具有23％的相同性(BlastP)。已確定了人催乳素的3-D結(jié)構(gòu)；如所預(yù)期的，其具有4個(gè)形成上-上-下-下拓樸結(jié)構(gòu)的主螺旋，這與人生長(zhǎng)激素是相同的。其中也存在感興趣的差異。hPRL的第一延伸環(huán)丟失了在hGH相應(yīng)的環(huán)中存在的兩個(gè)小螺旋中的第一螺旋，而第二小螺旋與其hGH相似物相比角度發(fā)生了偏移。hPRL和hGH均具有連接主螺旋2和3的短環(huán)，但hPRL中的較短，且其中沒(méi)有小螺旋元件。最后，hPRL的N端要比hGH長(zhǎng)，且包含短二硫鍵連接的環(huán)。參見Keeler等的《人催乳素三級(jí)結(jié)構(gòu)和骨架動(dòng)力學(xué)》(″The Tertiary Structure and Backbone Dynamics of HumanProlactin″，J.Molec.Biol.，3281105-221，2003年)。在Keeler的圖1中，HGHGly-120與hPRL Gly-129對(duì)齊。已知hPRL的G129X突變體具有催乳素受體拮抗劑活性，參見下文。
生長(zhǎng)激素(促生長(zhǎng)素)受體hGH受體屬于造血系統(tǒng)來(lái)源的受體大家族，該家族中包括白介素-3和粒細(xì)胞集落刺激因子受體。關(guān)于人生長(zhǎng)激素受體的純化和表征請(qǐng)參見Leung等的Nature，330537-43(1987)。
hGH受體的胞外結(jié)構(gòu)域被命名為hGHbp。Cunningham等(1989)報(bào)道了hGH對(duì)hGHbp的親和力(Kd)為0.34nM。WO92/03478報(bào)道了在EDTA的存在下，hGH對(duì)hGHbp的親和力，其Kd為0.42nM，而ZnCl2存在下的親和力降低(KD為1.6nM)。還報(bào)道了hPRL對(duì)hGHbp的親和力極低(KD＞100,000nM，不論存在EDTA還是ZnCl2，參見表1)。hPL對(duì)hGHbp的親和力非常低(949.2nM，表13)，但不像hRPL那么低。
GH的3D結(jié)構(gòu)GH受體復(fù)合物hGH的3D結(jié)構(gòu)還已知hGHbp復(fù)合物(參見Wells和DeVos，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.，22329-51(1993)和DeVos等，Science，255306(1992))。這些研究者用X射線衍生法檢測(cè)了由hGH及其受體(hGHR)的胞外結(jié)構(gòu)域形成的復(fù)合物。該復(fù)合物的形式為hGH(hGHR)2；即，受體二聚化以與hGH相互作用。
hGH的第一受體結(jié)合區(qū)域(″位點(diǎn)1″)為凹穴，其主要由螺旋4暴露表面上的殘基形成，但同時(shí)也通過(guò)螺旋1的暴露殘基和連接螺旋1和2的區(qū)域中的殘基組成。第二受體結(jié)合區(qū)域(″位點(diǎn)2″)包括螺旋1和3的暴露側(cè)，且相對(duì)較平坦。螺旋3的作用在DeVos的圖5中很好地展示；復(fù)合物形成后溶劑對(duì)hGH E119周圍的趨近性顯著減低。作為包含對(duì)應(yīng)于bGH119X(或hGH120X)突變的GH突變體的GH拮抗劑顯示受到受體二聚化的干擾。
hGH的位點(diǎn)1殘基是H18、H21、Q22、F25、K41、Y42、L45、Q46、P61、S62、N63、E66、R167、K168、D171、K172、1175、R178、C182和C189。位點(diǎn)2的殘基是T3、14、L6、L9、N12、L15、r16、R19、Q22、Y103、N109、D116、D119、G120和T123。關(guān)于這些殘基和hGHbp間相互作用性質(zhì)的詳細(xì)描述，可參見美國(guó)專利5,506,107的表4和5。
根據(jù)hgh(hGHbp)2復(fù)合物的X射線結(jié)構(gòu)，兩個(gè)HGHbp在Ser201處彼此接觸。所以，可用hGHbp(S201C)-基質(zhì)來(lái)測(cè)試hGH變體僅對(duì)位點(diǎn)1的結(jié)合性。參見WO97/11178。
催乳素受體催乳素受體的胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域(AA 1-211)被命名為hPRLbp。它與hGHbp有約32％的相同性，參見WO90/04788第89頁(yè)。WO92/03478最早報(bào)道了(表1)EDTA存在下hPRL對(duì)hPRLbp的親和力，其Kd為2.1nM，而在ZnCl2存在下親和力降低(KD為2.6nM)。然而，表11中不含鋅時(shí)hPRL對(duì)hPRLbp的親和力號(hào)據(jù)稱為2.8nM。
人GH也結(jié)合于人催乳素受體。(參見Boutin等，Cell，5369(1988))。WO92/03478報(bào)道了EDTA存在下hGH對(duì)hPRLbp的親和力，其Kd為270nM，而在ZnCl2存在下親和力大幅上升(KD為0.033nM，即33pM)。在Ala單取代的hGH突變體H18A(370-4.5nM)、H21A(200-3nM)、E174A(360-12nM)以及D171A(ND-0.037nM)中也觀察到親和力提高。
hGH上針對(duì)催乳素受體的結(jié)合表位由螺旋1中部的決定簇(包括殘基F25和D26)、環(huán)狀區(qū)(包括158和R64)以及螺旋4的中央部分(包括K168mK172、E174和F176)構(gòu)成。參見WO90/04788第56頁(yè)。該部分重疊(但不等同于)hGH對(duì)hGH受體的表位。ZnCl2存在下不同hGH突變體對(duì)hPRLbp的結(jié)合親和力在表7-9中給出。WO92/03478的第13頁(yè)表明鋅對(duì)hGHhPRLbp復(fù)合物的結(jié)合由hGH殘基H18、H21和E174介導(dǎo)。
ZnCl2存在下hPL對(duì)hPRLbp的親和力為50pM。不含鋅時(shí)hPL析出。hPRLbp與hPL突變體D56E、M64R、E174A、M1791、D56E/M64R/M1791以及V41/D56E/M64R/M1791的親和力示于WO92/03478的表12中。
雜交蛋白和同源掃描遺傳突變Cunningham等(Science 2431330-1336，1989年)使用一種稱為同源掃描遺傳突變法(homologue-scanning mutagenesis)的技術(shù)來(lái)鑒定參與hGH與hGHbp結(jié)合的殘基。本質(zhì)上是用同源激素(pGH、hPL或hPRL)的相應(yīng)片段(根據(jù)Cunningham的序列比對(duì))置換所選的hGH多肽片段。該方法有效地創(chuàng)建出作為hGH與同源激素的雜交體的蛋白質(zhì)。應(yīng)注意的是Cunningham并不總是替換靶片段中的所有殘基。
通過(guò)比較這些突變GH、野生型hGH對(duì)克隆的肝hGH受體的結(jié)合親和力得出如下結(jié)論受體結(jié)合中涉及到hGH中的三段不連續(xù)多肽決定簇。它們位于NH2端、COOH端以及氨基酸殘基54和74之間的環(huán)內(nèi)。通過(guò)丙氨酸掃描遺傳突變技術(shù)進(jìn)一步對(duì)這些推定的結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析，該技術(shù)中，在整個(gè)所述區(qū)域中對(duì)丙氨酸殘基進(jìn)行了系統(tǒng)性取代(見下文)。
由Cunningham導(dǎo)入hGH的突變?nèi)缦滤?
前4列基于Cunningham等人的文獻(xiàn)(1989)，最后一列基于WO90/04788的表XVIII。w+hPRL對(duì)hGHbp親和力的數(shù)據(jù)也來(lái)自WO90/04788。w+hGH結(jié)合hGH bp的數(shù)據(jù)來(lái)自WO94/04788的表III。
第一次Ala掃描遺傳突變研究丙氨酸掃描遺傳突變由Cunningham和Wells(《通過(guò)丙氨酸掃描遺傳突變進(jìn)行hGH-受體相互作用的高分辨率圖譜分析》，″High-Resolution Mapping ofhGH-Receptor Interactions by alanine Scanning Mutagenesis″，Science 2841081，1989年)首次描述。從同源掃描遺傳突變所得結(jié)果的角度來(lái)看，他們的研究指向殘基2-19、54-75和167-191。位于hGH第10、58、64、68、172、174、175和176的氨基酸殘基在對(duì)GH受體的結(jié)合中顯示出重要性。然而，所測(cè)試的單個(gè)Ala取代突變的GH無(wú)一報(bào)道會(huì)抑制生長(zhǎng)。
基于丙氨酸掃描遺傳突變，將優(yōu)選用于置換hGH殘基F10、F54、E56、158、R64、Q68、D171、K172、E174、T175、F176、R178、C182和V185的氨基酸列于WO90/04788第52頁(yè)上的表IV中。這些殘基為丙氨酸取代對(duì)Kd產(chǎn)生大于4倍的影響的殘基。在同一參考文獻(xiàn)的表V中列出了丙氨酸取代對(duì)Kd產(chǎn)生小于2倍影響的殘基，而表VI中為具有有利效果的殘基。示出的表X建議替換hGH殘基中的以下AAS43、F44、H18、E65、L73、E186、S188、F191、F97、A98、N99、S100L101、V102、Y103、G104、R19、Q22、D26、Q29、E30和E33。
對(duì)hGH174的研究由于突變體E174A造成hGHhGHbp親和力的實(shí)質(zhì)性提高，對(duì)該位點(diǎn)中12個(gè)可選(alternative)取代進(jìn)行了活性測(cè)定。側(cè)鏈大小表現(xiàn)為決定親和力的主要因素。優(yōu)化的AA保留了Ala(0.075)，接下來(lái)是Ser(0.11)、Gly(0.15)、Gln(0.21)、Asn(0.26)、Glu(野生型，0.37)、His(0.43)、Lys(1.14)、Leu(2.36)和Tyr(2.9)。沒(méi)有表達(dá)E174D或E174R。參見WO92/03478中的表6。
第二次Ala掃描遺傳突變研究在第一次研究中未對(duì)第一小螺旋中的殘基K41、Y42、L45和Q46進(jìn)行評(píng)估，故隨后對(duì)其進(jìn)行了研究。Kd值列于美國(guó)專利5,534,617的表3中。WO97/11178的第106頁(yè)中記載″有效優(yōu)化親和力的起點(diǎn)是對(duì)相關(guān)接觸面進(jìn)行完全的丙氨酸掃描″。
雙突變體為了改變hGH/hPRL受體的優(yōu)選性(preference)這一目的制備了數(shù)種雙突變體。對(duì)于wt hGH，對(duì)hPRLr的結(jié)合為2.3nM，而對(duì)hGHr則為0.34。對(duì)于K168A/E174A，該數(shù)值為1950和0.09，而對(duì)于K172A/F176A，它們是～40,000和190。由此證明，這些雙突變體對(duì)于hGHr具有超過(guò)hPRLr的提高的優(yōu)選性。參見WO90/04788。
單取代影響的加合性WO90/04788的表XXI分析了不同單取代對(duì)hGH或hPRL受體結(jié)合影響的加合性。這些影響被表征為具有″明顯的加合性″。
螺旋-4a庫(kù)制備了突變體的組合庫(kù)，該庫(kù)中野生型hGH的殘基K172、E174、F176和R178被隨機(jī)化。這些殘基被靶向用于隨機(jī)遺傳突變，這是由于它們均位于或鄰接hGH的表面、通過(guò)Ala掃描遺傳突變顯示出對(duì)受體結(jié)合具有重要貢獻(xiàn)、位于容納螺旋4同一側(cè)兩個(gè)轉(zhuǎn)角的井狀結(jié)構(gòu)中、以及各自被已知hGH進(jìn)化變體中的至少一種氨基酸取代。參見WO92/09690的第32頁(yè)。通過(guò)對(duì)hGHbp的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合而選出的突變體是KSYR(0.06nM)、RSFR(0.10)、RAYR(0.13)、KTYK(0.16)、RSYR(0.20)、KAYR(0.22)、RFFR(0.26)、KQYR(0.33)、KEFR(野生型，0.34)、RTYH(0.68)、QRYR(0.83)、KKYK(1.1)、RSFS(1.1)和KSNR(3.1)，其中例如″KSYR″表示K172，S174，Y176和R178。結(jié)合最緊密的突變體(E174S、F176Y)的親和力高于野生型hGH約6倍。參見WO92/09690的表VII。
關(guān)于一些未選中的突變體序列(藉此說(shuō)明該庫(kù)的差異性)，可參見美國(guó)專利5,780,279的表VI。這些突變體應(yīng)具有比選出的突變體低的hGHbp親和力，但不必為完全不結(jié)合。
螺旋-4b庫(kù)制備了突變體的組合庫(kù)，該庫(kù)中突變的hGH(E174S、F176Y)的R167、D171、T175和1179發(fā)生隨機(jī)突變。WO92/09690的表XI顯示N、K、S、D、T、E和A均可在167位被接受(野生型＝R)；S、N和D于171位(野生型＝D)；T、A和S于175位(野生型＝T)；以及T、N、Q、I和L于179位(野生型＝I)。
基于用于編碼某些突變體的密碼子(NNS)，與這些突變體所期望的出現(xiàn)頻度相比，這些突變體在被選出的克隆中過(guò)度表現(xiàn)(over-represent)。這一過(guò)度表現(xiàn)可用標(biāo)準(zhǔn)偏差單位通過(guò)(觀察頻度-期望頻度)/標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示。在經(jīng)測(cè)序的56個(gè)克隆中，過(guò)度表現(xiàn)的突變體(得分至少為2.0個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差單位)為R167N(25.6sd)、R167K(4.1)、D171S(14.1)、D171(4.8)、D171N(4.1)、T175(29.1)、1179T(18.6)、1179N(4.1)。參見美國(guó)專利5,534,617的表4。最佳的庫(kù)成員為五突變體(R167D、D171S、E174S、F176Y、1179T)，其中相對(duì)于2個(gè)突變背景再進(jìn)行了3個(gè)新的突變，其對(duì)hGH受體的結(jié)合優(yōu)于野生型hGH約8倍。
螺旋-1庫(kù)制備了突變體的組合庫(kù)，該庫(kù)中野生型hGH的F10、M14、H18和H21發(fā)生隨機(jī)突變。在4輪的篩選后，分離出了一種四突變體(F10A、M14W、H18D、H21N)，其對(duì)受體的結(jié)合優(yōu)于野生型hGH約3倍(Kd為0.10nM)。在經(jīng)測(cè)序的68個(gè)克隆中，以下氨基酸在突變位點(diǎn)過(guò)度表現(xiàn)，其得分至少為2.0個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差單位F10A(12.0sd)、F10(10.4sd)、F10H(6.2sd)、M14W(11.1)、M14S(4.8)、M14Y(2.7)、M14N(2.7)、M14H(2.0)、H18D(18.8)、H18F(4.1)、H18N(3.4)、H21N(20.2)和H21(4.8)。參見美國(guó)專利5,534,617的表4。更普遍而言，WO92/09690的表VIII顯示了H、A、Y、L、I和F在10位均可被接受；G、W、T、N和S于14位；N、D、V、IS和F于18位；以及N、H、G和L于21位。
小螺旋-1庫(kù)制備了突變體的組合庫(kù)，該庫(kù)中野生型hGH小螺旋-1的位點(diǎn)K41、Y42、L45和Q46發(fā)生突變。結(jié)果示于美國(guó)專利5,534,617的表4中。對(duì)17個(gè)克隆進(jìn)行了測(cè)序。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)偏差標(biāo)準(zhǔn)得出中等優(yōu)選為K41R(3.7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差單位)；輕度優(yōu)選為Y42R(2.0sd)或Y42Q(2.0sd)；強(qiáng)烈優(yōu)選為L(zhǎng)45W(4.8sd)或野生型L45(4.5sd)；以及更強(qiáng)優(yōu)選為Q46W(7.6)。同樣觀察到的還有K41F(2.0sd)、Q46F(2.0sd)和Q46Y(2.0sd)。最佳的庫(kù)成員是克隆835.A6(411、42H、45W、46W)，具有超過(guò)野生型hGH4.5倍的提高的親和力。參見美國(guó)專利5,534,617的表5。
環(huán)-A庫(kù)制備了突變體的組合庫(kù)，該庫(kù)中野生型hGH的環(huán)A位點(diǎn)F54、E56、158和R4發(fā)生隨機(jī)突變。在經(jīng)測(cè)序的26個(gè)克隆中，過(guò)度表現(xiàn)的突變體是(至少2sd)F54P(14.1sd)、E56D(4.7)、E56W(4.7)、E56Y(2.5)、158(8.1)、158V(3.5)和R64K(22.8)。先前就已知在81％的克隆中發(fā)現(xiàn)的R64K突變體本身就可引起親和力3倍的提高。測(cè)得最佳的庫(kù)成員為四突變體(F54P、E56D、158T、R64K)，其親和力大于野生型hGH5.6倍。
組合庫(kù)的大致使用WO97/11178注釋到(第107頁(yè))理想地，應(yīng)該是對(duì)在同一遺傳突變步驟中彼此接觸的殘基進(jìn)行隨機(jī)化，從而使得這些殘基能得以共同改變。雖然這些共同改變使得非加合的多個(gè)取代影響的測(cè)定成為可能，但大多數(shù)改善是簡(jiǎn)單的加合影響。參見WO97/11178的第108頁(yè)。
非組合多取代突變體如美國(guó)專利5,534,617表6中所示，合成并測(cè)試以下多位點(diǎn)突變體亞聯(lián)合的各種聯(lián)合A＝F10H，M14G，H18N，H21NB＝F10A，M14W，H18D，H21N(0.10)C＝M14S，H18F，H21L(0.68)
D＝R167N，D171S，E174S，F(xiàn)176Y，1179T(0.04)E＝R167E，D171S，E174S，F(xiàn)176Y(0.04)F＝R167N，D171N，E174S，F(xiàn)176Y，1179T(0.06)852b＝K411，Y42H，L45W，Q46W，F(xiàn)54P，R64K(0.0079)制備了螺旋-1變體A、B或C與螺旋-4b變體D、E或F的聯(lián)合。變體A，以及聯(lián)合體AD、AE和AF形成了二硫化二聚體，因此沒(méi)有進(jìn)行進(jìn)一步研究。變體C也形成了二硫化二聚體，但CD、CE和CF未形成。不清楚是否制備了BE；沒(méi)有關(guān)于BE的參考。
這些進(jìn)行測(cè)試的聯(lián)合物以及它們的Kd值(nM)為BD(0.01)、CD(0.011)、CE(0.014)、BF(0.016)、CF(0.021)和852d(BD+852b)(0.0009)。請(qǐng)注意852d與野生型hGH相比具有15個(gè)亞取代的不同。
