專利名稱：雌激素受體和使用方法
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政府資助本文所述的發(fā)明是在健康和人類服務(wù)部(Department of Healthand Human Services)資助號CA84328的支持下完成的。美國政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
雌激素是在卵巢、睪丸和可能的腎上腺皮質(zhì)中形成的類固醇化合物的總稱。雌激素和具有雌激素活性的化合物的實(shí)例包括二乙基己烯雌酚、己烯雌酚二磷酸酯、己雌酚、聚磷酸雌二醇、溴苯雌酚、氯烯雌醚、己二烯雌酚、二乙基己烯雌酚、丙甲雌酚、雙醋羥雌酮、6，9-去氫馬烯雌酮、馬烯雌酮、雌二醇、雌三醇、雌酮、乙炔雌二醇、美雌醇、mexestrol、雌三醇環(huán)戊醚和炔雌醚。雌激素調(diào)節(jié)生殖組織和乳房、心血管、骨、肝和腦組織中的多種生理過程。雌激素也用在口服避孕藥中。雌激素的其它用途包括，緩解絕經(jīng)的不適，抑制泌乳，和治療骨質(zhì)疏松癥、先兆流產(chǎn)和各種功能性卵巢病癥?？勾萍に厮幈挥糜谥委熮D(zhuǎn)移性乳腺癌和晚期前列腺癌。
雌激素的作用由雌激素受體介導(dǎo)。在1986年克隆了首個(gè)雌激素受體(ER)(Green等，Nature，320134(1986)和Greene等，Science，2311150(1986))。在1995年之前，認(rèn)為僅有一個(gè)負(fù)責(zé)天然的和合成的雌激素和抗雌激素藥的所有生理和藥理作用的雌激素受體。然而，在1995年，克隆了第二個(gè)雌激素受體(Kuiper等，PNAS，935925(1996))。發(fā)現(xiàn)的首個(gè)雌激素受體現(xiàn)在稱作雌激素受體-α(ER-α)，而第二個(gè)雌激素受體稱作雌激素受體-β(ER-β)。
ER-α和ER-β共有共同的結(jié)構(gòu)體系(Zhang等，F(xiàn)EBS Letters，54617(2003)和Kong等，Biochem.Soc.Trans.，3156(2003))。二者都由3個(gè)獨(dú)立的但是能相互作用的功能結(jié)構(gòu)域組成N-末端A/B結(jié)構(gòu)域、C或DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和D/E/F或配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(

圖1)。ER-α的N-末端結(jié)構(gòu)域編碼獨(dú)立于配體的激活功能(AF-1)，即參加與輔激活物的相互作用和靶基因的轉(zhuǎn)錄活化的區(qū)域。DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或C結(jié)構(gòu)域含有2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，其在受體二聚化和與特定的DNA序列的結(jié)合中起重要作用。C-末端D/E/F結(jié)構(gòu)域是一種配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其能介導(dǎo)配體結(jié)合、受體二聚化、核轉(zhuǎn)位和配體-依賴性的反式激活功能(AF-2)。AF-1和AF-2對轉(zhuǎn)錄控制的相對貢獻(xiàn)以細(xì)胞特異性的和DNA啟動(dòng)子特異性的方式變化(Berry等，EMBO J.，92811(1990)和Tzukerman等，Mol.Endocrin.，821(1994))。
已經(jīng)表明，缺少ER-α基因的全長基因產(chǎn)物的前173個(gè)氨基酸的46-kDa ER-α同種型(A/B或AF-1結(jié)構(gòu)域)，源自跳過外顯子1的ER-α基因的可變剪接(Flouriot等，EMBO J.，194688(2000))。該可變剪接事件會(huì)產(chǎn)生mRNA，其在有利于翻譯起始的Kozak序列內(nèi)具有與原始可讀框的剩余部分符合讀框的AUG。因此，ER-α的該新同種型稱作ER-α46，而原始同種型稱作ER-α66(Flouriot等，EMBO J.，194688(2000))。ER-α46形成同二聚體，并結(jié)合雌激素反應(yīng)元件(ERE)，且它也可以與ER-α66形成異二聚體(Flouriot等，EMBO J.，194688(2000))。與ER-α66同二聚體相比，ER-α46同二聚體表現(xiàn)出更高的對ERE的親和力。而且，ER-α46/66異二聚體比ER-α66同二聚體優(yōu)先形成，且ER-α46競爭地起作用，以抑制由結(jié)合了配體的-ER-α66的AF-1結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的反式激活，但是不影響AF-2-依賴性的反式激活(Floutiot等，EMBO J.，194688(2000))。因此，認(rèn)為ER-α46是天然產(chǎn)生的ER-α同種型，其調(diào)節(jié)由ER-α66的AF-1結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的雌激素信號傳導(dǎo)。
ER-α能在大約15-30％內(nèi)腔(luminal)上皮細(xì)胞中表達(dá)，但是根本不在正常人乳房中的任何其它細(xì)胞類型中表達(dá)。雙標(biāo)記免疫熒光技術(shù)揭示，在正常的人和嚙齒動(dòng)物乳腺中，ER-α-表達(dá)細(xì)胞能與用增殖標(biāo)記物標(biāo)記的細(xì)胞分開(Clarke等，Cancer Res.，574987(1997))。在導(dǎo)管增生的最早期，ER-α表達(dá)會(huì)增加，甚至隨著異型的增加而增加更多，從而在低和中等核級的不典型導(dǎo)管增生和原位導(dǎo)管癌中的大部分細(xì)胞含有ER-α(Khan等，Cancer Res.，54993(1994)和Lawson等，Lancet，3511787(1994))。隨著ER-α表達(dá)的增加，受體表達(dá)和細(xì)胞增殖之間的反相關(guān)變得調(diào)節(jié)異常(Shoker等，Amer.Jour.Path.，1551811(1999))。大約70％的侵入性乳腺癌表達(dá)ER-α，且這些腫瘤中的大部分含有ER-α-陽性的增殖細(xì)胞(Clarke等，Cancer Res.，574987(1997))。
雌激素受體是能控制許多生理過程的配體-活化的轉(zhuǎn)錄因子核受體超家族的成員。該控制經(jīng)常通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄來發(fā)生(Katzenellenbogen和Katzenellenbogen，Breast Cancer Res.，2335(2000)；Hull等，J.Biol.Chem.，27636869(2001)；McDonnell和Norris，Science，2961642(2002))。雌激素受體使用多種機(jī)理，以激活或抑制它的靶基因的轉(zhuǎn)錄。這些機(jī)理包括(a)在雌激素反應(yīng)元件處，配體-占據(jù)的受體與DNA的直接相互作用，隨后是轉(zhuǎn)錄輔調(diào)節(jié)物(coregulator)或介質(zhì)復(fù)合物的募集，(b)配體-占據(jù)的ER與其它轉(zhuǎn)錄因子相互作用，所述其它轉(zhuǎn)錄因子例如AP-1(Kushner等，J.SteroidBiochem.Mol.Biol.，74311(2000))、Sp1(Safe，Vitam.Horm.，62231(2001))或NF-κB(McKay和Cidlowski，Endocr.Rev.，20435(1999))，或(c)通過隔離一般的/普通的轉(zhuǎn)錄組分，間接調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄(Harnish等，Endocrinology，1413403(2000)和Speir等，Circ.Res.，871006(2000))。另外，雌激素受體通過這些不同的機(jī)理調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的能力，似乎是細(xì)胞類型特異性的，可能是由于在每種細(xì)胞類型中可得到的轉(zhuǎn)錄輔調(diào)節(jié)因子的補(bǔ)體的差異(Cerillo等，J.Steroid Biochem.Mol.Biol.，6779(1998)；Evans等，Circ.Res.，89823(2001)；Maret等，Endocrinology，1402876(1999))。同樣，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)依賴于配體的性質(zhì)，其中各種天然的和合成的選擇性的雌激素受體調(diào)節(jié)劑，通過這些不同機(jī)理中的每一種，起雌激素受體激動(dòng)劑或拮抗劑的作用(Shang和Brown，Science，2952465(2002)；Katzenellenbogen和Katzenellenbogen，Science，2952380(2002)；Margeat等，J.Mol.Biol.，32677(2003)；Dang等，J.Biol.Chem.，278962(2003))。
存在由雌激素介導(dǎo)的另一個(gè)信號傳導(dǎo)途徑，也稱作“非經(jīng)典的”、“非基因組的”或“膜信號傳導(dǎo)”途徑，其包含胞質(zhì)蛋白、生長因子和其它膜-啟動(dòng)的信號傳導(dǎo)途徑(Segars等，Trends Endocrin.Met.，13349(2002))。已經(jīng)表明，幾種細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)途徑能與快速的雌激素-啟動(dòng)的作用通訊腺苷酸環(huán)化酶途徑(Aronica等，PNAS，918517(1994))、磷脂酶C途徑(Le Mellay等，J.Cell.Biochem.，75138(1999))、G-蛋白-偶聯(lián)的受體-活化的途徑(Razandi等，Mol.Endocrin.，13307(1999))和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑(Watters等，Endocrinology，1384030(1997))。但是，迄今為止描述的所有膜形式，都與ER-α有關(guān)，但與ER-β無關(guān)(Segars等，TrendsEndocrin.Met.，13349(2002))。
病理上，雌激素信號傳導(dǎo)已經(jīng)與乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)(Summer和Fuqua，Semin.Cancer Biol.，11339(2001)；Turner等，Endocr.Rev.，15275(1994)；Farhat等，F(xiàn)ASEB J.，10615(1996)；Beato等，Cell，83851(1995)；Dobrzycka等，Endo.Rel.Cancer，10517(2003))。結(jié)果，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)雌激素受體是大多數(shù)這樣的癌癥的開始和發(fā)展所必需的。雌激素受體-陽性的乳腺癌的當(dāng)前內(nèi)分泌療法主要針對雌激素水平、雌激素受體水平或雌激素和雌激素受體的活性設(shè)計(jì)。在早期乳腺癌的管理中，部分的抗雌激素藥他莫昔芬的使用，已經(jīng)清楚地證實(shí)了無疾病和總存活的增加。另外，近期的研究證實(shí)，他莫昔芬可以用作激素-依賴性的乳腺癌的化學(xué)預(yù)防劑。使用他莫昔芬的長期療法的主要問題是它的親子宮作用，這會(huì)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌的高風(fēng)險(xiǎn)，和對他莫昔芬的獲得性臨床抗性。這已經(jīng)導(dǎo)致了對更好的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)的迫切尋求，所述調(diào)節(jié)劑在各種雌激素反應(yīng)靶組織中表現(xiàn)出最佳的激動(dòng)或拮抗活性。
因此，需要可以用于篩選能調(diào)節(jié)雌激素信號傳導(dǎo)的其它方法和材料，以及可以用于調(diào)節(jié)雌激素信號傳導(dǎo)的方法和材料。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了分離的抗體，其能特異性地結(jié)合SEQ ID NO1所述的氨基酸序列，或其免疫原性片段，優(yōu)選地，SEQ ID NO1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列?？贵w可以是單克隆抗體或多克隆抗體。任選地，抗體是人源化的抗體?？贵w可以共價(jià)地附著化合物，例如，化療劑或檢測標(biāo)記例如熒光標(biāo)記?？贵w可以存在于組合物中，且組合物可以包含藥學(xué)上可接受的載體。還提供了試劑盒，其包含本發(fā)明的抗體。
本發(fā)明也提供了制備抗體的方法?？贵w可以是多克隆的或單克隆的。該方法包括，給動(dòng)物施用具有SEQ ID NO1所述的氨基酸序列的多肽，或其免疫原性片段，優(yōu)選地，SEQ ID NO1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列。該方法還包括從動(dòng)物分離抗體，其中該分離的抗體能特異性地結(jié)合氨基酸序列。多肽或其免疫原性亞基可以共價(jià)地附著載體多肽。分離可以包括，從動(dòng)物得到產(chǎn)生該抗體的細(xì)胞，和使用該細(xì)胞制備能產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。本發(fā)明還包括通過該方法生產(chǎn)的多克隆抗體和通過該方法生產(chǎn)的單克隆抗體。
本發(fā)明也涉及包含外源編碼區(qū)的細(xì)胞，其中該編碼區(qū)編碼包含SEQ ID NO20的多肽。編碼區(qū)可以編碼具有與SEQ ID NO20具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽，其中該多肽具有ER-α36活性。編碼區(qū)可以可操作地連接到組成型啟動(dòng)子。細(xì)胞可以是真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。本發(fā)明還提供了表達(dá)這樣的多肽的細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了鑒別結(jié)合多肽的試劑的方法。該方法包括，組合包含SEQ ID NO1所述的氨基酸序列的多肽和試劑，檢測試劑和多肽之間的復(fù)合物形成，檢測多肽活性的改變，或其組合。通過直接檢測試劑與多肽的結(jié)合，使用競爭結(jié)合測定檢測試劑與多肽的結(jié)合，或其組合，可以檢測試劑與多肽的結(jié)合。任選地，該方法也包括，確定試劑是否結(jié)合包含SEQ ID NO18的多肽。
本發(fā)明還提供了檢測多肽的方法。一方面，該方法包括提供細(xì)胞，分析細(xì)胞中具有ER-α36活性和36kDa分子量的多肽，所述分子量如按照在十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠上電泳測得的，和確定細(xì)胞是否表達(dá)該多肽。細(xì)胞可以是離體的(ex vivo)或體內(nèi)的。細(xì)胞可以是，例如，腫瘤細(xì)胞，例如乳腺腫瘤細(xì)胞。分析可以包括，使細(xì)胞接觸能特異性地結(jié)合SEQ ID NO1所述的氨基酸序列，或其免疫原性片段的抗體。分析可以包括，擴(kuò)增mRNA多核苷酸，以形成擴(kuò)增的多核苷酸。擴(kuò)增包括，使從細(xì)胞得到的多核苷酸接觸引物對，后者能擴(kuò)增mRNA多核苷酸，其包括SEQ ID NO22或SEQID NO25，或其組合，其中擴(kuò)增的多核苷酸的存在表明該細(xì)胞表達(dá)多肽。引物對的一個(gè)引物可以選自SEQ ID NO22的核苷酸，與SEQID NO25的核苷酸互補(bǔ)的核苷酸，或其組合。
本發(fā)明也提供了抑制細(xì)胞的ER-α36活性的方法。該方法包括，使表達(dá)具有SEQ ID NO1所述的氨基酸序列的多肽的細(xì)胞接觸能抑制ER-α36活性的化合物。這樣的化合物可以是能特異性地結(jié)合具有SEQ ID NO1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列的多肽的抗體。細(xì)胞可以是體內(nèi)的或離體的，且任選地可以是ER-α66陰性的，ER-α46陰性的，或其組合。在有些方面，化合物不是抗雌激素藥。
本發(fā)明還提供了分離的多肽，其包含SEQ ID NO1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列，優(yōu)選地SEQ ID NO1所述的氨基酸序列，更優(yōu)選地，SEQ ID NO20所述的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，分離的多核苷酸與SEQ ID NO20具有至少70％同一性，其中該多肽具有ER-α36活性。本發(fā)明也包括SEQ ID NO1的免疫原性片段。
當(dāng)這些術(shù)語出現(xiàn)在說明書和權(quán)利要求書中時(shí)，術(shù)語“包含”和其變體不具有限制含義。除非另有限定，可互換地使用“一個(gè)(a)”、“一個(gè)(an)”、“該(the)”和“至少一個(gè)”，且指一個(gè)或多于一個(gè)。
附圖簡述圖1解釋了人雌激素受體-α(ER-α)同種型的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)代表。顯示了結(jié)構(gòu)域(用A-F標(biāo)記的)、氨基酸序列編號、AF-1和AF-2、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和二聚化結(jié)構(gòu)域。也指示了磷酸化位點(diǎn)和每個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能。
圖2是證實(shí)ER-α的膜和基因組信號傳導(dǎo)途徑之間的可能的通訊的示意圖。Cav-1代表小窩蛋白-1，ER-α，雌激素受體-α；RTK，受體酪氨酸激酶；Ras，Ras癌基因；Mek，MAP/ERK激酶；MAPK，促分裂原活化蛋白激酶；PI3K，磷酸肌醇-三磷酸激酶；AKT，蛋白激酶13；PDK1，磷酸肌醇-依賴性的蛋白激酶；RSK，p90核糖體S6激酶。
圖3是顯示在有雌二醇(E2)存在下，pRET-感染的MCF10A細(xì)胞在軟瓊脂中生長成大菌落的照片。ST1克隆在含有E2的軟瓊脂中表現(xiàn)出快速生長。分別包括MCF7和MCF10A細(xì)胞作為陽性和陰性對照。
圖4是顯示pRET-感染的MCF10A細(xì)胞中的小窩蛋白-1(Cav-1)表達(dá)的下調(diào)的蛋白印跡。通過使用兔抗-Cav-1抗體(N20)的蛋白印跡，分析來自不同細(xì)胞系的等量的全細(xì)胞提取物。用箭標(biāo)指示Cav-1的位置，且在每個(gè)泳道上面指示在每個(gè)泳道中分析的細(xì)胞提取物。
圖5是顯示pRET-感染的MCF10A細(xì)胞中的ER-α表達(dá)的下調(diào)的蛋白印跡。通過使用針對ER-α(H222)和ER-β的抗體的蛋白印跡，分析來自不同細(xì)胞系的等量的全細(xì)胞提取物。用箭標(biāo)指示ER-α和ER-β的位置，且在每個(gè)泳道上面指示在每個(gè)泳道中分析的細(xì)胞提取物。
圖6是顯示pRET-感染的MCF10A細(xì)胞中的ERK1/2磷酸化的活化的蛋白印跡。通過使用針對ERK1/2和磷酸化的ERK1/2的抗體的蛋白印跡，分析來自細(xì)胞系的等量的全細(xì)胞提取物。
圖7是顯示3種ER-α蛋白在Cav-1單倍體不足(haploinsufficient)細(xì)胞ST1和ST3和MCF7乳腺癌細(xì)胞中的存在的蛋白印跡。通過使用針對ER-α的H222抗體的蛋白印跡，分析來自細(xì)胞系的等量的全細(xì)胞提取物。用箭標(biāo)指示ER-α66、ER-α46和ER-α36的位置，且在每個(gè)泳道上面指示在每個(gè)泳道中分析的細(xì)胞提取物。
圖8描繪了人ER-α基因的基因組組織。用箭標(biāo)指示多個(gè)啟動(dòng)子的位置。用AUG和UGA指示翻譯起始和終止位置。用編號的框顯示外顯子。也用框中的外顯子1′顯示內(nèi)含子1。下圖顯示了ER-α同種型的mRNA結(jié)構(gòu)。用AAA指示聚腺苷酸化位點(diǎn)。