組合庫(kù)的聯(lián)合選擇已進(jìn)行了一些嘗試對(duì)螺旋-1和螺旋-4突變體的同時(shí)突變進(jìn)行組合研究。如果對(duì)螺旋-1中的4個(gè)殘基和螺旋-4中的4個(gè)殘基進(jìn)行突變以系統(tǒng)化地對(duì)該8個(gè)位點(diǎn)中各位點(diǎn)的所有20種可能的AA進(jìn)行研究，則意味著要制備包含1.1e12條DNA序列的庫(kù)，其通過(guò)NNS簡(jiǎn)并可編碼2.6e10個(gè)不同的多肽。在1991年時(shí)，要獲得大到足以確保代表所有變體的隨機(jī)噬菌粒庫(kù)(可能有e13個(gè)轉(zhuǎn)化子)是不可行的。
因此，通過(guò)將螺旋-1和螺旋-4b庫(kù)篩選中選擇的DNA群和未簡(jiǎn)并的DNA隨機(jī)連接(以使編碼序列完整)來(lái)構(gòu)建文庫(kù)，從而創(chuàng)建一個(gè)組合庫(kù)。在各供體群中將存在一定量的差異性。結(jié)果示于WO92/09690的表XIII-A中。也可參見WO97/11178的表7。
作為GH拮抗劑起作用的生長(zhǎng)激素第三α螺旋突變體作為GH拮抗劑起作用的hGH和bGH突變體是由Kopchick等首次鑒別出的。Kopchick等人揭示到bGH中的Gly119突變?yōu)锳rg(″G119R″)、Pro(″G119P″)、Lys(″G119K″)、Frp(″G119W″)或Leu(″G119L″)，或者h(yuǎn)GH中同源的Gly120突變?yōu)锳rg或Trp，會(huì)產(chǎn)生對(duì)脊椎動(dòng)物(尤其是哺乳動(dòng)物)具有生長(zhǎng)抑制活性的突變型蛋白(突變的蛋白質(zhì)或其肽片段)。
Kopchick等人揭示bGH突變體在轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)時(shí)使得小鼠的生長(zhǎng)率為0.57-1.0。小鼠生長(zhǎng)率與bGH類似物的血清水平呈負(fù)相關(guān)，即當(dāng)bGH類似物的血清水平上升，動(dòng)物的生長(zhǎng)率下降。同時(shí)，當(dāng)這些類似物在NIH-3T3-前脂肪細(xì)胞中表達(dá)時(shí)不會(huì)造成對(duì)前脂肪細(xì)胞分化的刺激，而天然GH將促進(jìn)該分化。事實(shí)上，這些類似物將對(duì)抗野生型GH促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化的能力。Kopchick等人將這些類似物稱為″功能性拮抗劑″。
Kopchick等人還產(chǎn)生了表達(dá)野生型hGH、hGH G120A、hGH G120R和hGHG120W之一的轉(zhuǎn)基因小鼠。表達(dá)hGH G120A的小鼠顯示出與表達(dá)野生型hGH的小鼠類似的生長(zhǎng)促進(jìn)表型。反之，在hGH中以R或W取代第120位的G，并使其隨后在轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)可導(dǎo)致動(dòng)物生長(zhǎng)率為0.73-0.96，其血清hGH水平與生長(zhǎng)表型呈負(fù)相關(guān)；即當(dāng)hGH 120類似物的血清水平提高時(shí)，生長(zhǎng)率下降。
遺傳技術(shù)(Genentech)研究者們已揭示了hGH的G120R突變體結(jié)合于hGHbp，其對(duì)hGHbp(S237C)的親和力Kd＝1.6nM，對(duì)hGHbp(S201C)的親和力為Kd＝2.7nM。在相同的試驗(yàn)中，野生型hGH與hGHbp(S201C)結(jié)合的KD為0.9nM。很重要的是要注意到當(dāng)將hGh和bGH根據(jù)常規(guī)接受的序列比對(duì)原則進(jìn)行比對(duì)時(shí)，bGH中第119位的甘氨酸與hGH第120位的甘氨酸對(duì)齊(即對(duì)應(yīng))。它們均位于第3α螺旋的中央部分。
優(yōu)選的生長(zhǎng)抑制突變體的特征是第三α螺旋表面拓樸圖像發(fā)生改變。在″野生型″牛生長(zhǎng)激素的第三α螺旋中存在表面裂縫或凹窩，它們起始于天冬氨酸-115，在甘氨酸-119處深陷，并終止于丙氨酸-122。在本部分引用的參考文獻(xiàn)中討論的突變體，不論保持野生型生長(zhǎng)促進(jìn)活性或不保持該活性的那些突變體，均符合生長(zhǎng)促進(jìn)活性需要存在所述縫隙或凹窩這一理論，如果用帶有較大側(cè)鏈的氨基酸“填充”該縫隙的中心，該突變型蛋白將抑制對(duì)象的生長(zhǎng)。
對(duì)于第119位的氨基酸，甘氨酸既是最小的氨基酸殘基，又是對(duì)α螺旋形成最不起作用的殘基。因此認(rèn)為可用任何其它氨基酸取代它而不使α螺旋喪失穩(wěn)定性，并同時(shí)填充上文所述的縫隙。所有測(cè)試的G119 bGH取代均導(dǎo)致了″小動(dòng)物″表型。這些取代為精氨酸(帶正電荷的大氨基酸)、脯氨酸(脂環(huán)族氨基酸)、賴氨酸(帶正電荷的大氨基酸)、色氨酸(大的芳香族氨基酸)和亮氨酸(非極性脂族大氨基酸)。
在hGH中，同源的甘氨酸位于第120位。用精氨酸或色氨酸取代導(dǎo)致拮抗劑的產(chǎn)生，然而hGH G120A保持了生長(zhǎng)促進(jìn)活性。因此，目前認(rèn)為如果需要拮抗劑活性，可用除丙氨酸(第二小的氨基酸)以外的任何氨基酸，優(yōu)選用至少與脯氨酸(已知可導(dǎo)致“小”動(dòng)物表型的最小取代氨基酸)一樣大的任何氨基酸取代在所有脊椎動(dòng)物GH中保守的該甘氨酸。
Kopchick等的″縫隙″理論建議對(duì)第115位進(jìn)行修飾。可用較大而不會(huì)破壞α螺旋的氨基酸取代第115位的天冬氨酸。該取代氨基酸的大小優(yōu)選大于天冬氨酸。組氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸這些氨基酸大體上均大于天冬氨酸。當(dāng)然，更為優(yōu)選的是His、Met、Leu和Trp，這是因?yàn)樗鼈兗婢吡梭w積大和具有合理強(qiáng)度的α螺旋傾向性的優(yōu)點(diǎn)。然而應(yīng)注意的是Glu是所有氨基酸中最強(qiáng)的α-螺旋形成物。bGH的D 115A突變體不是GH拮抗劑，但丙氨酸小于天冬氨酸，所以不能用來(lái)證明用較大氨基酸取代Asp115的價(jià)值。
對(duì)僅在對(duì)應(yīng)于bGH119的位點(diǎn)、或也在對(duì)應(yīng)于bGH115和/或119的位點(diǎn)進(jìn)行的所有可能的氨基酸取代的效果進(jìn)行系統(tǒng)篩選是可能的。如果與其它突變(例如在第115和122位)結(jié)合，G119A有可能會(huì)導(dǎo)致″小″表型。因此，可對(duì)所有庫(kù)成員均包含突變G119A且位點(diǎn)115和122各自在20種可能的氨基酸中變化的組合庫(kù)進(jìn)行篩選。
如果需要的化，這種方法還可延展到第三α螺旋中的其它氨基酸位置。對(duì)于篩選，尤為優(yōu)選的氨基酸是空間上與bGH的Gly119最鄰近的6個(gè)氨基酸，即Ala122、Leu123、IIe120、Leu116、Asp115和Glu118。對(duì)位點(diǎn)119以及這6個(gè)相鄰位點(diǎn)中所有可能突變效果的篩選將需要一個(gè)包含207個(gè)成員的庫(kù)。如果不能制備這樣的庫(kù)，則可建立19個(gè)獨(dú)立的庫(kù)，它們特征為各自以具體的bGH G119X為背景突變，并在6個(gè)相鄰位點(diǎn)中進(jìn)行隨機(jī)化(每個(gè)庫(kù)有206個(gè)不同的庫(kù)成員)。
除了被認(rèn)為是賦予所希望的生長(zhǎng)抑制活性所必需的對(duì)應(yīng)于bGH 119位點(diǎn)的突變，附加的突變也可能使其生長(zhǎng)抑制活性或其它拮抗活性保持完整。這些突變的形式可為多肽非必需區(qū)域中的單個(gè)或多個(gè)取代、缺失或插入。例如，如果取代不破壞α螺旋，則可在α螺旋中改變另一氨基酸。此類取代優(yōu)選用具有類似大小和極性的氨基酸取代某一氨基酸。對(duì)主突變位點(diǎn)119側(cè)翼的氨基酸進(jìn)行修飾以提高該序列α螺旋傾向性可能是有利的，尤其是在第119位的突變預(yù)期會(huì)破壞該螺旋時(shí)。
GH拮抗活性不僅在這些單一取代的突變中得到證實(shí)，在多取代突變中也得到證實(shí)。由Kopchick等進(jìn)行的首次此類研究是bGH突變體E117L/G119R/A122D，它抑制了轉(zhuǎn)基因小鼠的生長(zhǎng)。在bGH突變體E117/G119R、E111L/G119W、E111L/G119W/L121R/M124K、E111L/G119W/R125L和E111L/G119W/L121R/M124K中觀察到了小鼠L細(xì)胞分泌突變蛋白質(zhì)。
B2024和B2036GHA突變體根據(jù)之前進(jìn)行的突變分析，挑選出受到特別關(guān)注的兩種hGH突變體。B2024突變體的特征為發(fā)生H18A、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、G120K、K168A和E174A突變。B2036突變體的特征是發(fā)生H18D、H21N、G120K、R167N、K168A、D171S、K172R、E174S和l179T突變。在這兩種情況下，黑體字(表示的)突變賦予拮抗活性，而其它突變則促進(jìn)“位點(diǎn)1”結(jié)合于hGH受體。參見WO 97/11178。
B036突變體可與前述的852d GH促效突變體相比。省略了852d的R64K突變以保護(hù)結(jié)合位點(diǎn)1的殘基不被PEG化。類似地在B2036中加入K168A和K172R以減少位點(diǎn)1的PEG化位點(diǎn)數(shù)。從B2036中省略了852d的某些突變，因?yàn)樗鼈儍H對(duì)親和力進(jìn)行了中等的增強(qiáng)，而它們的省略被認(rèn)為可減低對(duì)人的抗原性。根據(jù)這一理論還在B2024突變體中省略了其它的突變。通過(guò)逆轉(zhuǎn)G120突變，B2036和B2024均可轉(zhuǎn)換為促效劑。
在以細(xì)胞為基礎(chǔ)的拮抗活性分析中，未PEG化的B2036的IC50為0.19ug/ml，而PEG化形式(PEG-4/5-B2036)的B2036的IC50為13.1ug/ml。后來(lái)顯示另一種PEG化形式——PEG(20,000)-B2036的IC50為0.25ug/ml。參見W097/11178的第135頁(yè)。在恒河猴中已顯示B2036的PEG化和非PEG化形式均可降低IGF-1水平。WO97/11178的第136頁(yè)。(總體上可參見，Ross等，JCE，2001，86卷，第1716-1723頁(yè)中關(guān)于PEG化生長(zhǎng)激素及其結(jié)合的討論)。
化學(xué)修飾(包括PEG化)的GH促效劑和拮抗劑為了降低免疫原性和/或提高半衰期，可在GH促效劑和拮抗劑的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基(例如賴氨酸)上偶聯(lián)上多元醇。參見WO93/00109。適宜的多元醇包括但不限于在一個(gè)或多個(gè)羥基位置被化學(xué)基團(tuán)(例如1-4個(gè)碳原子的烷基)取代的那些多元醇。通常，所述多元醇為聚亞烷基二醇，例如聚乙二醇(PEG)。將PEG偶聯(lián)到hGH(或hGH突變體)上的過(guò)程稱為PEG化，但該過(guò)程也可用于偶聯(lián)其它多元醇。所述PEG的分子量?jī)?yōu)選為500-30,000道爾頓，尤為優(yōu)選平均分子量為5,000D。
該過(guò)程優(yōu)選使得2-7，更優(yōu)選使得4-6個(gè)PEG分子與每一hGH分子(或突變體)偶聯(lián)。最終的組合物可為同質(zhì)的(即所有分子在相同的PEG化位點(diǎn)載有同樣數(shù)量的PEG)或異質(zhì)的(即偶聯(lián)物與偶聯(lián)物間的PEG數(shù)量或附著PEG的位置不同)。
優(yōu)選的反應(yīng)條件是偶聯(lián)物不破壞位點(diǎn)1結(jié)合活性。同樣，如果偶聯(lián)物將被用作GH促效劑，則該偶聯(lián)物不應(yīng)破壞位點(diǎn)2的結(jié)合活性?？傮w上參見WO97/11178。應(yīng)注意的是上文所述的G120K突變提供了附加的PEG化位點(diǎn)。
催乳素突變體基于上文所述的數(shù)據(jù)，Cunningham等(Science，2471461，1990年3月11日)設(shè)計(jì)了一種人催乳素八突變體，該突變體對(duì)hGHbp的結(jié)合(Kd為2.1nM)比野生型人催乳素(Kd＞40,000)強(qiáng)超過(guò)10,000倍。這-hPRL八突變體對(duì)hGHbp的結(jié)合強(qiáng)度為野生型hGH(Kd為0.34nM)的1/6，但與hGH僅有26％的全序列相同性。八突變體的特征為發(fā)生H171D、N175T、Y176F、K178R、E174A、E62S、D63N和Q66E突變(hGH標(biāo)號(hào)，Cunningham hGHhPRL比對(duì))。附加的突變L1791不改變親和力。WO90/04788提出了用V14M和H185V突變進(jìn)一步提高親和力的可能性，參見第113頁(yè)。
通過(guò)比較hGH和hPL進(jìn)行的突變研究在用Ala掃描遺傳突變鑒定為構(gòu)成hGH的hGHr結(jié)合表位的三個(gè)區(qū)域(hGH殘基4-14、54-74、171-185)中，hPL僅在如下7個(gè)位點(diǎn)不同于hGHP2Q、14V、N12H、R16Q、E56D、R64M和l179M，其中例如，″P2Q″是指第2位的脯氨酸在比對(duì)hPL的對(duì)應(yīng)AA被Q所取代。在hGH中對(duì)這7個(gè)位點(diǎn)均進(jìn)行了Ala掃描，4種Ala取代(14A、E56A、R64A和l179A)使得結(jié)合活性降低了2倍或更多。
hGH單取代突變體l179M僅降低了hGH親和力1.7倍(相比較于l179A的2.7倍)。R64A和R64M突變體均導(dǎo)致親和力下降20倍。經(jīng)證實(shí)hGH雙突變體E56D/R64M的親和力總體上降低了30倍。
胎盤催乳素突變體野生型hPL結(jié)合hGHbp(S201C)的親和力為(KD)1800nM，而野生型hGH結(jié)合相同靶標(biāo)的親和力則為1.4nM。突變體hPL(0274)的特征是發(fā)生10Y、14E、18R、21G突變，其結(jié)合hGHbp(S201C)的親和力為1.1nM，即高于野生型hGH的親和力。參見WO97/11178第101頁(yè)的表9。
WO90/04788的第116頁(yè)中指出hPL的雙突變體D56E、M64R大大增強(qiáng)了其與hGH受體的結(jié)合親和力，同時(shí)還提出其它修飾體M1791和V41。hPL的G120R變體抑制由hGH刺激的轉(zhuǎn)染了hPRL受體的FDC-P1細(xì)胞生長(zhǎng)。G120R-hPL的IC50約比G120R-hGH高8倍。參見Fuh & Wells，J.Biol.Chem.，27013133(1995)。
除了生長(zhǎng)激素超家族的蛋白質(zhì)之外，還具體包含了所有本文所述的肽/多肽/蛋白質(zhì)的變體。因此，可對(duì)任何位點(diǎn)的任何氨基酸通過(guò)缺失/插入/突變進(jìn)行修飾。這些變體可作為糖基化基序的補(bǔ)充或一部分。
關(guān)于藥物遞送/乳化用所需的基序標(biāo)記疏水性或兩親性小蛋白質(zhì)以使得藥物乳化。例子包括但不限于人血清白蛋白，包括其各結(jié)構(gòu)域。當(dāng)然，可根據(jù)本發(fā)明制備帶有糖組件的hSA，用于任何目的或用途，而不僅僅為了藥物遞送/乳化的目的。
具體包含了以下經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)1)在C端或N端用(Ser-Hyp)n修飾的人生長(zhǎng)激素，其中n約為約1-20，或約2-18，或約4-16，或約6-14，或約8-12，或約10；2)在C端或N端用(Ser-Hyp)n修飾的人催乳素，其中n約為1-20，或約2-18，或約4-16，或約6-14，或約8-12，或約10；3)在C端或N端用(Ser-Hyp)n修飾的人胎盤催乳素，其中n約為1-20，或約2-18，或約4-16，或約6-14，或約8-12，或約10；4)在C端或N端用(Ser-Hyp)n修飾的干擾素-2-α，其中n約為1-20，或約2-18，或約4-16，或約6-14，或約8-12，或約10；以及5)在C端或N端用(Ser-Hyp)n修飾的胰島素，其中n約為1-20，或約2-18，或約4-16，或約6-14，或約8-12，或約10。
在某些實(shí)施方式中，N端″插入″發(fā)生在成熟或循環(huán)形式的各種激素的N端。這種插入位置對(duì)于存在于血流中的蛋白激素而言可能是所希望的，這些蛋白激素以氨基末端分泌肽的形式產(chǎn)生，而該分泌肽在分泌過(guò)程中被切割。
除了本文所述的具體蛋白質(zhì)，還可根據(jù)本發(fā)明表達(dá)抗體(包括單抗和人源化單抗)。例如，可根據(jù)本發(fā)明制備針對(duì)生長(zhǎng)激素或生長(zhǎng)激素受體的糖基化抗體。
在植物中的表達(dá)重組基因在植物細(xì)胞中表達(dá)，所述細(xì)胞為例如懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，包括但不限于，BY2煙草細(xì)胞。也可在一些完整的植物宿主和有機(jī)體中獲得表達(dá)，包括但不限于無(wú)脊椎動(dòng)物、植物、海綿動(dòng)物、細(xì)菌、真菌、藻類、古細(xì)菌。
在某些實(shí)施方式中，表達(dá)構(gòu)建物/質(zhì)粒/重組DNA包含啟動(dòng)子。不希望本發(fā)明為具體的啟動(dòng)子所限制。任何可控制操作性連接的、編碼至少部分本發(fā)明的核酸序列的表達(dá)的啟動(dòng)子序列都包含在本發(fā)明的范圍中。啟動(dòng)子包括但不限于細(xì)菌、病毒和植物來(lái)源的啟動(dòng)子。細(xì)菌來(lái)源的啟動(dòng)子包括但不限于章魚堿合酶啟動(dòng)子、胭脂堿合酶啟動(dòng)子(nopaline synthase promotor)和其它源自天然Ti質(zhì)粒的啟動(dòng)子。病毒啟動(dòng)子包括但不限于花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S和19S RNA啟動(dòng)子、農(nóng)桿菌的T-DNA啟動(dòng)子。植物啟動(dòng)子包括但不限于核酮糖-1，3-二磷酸羧化酶小亞單位啟動(dòng)子、玉米泛素啟動(dòng)子、菜豆素啟動(dòng)子、E8啟動(dòng)子和Tob7啟動(dòng)子。