圖9是瓊脂糖凝膠的圖片，它顯示了通過PCR分離能編碼ER-α36的可讀框的cDNA。用箭標(biāo)指示cDNA在凝膠中的位置。
圖10顯示了ER-α36可讀框的預(yù)測的氨基酸序列。用氨基酸序列(SEQ ID NO20)左側(cè)的編號，指示氨基酸位置。ER-α36獨(dú)有的最后的27個(gè)氨基酸標(biāo)有下劃線。
圖11顯示了ER-α66、ER-α46和ER-α36的蛋白印跡分析。標(biāo)記為ER-α66、ER-α46和ER-α36的泳道代表著用能編碼所述的雌激素受體同種型的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、并在轉(zhuǎn)染后2天裂解的HEK 293細(xì)胞的分離的培養(yǎng)物。用抗-ER-α抗體(H222)，免疫檢測每種轉(zhuǎn)染子的裂解物。來自MCF7細(xì)胞的細(xì)胞提取物用作陽性對照。用箭標(biāo)指示ER-α66、ER-α46和ER-α36的位置。
圖12顯示了(a)能編碼ER-α36且包含ER-α36啟動(dòng)子的基因的5′側(cè)翼序列的DNA序列(SEQ ID NO22)，和(b)能編碼ER-α36且包含由外顯子9編碼的核苷酸的基因的3′側(cè)翼序列的DNA序列(SEQID NO25)。在5′側(cè)翼序列中，推定的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)標(biāo)有下劃線，且也指示了能結(jié)合核酸序列的蛋白。也用箭標(biāo)指示了cDNA的起始位點(diǎn)。
圖13顯示了不同的乳腺癌細(xì)胞MCF10A、T47D、MCF7和MDA-MB-231中的ER-α36的RNA印跡分析。用箭標(biāo)指示了ER-α36和肌動(dòng)蛋白的位置。
圖14顯示了ER-α36對ER-α66和ER-β的AF-1和AF-2結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)反式激活活性的抑制。(+E2)，E2處理的細(xì)胞；(-E2)，未用E2處理的細(xì)胞。
圖15顯示，ER-α36能介導(dǎo)由E2刺激的膜-啟動(dòng)的MAPK激酶途徑。(a)蛋白印跡顯示了用雌二醇-17β(E2β)處理ER36-293細(xì)胞，會(huì)誘導(dǎo)Mek1/2和ERK1/2的快速磷酸化。P-Mek1/2和P-ERK1/2，分別是Mek1/2和ERK1/2的磷酸化形式。(b)血清(而不是E2β)會(huì)誘導(dǎo)對照載體-293細(xì)胞中的ERK1/2的磷酸化。P-ERK1/2是ERK1/2的磷酸化形式。(c)不同的雌激素和抗雌激素藥會(huì)誘導(dǎo)ER36-293細(xì)胞中的ERK1/2的快速磷酸化。P-ERK1/2是ERK1/2的磷酸化形式。(d)他莫昔芬處理能組成型地刺激ER36-293細(xì)胞中的ERK1/2磷酸化。P-ERK1/2是ERK1/2的磷酸化形式。
圖16表明，ER-α36能介導(dǎo)E2β誘導(dǎo)的MAPK激酶核信號傳導(dǎo)，并刺激細(xì)胞生長。(a)E2β對MAPK激酶核信號傳導(dǎo)的作用。用5XGal4-LUC，即含有5個(gè)Gal4 DNA結(jié)合位點(diǎn)的螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒，和含有與Gal4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的ELK轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域的Gal-ELK表達(dá)載體(上圖)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染了ER36-293和對照載體-293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞培養(yǎng)物維持在沒有雌激素的培養(yǎng)基中36小時(shí)，然后加入E2β(1nM或10nM)12小時(shí)。具有標(biāo)準(zhǔn)差的螢光素酶活性代表著一式兩份進(jìn)行的超過3次實(shí)驗(yàn)。(b)E2β和抗雌激素藥能刺激ER36-293細(xì)胞的生長。顯示了在490nm的吸光度數(shù)據(jù)。平均了超過5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；顯示了平均值和SEM。還通過成對的t-檢驗(yàn)，評價(jià)了這些結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。ER36-293和載體-293細(xì)胞的P-值小于0.001。
圖17表明，ER-α36主要是基于膜的雌激素受體。(a)蛋白印跡分析ER-α36在不同的確立的乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)。剝離相同的印跡，并用抗-肌動(dòng)蛋白抗體探測，以確保等量裝載。(b)ER-α36在ER-α36轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。用ER-α36特異性的抗體，免疫印跡不同的亞細(xì)胞級分中的ER-α36。W，全細(xì)胞裂解物；PM，質(zhì)膜；C，胞質(zhì)溶膠；N，核。通過免疫印跡質(zhì)膜、胞質(zhì)溶膠、核和高爾基體的各種蛋白標(biāo)記，檢查亞細(xì)胞級分純度。5′NT，5′核苷酸酶；D4-GDI，GDP解離抑制劑；mSin3A，組蛋白重構(gòu)復(fù)合物的組分；COPB，β外被蛋白。
圖18表明，E2β能促進(jìn)ER-α66陰性的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231在軟瓊脂中的生長。在不存在E2β(0)、存在10nM E2β(E2)、存在10nM E2β和10nM他莫昔芬(E2+TAM)和存在單獨(dú)的10nM他莫昔芬(TAM)的情況下，使MDA-MB-231細(xì)胞在軟瓊脂上生長3周。
圖19表明，E2β能誘導(dǎo)ER-α66陰性的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中的膜啟動(dòng)的雌激素信號傳導(dǎo)。用雌二醇-17β(E2β)處理MDA-MB-231細(xì)胞，會(huì)誘導(dǎo)ERK1/2的快速磷酸化。用E2β(10nM)處理細(xì)胞不同的時(shí)間點(diǎn)，使所述細(xì)胞裂解，并使用磷酸化依賴性的和非依賴性的抗體，通過蛋白印跡進(jìn)行分析。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的詳述已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，小窩蛋白-1(Cav-1)系統(tǒng)的下調(diào)會(huì)組成型激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑，激活雌激素受體-α(ER-α)的表達(dá)，和觸發(fā)正雌激素信號傳導(dǎo)。該發(fā)現(xiàn)首次提供了活化的MAPK信號傳導(dǎo)和乳房腫瘤發(fā)生(尤其是由雌激素刺激的乳腺癌發(fā)展)之間的清楚的聯(lián)系。該發(fā)現(xiàn)有力地提示，Cav-1通過協(xié)調(diào)MAPK和雌激素信號傳導(dǎo)途徑之間的通訊，在維持乳房上皮細(xì)胞的正常生長中起重要作用，且它的下調(diào)可能有助于這2個(gè)重要途徑的調(diào)節(jié)異常，這最終導(dǎo)致乳腺腫瘤發(fā)生。圖2顯示了雌激素信號傳導(dǎo)途徑和MAPK信號傳導(dǎo)途徑的示意圖。
還已經(jīng)鑒別和克隆了雌激素受體-α同種型。從位于原始的66-kDa ER-α(ER-α66)基因的第一個(gè)內(nèi)含子中的啟動(dòng)子，產(chǎn)生了雌激素受體-α的該36-kDa同種型(ER-α36)。ER-α36不同于ER-α66，因?yàn)樗鄙?個(gè)轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域(AF-1和AF-2)，但是保留了DNA-結(jié)合、二聚化和大部分的配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。ER-α36的結(jié)構(gòu)表明，ER-α36是雌激素信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)劑。ER-α36也可以介導(dǎo)雌激素信號傳導(dǎo)的膜作用，因?yàn)樗饕谫|(zhì)膜上表達(dá)，且也在胞質(zhì)溶膠和核中表達(dá)。
已經(jīng)將ER-β視作ER-α66介導(dǎo)的雌激素信號傳導(dǎo)的組成型調(diào)節(jié)劑。發(fā)現(xiàn)缺少AF-1結(jié)構(gòu)域的ER-α46可以二聚化成ER-α66，并抑制由ER-α66的AF-1結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的反式激活活性，這表明ER-α46在由ER-α66的AF-1結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的功能活性中起調(diào)節(jié)作用。ER-α36缺少AF-1和AF-2結(jié)構(gòu)域。因而，認(rèn)為ER-α36會(huì)抑制由ER-α66的AF-1和AF-2介導(dǎo)的生物功能，以及由ER-α46的AF-2介導(dǎo)的功能。利用ER-α36和ER-α46介導(dǎo)的調(diào)節(jié)，其二者可能在不同的組織中以不同的水平表達(dá)，ER-α66可以在不同的靶組織中不同地起作用。認(rèn)為這樣的機(jī)理能解釋不同生物過程中的雌激素信號傳導(dǎo)的多效性作用。