本發(fā)明不限制用于控制感興趣的核酸序列表達(dá)的啟動(dòng)子的數(shù)量。可使用任何數(shù)量的啟動(dòng)子，只要能控制感興趣的核酸序列以所需的方式表達(dá)。此外，可根據(jù)是要在整棵植物中表達(dá)或是在所選的植物組織中(例如根、葉、果實(shí)等)局部表達(dá)的需要來(lái)控制所選的啟動(dòng)子。例如，已知在花中具有活性的啟動(dòng)子(Benfy等(1990)Plant Cell 2849-856)。
可通過(guò)多種方法完成植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其中的實(shí)例，包括例如，顆粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(參見例如，美國(guó)專利5,584,807，納入本文作為參考)；用農(nóng)桿菌菌株進(jìn)行感染，所述農(nóng)桿菌菌株含有用于隨機(jī)整合(美國(guó)專利4,940,838，納入本文作為參考)或靶向整合(美國(guó)專利5,501,967，納入本文作為參考)入植物細(xì)胞基因組的外源DNA；電子注射法(Nan等，1995年，在《農(nóng)業(yè)和林業(yè)中的生物技術(shù)》，″Biotechnology in Agriculture and Forestry″Ed.Y.P.S.Bajaj，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，第34卷145-155；Griesbach，1992年，HortScience 27620)；用脂質(zhì)體、溶酶體、細(xì)胞、小細(xì)胞或其它具有可融合脂質(zhì)表面的小體進(jìn)行融合(Fraley等，1982年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 791859-1863；聚乙二醇(Krens等(1982)Nature 29672-74)；提高自由DNA攝入的化學(xué)劑；用病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)化；等等。
術(shù)語(yǔ)用細(xì)菌″感染的″和″感染″是指在一定條件下將靶標(biāo)生物樣品(例如細(xì)胞、組織等)與細(xì)菌共孵育，以使得包含在細(xì)菌中的核酸導(dǎo)入到靶標(biāo)生物樣品的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中。
術(shù)語(yǔ)″農(nóng)桿菌″是指土生的、革蘭氏陰性、桿狀、植物致病性細(xì)菌，其可導(dǎo)致冠癭。術(shù)語(yǔ)″農(nóng)桿菌″包括但不限于根癌農(nóng)桿菌(Agtobacterium tumefaciens，其通常在受感染植物中導(dǎo)致冠癭)菌株和發(fā)根土壤桿菌(Agtobacteriumrhizogenes，其通常在受感染植物中導(dǎo)致毛狀根病)。用農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞通常使得受感染的細(xì)胞產(chǎn)生冠癭堿(例如胭脂堿、農(nóng)桿堿、章魚堿等)。因此，導(dǎo)致產(chǎn)生胭脂堿的農(nóng)桿菌菌株(例如，LBA4301、C58、A208株)被稱為″胭脂堿型″農(nóng)桿菌；導(dǎo)致產(chǎn)生章魚堿的農(nóng)桿菌菌株(例如，LBA4404、Ach5、B6株)被稱為″章魚堿型″農(nóng)桿菌；而導(dǎo)致農(nóng)桿堿產(chǎn)生的農(nóng)桿菌菌株(例如，EHA105、EHA101、A281株)被稱為″農(nóng)桿堿型″農(nóng)桿菌。
術(shù)語(yǔ)″轟擊″、″轟擊法″和″生物轟擊″是指使顆粒向靶標(biāo)生物樣品(例如細(xì)胞、組織等)加速以在靶標(biāo)生物樣品中細(xì)胞的細(xì)胞膜上造成創(chuàng)傷和/或使得所述顆粒進(jìn)入靶標(biāo)生物樣品的一種方法。本領(lǐng)域中已知用于生物轟擊的方法(例如，美國(guó)專利5,584,807，其內(nèi)容納入本文作為參考)，并可市售獲得(例如，氦氣驅(qū)動(dòng)的微粒加速器(PDS-1000/He)(BioRad)。
當(dāng)術(shù)語(yǔ)″微創(chuàng)″用于植物組織時(shí)是指在該組織中引入微觀的創(chuàng)傷。可通過(guò)例如顆?；蛏镛Z擊獲得微創(chuàng)。
可根據(jù)本發(fā)明通過(guò)葉綠體遺傳工程法對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，該方法在本領(lǐng)域中有記敘。用于葉綠體遺傳工程法的方法可按以下文獻(xiàn)的描述進(jìn)行，例如美國(guó)專利6,680,426和公開的美國(guó)申請(qǐng)2003/0009783、2003/0204864、2003/0041353、2002/0174453、2002/0162135，各文獻(xiàn)的內(nèi)容納入本文作為參考。
在本發(fā)明中可使用多種宿主細(xì)胞，包括真核和原核細(xì)胞。并不希望將本發(fā)明限制在用于表達(dá)本發(fā)明人工合成基因的宿主細(xì)胞中。通常，本發(fā)明涉及植物。如本文所用，″植物″包含任何光能自養(yǎng)的有機(jī)體，包括藍(lán)-綠藻類。還特別包含的是綠藻、紅藻和褐藻類。
可作為宿主細(xì)胞的植物包括維管類和無(wú)維管類植物。無(wú)維管類植物包括但不限于苔蘚植物，其進(jìn)一步包括但不限于苔蘚屬(蘚門)(mosses(Bryophyta))、獐耳細(xì)辛屬(苔門)(liverworts(Hepaticophyta))和金魚藻屬(角苔門)(hornworts(Anthocerotophyta))。維管類植物包括但不限于較低級(jí)(例如，分散的孢子)維管植物，例如石松門(Lycophyta)(club mosses)，包括石松(Lycopodiae)、卷柏(Selaginellae)和水韭(Isoetae)；問(wèn)荊(horsetails)或木賊(equisetum)(楔葉植物門，Sphenophyta)；帚蕨(whisk ferns)(裸蕨門，Psilotophyta)；和蕨類(ferns)(真蕨門，Pterophyta)。
維管類植物包括但不限于i)古種子蕨類植物(fossil seed fern，蕨類植物門，Pteridophyta)；ii)裸子植物(種子不被果實(shí)保護(hù))，例如蘇鐵門(Cycadophyta，蘇鐵)、松柏門(Coniferophyta，松柏，例如松樹、云杉、冷杉、鐵杉、紫杉)、銀杏門(Ginkgophyta，例如銀杏)、麻黃門(Gnetophyta，例如麻黃、山扁豆和百歲葉)；和iii)被子植物(開花植物-種子受到果實(shí)保護(hù))，其中包括被子植物門(Anthophyta)，進(jìn)一步包括雙子葉(雙子葉植物)和單子葉(單子葉植物)?？筛鶕?jù)本發(fā)明使用的具體植物宿主細(xì)胞包括但不限于豆科植物(例如，大豆)和茄科植物(例如，煙草、馬鈴薯等)。其它包含在本發(fā)明范圍內(nèi)的細(xì)胞是綠藻綱、衣滴蟲目、團(tuán)藻蟲屬(Chlamydomonas，Volvox，duckweed)的浮萍(Lemna)。
本發(fā)明不限于天然的植物細(xì)胞。所有來(lái)源的植物組織均包含在其中。在一個(gè)實(shí)施方式中，選做載體轉(zhuǎn)化靶標(biāo)的植物組織可再生植物，其中所述載體能夠表達(dá)本發(fā)明序列。術(shù)語(yǔ)″再生″如本文所用，是指由一個(gè)植物細(xì)胞、一群植物細(xì)胞、部分植株或植株的碎片(例如獲自種子、原生質(zhì)體、愈傷組織、原胚體樣小體或部分器官)長(zhǎng)成整棵植株。此類組織包括但不限于種子。開花植物的種子由胚芽、種皮和儲(chǔ)藏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成。當(dāng)完全形成時(shí)，胚芽通常由包含一片或兩片子葉的子葉下軸-根軸以及位于芽尖和根尖的頂端分生組織組成。大部分雙子葉植物的子葉是肉質(zhì)的，并含有種子儲(chǔ)存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在其它雙子葉植物和大部分單子葉植物中，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)儲(chǔ)存在胚乳，而子葉的功能則是吸收由所述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化得到的更為簡(jiǎn)單的化合物。
可從經(jīng)轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體中再生以下植物屬例子中的品種草莓屬(Fragaria)、睡蓮屬(Lotus)、苜蓿屬(Medicago)、驢食豆屬(Onobrychis)、車軸草屬(Trifolium)、胡蘆巴屬(Trigonella)、虹豆屬(Vigna)、柑橘屬(Citrus)、亞麻屬(Linum)、老鸛草屬(Geranium)、木薯屬(Manihot)、胡蘿卜屬(Daucus)、擬南芥屬(Arabidopsis)、蕓苔屬(Brassica)、蘿卡屬(Raphanus)、芥屬(Sinapis)、顛茄屬(Atropa)、辣椒屬(Capsicum)、莨菪屬(Hyoscyamus)、番茄屬(Lycopersicon)、煙草屬(Nicotiana)、茄屬(Solanum)、牽?；▽?Petunia)、毛地黃屬(Digitalis)、馬喬蓮屬(Majorana)、Ciohorium、向日葵屬(Helianthus)、萵苣屬(Lactuca)、雀麥屬(Bromus)、天門冬屬(Asparagus)、金魚草屬(Antirrhinum)、Hererocallis、龍面花屬(Nemesia)、天竺葵屬(Pelargonium)、黍?qū)?Panicum)、狼尾草屬(Pennisetum)、毛茛屬(Ranunculus)、千里光屬(Senecio)、喇叭舌屬(Salpiglossis)、黃瓜屬(Cucumis)、Browaalia、大豆屬(Glycine)、黑麥草屬(Lolium)、Zea、小麥屬(Triticum)、蜀黍?qū)?Sorghum)和曼陀羅屬(Datura)。
關(guān)于由轉(zhuǎn)基因原生質(zhì)體得來(lái)的轉(zhuǎn)基因植物的再生，首先要提供經(jīng)轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體的懸液或含有經(jīng)轉(zhuǎn)化的外植體(explants)的佩特里氏培養(yǎng)皿。形成愈傷組織，并可從愈傷組織中誘導(dǎo)出芽并隨后生根?；蛘?，可在愈傷組織中誘導(dǎo)體細(xì)胞胚芽的形成。這些體細(xì)胞胚芽象天然的胚芽一樣發(fā)芽以形成植物。培養(yǎng)基通常會(huì)含有各種氨基酸和植物激素，例如植物生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素。在培養(yǎng)基中加入谷氨酸和脯氨酸是有利的，尤其是該品種為玉米和苜蓿時(shí)。有效再生將取決于培養(yǎng)基、基因型和培養(yǎng)史?？山?jīng)驗(yàn)性地控制這三種變量以獲得重現(xiàn)性的再生。
也可從培養(yǎng)的細(xì)胞或組織中再生植物。已顯示能從經(jīng)轉(zhuǎn)化的個(gè)體細(xì)胞中再生并獲得轉(zhuǎn)基因的整個(gè)植株的雙子葉植物包括例如蘋果(Malus pumila)、黑莓(Rubus)、黑莓/覆盆子雜交體(Rubus)、紅覆盆子(Rubus)、胡蘿卜(Daucus carota)、花椰菜(Brassica oleracea)、芹菜(Apium graveolens)、黃瓜(Cucumis sativus)、茄子(Solanum melongena)、萵苣(Lactucasativa)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、杏仁(rape)(Brassica napus)、野生大豆(Glycine canescens)、草莓(Fragaria xananassa)、番茄(Lycopersicon esculentum)、胡桃(Juglans regia)、甜瓜(Cucumismelo)、葡萄(Vitis vinifera)和芒果(Mangifera indica)。已顯示能從經(jīng)轉(zhuǎn)化的個(gè)體細(xì)胞中再生并獲得轉(zhuǎn)基因的整個(gè)植株的單子葉植物包括例如水稻(Oryza sativa)、黑麥(Secale cereale)和玉米。
此外，也已在以下植物中觀察到可從細(xì)胞(不必為經(jīng)轉(zhuǎn)化的)再生整個(gè)植株杏(Prunus armeniaca)、蘆筍(Asparagus officinalis)、香蕉(hybrid Musa)、大豆(Phaseolus vulgaris)、櫻桃(hybrid Prunus)、葡萄(Vitis vinifera)、芒果(Mangiferaindica)、甜瓜(Cucumis melo)、赭石(Abelmoschus esculentus)、洋蔥(hybridAllium)、柑橘(Citrus sinensis)、木瓜(Carrica papaya)、桃(prunus persica)、梅(Prunus domestica)、梨(Pyrus communis)、菠蘿(Ananas comosus)、西瓜(Citrullusvulgaris)和小麥(Triticum aestivum)。
將再生的植物轉(zhuǎn)移到標(biāo)準(zhǔn)的土壤條件中，并以常規(guī)的方式種植。當(dāng)表達(dá)載體穩(wěn)定整合入再生的轉(zhuǎn)基因植物中后，可通過(guò)營(yíng)養(yǎng)體繁殖或有性雜交將其轉(zhuǎn)移到其它植物中。例如，在營(yíng)養(yǎng)體繁殖的農(nóng)作物中，通過(guò)進(jìn)行插條或組織培養(yǎng)技術(shù)使成熟的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行繁殖從而產(chǎn)生多株相同的植物。在種子繁殖的農(nóng)作物中，成熟的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行自交產(chǎn)生純合近交系(inbred)植株，該植株可通過(guò)孟德爾遺傳將轉(zhuǎn)移基因傳遞到其后代。該近交植株產(chǎn)生含有感興趣核酸序列的種子。可種植這些種子以得到可產(chǎn)生所需多肽的植物。也可用所述近交的植株來(lái)產(chǎn)生新的雜合體，通過(guò)使其與其它近交的植株雜交產(chǎn)生新雜合體。
不希望本發(fā)明被僅限于某些植物類型。單子葉和雙子葉植物都包含于其中。單子葉植物包括草、百合、鳶尾、蘭、蒲草、棕櫚、玉米(例如谷物)、稻、大麥、小麥和所有的草類。雙子葉植物包括幾乎所有常見的樹種和灌木(除了對(duì)照)和許多草本植物(非木本植物)。
番茄培養(yǎng)物是作為被羥基化和糖基化的重復(fù)HRGP組件的受體的例子之一。該培養(yǎng)物以高產(chǎn)率產(chǎn)生易于從完整細(xì)胞表面洗脫的細(xì)胞表面HRGP，它們具有植物特有的翻譯后加工所需的酶-HRGP脯氨酰羥化酶、羥脯氨酸O-糖基轉(zhuǎn)移酶和其它用于建立絡(luò)合多糖側(cè)鏈的特異性糖基轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明序列的其它受體包括但不限于煙草培養(yǎng)細(xì)胞和植株，例如煙草BY 2(亮黃2)。
簡(jiǎn)而言之，本發(fā)明的表達(dá)策略可用于植物中，例如完整的單子葉植物和雙子葉植物、裸子植物、蕨類、苔蘚植物、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物和藻類等，以從不同的有機(jī)體中表達(dá)蛋白質(zhì)，例如人和其它哺乳動(dòng)物和/或脊椎動(dòng)物、無(wú)脊椎動(dòng)物、植物、海綿動(dòng)物、細(xì)菌、真菌、藻類、古細(xì)菌、地球上潛在的任何有機(jī)體。
應(yīng)用根據(jù)具體表達(dá)的肽/多肽/蛋白質(zhì)，包含了產(chǎn)品的多種用途。如果表達(dá)的產(chǎn)物包含綠色熒光蛋白，例如包含該產(chǎn)物的產(chǎn)品或細(xì)胞可用于熒光篩選分析中。如果該產(chǎn)物是生物活性的，例如可將該表達(dá)的產(chǎn)物用作受體拮抗劑或促效劑，可在體外和體內(nèi)使用。體外的應(yīng)用包括，例如用于篩選分析。體內(nèi)應(yīng)用包括但不限于基于該化合物的促效或拮抗活性，用該化合物對(duì)人類或其它動(dòng)物進(jìn)行治療。
針對(duì)疾病而言，如本文所用的術(shù)語(yǔ)″治療″的含義很廣泛，不限于治愈疾病的方法。術(shù)語(yǔ)″治療″包括用于減輕疾病的一種或多種病理影響或癥狀或減慢一種或多種該病理影響或癥狀發(fā)展速度的任何方法。
雖然可根據(jù)本發(fā)明制備的所有肽/多肽/蛋白質(zhì)的所有用途的描述受到了篇幅的限制，但是將參考生長(zhǎng)激素具體地描述這些用途的例子。給予本文所描述的生長(zhǎng)激素可用于治療人或其它動(dòng)物的生長(zhǎng)激素不足，所述動(dòng)物包括狗、貓、豬、牛、馬；減小糖皮質(zhì)激素代謝的副作用；治療骨質(zhì)疏松癥；刺激免疫系統(tǒng)；加速傷口愈合；加速骨折修復(fù)；治療生長(zhǎng)遲緩；治療充血性心臟衰竭；治療急性或慢性腎衰竭或腎功能不足；治療生理性矮小，包括生長(zhǎng)激素不足的兒童；治療與慢性疾病相關(guān)的矮?。恢委煼逝职Y；治療與Prader-Willi綜合征和Turner氏綜合征相關(guān)的生長(zhǎng)遲緩；治療代謝綜合征(也稱為X綜合征)；加速燒傷病人或其后大手術(shù)的康復(fù)和減少住院；治療子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)遲緩、骨骼發(fā)育不良、腎上腺皮質(zhì)機(jī)能亢進(jìn)和Cushings綜合征；在應(yīng)激(stressed)病人中替代生長(zhǎng)激素；治療骨軟骨發(fā)育不良、Noonans癥狀、睡眠阻礙、阿茨海默氏癥、延遲的傷口愈合和心理社會(huì)喪失；治療肺機(jī)能障礙和對(duì)呼吸機(jī)的依賴性；在大手術(shù)后減弱蛋白質(zhì)代謝反應(yīng)；治療呼吸不良綜合征，減少由慢性疾病(例如癌癥或AIDS)引起的惡病質(zhì)和蛋白質(zhì)流失；加速患者對(duì)于總腸胃外營(yíng)養(yǎng)物的增重和蛋白質(zhì)生長(zhǎng)；治療包括胰島母細(xì)胞增生癥在內(nèi)的高胰島素血癥；用于排卵誘導(dǎo)的輔助治療、預(yù)防和治療胃和十二指腸潰瘍；刺激胸腺發(fā)育和預(yù)防年齡相關(guān)的胸腺功能下降；對(duì)慢性血液透析患者進(jìn)行輔助治療；治療免疫抑制的患者和促進(jìn)接種疫苗后的抗體反應(yīng)；在虛弱的老年中提高肌肉強(qiáng)度、提高肌肉質(zhì)量、靈活性、保持皮膚厚度、代謝穩(wěn)定、腎平衡；刺激成骨、骨重塑和軟骨生長(zhǎng)；治療神經(jīng)疾病，例如外周和藥物導(dǎo)致的神經(jīng)病變、Guillian-Barre綜合征、肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化癥、腦血管突發(fā)癥和脫髓鞘疾??；以及刺激羊的羊毛生長(zhǎng)。