本發(fā)明的多肽和肽模仿物(peptidomimetic)本發(fā)明提供了多肽。如本文使用的，術(shù)語“多肽”泛指通過肽鍵連接到一起的2個(gè)或更多個(gè)氨基酸的聚合物。術(shù)語肽、寡肽和蛋白都包含在多肽的定義中，且這些術(shù)語可互換地使用。應(yīng)當(dāng)理解，這些術(shù)語不意味著氨基酸聚合物的特定長度，它們也無意暗示或區(qū)分多肽是否由重組技術(shù)、化學(xué)或酶促合成生成，或是天然產(chǎn)生。本文公開和描述了本發(fā)明范圍內(nèi)的多肽的多個(gè)實(shí)例。在天然產(chǎn)生的多肽或多核苷酸的情況下，優(yōu)選地，分離這樣的多肽或多核苷酸，并任選地純化?！胺蛛x的”多肽或多核苷酸是從它的天然環(huán)境分開和分離的多肽或多核苷酸。“純化的”多肽或多核苷酸是至少60％地不含、優(yōu)選地75％地不含和最優(yōu)選地90％地不含它們天然地伴隨的其它組分的多肽或多核苷酸。認(rèn)為在它們天然發(fā)生的生物外面生產(chǎn)(例如，通過化學(xué)或重組方法)的多肽和核苷酸，是定義的分離的和純化的，因?yàn)樗鼈儚奈创嬖谟谔烊画h(huán)境中?！巴庠炊嚯摹敝竿鈦矶嚯模赐ǔ２淮嬖谟诩?xì)胞中的多肽，或通常存在于細(xì)胞中、但是已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)入細(xì)胞中(例如，通過導(dǎo)入能編碼該多肽的多核苷酸)的多肽。
本發(fā)明的多肽可以是生物活性的。這樣的生物活性在本文中稱作“ER-α36活性”?？梢杂糜诖_定本發(fā)明的多肽是否是生物活性的生物測定的實(shí)例包含，使能表達(dá)該多肽的細(xì)胞接觸雌激素或抗-雌激素藥，并測定在有雌激素或抗-雌激素藥存在的情況下，與不表達(dá)本發(fā)明的多肽的對照細(xì)胞中的MAPK活性相比，MAPK途徑的活性是增高還是降低。優(yōu)選地，MAPK活性是ERK 1/2和Mek 1/2的磷酸化，且優(yōu)選地，在有抗-雌激素藥存在的情況下，本發(fā)明的多肽誘導(dǎo)的ERK1/2的磷酸化不減少。優(yōu)選地，ER-α36活性是膜啟動(dòng)的。通過暴露能表達(dá)具有對不同配體的ER-α36活性的多肽的細(xì)胞，可以測量ER-α36活性?？梢允褂玫呐潴w的實(shí)例，包括但不限于，雌酮(E1)、17α-雌二醇(E2α)、17β-雌二醇(E2β)、雌三醇(E3)、雌四醇(estetrol)(E4)或附著到不可透過膜的分子，例如牛血清清蛋白(BSA)的雌激素。通常，當(dāng)待測ER-α36活性限于膜啟動(dòng)的ER-α36活性時(shí)，使用附著到不可透過膜的分子上的雌激素。使用的雌激素的量可以變化，且優(yōu)選地，在1nM至10nM的范圍內(nèi)。暴露于雌激素的細(xì)胞優(yōu)選地是休眠細(xì)胞。該暴露允許發(fā)生5-90分鐘，然后裂解細(xì)胞，并通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離存在于細(xì)胞中的多肽。將分離的多肽轉(zhuǎn)移到膜上后，使用針對非磷酸化和磷酸化形式的ERK 1/2和Mek 1/2的抗體，評價(jià)MAPK途徑的活化。任選地，可以包括抗-雌激素藥，例如他莫昔芬、4OH-他莫昔芬或ICI-182,780，以確定ERK 1/2的磷酸化是否對抗雌激素藥不敏感。
本發(fā)明提供了具有SEQ ID NO20所述的氨基酸序列的多肽。該多肽，和本文所述的有關(guān)多肽，在本文中也稱作ER-α36、ER-α36同種型和ER受體α36-亞基。如圖1所示，當(dāng)與ER-α66同種型相比較時(shí)，ER-α36同種型缺少氨基-末端氨基酸殘基1-183，羧基-末端氨基酸殘基430-595，且在它的C-末端具有27個(gè)氨基酸殘基的添加(見表1)。雌激素受體α異構(gòu)體包括ER-α36、ER-α46、ER-α66。雌激素受體β異構(gòu)體包括ER-β。本發(fā)明也提供了雌激素受體，其包括ER-α36同種型。無意進(jìn)行限制，認(rèn)為ER-α36同種型能通過與ER-α66、ER-α46或ER-β形成二聚體，通過調(diào)節(jié)雌激素受體功能，來調(diào)節(jié)細(xì)胞對雌激素的反應(yīng)。而且，認(rèn)為ER-α36缺少活化因子1(AF-1)和活化因子2(AF-2)活性，并因而缺少內(nèi)在的轉(zhuǎn)錄活性。但是，認(rèn)為ER-α36保留了完整的二聚化結(jié)構(gòu)域，其允許ER-α36與ER-α46、ER-α66或ER-β二聚化。認(rèn)為該相互作用允許ER-α36調(diào)節(jié)含有雌激素受體的ER-α46、ER-α66和ER-β的活性。
表1氨基酸和核苷酸序列
本發(fā)明的多肽包括與SEQ ID NO20具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽。這樣的多肽包括與SEQ ID NO20具有超過70％的至少單個(gè)百分比的同一性的氨基酸序列的多肽，例如與SEQ IDNO20具有71％、72％、73％的同一性，等等，直到100％的同一性。優(yōu)選地，多肽包括且有如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列以遞增的優(yōu)選等級，與SEQ ID NO20具有至少約80％同一性、至少約90％同一性或至少約95％同一性。優(yōu)選地，多肽是生物活性的。優(yōu)選地，多肽具有36kDa的分子量，如按照十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠上的電泳測得的。一般，參與ER-α66的磷酸化的殘基，例如S236、K302和K303是保守的，參與ER-α66的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和二聚化結(jié)構(gòu)域的功能的那些殘基也是如此。在DNA結(jié)合、配體結(jié)合和/或二聚化中起作用的殘基是本領(lǐng)域已知的。
通常，通過比對2個(gè)氨基酸序列的殘基，確定2個(gè)多肽序列之間的百分比同一性，以最優(yōu)化沿著它們的序列長度的相同氨基酸的數(shù)目；在進(jìn)行比對時(shí)允許任一個(gè)或2個(gè)序列中有缺口，以最優(yōu)化相同氨基酸的數(shù)目，盡管每個(gè)序列中的氨基酸必須保持它們的正確次序。優(yōu)選地，使用BLAST 2搜索算法的Blastp程序，版本2.0.9，如Tatusova等(FEMS Microbiol.Lett.，174，247-250(1999))所述，且可以在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html從環(huán)球網(wǎng)上得到，來對比2個(gè)氨基酸序列。優(yōu)選地，使用所有BLAST 2搜索參數(shù)的缺省值，包括矩陣(matrix)＝BLOSUM62；開放缺口罰分(open gappenalty)＝11，延伸缺口罰分(extension gap penalty)＝1，gapx_dropoff＝50，期望(expect)＝10，字長(wordsize)＝3，并任選地，過濾器處于開。在使用BLAST搜索算法對比2個(gè)氨基酸序列時(shí)，結(jié)構(gòu)相似性稱作“同一性”。
本發(fā)明也提供了作為ER-α36雌激素受體同種型的片段的多肽。優(yōu)選地，片段是免疫原性的。在有些方面，片段具有ER-α6活性。免疫原性片段的實(shí)例是，SEQ ID NO1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列，更優(yōu)選地，SEQ ID NO1的1-27。這樣的片段可以用于制備能特異性地結(jié)合ER-α36雌激素受體同種型的抗體。片段的實(shí)例包括已經(jīng)在N-末端或C-末端或兩末端截短1個(gè)或多個(gè)氨基酸的雌激素受體同種型，只要該片段含有至少5個(gè)鄰接氨基酸，更優(yōu)選地至少7個(gè)鄰接氨基酸，甚至更優(yōu)選地至少10個(gè)鄰接氨基酸，和最優(yōu)選地至少12個(gè)鄰接氨基酸。
本發(fā)明提供了融合多肽，其具有偶聯(lián)到本發(fā)明的多肽上的載體多肽。載體多肽可以用于增加或降低融合多肽的溶解度。載體多肽也可以用于增加融合多肽的免疫原性，以增加能結(jié)合本發(fā)明的多肽的抗體的生產(chǎn)。例如，載體多肽可以融合到本發(fā)明的多肽片段上，以促進(jìn)能特異性地結(jié)合ER-α36的抗體的生產(chǎn)。這樣的片段的實(shí)例是具有SEQID NO1的氨基酸13-27的多肽。本發(fā)明不受用于生成本發(fā)明的融合多肽的載體多肽類型的限制。載體多肽的實(shí)例包括匙孔血藍(lán)蛋白、牛血清清蛋白、卵清蛋白、小鼠血清清蛋白、兔血清清蛋白等。載體多肽也可以用于分離或檢測融合多肽。這樣的載體蛋白的實(shí)例包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖-結(jié)合蛋白、殼多糖-結(jié)合蛋白和具有下述氨基酸序列的多肽QFFGLM(SEQ ID NO2)、EQKLISEEDL(SEQID NO3)、KAEDESS(SEQ ID NO4)、YPYDVPDYA(SEQ IDNO5)、DYKDDDDK(SEQ ID NO6)、YTDIEMNRLGK(SEQ IDNO7)、MASMTGGQQMG(SEQ ID NO8)、DTYRYI(SEQ ID NO9)、TDFYLK(SEQ ID NO10)、HHHHHH(SEQ ID NO11)、HPOL(SEQ ID NO12)、QYPALT(SEQ ID NO13)、QRQYGDVFKGD(SEQ ID NO14)、EYMPME(SEQ ID NO15)、EFMPME(SEQ IDNO16)和RYIRS(SEQ ID NO17)。因此，通過與結(jié)合融合多肽的載體多肽部分的其它組分的相互作用，可以檢測或分離融合多肽。例如，通過使用已知的方法，可以用生物素檢測或分離具有作為載體多肽的抗生物素蛋白的融合多肽。載體多肽也可以用于造成融合多肽在細(xì)胞中表達(dá)后形成內(nèi)含體。載體多肽也可以是輸出信號，其能造成融合多肽輸出細(xì)胞，或把融合多肽導(dǎo)向細(xì)胞中的隔室，例如周質(zhì)。