在家畜中，生長(zhǎng)激素可用于提高肉產(chǎn)量，例如提高雞、火雞、羊、豬和牛的肉產(chǎn)量；刺激出生前和出生后生長(zhǎng)、在飼養(yǎng)用于產(chǎn)肉的動(dòng)物時(shí)提高喂養(yǎng)效率，提高胴體質(zhì)量(提高肌肉對(duì)脂肪的比率)；提高奶?；蚱渌溉閯?dòng)物物種的產(chǎn)奶量；改善身體構(gòu)成；對(duì)其它GH依賴性的代謝和免疫功能進(jìn)行修飾，例如促進(jìn)給予疫苗后的抗體應(yīng)答、或促進(jìn)發(fā)育過(guò)程；以及促進(jìn)魚類生長(zhǎng)和提高蛋白質(zhì)對(duì)脂肪的比率。
在寵物中，生長(zhǎng)激素的用途包括刺激胸腺發(fā)育和防止與年齡相關(guān)的胸腺功能減退；防止與年齡相關(guān)的胸腺功能減退；防止與年齡相關(guān)的認(rèn)知減退；促進(jìn)傷口愈合；促進(jìn)骨折修復(fù)；促進(jìn)成骨、骨重塑和軟骨生長(zhǎng)；衰減大手術(shù)后的蛋白質(zhì)代謝反應(yīng)、加快燒傷和大手術(shù)后復(fù)原，例如胃腸道手術(shù)；刺激免疫系統(tǒng)和增強(qiáng)給予疫苗后的抗體應(yīng)答；治療充血性心臟衰竭、治療急性或慢性腎衰竭或腎功能不足、治療肥胖癥；治療生長(zhǎng)遲緩、骨骼發(fā)育遲緩和骨軟骨發(fā)育不良；防止糖皮質(zhì)激素的代謝副作用；治療Cushing氏綜合征；治療吸收不良綜合征、減少由于慢性疾病(例如癌癥)引起的惡病質(zhì)和蛋白質(zhì)流失；加速動(dòng)物對(duì)于總腸胃外營(yíng)養(yǎng)物的增重和蛋白質(zhì)生長(zhǎng)；為排卵誘導(dǎo)提供輔助治療以及防止胃腸道潰瘍；改善肌肉質(zhì)量、強(qiáng)度和靈活性；保持皮膚厚度、改善器官的功能和代謝穩(wěn)定，或促進(jìn)小動(dòng)物生長(zhǎng)成較大的動(dòng)物。
關(guān)于本文所述的生長(zhǎng)激素拮抗物，可用其治療的疾病的特征為以下標(biāo)準(zhǔn)中的一種或多種生長(zhǎng)激素的產(chǎn)生水平提高、生長(zhǎng)激素受體的產(chǎn)生水平提高以及受體對(duì)生長(zhǎng)激素的細(xì)胞應(yīng)答提高。術(shù)語(yǔ)″提高″如本文所用，是將患病的人(或動(dòng)物)組織(或多個(gè)組織)中生長(zhǎng)激素生產(chǎn)、生長(zhǎng)激素受體生產(chǎn)或生長(zhǎng)激素介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答的常態(tài)水平與正常個(gè)體中的水平相比?？赏ㄟ^(guò)本發(fā)明的方法用生長(zhǎng)激素拮抗物治療的疾病包括但不限于肢端肥大癥、巨人癥、癌癥、糖尿病、血管性眼病(糖尿病性視網(wǎng)膜病，早產(chǎn)性視網(wǎng)膜病、年齡相關(guān)的黃斑變性、鐮刀形紅細(xì)胞貧血病性視網(wǎng)膜病等)以及腎病和腎小球硬化癥和醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房中患有嚴(yán)重疾病的個(gè)體。
可用本發(fā)明治療的癌癥包括但不限于包含表達(dá)生長(zhǎng)激素受體的腫瘤細(xì)胞的癌癥?？捎帽景l(fā)明治療的癌癥包括但不限于心臟肉瘤(血管肉瘤、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肉瘤)、粘液瘤、橫紋肌瘤、纖維瘤、脂瘤和畸胎瘤；肺部肺癌(鱗狀細(xì)胞、未分化的小細(xì)胞、未分化的大細(xì)胞、腺癌)、肺泡(細(xì)支氣管)癌、支氣管癌、肉瘤、淋巴瘤、軟骨錯(cuò)構(gòu)瘤、間皮瘤；胃腸食道(鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰腺(導(dǎo)管腺癌、胰島素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、良性腫瘤、血管活性腸肽腫瘤)、小腸(腺癌、淋巴瘤、良性腫瘤、Kaposi氏肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神經(jīng)纖維瘤、纖維瘤)、大腸(腺癌、管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、錯(cuò)構(gòu)瘤、平滑肌瘤)；生殖泌尿道腎(腺癌、Wilm氏腫瘤(腎胚細(xì)胞瘤)、淋巴瘤、非白血性白血病)、膀胱和尿道(鱗狀細(xì)胞癌、移行細(xì)胞癌、腺癌)、前列腺(腺癌、肉瘤)、睪丸(精原細(xì)胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎癌、絨毛膜癌、肉瘤、間質(zhì)細(xì)胞癌、纖維瘤、纖維腺瘤、腺瘤樣腫瘤、脂肪瘤)；肝肝癌(干細(xì)胞癌)、膽管癌、肝毒細(xì)胞瘤、血管肉瘤、干細(xì)胞腺癌、血管瘤；骨成骨肉瘤(骨癌)、纖維肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、軟骨肉瘤、Ewing氏肉瘤、惡性淋巴瘤(網(wǎng)狀肉瘤)、多發(fā)性骨髓瘤、惡性巨細(xì)胞腫瘤、脊索瘤、osteochronfroma(骨軟骨外生骨疣)、良性軟骨瘤、成軟骨細(xì)胞瘤、choridromyxofibroma、類骨質(zhì)骨瘤和巨細(xì)胞腫瘤；神經(jīng)系統(tǒng)顱(骨癌、血管瘤、肉芽瘤、脂肪性纖維瘤、畸形性骨炎)、腦膜(腦膜瘤、腦膜肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤)、大腦(星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、胚組織瘤[松果體瘤]、多形成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、間膠質(zhì)瘤、神經(jīng)鞘瘤、視網(wǎng)膜成神經(jīng)細(xì)胞瘤、先天性腫瘤)、脊索(神經(jīng)纖維瘤、硬腦脊膜肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肉瘤)；婦科子宮(子宮內(nèi)膜癌)、宮頸(宮頸癌、腫瘤前宮頸非典型增生(pre-tumor cervical dysplasia))、卵巢(卵巢癌[嚴(yán)重囊腺癌、粘蛋白囊腺癌、子宮粘膜樣腫瘤、celioblastoma、透明細(xì)胞癌、未分類癌]、粒層-卵泡膜細(xì)胞腫瘤、Sertoli-Leydig細(xì)胞腫瘤、無(wú)性細(xì)胞瘤、惡性畸胎瘤)、外陰(鱗狀細(xì)胞癌、上皮內(nèi)癌、腺癌、纖維肉瘤、黑素瘤)、陰道(透明細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、葡萄狀肉瘤(胚胎橫紋肌肉瘤)、輸卵管(癌)；血液學(xué)血液(髓細(xì)胞性白血病(急性和慢性)、急性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、骨髓增生性疾病、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生綜合征、Hodgkin氏病、非Hodgkin氏淋巴瘤[惡性淋巴瘤]；皮膚惡性黑色素瘤、基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、Kaposi氏肉瘤、痣、發(fā)育不良痣、脂肪瘤、血管瘤、皮膚纖維瘤、瘢痕瘤、牛皮癬；以及腎上腺成神經(jīng)細(xì)胞瘤。尤其考慮用于乳腺、結(jié)腸和前列腺癌癥、以及非白血性白血病和淋巴瘤。
可將生長(zhǎng)激素促效劑或拮抗劑與相容的、無(wú)毒性的藥學(xué)賦形劑配伍結(jié)合使用并給藥。在給予非人動(dòng)物的情況下，優(yōu)選將藥物摻混入動(dòng)物的飼料，可能的話制成供飼養(yǎng)者方便使用的藥物與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的組合物成品。生長(zhǎng)激素或生長(zhǎng)激素拮抗物可用任何適宜的藥學(xué)劑型，通過(guò)口服、直腸、透皮、肺部吸入、鼻吸入法或非胃腸道注射(包括靜脈內(nèi)、皮下和肌內(nèi)注射)方式給予人。也可將聚乙二醇部分加入生長(zhǎng)激素或生長(zhǎng)激素拮抗物。在治療視網(wǎng)膜病的情況下，可通過(guò)傳統(tǒng)的眼部用藥形式將其直接給到眼睛上或給入眼中。
可通過(guò)傳統(tǒng)的方式確定有效劑量和治療方案，從在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中以低劑量開始，然后提高劑量直至監(jiān)測(cè)到效果，并同時(shí)系統(tǒng)性地改變劑量用法。通常，GH反應(yīng)的臨床終點(diǎn)是測(cè)定血清IGF-1的水平。當(dāng)GH上升，IGF-1也上升。當(dāng)GH下降，IGF-1也下降。因此在GH不足的條件下，GH和IGF-1均很低。當(dāng)將重組GH給予這些個(gè)體時(shí)，IGF-1水平上升。臨床醫(yī)師可將IGF-1水平保持在按年齡調(diào)整的正常范圍內(nèi)。另一方面，如果患者的GH過(guò)多，則IGF-1也將偏高。當(dāng)給予GH拮抗劑時(shí)，IGF-1水平將下降。臨床醫(yī)生可嘗試調(diào)整給予患者的劑量從而使得IGF-1水平回復(fù)到正常的按年齡調(diào)整的水平。當(dāng)臨床醫(yī)生確定給予某對(duì)象的優(yōu)選劑量時(shí)，應(yīng)考慮到多種因素。這些因素中主要的因素是由腦垂體正常分泌的生長(zhǎng)激素的量，其在健康成人中的數(shù)量級(jí)為0.5mg/天。其它因素包括患者的體形、患者的年齡、患者的整體狀況、需要治療的具體疾病、疾病的嚴(yán)重程度、患者中存在的其它藥物、促效劑或拮抗劑的體內(nèi)活性等。在考慮了關(guān)于給予生長(zhǎng)激素和/或生長(zhǎng)激素抑制素(生長(zhǎng)激素釋放抑制劑)的動(dòng)物研究結(jié)果和臨床文獻(xiàn)后，可選擇出臨床試驗(yàn)劑量。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解獲自體外生長(zhǎng)激素結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)分析的結(jié)合常數(shù)和Ki等信息也可用于計(jì)算劑量。
生長(zhǎng)激素拮抗物典型的人用劑量可為約0.1-10mg/天，或約0.5-2mg/天，或約1mg/天。生長(zhǎng)激素促效劑典型的人用劑量可為約10-80mg/天，或約20-40mg/天，或約30mg/天。如上所述，可經(jīng)驗(yàn)性地通過(guò)監(jiān)測(cè)IGF-1水平來(lái)確定適宜的劑量。例如，給予足量的GH拮抗劑將IGF-1水平恢復(fù)到正常。
應(yīng)注意到的是本發(fā)明糖基化的蛋白質(zhì)可顯著提高分子量。例如，用(Ser-Hyp)10修飾的生長(zhǎng)激素(22kDa)所顯示的分子量超過(guò)45kDa。因此，分子量可超過(guò)兩倍，而活性卻保持不變。當(dāng)確定劑量時(shí)應(yīng)考慮到這點(diǎn)，應(yīng)在摩爾基礎(chǔ)上考慮劑量當(dāng)量。
本發(fā)明還提供了用于治療疾病對(duì)象方法的藥物制劑。該制劑可包含至少一種生物活性蛋白，例如，生長(zhǎng)激素促效劑或拮抗劑，并可包含藥學(xué)上可接受的載體?？墒褂枚喾N水性的載體，例如水、經(jīng)緩沖的水、0.4％鹽水、0.3％甘氨酸等。所述藥物制劑還可包含用于延長(zhǎng)藥物制劑儲(chǔ)存時(shí)間的其它成分，包括防腐劑、蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑等。所述制劑優(yōu)選為無(wú)菌制劑并不含顆粒狀物質(zhì)(對(duì)于注射用劑型)。可通過(guò)常規(guī)、熟知的滅菌技術(shù)對(duì)這些組合物進(jìn)行滅菌。該組合物可根據(jù)需要包含藥學(xué)上可接受的輔料以接近生理?xiàng)l件，例如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑等，例如醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。可將本發(fā)明的制劑調(diào)整為適于不同給藥方式，包括肌內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、眼內(nèi)等給藥方式。也可對(duì)對(duì)象制劑進(jìn)行配制，以提供緩釋的生長(zhǎng)激素促效劑或拮抗劑。關(guān)于制備可用于非胃腸給藥的組合物的方法和為了給予對(duì)象藥物而進(jìn)行的必需調(diào)整，在例如《雷明頓制藥科學(xué)》(Remington′s Pharmaceutical Science)中有更為詳細(xì)的其它描述，該文獻(xiàn)納入本文作為參考。
在閱讀了本說(shuō)明書后，其它的用途對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言應(yīng)是很顯而易見的。
實(shí)施例實(shí)施例1用轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞表達(dá)阿拉伯樹膠糖蛋白類似物阿拉伯樹膠糖蛋白(GAGP)是一種阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGP)，它是賦予阿拉伯樹膠乳化特性的表面活性成分。該功能性GAGP是一種典型的HRGP，由4個(gè)主要糖基部分和少部分(～10％，w/w)作為結(jié)構(gòu)整合部分的富含Hyp的蛋白質(zhì)構(gòu)成，所述4個(gè)糖基部分包括半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸(IslamA.M.，Philips G.O.，Sljivo A.，Snowden M.J.和William P.A.(1997)，F(xiàn)oodHydrocolloids 11(4)493-505.)。該GAGP已被分離并很好地表征。然而，編碼GAGP的基因尚未被克隆出，也尚未闡明GAGP顯示乳化能力和獨(dú)特性質(zhì)的明確機(jī)制。最近，對(duì)GAGP多肽主鏈的主要氨基酸序列進(jìn)行了衍生。其包含重復(fù)的19殘基共有基序SOOO(O/T/S)LSOSOTOTOO(O/L)GPH(O羥脯氨酸)(GoodrumL.J.，Patel A.，Leykam J.F.和Kieliszewski M.J.(2000)，Phytochem 54(1)99-106)。這就使得在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中通過(guò)使用人工合成基因技術(shù)表達(dá)GAGP類似物成為可能。設(shè)計(jì)并構(gòu)建了編碼7種GAGP類似物的基因。它們包含3種類型a)[Gum]3、[Gum]8和[Gum]20是分別編碼3、8和20段重復(fù)的GAGP共有基序的基因；b)[HP]4和[HP]8是編碼4和8段重復(fù)的GAGP疏水肽[HP]的基因，該疏水肽也源自GAGP骨架多肽；和c)[Gum]8[HP]2和[Gum]8[HP]4是[Gum]8與2和4段[HP]重復(fù)的組合。這些合成的類似物作為與增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)的融合蛋白在煙草細(xì)胞中表達(dá)。
材料和方法基因構(gòu)建所有構(gòu)建用于表達(dá)GAGP類似物的基因盒均具有″SStob-[人工合成基因]-EGFP″結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中編碼不同GAGP類似物的人工合成基因插入到編碼煙草伸展蛋白信號(hào)序列的SStob(De Loose，M.，Gheysen，G.，Tire，C.，Gielen，J.，Villarroel，R.，Genetello，C.，Van Montagu，M.，Depicker，A.和Inze，D.(1991)，Gene，9995-100)和編碼EGFP的基因之間。
1)[Gum]3、[Gum]8和[Gum]20基因的合成如Shpak等所述，通過(guò)頭-尾聚合三套部分重疊的互補(bǔ)寡核苷酸對(duì)來(lái)構(gòu)建編碼3段重復(fù)的SPSPTPTAPPGPHSPPPTL的[Gum]3基因，所述寡核苷酸對(duì)包括5′-連接子、內(nèi)部GAGP重復(fù)和3′-連接子(Shpak，E.，Leykam，J.F.，和Kieliszewski，M.J.(1999)，Proceedings of the National Academy of Sciences(USA)，9614736-14741)。
設(shè)計(jì)了[Gum]8和[Gum]20以編碼4段和10段重復(fù)的GPHSPPPPLSPSPTPSPPL-GPHSPPPTLSPSPTPTPPP(稱為[Gum]2)。其在交替的重復(fù)中有輕微的不同，因此更接近于天然GAGP。[Gum]2基因是通過(guò)兩種相互引發(fā)的寡核苷酸的引物延伸而合成的(圖1a)(Integrated DNA Technologies，Inc.Coralville，IA)。將產(chǎn)生的雙鏈作為HindIII/EcoRI片段置于pUC18質(zhì)粒中。4個(gè)和10個(gè)重復(fù)的人工合成基因的構(gòu)建涉及將[Gum]片段中相容(compatible)但不可再生(non-regenerable)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(Xmal和BsrFl)退火以產(chǎn)生雙倍的重復(fù)體(Lewis R.V.，Hinman M.，KothakotaS.和FournierM.(1996)，ProteinExpression Purif 7400-406)。通過(guò)這樣的重復(fù)方式，該基因片段的長(zhǎng)度可以幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)到4和10段重復(fù)。
2)[HP]2、[HP]4和[HP]8基因的合成設(shè)計(jì)了[HP]2、[HP]4和[HP]8基因以編碼2、4和8段重復(fù)的TPLPTLTPLPAPTPPLLPH(稱為[HP]1)。[HP]1的合成也是通過(guò)如上所述兩條互相引發(fā)的寡核苷酸的引物延伸(圖1b)進(jìn)行的。產(chǎn)生的雙鏈作為HindIII/EcoRI片段置于pUC18質(zhì)粒中。人工合成基因的二重復(fù)體([HP]2)、四重復(fù)體([HP]4)和八重復(fù)體([HP]8)的構(gòu)建涉及如上所述的將[HP]1片段中相容但不可再生的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(BspEl和Xmal)退火。