本發(fā)明也提供了本發(fā)明的2種或更多種多肽，其連續(xù)連接進(jìn)單個(gè)氨基酸鏈中。這樣的多肽在本文中稱作多肽。多肽可以通過接頭連接(見Stahl等，美國專利號6,558,924)?？梢苑蛛x這樣的多蛋白，然后切割，以生成本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)多肽。通過使用許多方法，例如化學(xué)或蛋白酶切割，可以切割多蛋白。因此，可以將接頭設(shè)計(jì)成被特定的蛋白酶或化學(xué)試劑切割。可以用于切割本發(fā)明的多蛋白的化合物的實(shí)例包括化學(xué)試劑和酶?；瘜W(xué)試劑的實(shí)例包括溴化氰、甲酸和加熱、羥胺和加熱、溶于醋酸中的亞碘?；郊姿?2-(2-硝基苯基)-3-甲基-3-溴代假吲哚等。酶的實(shí)例包括Ala-64枯草桿菌蛋白酶、梭菌蛋白酶、膠原酶、腸激酶、凝血因子Xa、腎素、α-凝血酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、煙草蝕紋病毒蛋白酶等。多蛋白可以用于增加本發(fā)明的多肽的生產(chǎn)效率。生產(chǎn)多蛋白的方法是本領(lǐng)域已知的(見Coolidge等，美國專利號6,127,150)。
本發(fā)明的多肽包括已經(jīng)通過添加、取代或缺失一個(gè)或多個(gè)鄰接的或不鄰接的氨基酸來修飾的類似物，或已經(jīng)被化學(xué)地或酶促地修飾的類似物，例如通過報(bào)告基團(tuán)的附著，通過N-末端、C-末端或其它官能團(tuán)修飾或衍生，或通過環(huán)化，只要該類似物能保留生物活性或能刺激結(jié)合ER-α36的抗體的生產(chǎn)。類似物因而可以在多肽的一個(gè)或兩個(gè)末端包括其它的氨基酸。優(yōu)選地，類似物是免疫原性的，更優(yōu)選地，類似物是免疫原性的，且具有ER-α36活性。在有些方面，本發(fā)明提供了非類似物的多肽。
本發(fā)明的多肽中的氨基酸取代優(yōu)選地是保守取代，其選自該氨基酸所屬類別的其它成員。例如，蛋白生物化學(xué)領(lǐng)域眾所周知，屬于具有特定大小或特征(例如電荷、疏水性和親水性)的氨基酸組的氨基酸，通?？梢匀〈鸀榱硪环N氨基酸，而基本上不改變多肽的結(jié)構(gòu)。例如，非極性的(疏水的)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。極性的中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。優(yōu)選的保守取代的實(shí)例包括Lys取代Arg，反之亦然，以維持正電荷；Glu取代Asp，反之亦然，以維持負(fù)電荷；Ser取代Thr，以維持游離的-OH；和Gln取代Asn，以維持游離的NH2。有關(guān)的氨基酸(例如3-羥脯氨酸、4-羥脯氨酸、高半胱氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基庚二酸、γ-羧基谷氨酸、β-羧基天冬氨酸)、氨基酸酰胺(鳥氨酸、高精氨酸、N-甲基賴氨酸、二甲基賴氨酸、三甲基賴氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸、高精氨酸、肌氨酸和羥賴氨酸)和取代的苯丙氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、2-氨基辛酸、2-氨基庚酸、statine、β-纈氨酸、萘基丙氨酸、四氫異喹啉-3-羧酸和鹵化的酪氨酸，可以被交換成類似的氨基酸。
本發(fā)明提供了本發(fā)明的多肽的肽模仿物。肽模仿物指這樣的多肽，其中至少一個(gè)肽鍵已經(jīng)被替換為非肽鍵，例如在制藥工業(yè)中經(jīng)常用作非肽藥物的那些，其具有與模板多肽類似的性質(zhì)(Fauchere，J.，Adv.Drug Res.，1529(1986)，Evans等，J.Med.Chem.，301229(1987)，和Janda等，美國專利號6,664,372)。肽模仿物在結(jié)構(gòu)上類似于具有肽鍵的多肽，但是具有一個(gè)或多個(gè)通過本領(lǐng)域已知的方法任選地被下述鍵替代的肽鍵例如，--CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH2--、--CH＝CH--(順式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和--CH2SO--。肽模仿物勝過天然多肽實(shí)施方案的優(yōu)點(diǎn)包括，更經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)，更高的化學(xué)穩(wěn)定性，改變的特異性和增強(qiáng)的藥理性質(zhì)，例如半衰期、吸收、效價(jià)和功效。
用相同類型的D-氨基酸取代多肽或肽模仿物中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如，D-賴氨酸替代L-賴氨酸)，可以產(chǎn)生多肽和肽模仿物，其例如更穩(wěn)定，且更能抗內(nèi)源蛋白酶。
通過在氨基-末端和/或羧基-末端添加能減少體內(nèi)降解的封閉劑，可以修飾本發(fā)明的多肽和肽模仿物用于體內(nèi)用途。這可以用于這樣的情形，其中多肽末端傾向于被蛋白酶體內(nèi)降解。這樣的封閉劑包括但不限于，可以附著到本發(fā)明的多肽或肽模仿物的氨基和/或羧基末端殘基的其它的有關(guān)的或無關(guān)的肽序列。這可以在化學(xué)合成過程中完成，或通過一般技術(shù)的人員熟悉的方法，通過重組DNA技術(shù)完成?；蛘?，封閉劑例如焦谷氨酸，或本領(lǐng)域已知的其它分子，可以附著到氨基和/或羧基末端殘基上，或氨基末端的氨基或羧基末端的羧基可以替換為不同的部分。因此，本發(fā)明提供了被封閉的多肽和肽模仿物，和氨基末端、羧基末端或其組合。
通過使用許多表達(dá)系統(tǒng)，包括但不限于，用其中已經(jīng)插入了本發(fā)明的多核苷酸的重組載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或微生物，可以小規(guī)?；虼笠?guī)模地生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。下面描述了這樣的重組載體和其應(yīng)用方法。這些載體可以用于轉(zhuǎn)化許多生物。這樣的生物的實(shí)例包括，細(xì)菌(例如，大腸桿菌(E.coli)或枯草芽孢桿菌(B.subtilis))；酵母(例如，糖酵母屬(Saccharomyces)和畢赤氏酵母屬(Pichia))；昆蟲(例如，桿狀病毒)；植物；或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，COS、CHO、BHK、293、VERO、HeLa、MDCK、W138和NIH 3T3細(xì)胞)。直接從用載體轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物得到的原代或次生細(xì)胞，也可以用作宿主細(xì)胞。
合成方法也可以用于生產(chǎn)本發(fā)明的多肽和肽模仿物。這樣的方法是本領(lǐng)域已知的和常規(guī)的。例如，固相肽合成方法是確定的且廣泛使用的方法。通過在免疫親和或離子交換柱上的分級分離、乙醇沉淀、反相HPLC、硅石或陰離子交換樹脂例如DEAE上的色譜、色譜聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沉淀、使用例如Sephadex G-75的凝膠過濾、配體親和色譜等，可以容易地純化多肽。通過使融合多肽結(jié)合分離介質(zhì)，然后切割融合多肽以釋放純化的多肽，也可以容易地純化多肽。例如，可以生成包含在多肽和載體多肽之間的凝血因子Xa切割位點(diǎn)的融合多肽。融合多肽也可以結(jié)合親和柱，后者上面結(jié)合了融合多肽的載體多肽部分。然后，可以用凝血因子Xa切割融合多肽，以釋放多肽。這樣的系統(tǒng)已經(jīng)與凝血因子Xa去除試劑盒組合使用，用于純化本發(fā)明的多肽。
多核苷酸本發(fā)明提供了能編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸。術(shù)語“多核苷酸”泛指以5′至3′方向共價(jià)連接的2個(gè)或更多個(gè)核苷酸的聚合物。多核苷酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，包括例如編碼序列，和非編碼序列，例如調(diào)節(jié)序列。編碼序列、非編碼序列和調(diào)節(jié)序列如下面定義。術(shù)語核酸、核酸分子和寡核苷酸和蛋白包含在多核苷酸的定義內(nèi)，且這些術(shù)語可互換地使用。應(yīng)當(dāng)理解，這些術(shù)語不意味著核苷酸聚合物的特定長度，它們也無意暗示或區(qū)分多核苷酸是否由重組技術(shù)、化學(xué)或酶促合成生成，或是天然產(chǎn)生。
多核苷酸可以是單鏈的或雙鏈的，且第二個(gè)互補(bǔ)鏈的序列由第一鏈的序列決定。因此，術(shù)語“多核苷酸”應(yīng)當(dāng)廣義地理解為包括單鏈的核酸聚合物，它的互補(bǔ)體，和由此形成的雙鏈體。多核苷酸的“互補(bǔ)性”指2個(gè)單鏈多核苷酸彼此堿基配對的能力，其中一個(gè)多核苷酸上的腺嘌呤與另一個(gè)上的胸苷(或尿嘧啶，在RNA的情況下)堿基配對，而一個(gè)多核苷酸上的胞苷與另一個(gè)上的鳥嘌呤堿基配對。當(dāng)一個(gè)多核苷酸上的核苷酸序列與第二個(gè)多核苷酸上的核苷酸序列堿基配對時(shí)，2個(gè)多核苷酸彼此互補(bǔ)。例如，5′-ATGC和5′-GCAT是完全互補(bǔ)的，5′-GCTA和5′-TAGC也是如此。
本發(fā)明的多核苷酸的一個(gè)實(shí)例是SEQ ID NO21(見表1，也即存在于GenBank登記號BX640939中的核苷酸序列的核苷酸234-1166)。優(yōu)選的本發(fā)明的多核苷酸也包括具有與能編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的核苷酸序列“基本上互補(bǔ)的”核苷酸序列的多核苷酸，或這樣的核苷酸序列的互補(bǔ)體。“基本上互補(bǔ)的”多核苷酸可以包括至少一個(gè)堿基對錯(cuò)配，但是2個(gè)多核苷酸仍然具有雜交的能力。例如，2個(gè)DNA分子5′-AGCAAATAT和5′-ATATATGCT中的每一個(gè)的中間核苷酸不能堿基配對，但是這2個(gè)多核苷酸仍然是如本文定義的基本上互補(bǔ)的。如果它們在55℃、2X SSC(SSC150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉，pH 7.6)示例的雜交條件下雜交，則2個(gè)多核苷酸是基本上互補(bǔ)的。用于本發(fā)明目的的基本上互補(bǔ)的多核苷酸優(yōu)選地共有至少一個(gè)至少20個(gè)核苷酸長的區(qū)域，該共有區(qū)域具有至少60％核苷酸同一性、優(yōu)選地至少80％核苷酸同一性、更優(yōu)選地至少90％核苷酸同一性和最優(yōu)選地至少95％核苷酸同一性。特別優(yōu)選的基本上互補(bǔ)的多核苷酸共有許多這樣的區(qū)域。優(yōu)選地，多核苷酸與SEQ ID NO21具有至少70％同一性的核苷酸序列。更優(yōu)選地，多核苷酸具有如下核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID NO21具有超過70％的至少單個(gè)百分比的同一性，例如與SEQ ID NO21具有71％、72％、73％的同一性，等等，直到100％的同一性。甚至更優(yōu)選地，多核苷酸具有與SEQ ID NO21具有至少80％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性的核苷酸序列。最優(yōu)選地，多核苷酸具有與SEQ IDNO21具有100％同一性的核苷酸序列。與SEQ ID NO21具有至少70％同一性的多核苷酸具有ER-α36活性。