3)pUC-SStob-[Gum]n-EGFP(n＝3，8，10)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)Shpak等的方法構(gòu)建質(zhì)粒pUC-SStob-[Gum]3-EGFP(Shpak，E.，Leykam，J.F.，和Kieliszewski，M.J.(1999)，Proceedings of the National Academy of Sciences(USA)，9614736-14741)(圖2a)。將聚合的[Gum]8和[Gum]20基因作為BspEl/Agel片段亞克隆入pUC-SStob-EGFP(Shpak，E.，Leykam，J.F.，和Kieliszewski，M.J.(1999)，Proceedings of the National Academy of Sciences(USA)，9614736-14741)的SStob和EGFP基因間以產(chǎn)生命名為pUC-SStob-[Gum]8-EGFP和pUC-SStob-[Gum]20-EGFP的質(zhì)粒(圖2b)。
4)pUC-SStob-[HP]n-EGFP(n＝4，8)質(zhì)粒的構(gòu)建將聚合的[HP]4和[HP]8基因作為Agel/Ncol片段亞克隆入pUC-SStob-EGFP(Shpak，E.，Leykam，J.F.，和Kieliszewski，M.J.(1999)，Proceedingsof the National Academy of Sciences(USA)，9614736-14741)的SStob與EGFP基因間以產(chǎn)生命名為pUC-SStob-[HP]4-GFP和pUC-SStob-[HP]8-EGFP的質(zhì)粒(圖3)。
5)pUC-SStob-[Gum]8[HP]n-EGFP(n＝2，4)質(zhì)粒的構(gòu)建將聚合的[HP]2和[HP]4基因作為Agel/Ncol片段亞克隆入pUC-SStob-[Gum]8-EGFP的[Gum]8與EGFP基因間以產(chǎn)生命名為pUC-SStob-[Gum]8[HP]2-EGFP和pUC-SStob-[Gum]8[HP]4-EGFP的質(zhì)粒(圖4)。
上述所有基因構(gòu)建物的DNA測(cè)序均在Ohio University的環(huán)境與植物生物學(xué)系中進(jìn)行。
植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建然后將整個(gè)″SStob-[人工合成基因]-EGFP″構(gòu)建物作為BamHl/Sacl片段亞克隆到植物載體pBI121中以替代β-葡糖苷酸酶報(bào)告基因(Clontech，CA)產(chǎn)生pBI-SStob-[人工合成基因]-EGFP質(zhì)粒。這些人工合成基因的表達(dá)在35S花椰菜花葉病毒(CaMV)啟動(dòng)子的控制下。
植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和選擇通過(guò)凍融法將質(zhì)粒pBI121-SStob-[人工合成基因]-EGFP導(dǎo)入到根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404(Holsters等，1978)，然后如先前所述(An，G.(1985)，Plant Physiol，79568-570)用該農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化懸浮培養(yǎng)的煙草細(xì)胞(煙草(Nicotiana tabacum)，BY2)，并在固體Schenk & Hildebrandt(SH)培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇(Schenk和Hildebrandt，1972)，所述培養(yǎng)基含有0.4mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、200mg/L的卡那霉素(Sigma)和400mg/L的特美汀(SmithKline Beecham，PA)。每個(gè)構(gòu)建物選出了至少十個(gè)細(xì)胞株并轉(zhuǎn)移入包含如上所述成分(除了特美汀)的液體SH培養(yǎng)基中。于室溫下在Innova變向(gyrotary)振蕩器(New BrunswickScientific，Edison，NJ)上以90rpm旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)10天后，通過(guò)測(cè)定綠色熒光的強(qiáng)度，對(duì)各細(xì)胞系的培養(yǎng)基進(jìn)行靶蛋白表達(dá)篩選。選擇出各種構(gòu)建物中產(chǎn)生最高綠色熒光強(qiáng)度的細(xì)胞系用于傳代培養(yǎng)。
從培養(yǎng)基中分離GAGP類似物-EGFP融合糖蛋白收集培養(yǎng)12-14天后的培養(yǎng)基，將其于30℃下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮約10倍。將含有2M氯化鈉的100-200ml的培養(yǎng)基等份加入用2M氯化鈉平衡過(guò)的疏水性相互作用層析(HIC)柱中(苯基-瓊脂糖6Fast Flow，16×700mm，AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，用分級(jí)氯化鈉梯度(從2M、1M到蒸餾水)洗脫?；旌舷疵撊胝麴s水中的綠色熒光部分，通過(guò)冷凍干燥濃縮，然后用在200mM磷酸鈉緩沖液(pH7)中平衡的Superose-12凝膠滲透色譜(GPC)柱(16×700mm，Amersham Pharmacia Biotech)進(jìn)行分級(jí)。將收集自GPC柱的熒光部分注入用起始緩沖液A(0.1％三氟乙酸)平衡的Hamilton PRP-1半制備柱(10μm，7×305mm，Hamilton Co.，Reno，NV)，用HPLC進(jìn)行進(jìn)一步純化。用緩沖液B(0.1％三氟乙酸+80％乙腈，v/v)以0-70％B的線性梯度在100分鐘內(nèi)以1.0ml/分鐘的流速洗脫蛋白質(zhì)。
通過(guò)胰蛋白酶消化從融合糖蛋白中去除EGFP在沸水中將約100mg的融合糖蛋白加熱失活2分鐘，冷卻，然后與等體積新鮮制備的含有10mM氯化鈣和100μg胰蛋白酶的2％(w/v)碳酸氫銨混合。在室溫下孵育過(guò)夜后，用Superose-12GPC柱對(duì)樣品進(jìn)行分級(jí)，并進(jìn)一步以如上所述的方法用HPLC進(jìn)行進(jìn)一步純化。
乳化特性表征以經(jīng)過(guò)一些改進(jìn)的Pearce和Kinsella的方法進(jìn)行乳化分析(Pearce K.N.和Kinsella J.E.(1978)，J Agric Food Chem 26(3)716-723)。通過(guò)在玻璃試管中對(duì)0.4mL橙油和0.6mL 0.5％(w/v)的蛋白質(zhì)溶液(于0.05M磷酸緩沖液中，pH6.5)用配備有Microtip探頭的超聲波破碎儀(Sonic Dismembrator，F(xiàn)isher Scientific)進(jìn)行超聲處理來(lái)制備乳液。將振幅設(shè)置在4，對(duì)油/水混合物進(jìn)行60秒的處理，全過(guò)程在冰上進(jìn)行。然后將由此獲得乳液的100μl等份用0.1％SDS(十二烷基磺酸鈉)系列稀釋以得到1/1500的終稀釋度。在500nm下測(cè)定1/1500稀釋物的光學(xué)密度，將其定義為乳化能力(EA)。將剩余的乳液在室溫下垂直儲(chǔ)存于玻璃試管中2小時(shí)，然后再次測(cè)定1/1500稀釋物的光學(xué)密度。將2小時(shí)儲(chǔ)存后剩余的光學(xué)強(qiáng)度的百分比定義為乳化穩(wěn)定性(ES)。
結(jié)果由煙草細(xì)胞表達(dá)的所有GAGP類似物顯示出比天然GAGP低的乳化能力。這些GAGP類似物乳化能力的順序?yàn)閇HP]8＞[HP]4＞[Gum]8[HP]4＞[Gum]8[HP]2＞[Gum]20＞[Gum]8＞[Gum]3。然而，如表1所示，當(dāng)EGFP附著于這些合成的GAGP類似物時(shí)，所有融合蛋白表現(xiàn)出比天然GAGP更佳的乳化能力。
表1.重組GAGP類似物的乳化特性
實(shí)施例2通過(guò)糖基化提高的產(chǎn)率在植物細(xì)胞中表達(dá)的某些轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)通常具有非常低的產(chǎn)率，因此它們?cè)谥参锵到y(tǒng)中的表達(dá)是昂貴、無(wú)效率且不實(shí)用的。本發(fā)明包括在植物細(xì)胞中提高轉(zhuǎn)基因蛋白產(chǎn)率的新方法，該方法通過(guò)將轉(zhuǎn)基因蛋白作為具有至少一種富含羥脯氨酸的糖蛋白(HRGP)糖組件的融合糖蛋白的形式來(lái)產(chǎn)生，從而增加轉(zhuǎn)基因蛋白的產(chǎn)率。本實(shí)施例用上面實(shí)施例1中所述的一些技術(shù)來(lái)產(chǎn)生帶有糖組件的新蛋白。通過(guò)包含這些糖組件，表達(dá)入培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)的產(chǎn)率提高。
簡(jiǎn)而言之，存在兩種主要類型的糖組件1)阿拉伯半乳聚糖糖組件，其包含成簇的非鄰接羥脯氨酸(Hyp)殘基，其中的Hyp殘基被阿拉伯半乳聚糖加合物(例如，Xaa-Hyp-Xaa-Hyp-Xaa-Hyp重復(fù)體，其中Xaa是Ser或Ala，但可為其它氨基酸，如Thr或Val(或Lys或Gly)O-糖基化。例如[Ser-Hyp]n或[Ala-Hyp]n)；以及2)阿拉伯次黃苷基化糖組件，其包含鄰接的Hyp殘基，其中一些或全部Hyp殘基被約1-5個(gè)殘基長(zhǎng)的阿拉伯寡聚糖鏈(例如Xaa-Hyp-Hyp-Hyp-Hypn組件，其中Xaa可為Ser或Ala或其它氨基酸，例如[Ser-Hyp-Hyp-Hyp-Hyp]n或[Ser-Hyp-Hyp]n)阿拉伯次黃苷基化。
定制基因的表達(dá)轉(zhuǎn)基因可包括用于穿過(guò)內(nèi)膜系統(tǒng)分泌的信號(hào)序列。例如，煙草伸展蛋白信號(hào)序列MASLFATFLWLSLSLAQTTRSA(Shpak，E.，Leykam，J.F.，和Kieliszewski，M.J.(1999)，Proceedings of the National Academy of Sciences(USA)，9614736-14741)；番茄LeAGP-1信號(hào)序列MDRKFVFLVSILCIVVASVTG(Li & Showalter，Li和Showalter，Plant Mol Biol.(1996)Nov；32(4)641-52；Zhao ZD，Tan L，Showalter AM，Lamport DT，Kieliszewski MJ.，Plant J.2002 Aug；31(4)431-44)。
1)基因構(gòu)建對(duì)于這些實(shí)例，構(gòu)建具有以下結(jié)構(gòu)的基因盒 圖5、6、7、8和9分別顯示了用于表達(dá)hGH-(SP)10-EGFP、hGH-(SP)10、INF-(SP)10、HSA(人血清白蛋白)-(SP)10和結(jié)構(gòu)域1(HAS的結(jié)構(gòu)域I)-(SP)10的基因盒的構(gòu)建流程。圖10A所示為用于表達(dá)hGH-(SP)10的遺傳構(gòu)建物；圖10B所示為如何通過(guò)引物延伸產(chǎn)生該構(gòu)建物。圖11、12(A和B)、13和14分別顯示了用于表達(dá)hGH-(SP)10-EGFP、HSA-(SP)10、(HAS的)結(jié)構(gòu)域1-(SP)10和INF2a(干擾素2a)-(SP)10的遺傳構(gòu)建物。
結(jié)果總結(jié)所表達(dá)的EGFP帶有靶向EGFP使其分泌的N端信號(hào)序列。然而，即便附著有該信號(hào)序列，分泌入培養(yǎng)基中的平均量還是低到不能對(duì)它們進(jìn)行精確定量。
反之，當(dāng)將EGFP作為不同類型的HRGP融合蛋白表達(dá)時(shí)，產(chǎn)率顯著提高。下表2和3提供了可給出提高產(chǎn)率的不同類型植物、蛋白質(zhì)和構(gòu)建物的實(shí)例。
表2.在煙草BY2細(xì)胞(還記錄了在番茄或擬南芥中表達(dá)的那些)中表達(dá)的純化HRGP-EGFP融合糖蛋白的產(chǎn)率實(shí)例
a(YK)20和(YK)8分別代表以下序列(Ser-Hyp4-Ser-Hyp-Ser-Hyp4-Tyr-Tyr-Tyr-Lys)20和(Ser-Hyp4-Ser-Hyp-Ser-Hyp4-Tyr-Tyr-Tyr-Lys)8；(YL)8代表(Ser-Hyp4-Ser-Hyp-Ser-Hyp4-Tyr-Tyr-Tyr-Leu)8；(FK)8代表(Ser-Hyp4-Ser-Hyp-Ser-Hyp4-Phe-Phe-Phe-Lys)8。
表3.在煙葉懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞中作為分泌蛋白表達(dá)的非植物蛋白的產(chǎn)率
結(jié)果的詳細(xì)分析上文中總結(jié)的結(jié)果獲自許多不同的研究，使用了不同的構(gòu)建物，表達(dá)了不同的蛋白，并作為各個(gè)具體研究的代表而被選出。以下部分分解表達(dá)的過(guò)程，在不同階段進(jìn)行觀察，聚焦于以下物質(zhì)的表達(dá)a)不含糖基化組件的hGH構(gòu)建物；和b)帶有糖基化組件的hGH構(gòu)建物。在某些情況下，將hGH-(SO)10的表達(dá)與hGH-(SO)10-EGFP進(jìn)行對(duì)比以觀察不同肽元件如何表達(dá)。
圖15所示為所檢測(cè)到的分泌入hGH-(SO)10和hGH轉(zhuǎn)化的煙草細(xì)胞培養(yǎng)基中的hGH等效物。圖(A)所示為用hGH-(SO)10(上方)或hGH(下方)轉(zhuǎn)化的10個(gè)細(xì)胞株的1μl培養(yǎng)基中存在的hGH等效物的斑點(diǎn)印跡分析；圖(B)所示為相同的兩組10個(gè)細(xì)胞系的培養(yǎng)基中的hGH等效物的夾心ELISA定量分析。這些結(jié)果證實(shí)糖基化組件的附著顯著提高了表達(dá)蛋白分泌入培養(yǎng)基。
圖16所示為細(xì)胞生長(zhǎng)的時(shí)間進(jìn)程以及用hGH-(SO)10轉(zhuǎn)化的BY-2煙草細(xì)胞中的hGH等效物的時(shí)間進(jìn)程。將煙草細(xì)胞培養(yǎng)在含有100mL培養(yǎng)基的250mLErlenmeyer燒瓶中。以2天的間隔取出3個(gè)燒瓶以測(cè)定培養(yǎng)基中的細(xì)胞干重和hGH等效物。通過(guò)在燒結(jié)漏斗上過(guò)濾來(lái)收集培養(yǎng)的細(xì)胞，收集濾出液(培養(yǎng)基)用于hGH分析；用蒸餾水洗滌細(xì)胞3次，然后在測(cè)定細(xì)胞干重前凍干3天。通過(guò)夾心ELISA分析法測(cè)定hGH等效物。
經(jīng)8-10天的培養(yǎng)后，通過(guò)在粗燒結(jié)漏斗上進(jìn)行過(guò)濾，收集獲自經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)基，并補(bǔ)充氯化鈉至終濃度為2M。在4℃下以25,000xG離心20分鐘，得到不溶性物質(zhì)的團(tuán)塊。通過(guò)疏水性相互作用層析(HIC)，使用在2M氯化鈉中平衡的苯基-瓊脂糖6柱(苯基-瓊脂糖6Fast Flow，16×700mm，AmershamPharmacia Biotech)對(duì)上清液進(jìn)行分級(jí)。將培養(yǎng)基完全加入HIC柱后，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分步(step-wise)洗脫首先使用Tris緩沖液(25mM，pH8.5)/2M氯化鈉，然后使用Tris緩沖液(25mM，pH8.5)/0.8M氯化鈉，接著使用Tris緩沖液(25mM，pH8.5)/0.2N氯化鈉。流速為1.0ml/min，在220nm下用UV檢測(cè)儀監(jiān)控分級(jí)。通過(guò)斑點(diǎn)印跡法和ELISA分析法，分析各洗脫的部分中hGH的存在。Tris緩沖液(25mM，pH8.5)/0.2N NaCl部分中含有大部分的hGH-(SO)10融合糖蛋白，將其在4℃下通過(guò)超濾濃縮，用于hGH結(jié)合和活性分析或者用反相色譜法進(jìn)一步純化。
圖18所示為通過(guò)反相色譜法，在用緩沖液A(0.1％三氟乙酸)平衡的哈密頓聚合物反相-1(Hamilton polymeric reversed phase-1，PRP-1)柱上分離hGH-(SO)10(A)和hGH-(SO)10-EGFP(B)。用緩沖液B(0.1％三氟乙酸，80％乙腈，v/v)在15分鐘內(nèi)以0-30％B、然后在90分鐘內(nèi)以30-70％B的兩步線性梯度法，以0.5ml/分鐘的流速洗脫蛋白質(zhì)。于220nm下測(cè)定吸光度。先在Superose-12柱上通過(guò)凝膠滲透層析法對(duì)融合蛋白hGH-(SO)10-EGFP進(jìn)行分級(jí)，然后注于PRP-1上。
圖17所示為使用抗hGH抗體，以蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)hGH-(SO)10(左手邊的區(qū)域)和hGH-(SO)10-EGFP(右手邊的區(qū)域)。使用疏水性相互作用層析對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行分級(jí)后，進(jìn)行凝膠電泳。在4-15％SDS-PAGE上跑樣品(10ug蛋白質(zhì))，然后轉(zhuǎn)移到NitroBind膜上。在TTBS緩沖液(100mM Tris-HCI，pH 7.5、150mM NaCl和0.1％Tween20)中稀釋兔多克隆抗-hGH抗體到1∶500，在TTBS緩沖液中將堿性磷酸酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG稀釋到1∶1000，將它們分別作為一抗和二抗。泳道1分子量標(biāo)記；泳道2、3、4hGH-(SO)10(A)或hGH-(SO)10-EGFP(B)培養(yǎng)物培養(yǎng)基；泳道5hGH標(biāo)準(zhǔn)品(2ug)。
在50-75kDa(A)處的或75-100kDa處的模糊條帶是典型的阿拉伯半乳聚糖-蛋白質(zhì)條帶，其包括hGH-(SO)10和hGH-(SO)10-EGFP。加入足量的O-Hyp阿拉伯半乳聚糖以將分子質(zhì)量帶到50kDa。碳水化合物不僅產(chǎn)生了微觀不均勻性位點(diǎn)，還干擾了SDS的結(jié)合，產(chǎn)生了凝膠中觀察到的模糊條帶。(A)中＞150kDa的條帶可能是污染物。(A)中～22kDa的條帶可能是從hGH-(SO)10融合蛋白中釋放出來(lái)的hGH，該釋放是在分離步驟或在pH8加樣緩沖液中進(jìn)行加熱處理時(shí)發(fā)生的。我們還觀察到在堿(pH8)中加熱時(shí)，富含SOSO的構(gòu)建物(O＝Hyp)有些不穩(wěn)定，這可能是由在Ser殘基周圍發(fā)生的N-＞O?；兓斐傻?。在進(jìn)行SDS-PAGE前不加熱構(gòu)建物，而是將蛋白質(zhì)在加樣緩沖液中室溫孵育數(shù)小時(shí)(不加熱)，似乎可解決這一問(wèn)題。(B)中～25kDa的條帶可為EGFP、附著有一些SO和聚糖的hGH或某些污染物。
EGFP元件的存在不會(huì)顯著改變所表達(dá)的蛋白質(zhì)的糖基化分布。如下表4所示，半乳糖和阿拉伯糖構(gòu)成了hGH(SO)10或hGH-(SO)10-EGFP中的主要單糖，并伴有較少量的鼠李糖和糖醛酸。糖占hGH(SO)10干重的55.5％，占hGH-(SO)10-EGFP融合糖蛋白干重的46.5％。
表4.hGH-(SO)10和hGH-(SO)10-EGFP糖基組合物
表5所示為INF-(SO)10的糖基化分布，其類似于hGH-(SO)10的糖基化分布。
表5.INF-(SO)10的糖基組合物
根據(jù)Hyp鄰接假說(shuō)的預(yù)測(cè)(Shpak，E.，Leykam，J.F.和Kieliszewski，M.J.(1999)，Proceedings of the National Academy of Sciences(USA)，9614736-14741；Shpak，E.，Barbar，E.，Leykam，J.F.& Kieliszewski，M.J.J.Biol.Chem.276，11272-11278(2001))，hGH-(SO)10和hGH-(SO)10-EGFP融合糖蛋白僅含有Hyp-多糖(表6)。在INF-(SO)10中也觀察到相同的效應(yīng)(表7)。
表6 Hyp-PS，Hyp多糖；Hyp-Aran，Hyp-阿拉伯糖苷1-4；NG-Hyp，非糖基化的Hyp表7INF-(SO)10的羥脯氨酸的配糖體分布 Hyp-PS，Hyp多糖；Hyp-Aran，Hyp-阿拉伯糖苷1-4；NG-Hyp，非糖基化的Hyp
表8所示為hGH-(SO)10的糖基連接分析表8
克隆過(guò)程的總體描述建立了基因盒以編碼位于蛋白質(zhì)N端或C端的糖基化位點(diǎn)，并將其亞克隆入pUC18-SStob-EGFP(編碼煙草伸展蛋白信號(hào)序列[SStob]和EGFP的pUC18載體)。對(duì)這些基因進(jìn)行測(cè)序，然后作為BamHI/Sacl片段亞克隆入pB121(Clontech)，替換β-葡糖苷酸酶基因，其位置位于花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子之后。
植物轉(zhuǎn)化將含有基因盒的pBI121-來(lái)源的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移入根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404中。根據(jù)前述的方法(An，G.(1985)，Plant Physio，79568-570；Shpak，E.，Leykam，J.F.，和Kieliszewski，M.J.(1999)，Proceedings of the National Academy of Sciences(USA)，9614736-14741；Zhao ZD，F(xiàn)an L，Showalter AM，Lamport DI，Kieliszewski MJ.，Plant J.2002年8月；31(4)431-44)，轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞。用葉盤法(McCormick等，1986，《用根瘤農(nóng)桿菌對(duì)培養(yǎng)的番茄(L.esculentum)進(jìn)行葉盤法轉(zhuǎn)化》，″Leaf disc transformation of cultivated tomato(L.esculentum)usingAgrobacterium tumefaciens McCormick，S.；Niedermeyer，J.；Fry，J.；Barnason，A.；Horsch，R.；Fraley，R.Plant Cell Reports 581-84)，轉(zhuǎn)化番茄細(xì)胞。用Forreiter等(Forreiter C，Kirschner M，Nover L.，Plant Cell.1997年12月；9(12)2171-81)的方法轉(zhuǎn)化擬南芥細(xì)胞。
細(xì)胞培養(yǎng)在SH培養(yǎng)基(Schenk和Hildebrandt，1972)中培養(yǎng)所有經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，所述培養(yǎng)基含有34g/L蔗糖、0.4mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和200mg/L卡那霉素(Sigma)。于室溫下，將燒瓶(250-ml或1000-ml)置于轉(zhuǎn)速為90rpm的變向振蕩器上。培養(yǎng)10-20天后，收集培養(yǎng)基以用于分離目標(biāo)蛋白。
糖蛋白的分離如上文所示，采用疏水性相互作用層析(HIC)和反相色譜法從培養(yǎng)基中分離糖蛋白(注意以下的區(qū)別用2M NaCl/25mM Tris pH 8.5平衡HIC柱；且用僅含有25mM Tris pH 8.5的第二緩沖液對(duì)柱進(jìn)行分步梯度洗脫。hGH衍生物在25mMTris/0.2M的梯度下被洗脫出)(Shpak，E.，Barbar，E.，Leykam，J.F.&Kieliszewski，M.J.J.Bol.Chem.276，11272-11278(2001)；Zhao ZD，Tan L，Showalter AM，Lamport DT，Kieliszewski MJ.，Plant J.2002年8月；31(4)431-44；Li LC，Bedinger PA，Volk C，Jones AD，Cosgrove DJ，Plant Physiol.2003年8月；132(4)2073-85)。
實(shí)施例3其它人生長(zhǎng)激素構(gòu)建物的例子除了如上文實(shí)施例2中所述構(gòu)建的hGH構(gòu)建物以外，還合成了以下構(gòu)建物并將其轉(zhuǎn)化入煙草細(xì)胞。
1.hGH-(SO)1用PCR法擴(kuò)增SStob-hGH-(SP)1基因片段，以pUC-SStob-hGH-(SP)10為模板，并使用以下的引物對(duì)5’-AGAGGATCCGCAATGGGAAAAATGGC-3’和5’-TAAGTGTACAATCAGGGTGAGAAGCCGCAGCTG-3’然后將所得PCR片段作為BamHI/BsrGI片段亞克隆入pUC-SStob-EGFP替代SStob-EGFP，以產(chǎn)生命名為pUC-SStob-hGH-(SP)1的質(zhì)粒(圖19)。
2.hGH-(SO)2用PCR法擴(kuò)增SStob-hGH-(SP)2基因片段，以pUC-SStob-hGH-(SP)10為模板，并使用以下的引物對(duì)5’-AGAGGATCCGCAATGGGAAAAATGGC-3’和5’-TAAGTGTACAATCATGGAGAGGGTGAGAAGCC-3’然后將所得PCR片段作為BamHI/BsrGI片段亞克隆入pUC-SStob-EGFP，替代SStob-EGFP，以產(chǎn)生命名為pUC-SStob-hGH-(SP)2的質(zhì)粒(圖20)。
3.hGH-(SO)5用PCR法擴(kuò)增SStob-hGH-(SP)5基因片段，以pUC-SStob-hGH-(SP)10為模板，并使用以下的引物對(duì)5’-AGAGGATCCGCAATGGGAAAAATGGC-3’和5’-TAAGTGTACAATCAAGGCGATGGGGAAGGGCTTGG-3’然后將所得PCR片段作為BamHI/BsrGI片段亞克隆入pUC-SStob-EGFP，替代SStob-EGFP，以產(chǎn)生命名為pUC-SStob-hGH-(SP)5的質(zhì)粒(圖21)。
4.hGH-(SO)20首先用PCR法引入Ncol限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)并緊接SStob-hGH-(SP)10基因片段之后，以pUC-SStob-hGH-(SP)10為模板，并使用以下的引物對(duì)5’-AGAGGATCCGCAATGGGAAAAATGGC-3’和5’-ATAAGCCATGGTTGGGCTGGGAGAAGGGGATGG-3’。
然后將所得PCR片段(SStob-hGH-(SP)10Ncol)作為BamHI/Ncol片段亞克隆入pUC-SStob-hGHNcol-(SP)10*替代SStob-hGHNcol，以產(chǎn)生命名為pUC-SStob-hGH-(SP)20的質(zhì)粒(圖22)。然后使用QuickChange誘變?cè)噭┖?Strategies，CA)通過(guò)定向誘變?nèi)コ秊榭寺〉哪康亩鴮?dǎo)入該質(zhì)粒中的附加核苷酸。(*pUC-SStob-hGHNcol-(SP)10是未進(jìn)行定向誘變?nèi)コ齆col限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的初級(jí)pUC-SStob-hGH-(SP)10質(zhì)粒。)5.(SO)10-hGH-(SO)10首先用PCR法擴(kuò)增(SP)10基因片段，以pUC-SStob-hGH-(SP)10為模板，并使用以下的引物對(duì)5’-TTATCCCGGGCCTCACCCTCTCCAAGCCCTTCC-3’和5’-TTATCCCGGGTGGGCTGGGAGAAGGGGATGG-3’。
將所得PCR片段Xmal(SP)10Xmal在Xmal位點(diǎn)亞克隆入pUC-SStob-XmalhGH-(SP)10**，插入SStob和hGH-Xmal(SP)10之間，以產(chǎn)生命名為pUC-SStob-(SP)10-hGH-(SP)10的質(zhì)粒(圖23)。然后使用QuickChange誘變?cè)噭┖?Strategies，CA)通過(guò)定向誘變?nèi)コ秊榭寺〉哪康亩鴮?dǎo)入該質(zhì)粒中的附加核苷酸。(**pUC-Stob-XmalhGH-(SP)10是未進(jìn)行定向誘變?nèi)コ齒mal限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的初級(jí)pUC-SStob-hGH-(SP)10質(zhì)粒)6.hGHA-(SO)10(hGHA人生長(zhǎng)激素拮抗物)通過(guò)對(duì)質(zhì)粒pUC-SStob-hGH-(SP)10進(jìn)行定向誘變產(chǎn)生pUC-SStob-hGHA-(SP)10(圖24)(由編碼Gly120到編碼Lys120)，使用了以下的引物對(duì)5’-GGACCTAGAGGAAAAGATCCAAACGCTG-3’和5’-CAGCGTTTGGATCTTTTCCTCTAGGTCC-3’。
實(shí)施例4干擾素構(gòu)建物的其它例子除了如上文實(shí)施例2中所述構(gòu)建的干擾素α2構(gòu)建物(INF-(SO)10)以外，還制備了以下構(gòu)建物。
1.INF-(SO)5用PCR法擴(kuò)增SStob-INF-(SP)5基因片段，以pUC-SStob-INF-(SP)10為模板，并使用以下的引物對(duì)5’-AGAGGATCCGCAATGGGAAAAATGGC-3’和5’-TAAGTGTACAATCAAGGCGATGGGGAAGGGCTTGG-3’。
然后將所得PCR片段作為BamHI/BsrGI片段亞克隆入pUC-SStob-EGFP，替代SStob-EGFP，以產(chǎn)生命名為pUC-SStob-INF-(SP)5的質(zhì)粒(圖25)。該轉(zhuǎn)化是在擬南芥細(xì)胞中進(jìn)行的。
2.(SO)5-INF-(SO)5用PCR法擴(kuò)增SStob-(SP)5基因片段，以pUC-SStob-(sp)10-hGH-(SP)10為模板，并使用以下的引物對(duì)5’-AGAGGATCCGCAATGGGAAAAATGGC-3’和5’-ATAAGGCCCGGGTAGGCGATGGGGAAGGGCTTG-3’。
然后將所得PCR片段作為BamHI/XmaI片段亞克隆入pUC-SStob-INF-(SP)5替代SStob，以產(chǎn)生命名為pUC-SStob-(SP)5-INF-(SP)5的質(zhì)粒(圖26)。然后使用QuickChange誘變?cè)噭┖?Strategies，CA)通過(guò)定向誘變?nèi)コ秊榭寺〉哪康亩鴮?dǎo)入該質(zhì)粒中的附加核苷酸。該轉(zhuǎn)化是在擬南芥細(xì)胞中進(jìn)行的。
3.(SO)5-INF如上所述用PCR法擴(kuò)增SStob-(SP)5基因片段。將所得PCR片段作為BamHI/Xmal片段亞克隆入pUC-SStob-INF替代SStob，以產(chǎn)生命名為pUC-SStob-(SP)5-INF的質(zhì)粒(圖27)。然后使用QuickChange誘變?cè)噭┖?Strategies，CA)通過(guò)定向誘變?nèi)コ秊榭寺〉哪康亩鴮?dǎo)入該質(zhì)粒中的附加核苷酸。該轉(zhuǎn)化是在擬南芥細(xì)胞中進(jìn)行的。
4.INF-(SO)20首先用PCR法導(dǎo)入Ncol限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)并緊接SStob-INF-(SP)10基因片段之后，以pUC-SStob-INF-(SP)10為模板，并使用以下的引物對(duì)5’-AGAGGATCCGCAATGGGAAAAATGGC-3’和5’-ATAAGCCATGGTTGGGCTGGGAGAAGGGGATGG-3’然后將所得PCR片段SStob-INF-(SP)10Ncol作為BamHI/Ncol片段亞克隆入pUC-SStob-hGHNcol-(SP)10替代SStob-INFNcol，以產(chǎn)生命名為pUC-SStob-INF-(SP)20的質(zhì)粒(圖28)。然后使用QuickChange誘變?cè)噭┖?Strategies，CA)通過(guò)定向誘變?nèi)コ秊榭寺〉哪康亩鴮?dǎo)入該質(zhì)粒中的附加核苷酸。該轉(zhuǎn)化是在擬南芥細(xì)胞中進(jìn)行的。
5.(SO)10-INF-(SO)10通過(guò)用BamHI/Xmal消化pUC_SStob-(SP)10Xmal-hGH-(SP)10***產(chǎn)生SStob-(SP)10片段。然后將該片段亞克隆入pUC-SStob-INF-(SP)10替代SStob，以產(chǎn)生命名為pUC-SStob-(SP)10-INF-(SP)10的質(zhì)粒(圖29)。然后使用QuickChange誘變?cè)噭┖?Strategies，CA)通過(guò)定向誘變?nèi)コ秊榭寺〉哪康亩鴮?dǎo)入該質(zhì)粒中的附加核苷酸。(***pUC-SStob-(SP)10Xmal-hGH-(SP)10是未進(jìn)行定向誘變?nèi)コ齒mal限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的初級(jí)pUC-SStob-(SP)10-hGH-(SP)10質(zhì)粒)。該轉(zhuǎn)化是在煙草細(xì)胞中進(jìn)行的。
實(shí)施例5EGFP融合蛋白的預(yù)示例可根據(jù)本發(fā)明制備其它EGFP融合蛋白，它們包括但不限于(Ala-Hyp)11-EGFP、(Thr-Hyp)11-EGFP、(Thr-Hyp)101-EGFP和(Val-Hyp)11-EGFP。這些僅是具體包含的一些例子。本發(fā)明幾乎不受這些例子的限制；基本上可制備任何組合和數(shù)目的X-Hyp重復(fù)(其中X為氨基酸，而Hyp為羥脯氨酸)。
實(shí)施例6通過(guò)糖基化促進(jìn)肽生物活性人生長(zhǎng)激素(hGH)是一種由腦垂體腺分泌并通過(guò)血液傳遞到靶組織(例如肝、肌肉、骨和脂肪)的多肽激素。人GH在靶組織中誘導(dǎo)代謝變化，最終激活導(dǎo)致身體生長(zhǎng)的過(guò)程。hGH分泌過(guò)少會(huì)導(dǎo)致侏儒癥，而分泌過(guò)多則會(huì)導(dǎo)致巨人癥和肢端肥大癥。此外，hGH影響脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞的代謝以及例如老化等過(guò)程；因此，對(duì)于在血液和組織中控制hGH水平產(chǎn)生了濃烈的興趣。
除了這些重要的用途，由于天然或重組的GH比較小，導(dǎo)致了迅速的肝臟清除和非常短的循環(huán)半衰期(～30分鐘)，所以它們通常不適于作為多肽藥物。因此，接受侏儒癥治療的患者需要非常頻繁地注射hGH。
在多肽中將聚乙二醇(PEG)基團(tuán)附著于賴氨酸殘基——被稱為PEG化的方法——顯著改善了hGH的藥理學(xué)特性。PEG化通過(guò)提高h(yuǎn)GH的分子質(zhì)量使得hGH在臨床上更為有效，由此防止了腎濾過(guò)并減緩了hGH從體內(nèi)的清除；它還保護(hù)了多肽，使其免遭蛋白質(zhì)水解作用并降低了免疫原性。
然而PEG化具有某些缺點(diǎn)。相對(duì)非特異性的賴氨酸殘基靶向性使得受體結(jié)合親和力顯著降低多達(dá)1500倍。此外，PEG化過(guò)程耗時(shí)且不便，由于其需要對(duì)衍生的多肽進(jìn)行純化，極大地提高了藥物成本。
本實(shí)施例描述了發(fā)明人通過(guò)將hGH在植物細(xì)胞中作為糖蛋白表達(dá)，提高h(yuǎn)GH的有效分子量及其相應(yīng)的循環(huán)穩(wěn)定性的研究。
材料和方法植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBI SStob-hGH-(SP)10的構(gòu)建pBI121是購(gòu)自Clontech的一種質(zhì)粒。在本研究中制備了其衍生物。
從提取自用hGH基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的小鼠L細(xì)胞的總RNA中通過(guò)RT-PCR產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素cDNA(Chen等，1994)，使用的引物對(duì)為5′-ACCCGGGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCC-3′和5′-GATTCCATGGTGAAGCCACAGCTGCCCTCCAC-3′。
所得PCR片段包含編碼hGH的開放閱讀框，但缺少其信號(hào)肽。將該片段作為Xmal/Ncol片段克隆入pUC-SStob-EGFP，位于SStob(編碼煙草的伸展蛋白信號(hào)序列(SS))和編碼增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)的基因之間，以產(chǎn)生命名為pUC-SStob-hGH-EGFP的質(zhì)粒。通過(guò)兩條互相引發(fā)(mutually priming)的寡核苷酸(Integrated DNA Technologies，Inc.Coralville，IA)的引物延伸，構(gòu)建編碼10段重復(fù)的二肽Ser-Pro(SP)10的人工合成基因(圖10B)。