通常，通過比對2個(gè)多核苷酸序列的堿基，確定2個(gè)多核苷酸序列之間的百分比同一性，以最優(yōu)化沿著它們的序列長度的相同堿基的數(shù)目；在進(jìn)行比對時(shí)允許任一個(gè)或2個(gè)序列中有缺口，以最優(yōu)化相同堿基的數(shù)目，盡管每個(gè)序列中的堿基必須保持它們的正確次序。優(yōu)選地，使用BLAST 2搜索算法的Blastn程序，版本2.0.11，也如Tatusova等(FEMS Microbiol.Lett，174，247-250(1999))所述，且可以在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html從環(huán)球網(wǎng)上得到，來對比2個(gè)多核苷酸序列。優(yōu)選地，使用所有BLAST 2搜索參數(shù)的缺省值，包括匹配獎(jiǎng)分(reward for match)＝1，錯(cuò)配罰分(penaltyfor mismatch)＝-2，開放缺口罰分＝5，延伸缺口罰分＝2，gapx_dropoff＝50，期望＝10，字長＝11，并任選地，過濾器處于開。使用CLUSTALW多序列比對軟件(J.Thompson等，Nucl.Acids Res.，224673-4680(1994))，其可以在www.ebi.ac.uk/clustalw/從環(huán)球網(wǎng)上得到，也可以容易地確定2個(gè)多核苷酸序列之間的核苷酸序列同一性的位置和水平。
應(yīng)當(dāng)理解，能編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸不限于含有天然產(chǎn)生的基因組或cDNA核苷酸序列的全部或部分的多核苷酸，而是也包括由于遺傳密碼的簡并性，能編碼這樣的多肽的多核苷酸類別。例如，天然產(chǎn)生的多核苷酸序列SEQ ID NO21只是能編碼具有氨基酸SEQ ID NO20的多肽的核苷酸序列類別的一個(gè)成員。能編碼選擇的多肽序列的核苷酸序列類別很大但是有限，且參考標(biāo)準(zhǔn)的遺傳密碼，其中已知不同的核苷酸三聯(lián)體(密碼子)能編碼相同的氨基酸，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能容易地確定類別中的每個(gè)成員的核苷酸序列。
能“編碼”本發(fā)明的多肽的多核苷酸任選地包含編碼區(qū)和非編碼區(qū)，且因此應(yīng)當(dāng)理解，除非另有相反說明，能“編碼”多肽的多核苷酸在結(jié)構(gòu)上不限于能編碼多肽的核苷酸序列，而是也包括編碼區(qū)以外(即，5′或3′)的其它核苷酸序列?！熬幋a區(qū)”或“編碼序列”是能編碼多肽的核苷酸序列，且當(dāng)置于適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列的控制下時(shí)，其能表達(dá)編碼的多肽。編碼區(qū)的邊界通常由在它的5′端的翻譯起始密碼子和在它的3′端的翻譯終止密碼子決定?！巴庠淳幋a區(qū)”指外來編碼區(qū)，即通常在細(xì)胞中不存在的編碼區(qū)，或通常存在于細(xì)胞中、但是已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)入細(xì)胞中、可操作地連接到它通常不可操作地連接的調(diào)節(jié)區(qū)的編碼區(qū)，或其組合。
本發(fā)明的多核苷酸在拓?fù)鋵W(xué)上可以是線狀的或環(huán)狀的。多核苷酸可以是，例如，載體的一部分。載體可以提供進(jìn)一步克隆(多核苷酸的擴(kuò)增)，即克隆載體，或提供由編碼區(qū)編碼的多肽的表達(dá)，即表達(dá)載體。載體可以包括，但不限于，質(zhì)粒、噬菌粒、F因子、病毒、粘粒或噬菌體。載體可以是雙鏈或單鏈的線狀或環(huán)狀形式。通過整合進(jìn)細(xì)胞基因組或存在于染色體外(例如，作為具有復(fù)制起點(diǎn)的自主復(fù)制質(zhì)粒)，載體也可以轉(zhuǎn)化原核或真核宿主。載體中的多核苷酸可以在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子或用于體外轉(zhuǎn)錄或在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的其它調(diào)節(jié)序列的控制下，并與其可操作地連接，所述宿主細(xì)胞例如真核細(xì)胞，或微生物，例如細(xì)菌。優(yōu)選的真核細(xì)胞實(shí)例包括MDA-MB-231、Hela、CHO和MCF10A細(xì)胞系。調(diào)節(jié)序列，或調(diào)節(jié)區(qū)，指位于編碼序列的上游、中間或下游的核苷酸序列，且可操作地連接編碼序列。調(diào)節(jié)序列的實(shí)例包括增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化信號序列。它們包括天然的和合成的序列，以及可以與合成的和天然的序列相組合的序列。調(diào)節(jié)序列不限于啟動(dòng)子。但是，在本發(fā)明中有用的一些合適的調(diào)節(jié)序列包括，但不限于，組成型啟動(dòng)子、組織-特異性的啟動(dòng)子、發(fā)育-特異性的啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和病毒啟動(dòng)子。術(shù)語“可操作地連接”指組分的并列，以便它們處于允許它們以目標(biāo)方式發(fā)揮作用的關(guān)系。當(dāng)以在與調(diào)節(jié)序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)編碼區(qū)的表達(dá)的方式連接時(shí)，調(diào)節(jié)序列“可操作地連接”到編碼區(qū)。
載體可以是能在多種宿主中起作用的穿梭載體。載體也可以是克隆載體，其一般含有一個(gè)或少數(shù)限制性內(nèi)切核酸酶識別位點(diǎn)，外來DNA序列可以在這里以可確定的方式插入。可以發(fā)生這樣的插入，而不喪失克隆載體的基本生物功能?？寺≥d體也可以含有標(biāo)記基因，其適用于鑒別和選擇用克隆載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。標(biāo)記基因的實(shí)例是四環(huán)素抗性或氨芐青霉素抗性。許多克隆載體可以商業(yè)上得到(例如Stratagene，New England Biolabs，Clonetech)。載體可以是含有調(diào)節(jié)序列的表達(dá)載體，所述調(diào)節(jié)序列能指導(dǎo)插入表達(dá)載體的多核苷酸的表達(dá)。許多載體可以商業(yè)上得到，且是本領(lǐng)域已知的(Stratagene，LaJolla，CA；New England Biolabs，Beverly，MA)。表達(dá)載體可以用于體外轉(zhuǎn)錄和翻譯測定。
將多核苷酸導(dǎo)入載體的方法，是本領(lǐng)域眾所周知的(Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第3版，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001))。簡而言之，用一種或多種限制酶(限制性內(nèi)切核酸酶)處理要插入多核苷酸的載體，生成線性化的載體，其具有平端，具有5′或3′突出端的“粘性”末端，或上面的任意組合。也可以用限制酶處理載體，隨后用另一種修飾酶處理，例如聚合酶、外切核酸酶、磷酸酶或激酶，以生成線性化的載體，其具有對將多核苷酸連接進(jìn)載體有用的特征。用一種或多種限制酶處理要插入載體的多核苷酸，以生成線性化的片段，其具有平端，具有5′或3′突出端的“粘性”末端，或上面的任意組合。也可以用限制酶處理多核苷酸，隨后用另一種DNA修飾酶處理。這樣的DNA修飾酶包括，但不限于，聚合酶、外切核酸酶、磷酸酶或激酶，以生成多核苷酸，其具有對將多核苷酸連接進(jìn)載體有用的特征。
然后，根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，將處理的載體和多核苷酸連接到一起，以形成含有多核苷酸的構(gòu)建體(Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001))。簡而言之，可以在有合適的緩沖液和連接酶存在下，組合處理的核酸片段和處理的載體。然后，在適當(dāng)?shù)臈l件下，溫育混合物，以允許連接酶將核酸片段連接進(jìn)載體。
本發(fā)明還提供了制備本發(fā)明的多肽的方法和制備能編碼它們的多核苷酸的方法。方法包括生物的、酶促的和化學(xué)的方法，以及其組合，且是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，使用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)，可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)多核苷酸，使用無細(xì)胞的基于RNA的系統(tǒng)，可以體外地酶促合成它，或使用化學(xué)技術(shù)，例如固相肽合成，可以合成它。當(dāng)使用重組DNA技術(shù)時(shí)，宿主細(xì)胞可以是，例如，細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