將(SP)10基因作為Ncol和BsrGI片段亞克隆入pUC-SStob-hGH-EGFP中替代EGFP，以產(chǎn)生pUC-SStob-hGH-(SP)10。然后使用QuickChange誘變?cè)噭┖?Strategies，CA)通過(guò)定向誘變?nèi)コ秊榭寺〉哪康亩鴮?dǎo)入SStob-hGH-(SP)10基因盒中的附加核苷酸。在Ohio University的環(huán)境和植物生物學(xué)系對(duì)SStob-hGH-(SP)10進(jìn)行測(cè)序。
然后將整個(gè)SStob-hGH-(SP)10構(gòu)建物(圖10A)作為BamHl和Sacl片段克隆入植物轉(zhuǎn)化載體pBI121(Clontech，CA)中替代β-葡糖苷酸酶報(bào)告基因，以得到質(zhì)粒pBI-SStob-hGH-(SP)10。在35S花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子的控制下表達(dá)SStob-hGH-(SP)10。
植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和選擇通過(guò)凍融法(Holsters等.，1978)將質(zhì)粒pBI-SStob-hGH-(SP)10導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404中，然后如前所述(An，G.(1985)《培養(yǎng)的煙草細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)化》，″High efficiency transformation of cultured tobacco cells″，Plant Physio，79568-570)，用該農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化懸浮培養(yǎng)的煙草細(xì)胞(煙草(Nicotiana tabacum)，BY2)，并在固體Schenk & Hildebrandt(SH)培養(yǎng)基(Schenk和Hildebrandt，(1972)《用于單子葉和雙子葉植物細(xì)胞培養(yǎng)的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)培養(yǎng)基及技術(shù)》，″Mediumand techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonousplant cell culture″，Can J Bot，50199-204)上進(jìn)行選擇，所述培養(yǎng)基含有0.4mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、200mg/L卡那霉素(Sigma)和400mg/L特美汀(SmithKline Beecham，PA)。
為了生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，使細(xì)胞在包含上述相同成分(除了不含特美汀以外)的液體SH培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。室溫下在Innova變向振蕩器(New BrunswickScientific，Edison，NJ)上以90rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)8-10天后，用斑點(diǎn)印跡法和ELISA分析法對(duì)各細(xì)胞系的培養(yǎng)物培養(yǎng)基進(jìn)行hGH表達(dá)篩選。選擇了三株高產(chǎn)率的細(xì)胞株，并在上述條件下對(duì)其進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
hGH-(SO)10融合糖蛋白的分離經(jīng)8-10天的培養(yǎng)后，通過(guò)在粗糙的燒結(jié)漏斗上進(jìn)行過(guò)濾，收集經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)基，并補(bǔ)充氯化鈉至終濃度為2M。在4℃下以25,000xG離心20分鐘，獲得不溶性物質(zhì)的團(tuán)塊。通過(guò)疏水性相互作用層析(HIC)，使用在2M氯化鈉中平衡的苯基-瓊脂糖6柱(苯基-瓊脂糖6Fast Flow，16×700mm，AmershamPharmacia Biotech)對(duì)上清液進(jìn)行分級(jí)。將培養(yǎng)基完全加入HIC柱后，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分步洗脫首先使用Tris緩沖液(25mM，pH8.5)/2M氯化鈉，然后使用Tris緩沖液(25mM，pH8.5)/0.8M氯化鈉，接著使用Tris緩沖液(25mM，pH8.5)/0.2N氯化鈉。流速為1.0ml/min，在220nm下用UV檢測(cè)儀監(jiān)控分級(jí)。通過(guò)斑點(diǎn)印跡法和ELISA分析法，分析各洗脫部分中hGH的存在。Tris緩沖液(25mM，pH8.5)/0.2NNaCl部分中含有大部分的hGH-(SO)10融合糖蛋白，將其在4℃下通過(guò)超濾濃縮，用于hGH結(jié)合和活性分析或者用反相色譜法進(jìn)一步純化。
通過(guò)斑點(diǎn)印跡法和ELISA分析法，分析各洗脫部分中hGH的存在。在4℃下通過(guò)超濾來(lái)濃縮獲自HIC柱的含有融合糖蛋白(稱為hGH-(SO)10)的部分，用于hGH結(jié)合和活性分析。通過(guò)反相色譜法，在用緩沖液A(0.1％三氟乙酸)平衡的哈密頓聚合物反相-1(PRP-1)分析柱(4.1×150mm，Hamilton Co.，Reno，NV)上對(duì)HIC富含hGH-(SO)10的部分進(jìn)行進(jìn)一步分級(jí)。用緩沖液B(0.1％三氟乙酸，80％乙腈，v/v)在15分鐘內(nèi)以0-30％B、然后在90分鐘內(nèi)以30-70％B的兩步線性梯度法，以0.5ml/分鐘的流速洗脫蛋白質(zhì)。于220nm下測(cè)定吸光度。
蛋白質(zhì)印跡分析將hGH-(SO)10樣品(10-μg)與等體積的2×還原樣品緩沖液混合，并在4-12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠(BioRad，CA)上進(jìn)行電泳，然后用BioRad微斑點(diǎn)轉(zhuǎn)移單元(mini Trans-Blot cell)將其轉(zhuǎn)移到NitroBind膜上(MSI，Westboro，MA)。在TTBS緩沖液(100mM Tris-HCI，pH 7.5、150mM NaCl和0.1％Tween20)中稀釋兔多克隆抗-hGH抗體到1∶500，在TTBS緩沖液中將堿性磷酸酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG(Sigma)稀釋到1∶1000，將它們分別作為一抗和二抗。
通過(guò)ELISA對(duì)hGH進(jìn)行定量使用夾心hGH ELISA試劑盒(Roche Molecular Biochemicals，Germany)，根據(jù)廠家說(shuō)明書測(cè)定培養(yǎng)基中hGH或柱洗脫液中hGH的濃度。
糖基化組合物和羥脯氨酸配糖體分布通過(guò)氣相色譜層析法，使用Hewlett-Packard HP-5柱(交聯(lián)的5％PH ME硅氧烷，30m×0.32mm×0.25μm)以設(shè)定為130-177℃、1.2℃/分鐘的條件，將中性糖作為糖醇醋酸酯(alditol acetate)進(jìn)行分析。用Hewlett-Packard ChemStation軟件捕獲數(shù)據(jù)。每個(gè)分析使用100μg hGH-(SO)10，50nmol肌醇作為內(nèi)標(biāo)。通過(guò)與間羥基二苯基的反應(yīng)，用比色法對(duì)糖醛酸進(jìn)行分析，將D-葡萄糖醛酸作為標(biāo)準(zhǔn)品。
氨基酸測(cè)序和組成分析在密西根州立大學(xué)的大分子實(shí)驗(yàn)室，用477-A Applied Biosystems Gas測(cè)序儀對(duì)hGH-(SO)10進(jìn)行N端氨基酸序列分析。在用鹽酸水解并隨后用異硫氰酸苯酯進(jìn)行衍生(Bergman，T，Carlquist，M，Jornvall，H(1986)通過(guò)苯基硫代氨基甲酰(phenylthiocarbamyl)衍生物的高效液相色譜法對(duì)氨基酸進(jìn)行分析，Wittmann-liebold B編，《蛋白質(zhì)微測(cè)序分析高級(jí)方法》″Advanced Methods inProtein Microsequence Analysis″。BerlinSpringer-Verlag.p45-55)后，通過(guò)反相HPLC，在Beckman Gold System(Beckman InstrumentsInc.，CA)中對(duì)hGH-(SO)10氨基酸組成進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)如前所述的比色分析法(Kivirikko，K.l.和Liesmaa，M.(1959)，《用于組織水解產(chǎn)物中羥脯氨酸測(cè)定的比色法》，″A colorimetricmethod for determination of hydroxyproline in tissue hydrolysates″，Scandinavian JClin Lab，11128-131)，對(duì)樣品的Hyp含量進(jìn)行分析。
表9hGH-(SO)10的氨基酸組成和N端序列
aAsx包括Asp和Asn；bGlx包括Glu和Gln；c根據(jù)設(shè)計(jì)的hGH(SO)10糖蛋白的肽序列和Hyp鄰接理論進(jìn)行預(yù)測(cè)(Shpak，E.，Leykam，J.F.，和Kieliszewski，M.J.(1999)，Proceedings of the National Academy ofSciences(USA)，9614736-14741；Shpak，E.，Barbar，E.，Leykam，J.F.& Kieliszewski，M.J.J.Biol.Chem.276，11272-11278(2001))上文中的主要序列是完整的hGH-(SP)10的N端，而次要序列則是在hGH-SP10的hGH結(jié)構(gòu)域中于一個(gè)不穩(wěn)定位點(diǎn)(N150-S151)進(jìn)行蛋白質(zhì)水解切割而產(chǎn)生的。在我們的BY-2系統(tǒng)中對(duì)作為目標(biāo)蛋白表達(dá)的hGH進(jìn)行分析，結(jié)果顯示其不含Hyp，這表明我們的融合糖蛋白的hGH僅在SO組件中包含Hyp。這種氨基酸組成表明在211個(gè)氨基酸的序列中有9.5個(gè)Hyp殘基。
hGH-(SO)10的放射受體結(jié)合分析采用單層細(xì)胞表面結(jié)合分析法，對(duì)用HIC(疏水性相互作用層析)分離的hGH-(SP)10進(jìn)行結(jié)合分析。
簡(jiǎn)而言之，使表達(dá)生長(zhǎng)激素受體(GHR)的NIH3T3-L1細(xì)胞在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中生長(zhǎng)至匯合。用純DMEM使細(xì)胞血清饑餓過(guò)夜。在結(jié)合分析之前，在室溫下用1ml含有0.1％BSA的PBS沖洗細(xì)胞2次。在恒量[125I]-hGH(Perkin Elmer)的存在下，于室溫下在定軌振蕩器上，將細(xì)胞與含0.1％BSA的1-mL反應(yīng)體積的不同量的GH制備物一起孵育2小時(shí)。用含有0.1％BSA的1mL冰冷PBS沖洗細(xì)胞3次以終止結(jié)合反應(yīng)。用0.1N NaOH溶解細(xì)胞，并用0.1N HCl進(jìn)行中和，然后采用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞表面結(jié)合放射性。
用hGH-(SP)10-EGFP構(gòu)建物重復(fù)該結(jié)合分析。結(jié)果示于圖30中，結(jié)果顯示即便附著了綠色熒光蛋白，經(jīng)修飾的hGH仍以相對(duì)高的親和力與受體結(jié)合(EC50約為10nM)。該結(jié)果還顯示糖基化基序可位于內(nèi)部；該糖基化基序并非必須位于兩端。
圖31和32所示為市售hGH的hGH-(SP)10的結(jié)果。hGH-(SP)10的EC50為1nM，與市售hGH對(duì)其受體的結(jié)合一致(圖31)。
hGH-(SP)10的體內(nèi)效果為了測(cè)定經(jīng)修飾的生長(zhǎng)激素、hGH-(SP)10和市售hGH(Fitzgerald IndustriesInternational，Inc.34 Junction Square Drive，Concord，MA 01742-3049 USA)的藥理效果和清除速率在小鼠中進(jìn)行了測(cè)試。
對(duì)于這些測(cè)試，用配制于PBS中的GH樣品對(duì)5-6月齡的C57BL/6J小鼠進(jìn)行腹腔注射。分析血漿中的生長(zhǎng)激素和胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(″IGF-1″；由體內(nèi)應(yīng)答生長(zhǎng)激素而釋放)水平。(生長(zhǎng)激素ELISA試劑盒和IGF-1試劑盒均購(gòu)自DiagnosticSystems Laboratories Inc.)測(cè)試1單次注射2μg GH/g體重。在注射后1和4天采集血漿樣品。結(jié)果示于圖33(生長(zhǎng)激素濃度)和34(IGF-1濃度)中。很明顯，hGH-(SP)10在1天測(cè)定中顯示高出很多的濃度，并顯示出顯著增加的半衰期和曲線下面積。IGF-1水平顯示GH的生物效應(yīng)同時(shí)增強(qiáng)并延長(zhǎng)。
在hGH半衰期的另一個(gè)測(cè)試中，給予各組小鼠(2只)單劑的30μg hGH等效物。在直至48小時(shí)的時(shí)間間隔中采集血清樣品(30μl)，并通過(guò)ELISA分析hGH的濃度。結(jié)果示于圖35中，該結(jié)果證明糖基化顯著延長(zhǎng)了血漿半衰期。
測(cè)試22μg GH/g體重/天。每日兩次注射給予生長(zhǎng)激素(經(jīng)修飾的和對(duì)照)，間隔為12小時(shí)，共5天。在首次注射后的1、4、6、8、11和18天后采集血漿樣品。結(jié)果示于圖36和37中。圖36所示為生長(zhǎng)激素的血清濃度；圖37所示為IGF-1的血清濃度。
請(qǐng)?jiān)俅巫⒁獾紾H水平(圖36)在第1天時(shí)相對(duì)于市售生長(zhǎng)激素制劑是如何地?zé)o顯著差異，而糖基化形式則在第1天時(shí)就具有了高出很多的濃度。在末次給藥(第5天時(shí))后，市售生長(zhǎng)激素的生物效應(yīng)在5天內(nèi)基本停止(如圖37所示)，而糖基化形式則在末次給藥后的超過(guò)2周內(nèi)，持續(xù)產(chǎn)生可測(cè)定的IGF-1水平。這些結(jié)果表明這可能成為已開發(fā)的生長(zhǎng)激素中最長(zhǎng)效的生長(zhǎng)激素。
測(cè)試31μg GH/g體重/天。每日單次注射給予GH，共5天，在首次注射1、4、7、9和11天后采集血漿樣品。結(jié)果示于圖38和39中。即使是這一較低的劑量，在市售生長(zhǎng)激素和本發(fā)明的糖基化形式間仍然觀察到了顯著的差異。
測(cè)試4hGH-(SO)10對(duì)整體生長(zhǎng)的影響將7-8周齡的小時(shí)隨機(jī)分為3個(gè)治療組，即對(duì)照(n＝3)、hGH(n＝3)和hGH-(SO)10(n＝4)。將小鼠2或3只一組分籠飼養(yǎng)。在PBS中配制100μg/ml的hGH(Fittzgerald，Concord MA)和hGH-(SO)10。每日2次于上午9點(diǎn)和下午9點(diǎn)時(shí)，給予小鼠總劑量為1μg/g體重的腹腔內(nèi)注射，共6天。在1天的間隔后，將劑量提高到2μg/g體重，再給藥7天。
圖40所示為測(cè)試中小鼠的增重。簡(jiǎn)而言之，對(duì)照小鼠在2周期間平均增重0.83g。在兩周期間，接受hGH的小鼠平均增重2.13g，而接受hGH-(SO)10的小鼠增重2.15g。hGH和hGH-(SO)10相對(duì)于對(duì)照小鼠的增重是明顯的(p＜0.05，ANOVA)，而在hGH和hGH-(SO)10處理中不存在顯著差異。
hGH-(SO)10的免疫原性分析將hGH-(SO)10注射入小鼠以測(cè)試其相對(duì)于野生型生長(zhǎng)激素的免疫原性。
免疫方案給2只雌性Balb/C小鼠(6-7周齡)放血，并每隔2周進(jìn)行免疫，共免疫4次。在各鼠的兩個(gè)部位(右和左肋，0.05mL/部位)皮下給予50μghGH-(SP)10。將血清冷凍于-20℃下直至用ELISA對(duì)抗體活性進(jìn)行分析。
ELISA方案在EIA板(NUNC聚苯乙烯)中涂覆40μg/mL免疫原(hGH-(SP)10)(溶于碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液(pH9.0))，50μL/孔，并靜置過(guò)夜。僅用緩沖液、僅用(SP)10(20μg/mL)或僅用hGH(20μg/mL)涂覆等數(shù)量的孔。傾析(decant)免疫原，并于室溫下在每孔中加入200μL PBS-5％BSA(+0.05％Tween-20)2小時(shí)以封閉非特異性結(jié)合。
傾析BSA并在各孔中加入50μL(用免疫原涂覆的孔和未經(jīng)涂覆的孔各重復(fù)2孔)僅PBS-1％BSA或小鼠血清的PBS-BSA稀釋物。在各板上將獲自同一小鼠的免疫前血清和時(shí)間最近的血清樣品進(jìn)行比較。
孵育在室溫下進(jìn)行4小時(shí)或在4℃下過(guò)夜。用PBS-Tween洗滌各孔4次。
向各孔中加入過(guò)氧化氫酶偶聯(lián)的羊抗鼠Ig(均為同種型)在PBS-BSA中的1∶5000的稀釋液50μl，室溫下1小時(shí)。對(duì)孔進(jìn)行4次洗滌。
加入50μL/孔的OPD底物(溶于檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH6))進(jìn)行顯像。當(dāng)觀察到背景與樣品間良好的對(duì)比度時(shí)，加入50μl/孔的12.5％硫酸以終止反應(yīng)。在490nm處讀取ELISA。
解釋說(shuō)明在單次注射hGH后，兩只小鼠均對(duì)hGH顯示出強(qiáng)烈的抗體應(yīng)答。抗體水平隨反復(fù)注射上升。
在第2和第3次注射后，兩只小鼠對(duì)經(jīng)純化的(SP)10具有可臨界性檢測(cè)的抗體。該低應(yīng)答性可能是由純化的(SP)10抗原對(duì)ELISA板的低結(jié)合性而導(dǎo)致的檢測(cè)較差造成的(見下文)，這將降低可觀察到的反應(yīng)。
兩只小鼠對(duì)hGH-SP 10偶聯(lián)物抗原均具有意想不到的高抗體水平，甚至在進(jìn)行免疫之前。免疫前血清不與經(jīng)純化的(SP)10或hGH單獨(dú)反應(yīng)，可將之解釋為所述小鼠具有預(yù)成性抗(SP)10抗體，這是一種對(duì)曾經(jīng)遇到過(guò)的某些其它抗原的交叉反應(yīng)性抗體。有可能僅當(dāng)與hGH偶聯(lián)時(shí)才檢測(cè)得到，這是由于hGH-(SP)10偶聯(lián)物強(qiáng)烈附著于ELISA板，使得對(duì)抗(SP)10抗體的檢測(cè)更佳。雖然這是一種推測(cè)，但這與在其它小鼠中觀察到的不經(jīng)免疫由植物材料產(chǎn)生的背景應(yīng)答的現(xiàn)象是一致的。
用hGH涂覆的板的OD值高于用hGH-(SP)10涂覆的板，這可反映出兩板之間的差異性識(shí)別或僅僅反映出兩板上被識(shí)別的決定簇的不同水平。
表10
還用以hGH-(SO)10-涂覆的板、抗-hGH-(SO)10抗體(1∶10,000血清稀釋物)，以100μl/ml(SO)10作為抗體結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)抑制劑進(jìn)行了競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)。觀察到5％的反應(yīng)抑制率。
綜上所述，在命名為hGH-(SO)10的hGH融合糖蛋白的C端包含10段串聯(lián)重復(fù)的糖基化位點(diǎn)Ser-Hyp(SO)，這些位點(diǎn)引導(dǎo)鼠李糖葡萄糖阿拉伯半乳聚糖(rhamnoglucuronoarabinogalactan)多糖加入到各Hyp殘基，并將hGH的分子質(zhì)量從22kDa提高到約50kDa，將循環(huán)半衰期從分鐘級(jí)提高到數(shù)小時(shí)或甚至數(shù)天。hGH-(SO)10的EC50為1nM，與野生型GH結(jié)合其受體的EC50一致；此外，hGH-(SO)10在培養(yǎng)細(xì)胞中刺激了JAK 5的磷酸化，并最終產(chǎn)生與野生型hGH相同的生理應(yīng)答。對(duì)皮下注射入小鼠的hGH-(SO)10抗原性的初步評(píng)估表明其抗原性不超過(guò)野生型生長(zhǎng)激素。
在考慮了說(shuō)明書和本文所揭示的本發(fā)明實(shí)踐后，本發(fā)明的其它實(shí)施方式對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。應(yīng)僅將說(shuō)明書和實(shí)施例理解為示例，而本發(fā)明真正的范圍和精神是由下述的權(quán)利要求所闡明的。
權(quán)利要求
1.一種核酸構(gòu)建物，其用于在植物中表達(dá)至少一種生物活性蛋白，所述核酸構(gòu)建物包括a)至少一種編碼糖基化位點(diǎn)的核酸序列；和b)至少一種編碼生物活性蛋白的核酸序列。
2.一種植物來(lái)源的生物活性哺乳動(dòng)物融合糖蛋白，所述糖蛋白包括a)至少一種糖組件，其共價(jià)連接于b)哺乳動(dòng)物生物活性蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的植物來(lái)源的生物活性哺乳動(dòng)物融合蛋白，其特征在于，所述至少一種糖組件選自i)X-Hypn或X-Pro-Hypn，其中n為2-約1000；ii)Hypn-X，其中n為2-約1000；iii)(Hyp-X)n，其中n為1-約1000；和iv)(X-Hyp)n，其中n為1-約1000；其中X為任何氨基酸。
4.如權(quán)利要求3所述的植物來(lái)源的生物活性哺乳動(dòng)物融合蛋白，其特征在于，對(duì)于糖組件X-Hypn、Hypn-X、(Hyp-X)n和(X-Hyp)n，所述X選自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val。
5.如權(quán)利要求4所述的植物來(lái)源的生物活性哺乳動(dòng)物融合蛋白，其特征在于，所述X選自Ser、Ala、Thr和Val。
6.如權(quán)利要求3所述的植物來(lái)源的生物活性哺乳動(dòng)物融合蛋白，其特征在于，所述至少一種糖組件共價(jià)連接于選自所述蛋白質(zhì)N端和C端的位置。
7.如權(quán)利要求3所述的植物來(lái)源的生物活性哺乳動(dòng)物融合蛋白，其特征在于，所述至少一種糖組件在所述生物活性哺乳動(dòng)物蛋白的內(nèi)部。
8.如權(quán)利要求2所述的植物來(lái)源的生物活性哺乳動(dòng)物融合蛋白，其特征在于，所述生物活性哺乳動(dòng)物蛋白選自生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng)激素拮抗物、生長(zhǎng)激素釋放激素、生長(zhǎng)激素抑制素、ghrelin、來(lái)普汀、催乳素、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、白介素-10、多效素、白介素-7、白介素-8、干擾素Ω、干擾素-α2、干擾素γ、白介素-1、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子6、IFG-1、胰島素樣生長(zhǎng)因子1、胰島素、促紅細(xì)胞生成素、GMCSF以及任何人源化單克隆抗體，其中所述糖組件包括i)X-Hypn、X-Pro-Hypn或Hypn-X，其中n為2-約1000；和ii)(X-Hyp)n或(Hyp-X)n，其中n為1-約1000；且其中，X為任何氨基酸。
9.如權(quán)利要求8所述的植物來(lái)源的生物活性哺乳動(dòng)物融合蛋白，其特征在于，對(duì)于糖組件X-Hypn、Hypn-X、(Hyp-X)n和(X-Hyp)n，所述X選自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val。
10.如權(quán)利要求9所述的植物來(lái)源的生物活性哺乳動(dòng)物融合蛋白，其特征在于，所述X選自Ser、Ala、Thr和Val。
11.如權(quán)利要求8所述的植物來(lái)源的生物活性哺乳動(dòng)物融合蛋白，其特征在于，所述生物活性哺乳動(dòng)物蛋白是人蛋白質(zhì)。
12.如權(quán)利要求8所述的植物來(lái)源的生物活性哺乳動(dòng)物融合蛋白，其特征在于，所述糖組件包括(X-Hyp)n或(Hyp-X)n，其中X選自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val。
13.如權(quán)利要求12所述的植物來(lái)源的生物活性哺乳動(dòng)物融合蛋白，其特征在于，所述X選自Ser、Ala、Thr和Val。
14.如權(quán)利要求13所述的植物來(lái)源的生物活性哺乳動(dòng)物融合蛋白，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是人生長(zhǎng)激素，且所述糖組件包括(Ser-Hyp)10。
15.如權(quán)利要求2所述的植物來(lái)源的生物活性哺乳動(dòng)物融合蛋白，其特征在于，所述融合糖蛋白共價(jià)連接于至少一種碳水化合物分子。
16.一種提高蛋白質(zhì)分子水溶性的方法，所述方法包括制備一種編碼如下物質(zhì)的核酸序列a)至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)；和b)至少一種蛋白質(zhì)；并將該核酸構(gòu)建物作為融合糖蛋白表達(dá)；其中所述糖蛋白的碳水化合物部分占所述糖蛋白分子量的大于或等于約10％。
17.如權(quán)利要求16所述的提高蛋白質(zhì)分子水溶性的方法，其特征在于，所述糖蛋白的碳水化合物部分占所述糖蛋白分子量的大于或等于約50％。
18.如權(quán)利要求17所述的提高蛋白質(zhì)分子水溶性的方法，其特征在于，所述糖蛋白的碳水化合物部分占所述糖蛋白分子量的大于或等于約75％。
19.如權(quán)利要求18所述的提高蛋白質(zhì)分子水溶性的方法，其特征在于，所述糖蛋白的碳水化合物部分占所述糖蛋白分子量的大于或等于約90％。
20.一種生產(chǎn)生物活性融合蛋白的方法，所述方法包括在植物中將編碼如下物質(zhì)的至少一種核酸序列表達(dá)為糖蛋白a)至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)；和b)至少一種生物活性蛋白；其中，所述糖蛋白的分子量大于或等于約10kD，且其中所述糖蛋白的碳水化合物部分占所述糖蛋白分子量的大于或等于約10％。
21.如權(quán)利要求20所述的生產(chǎn)生物活性融合蛋白的方法，其特征在于，所述至少一種生物活性蛋白選自胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)激素抑制素、生長(zhǎng)激素釋放激素、ghrelin、催乳素、胎盤催乳素、生長(zhǎng)激素和生長(zhǎng)激素拮抗物。
22.如權(quán)利要求20所述的生產(chǎn)生物活性融合蛋白的方法，其特征在于，所述糖蛋白的分子量大于或等于約35kD。
23.如權(quán)利要求22所述的生產(chǎn)生物活性融合蛋白的方法，其特征在于，所述糖蛋白的分子量大于或等于約40kD。
24.如權(quán)利要求23所述的生產(chǎn)生物活性融合蛋白的方法，其特征在于，所述糖蛋白的分子量大于或等于約45kD。
25.如權(quán)利要求20所述的生產(chǎn)生物活性融合蛋白的方法，其特征在于，所述糖蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)半衰期大于相應(yīng)的野生型蛋白質(zhì)的藥代動(dòng)力學(xué)半衰期。
26.如權(quán)利要求20所述的生產(chǎn)生物活性融合蛋白的方法，其特征在于，所述至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)選自i)X-Pron或Pron-X，其中n為6-約100；和ii)(X-Pro)n或(Pro-X)n，其中n為6-約100；其中X為任何氨基酸。
27.如權(quán)利要求26所述的生產(chǎn)生物活性融合蛋白的方法，其特征在于，所述X選自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val。
28.如權(quán)利要求27所述的生產(chǎn)生物活性融合蛋白的方法，其特征在于，所述X選自Ser、Ala、Thr和Val。
29.如權(quán)利要求20所述的生產(chǎn)生物活性融合蛋白的方法，其特征在于，所述生物活性蛋白是生長(zhǎng)激素，且所述糖蛋白包括(Ser-Hyp)10。
30.如權(quán)利要求29所述的生產(chǎn)生物活性融合蛋白的方法，其特征在于，所述(Ser-Hyp)10共價(jià)連接于所述生長(zhǎng)激素的C端。
31.如權(quán)利要求29或30中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)生物活性融合蛋白的方法，其特征在于，所述生長(zhǎng)激素是人生長(zhǎng)激素。
32.一種注射用藥物制劑，所述藥物制劑包括糖基化人生長(zhǎng)激素；且不含選自下組的至少一種賦形劑甘露醇、山梨醇、海藻糖、葡萄糖、甘氨酸、亮氨酸、三亮氨酸、組氨酸和磷脂。
33.如權(quán)利要求32所述的注射用藥物制劑，其特征在于，所述糖基化人生長(zhǎng)激素包括選自下組的糖組件i)X-Pro-Hypn、X-Hypn或Hypn-X，其中n為6-約100；和ii)(X-Hyp)n或(Hyp-X)n，其中n為6-約100；其中，在糖組件X-Pro-Hypn中，X為任何氨基酸；而對(duì)于糖組件X-Hypn、Hypn-X、(Hyp-X)n和(X-Hyp)n，X選自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val。
34.如權(quán)利要求33所述的注射用藥物制劑，其特征在于，所述糖基化生長(zhǎng)激素包括(X-Hyp)n或(Hyp-X)n，其中n為6-約20；其中，X選自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val。
35.如權(quán)利要求34所述的注射用藥物制劑，其特征在于，X選自Ser、Ala、Thr和Val。
36.一種糖基化人生長(zhǎng)激素的凍干粉末制劑，其具有大于或等于約10mg/ml的溶解度，其中所述制劑不含選自下組的至少一種賦形劑甘露醇、山梨醇、海藻糖、葡萄糖、甘氨酸、亮氨酸、三亮氨酸、組氨酸和磷脂。
37.如權(quán)利要求36所述的凍干粉末制劑，其特征在于，所述制劑不含甘露醇、山梨醇、海藻糖、葡萄糖、甘氨酸、亮氨酸、三亮氨酸和磷脂。
38.一種提高植物中生產(chǎn)蛋白質(zhì)的產(chǎn)率的方法，所述方法包括制備編碼以下物質(zhì)的核酸構(gòu)建物a)至少一種信號(hào)肽的核酸編碼序列；b)至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的核酸編碼序列；和c)至少一種蛋白質(zhì)的核酸編碼序列；并將所述核酸構(gòu)建物表達(dá)為糖蛋白。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)選自i)X-Pron或Pron-X，其中n為2-約1000；和ii)(X-Pro)n或(Pro-X)n，其中n為1-約1000；其中X為任何氨基酸。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述X選自Gly、Lys、Ser、Thr、Ala和Val。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述X選自Ser、Ala、Thr和Val。
42.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述核酸構(gòu)建物不含編碼綠色熒光蛋白的核酸序列。
43.一種根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。
44.一種共價(jià)連接于包含至少一種糖組件的氨基酸序列的人生長(zhǎng)激素分子，其中，所述糖組件選自i)X-Hypn或X-Pro-Hypn，其中n為4-約100；ii)Hypn-X，其中n為4-約100；iii)(Hyp-X)n，其中n為4-約100；和iv)(X-Hyp)n，其中n為4-約100；其中，在糖組件X-Pro-Hypn中，X為任何氨基酸；而對(duì)于糖組件X-Hypn、Hypn-X、(Hyp-X)n和(X-Hyp)n，X選自Ser、Ala、Thr和Val。
45.一種共價(jià)連接于包含至少一種糖組件的氨基酸序列的人生長(zhǎng)激素拮抗物分子，其中，所述糖組件選自i)X-Hypn或X-Pro-Hypn，其中n為4-約100；ii)Hypn-X，其中n為4-約100；iii)(Hyp-X)n，其中n為4-約100；和iv)(X-Hyp)n，其中n為4-約100；其中，在糖組件X-Pro-Hypn中，X為任何氨基酸；而對(duì)于糖組件X-Hypn、Hypn-X、(Hyp-X)n和(X-Hyp)n，X選自Ser、Ala、Thr和Val。
46.一種治療患有生長(zhǎng)激素不足或機(jī)能不全的患者的方法，所述方法包括給予治療有效量的糖基化人生長(zhǎng)激素。
47.如權(quán)利要求46所述的治療患者的方法，其特征在于，所述生長(zhǎng)激素如權(quán)利要求44所述。
48.一種治療患有人生長(zhǎng)激素過(guò)量或生長(zhǎng)激素活性過(guò)度的患者的方法，所述方法包括給予治療有效量的糖基化生長(zhǎng)激素拮抗物。
49.如權(quán)利要求48所述的治療患者的方法，其特征在于，所述生長(zhǎng)激素如權(quán)利要求45所述。
50.一種治療患有I型或II型糖尿病的患者的方法，所述方法包括給予治療有效量的糖基化胰島素。
51.如權(quán)利要求50所述的治療患者的方法，其特征在于，所述糖基化胰島素包括至少一種選自下組的糖組件i)X-Hypn或X-Pro-Hypn，其中n為4-約100；ii)Hypn-X，其中n為4-約100；iii)(Hyp-X)n，其中n為4-約100；和iv)(X-Hyp)n，其中n為4-約100；其中，在糖組件X-Pro-Hypn中，X為任何氨基酸；而對(duì)于糖組件X-Hypn、Hypn-X、(Hyp-X)n和(X-Hyp)n，X選自Ser、Ala、Thr和Val。
52.一種在哺乳動(dòng)物中預(yù)防過(guò)敏性免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括對(duì)所述動(dòng)物進(jìn)行至少一次給藥，以給予其植物來(lái)源的融合糖蛋白，所述融合糖蛋白包括a)至少一種糖組件，其共價(jià)連接于b)生物活性蛋白；其中所述至少一種糖組件選自X-Hypn和X-Pro-Hypn，其中n為2-約1000，且其中X為任何氨基酸。
53.如權(quán)利要求52所述的預(yù)防過(guò)敏性免疫反應(yīng)的方法，其特征在于，所述X選自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val。
54.一種延長(zhǎng)生物活性融合蛋白半衰期的方法，所述方法包括在植物中將編碼以下物質(zhì)的至少一種核酸序列表達(dá)為糖蛋白a)至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)；和b)至少一種生物活性蛋白；其中，所述糖蛋白的分子量大于或等于約10kD，且其中所述糖蛋白的碳水化合物部分占所述糖蛋白分子量的大于或等于約10％。
55.如權(quán)利要求54所述的延長(zhǎng)生物活性融合蛋白分子半衰期的方法，其特征在于，所述至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)選自i)X-Pron或Pron-X，其中n為6-約100；和ii)(X-Pro)n或(Pro-X)n，其中n為6-約100；其中X為任何氨基酸。
56.如權(quán)利要求55所述的生產(chǎn)生物活性融合蛋白分子的方法，其特征在于，所述X選自Lys、Ser、Ala、Thr、Gly和Val。
57.如權(quán)利要求56所述的生產(chǎn)生物活性融合蛋白的方法，其特征在于，所述X選自Ser、Ala、Thr和Val。
全文摘要
提高重組蛋白的植物表達(dá)產(chǎn)率的方法，該方法包括利用植物中驅(qū)動(dòng)翻譯后修飾的密碼子，將糖基化位點(diǎn)經(jīng)工程化插入表達(dá)蛋白的克隆的基因或cDNA中；和工程化所述克隆的基因或cDNA，以使其包含靶向基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))以用于分泌的植物分泌信號(hào)序列。該方法提高了重組糖基化蛋白的產(chǎn)率。揭示了用這些方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1930189SQ200580007911
公開日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2005年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月14日
發(fā)明者M·J·基利斯?jié)删S斯基, 許建峰, J·科普切克, 岡田茂 申請(qǐng)人:俄亥俄州立大學(xué)