本發(fā)明也提供了具有啟動(dòng)子活性的多核苷酸。一方面，本發(fā)明的啟動(dòng)子包括SEQ ID NO22所述的核苷酸序列，或其一部分。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的啟動(dòng)子具有如下核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID NO22具有超過70％的至少單個(gè)百分比的同一性，例如與SEQ ID NO22具有71％、72％、73％的同一性，等等，直到100％的同一性。本文描述了確定百分比同一性的方法。甚至更優(yōu)選地，啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO22具有至少80％同一性、至少90％同一性、或至少95％同一性的核苷酸序列。本發(fā)明的啟動(dòng)子具有雌激素受體(ER)調(diào)節(jié)的活性。如本文使用的，ER調(diào)節(jié)的活性指在有ER-α66存在下，優(yōu)選地，在有能結(jié)合雌激素的ER-α66存在下，可操作地連接的編碼區(qū)的增強(qiáng)表達(dá)。本發(fā)明的啟動(dòng)子以依賴于和非依賴于雌激素的方式表達(dá)。本發(fā)明的啟動(dòng)子可以可操作地連接到能編碼多肽(包括標(biāo)記多肽)的編碼區(qū)。標(biāo)記多肽的實(shí)例包括檢測標(biāo)記(例如，熒光蛋白、酶、抗原標(biāo)記等)和選擇標(biāo)記(能造成藥物抗性、藥物易感性或營養(yǎng)缺陷或糾正營養(yǎng)缺陷的多肽等)。
抗體本發(fā)明提供了能特異性地結(jié)合本發(fā)明的多肽和肽模仿物的抗體。如本文使用的，“能特異性地結(jié)合”多肽的抗體是這樣的抗體，其僅僅能與誘導(dǎo)該抗體合成的抗原的表位相互作用，或能與結(jié)構(gòu)上有關(guān)的表位相互作用。甚至在有多種潛在結(jié)合靶存在下，“能特異性地結(jié)合”表位的抗體也能在適當(dāng)?shù)臈l件下，與表位相互作用。在有些方面，本發(fā)明的抗體能特異性地結(jié)合ER-α36或其一部分，且不特異性地結(jié)合ER-α66或ER-α46。
因此，本發(fā)明的多肽和肽模仿物和其片段可以用作抗原，來生產(chǎn)抗體，包括脊椎動(dòng)物抗體、雜合抗體、嵌合抗體、人源化的抗體、改變的抗體、單價(jià)抗體、單克隆和多克隆抗體、Fab蛋白和單結(jié)構(gòu)域抗體。例如，具有SEQ ID NO1的多肽或其片段，例如SEQ ID NO1的氨基酸13-27，可以用于產(chǎn)生能特異性地結(jié)合ER-α36的抗體。通過將它們共價(jià)連接到免疫原性載體上，例如匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清清蛋白、卵清蛋白、小鼠血清清蛋白、兔血清清蛋白等，可以修飾本發(fā)明的多肽或肽模仿物或其片段。
如果需要多克隆抗體，則可以用需要的抗原免疫選擇的動(dòng)物(例如，小鼠、兔子、山羊、馬或鳥，例如雞)。根據(jù)已知且常規(guī)的方法，收集并處理來自免疫的動(dòng)物的血清。如果含有針對本發(fā)明的多肽的多克隆抗體的血清，含有對其它抗原的抗體，則可以通過免疫親和色譜，純化多克隆抗體。本領(lǐng)域已知用于生產(chǎn)和加工多克隆抗血清的技術(shù)(見，例如，Harlow等，AntibodiesA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Pub.1988))。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員也可以容易地生產(chǎn)針對本發(fā)明的多肽或肽模仿物或其片段的單克隆抗體。通過雜交瘤制備單克隆抗體的一般方法是眾所周知的(見，例如，Harlow等，AntibodiesA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Pub.1988)。通過細(xì)胞融合，且也可以通過其它技術(shù)，例如用致癌DNA直接轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞，或用EB病毒轉(zhuǎn)染，可以生成無限增殖化的抗體生產(chǎn)性細(xì)胞系(雜交瘤)。可以篩選針對本發(fā)明的多肽和肽模仿物生產(chǎn)的單克隆抗體組的各種性質(zhì)，例如表位親和性。制備抗體的其它眾所周知的方法，包括使用噬菌體顯示技術(shù)(見，例如，Kay等，Phage display of peptides and proteinsAlaboratory manual.San DiegoAcademic Press(1996))。
本發(fā)明的抗體可以衍生自“人源化的”單克隆抗體。通過將小鼠互補(bǔ)決定區(qū)從小鼠免疫球蛋白的重和輕可變鏈轉(zhuǎn)移進(jìn)人可變結(jié)構(gòu)域，然后取代鼠對應(yīng)物的構(gòu)架區(qū)的人殘基，可以生產(chǎn)人源化的單克隆抗體。使用源自人源化的單克隆抗體的抗體組分，消除了與鼠恒定區(qū)的免疫原性有關(guān)的潛在問題。描述了用于克隆鼠免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的一般技術(shù)(Orlandi等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，863833(1989)，且也描述了生產(chǎn)人源化的單克隆抗體的技術(shù)(Jones等，Nature，321522(1986)；Riechmann等，Nature，332323(1988))。
通過常規(guī)的已知方法，包括抗體的蛋白水解，或通過能編碼該片段的多核苷酸在大腸桿菌中的表達(dá)，可以制備本發(fā)明的抗體片段。通過常規(guī)方法(用例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化完整的抗體，可以得到抗體片段。例如，通過用胃蛋白酶酶促切割抗體，提供稱作F(ab’)2的5S片段，可以生產(chǎn)抗體片段。使用硫醇還原劑和任選的由二硫鍵的切割產(chǎn)生的巰基的封閉劑，可以進(jìn)一步切割該片段，以生成3.5SFab′單價(jià)片段?；蛘?，使用胃蛋白酶的酶促切割，會(huì)直接產(chǎn)生2個(gè)單價(jià)的Fab′片段和1個(gè)Fc片段。
也可以使用切割抗體的其它方法，例如分離重鏈，以形成單價(jià)的輕-重鏈片段，進(jìn)一步切割片段，或其它的酶促的、化學(xué)的或遺傳技術(shù)，只要該片段能結(jié)合可由完整的抗體識別的抗原。
可以篩選抗體，以確定它們所結(jié)合的表位的同一性。表位指抗原(例如本發(fā)明的多肽)上的抗體互補(bǔ)位結(jié)合的部位。表位通常由分子的化學(xué)活性的表面基團(tuán)例如氨基酸或糖側(cè)鏈組成，且可以具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，以及特定的電荷特征?？梢杂糜阼b別表位的方法，是本領(lǐng)域已知的(Harlow等，AntibodiesA Laboratory Manual，page319(Cold Spring Harbor Pub.1988)。
可以篩選抗體特異性地結(jié)合本發(fā)明的多肽或肽模仿物的能力。例如，通過使用本領(lǐng)域的常規(guī)方法，可以選擇能特異性地結(jié)合ER-α36同種型或其部分、但是不能結(jié)合ER-α46或α66同種型的抗體(見Kitajima等，美國專利號6,534,281，和Harlow等，AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Pub.1988)。
可以將本發(fā)明的抗體偶聯(lián)到多種化合物上?；衔锏膶?shí)例包括檢測標(biāo)記。這樣的檢測標(biāo)記的實(shí)例包括熒光標(biāo)記、酶、放射性同位素等，例如抗生物素蛋白或生物素，其允許檢測抗體。本領(lǐng)域已知將抗體偶聯(lián)到檢測標(biāo)記的方法，和有用的檢測標(biāo)記。這樣的抗體可以用于檢測ER-α36的自動(dòng)系統(tǒng)中。抗體可以共價(jià)地附著到化療劑。本領(lǐng)域已知可用于治療癌癥例如乳腺癌和前列腺癌的化療劑?；焺┑膶?shí)例包括苯并二氫吡喃、代馬孕酮酯、屈洛西芬、艾多昔芬、他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、氟維司群(fulvestrant)和faslodex、二膦酸鹽、降鈣素、tribolone、甲狀旁腺素或雷尼酸鍶(strontium ranelate)。其它實(shí)例包括細(xì)胞因子，或毒素，例如白喉毒素A鏈。
組合物本發(fā)明也提供了組合物，其包含本發(fā)明的多核苷酸、肽模仿物或抗體。這樣的組合物一般包含藥學(xué)上可接受的載體。如本文使用的“藥學(xué)上可接受的載體”包括與藥物施用相容的鹽水、溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延緩劑等。也可以將其它活性化合物整合進(jìn)組合物中。
可以將本發(fā)明的組合物制備成許多形式，包括片劑、硬或軟膠囊、水溶液、懸浮液和脂質(zhì)體，和其它緩釋制劑，例如成形的聚合凝膠。可以配制經(jīng)口劑型，從而使多肽、肽模仿物或抗體在經(jīng)過胃后釋放進(jìn)腸中。這樣的制劑記載在Hong等，美國專利號6,306,434和其中包含的文獻(xiàn)中。
經(jīng)口的液體組合物可以是下述形式例如，水性的或油性的懸浮液、溶液、乳劑、糖漿或酏劑，或可以作為干燥產(chǎn)品存在，以在使用前與水或其它合適的載體配制。這樣的液體組合物可以含有常規(guī)添加劑，例如懸浮劑、乳化劑、非水載體(其可以包括食用油)或防腐劑。
組合物可以配制成用于腸胃外施用(例如，通過注射，例如，快速濃注或連續(xù)輸注)，且可以以單位劑型存在于安瓿、預(yù)裝注射器、小體積輸注容器或具有添加的防腐劑的多劑量容器中。組合物可以采取下述形式在油性或水性載體中的懸浮液、溶液或乳劑，且可以含有配制試劑，例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。
可以將適用于直腸施用的組合物制備成單位劑量栓劑。組合物中可以包含的合適的載體包括鹽水溶液示例的那些，和本領(lǐng)域經(jīng)常使用的其它材料。
對于吸入施用，可以從吹入器、噴霧器或加壓包或其它方便的送遞氣溶膠噴霧劑的工具，方便地送遞組合物。加壓包可以包含合適的推進(jìn)劑例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體。在加壓的氣溶膠的情況下，通過提供閥門來送遞計(jì)量的量，可以確定劑量單位。
或者，對于通過吸入或吹入施用，組合物可以采取干粉組合物的形式，例如，調(diào)節(jié)劑和合適的粉末基質(zhì)(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末組合物可以以單位劑型存在，例如在膠囊或藥筒中，或例如，明膠或硬質(zhì)泡沫塑料襯墊包裝，在吸入器或吹入器的輔助下，可以從其中施用粉末。對于鼻內(nèi)施用，可以通過液體噴霧施用組合物，例如通過塑料瓶噴霧器。
可以將組合物配制成用于經(jīng)皮施用。也可以將組合物配制成水溶液、懸浮液或分散體、水性凝膠、油包水乳劑或水包油乳劑。通過將組合物被囊化在聚合物中，也可以制備經(jīng)皮制劑?？梢詫┬椭苯討?yīng)用于皮膚，作為洗劑、乳膏、油膏，或通過使用貼劑。
本發(fā)明的組合物也可以含有其它成分，例如調(diào)味劑、著色劑、抗微生物劑和防腐劑。另外，本發(fā)明的組合物可以包含藥學(xué)活性成分，例如激素、抗壞死劑、血管擴(kuò)張劑、藥物試劑等。
通過細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)方法，例如測定LD50(對50％群體致死的劑量)和ED50(對50％群體治療上有效的劑量)，可以確定這樣的組合物的毒性和治療功效。毒性和治療作用之間的劑量比率，是治療指數(shù)，且其可以表達(dá)為比率LD50/ED50。能表現(xiàn)出高治療指數(shù)的化合物是優(yōu)選的。
從細(xì)胞培養(yǎng)測定和動(dòng)物研究得到的數(shù)據(jù)，可以用于配制一定范圍的人用劑量。這樣的化合物的劑量，優(yōu)選地在循環(huán)濃度的范圍內(nèi)，其包括具有較少或無毒性的ED50。依賴于采用的劑型和使用的施用途徑，劑量可以在該范圍內(nèi)變化。對于在本發(fā)明的方法中使用的化合物，可以從細(xì)胞培養(yǎng)測定，初步估計(jì)治療上有效的劑量?？梢栽趧?dòng)物模型中配制劑量，以達(dá)到包含IC50的循環(huán)血漿濃度范圍(即，能達(dá)到癥狀的半數(shù)最大抑制的實(shí)驗(yàn)化合物的濃度)，如在細(xì)胞培養(yǎng)中測定的。這樣的信息可以用于更準(zhǔn)確地確定在人類中有用的劑量?？梢詼y量血漿中的水平，例如通過高效液相色譜。一方面，人用的劑量范圍是足以產(chǎn)生至少10微摩爾(μM)，優(yōu)選地至少25μM，更優(yōu)選地50μM的血清濃度的量。
可以每天1次或多次至每周1次或多次施用組合物，包括每隔一天1次。熟練的技術(shù)人員能明白，某些因素可能影響有效地治療受試者所需的劑量和時(shí)間選擇，包括但不限于疾病或障礙的嚴(yán)重性，以前的治療，受試者的總體健康和/或年齡，和存在的其它疾病。而且，用有效量的組合物治療受試者，可以包括單一治療，或優(yōu)選地，包括系列治療。
檢測方法本發(fā)明提供了檢測本發(fā)明的多肽的方法。該方法一般包括，提供細(xì)胞，分析細(xì)胞中的本發(fā)明的多肽，和確定細(xì)胞是否表達(dá)該多肽。細(xì)胞可以是離體的或體內(nèi)的。如本文使用的，術(shù)語“離體”指已經(jīng)從受試者的身體取出(例如，分離)的細(xì)胞。離體細(xì)胞包括，例如，原代細(xì)胞(例如，最近已經(jīng)從受試者取出，且能在組織培養(yǎng)基中進(jìn)行有限的生長或維持的細(xì)胞)和培養(yǎng)的細(xì)胞(例如，能在組織培養(yǎng)基中進(jìn)行長期生長或維持的細(xì)胞)。如本文使用的，術(shù)語“體內(nèi)”指在受試者體內(nèi)的細(xì)胞。體內(nèi)細(xì)胞可以是存在于器官或腫瘤中的細(xì)胞。細(xì)胞優(yōu)選地是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如，小鼠、大鼠或靈長類動(dòng)物(例如，猴子，人)，優(yōu)選地，人。優(yōu)選的細(xì)胞的實(shí)例包括乳房細(xì)胞，例如乳腺腫瘤細(xì)胞，和前列腺細(xì)胞，例如前列腺腫瘤細(xì)胞。通過例如，人乳房或前列腺組織的活組織檢查，可以從受試者得到細(xì)胞?？梢允褂脧膸缀跛蓄愋偷慕M織得到的樣品。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，可以體外培養(yǎng)對照細(xì)胞。不能表達(dá)ER-α36kDa雌激素受體并因而可以用作陰性對照的細(xì)胞包括HEK293細(xì)胞。陽性對照細(xì)胞包括，在有血清和BRCA1陰性細(xì)胞存在下，可以以低細(xì)胞密度生長的細(xì)胞。優(yōu)選地，細(xì)胞在有血清存在下以低密度生長。通過例如活組織檢查，也可以從組織樣品得到對照細(xì)胞。
一方面，該方法包括，通過使細(xì)胞接觸本發(fā)明的抗體來分析細(xì)胞。使用常規(guī)的且本領(lǐng)域已知的檢測方法，可以測定細(xì)胞是否能表達(dá)本發(fā)明的多肽。免疫測定的實(shí)例包括，競爭性的和非競爭性的測定、例如，放射免疫測定、免疫酶測定、免疫熒光測定或酶免疫測定。也可以使用利用辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或其它化學(xué)發(fā)光檢測劑的化學(xué)發(fā)光方法。在本發(fā)明的方法中，也可以使用蛋白印跡和色譜測定。用于檢測本發(fā)明的多肽的本發(fā)明的抗體可以偶聯(lián)檢測標(biāo)記，并從而直接檢測，或可以使用第二抗體。當(dāng)使用允許檢測不同細(xì)胞區(qū)域中的多肽的檢測方法時(shí)，當(dāng)多肽主要與質(zhì)膜和細(xì)胞質(zhì)有關(guān)、且少于20％信號與核有關(guān)時(shí)，一般認(rèn)為能表達(dá)ER-α36的細(xì)胞是ER-α36陽性的。
在另一個(gè)方面，該方法包括，通過擴(kuò)增多核苷酸，優(yōu)選地，RNA多核苷酸(例如，mRNA)，以形成擴(kuò)增的多核苷酸，來分析細(xì)胞。優(yōu)選地，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增多核苷酸，優(yōu)選地，通過逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)PCR。從RNA多核苷酸合成DNA多核苷酸的方法，是本領(lǐng)域已知的和常規(guī)的。使從細(xì)胞得到的多核苷酸接觸引物對，后者能擴(kuò)增多核苷酸，包括SEQ ID NO22或SEQ ID NO25，或其組合。由這樣的引物對產(chǎn)生的擴(kuò)增的多核苷酸的存在，指示著細(xì)胞能表達(dá)雌激素受體。如本文使用的，術(shù)語“引物對”指設(shè)計(jì)用于側(cè)接要擴(kuò)增的多核苷酸區(qū)域的2個(gè)寡核苷酸。一個(gè)引物與存在于在要擴(kuò)增的多核苷酸的一端的有義鏈上的核苷酸互補(bǔ)，而另一個(gè)引物與存在于在要擴(kuò)增的多核苷酸的另一端的反義鏈上的核苷酸互補(bǔ)。要擴(kuò)增的多核苷酸可以稱作模板多核苷酸。引物與其互補(bǔ)的多核苷酸的核苷酸可以稱作靶序列。引物可以具有至少約15個(gè)核苷酸，優(yōu)選地，至少約20個(gè)核苷酸，最優(yōu)選地，至少約25個(gè)核苷酸。通過PCR擴(kuò)增多核苷酸的條件，依賴于使用的引物的核苷酸序列而變化，且用于確定這樣的條件的方法，是本領(lǐng)域常規(guī)的。
擴(kuò)增后，可以確定擴(kuò)增的多核苷酸的存在，例如通過凝膠電泳。通過染色(例如，用溴化乙錠)或用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的合適的標(biāo)記(包括放射性的和非放射性的標(biāo)記)進(jìn)行標(biāo)記，可以顯現(xiàn)擴(kuò)增的多核苷酸。一般的放射性標(biāo)記包括33P。非放射性的標(biāo)記包括，例如，配體例如生物素或洋地黃毒苷，以及酶例如磷酸酶或過氧化物酶，或各種化學(xué)發(fā)光劑(chemiluminescer)例如螢光素，或熒光化合物如熒光素和它的衍生物。
任選地，也可以測定ER-α66多肽、ER-α46多肽、ER-β或其組合在細(xì)胞中的存在。檢測ER-α66、ER-α46、ER-β或其組合的存在的方法包括，使用基于抗體或多核苷酸的檢測方法，例如多核苷酸的擴(kuò)增，來應(yīng)用免疫檢測。當(dāng)使用允許檢測不同細(xì)胞區(qū)域中的多肽的檢測方法時(shí)，當(dāng)多肽主要與細(xì)胞核有關(guān)，例如超過90％的信號與核有關(guān)時(shí)，一般認(rèn)為能表達(dá)ER-α66或ER-α46的細(xì)胞是ER-α66或ER-α46陽性的。
所有乳腺癌中的大約70-80％能表達(dá)ER-α66，且稱作ER-陽性的乳腺癌。這些腫瘤通常更緩慢地生長，更好地分化，且與更好的總體預(yù)后有關(guān)(Clark，InHarris JR，editor.Diseases of the breast，volume 2.Lippincott Williams & Wilkins，38103-116(2000))。檢測本發(fā)明的多肽的存在的方法，可以作為診斷標(biāo)記，用于區(qū)分雌激素-陽性的和雌激素-陰性的癌癥，優(yōu)選地，乳腺癌。在本文的實(shí)施例中公開的結(jié)果強(qiáng)烈表明，由ER-α36介導(dǎo)的雌激素信號傳導(dǎo)有助于乳房腫瘤發(fā)生，并暗示ER-α36可能參與ER-α66陰性的乳腺癌的腫瘤發(fā)生。在本文的實(shí)施例中公開的結(jié)果也表明，能高度表達(dá)本發(fā)明的多肽的細(xì)胞，比能表達(dá)高水平的ER-α66、但是更低水平的ER-α36的細(xì)胞，更能耐受低劑量的抗-雌激素藥，例如，他莫昔芬。因而，檢測本發(fā)明的多肽的存在的方法，允許鑒別新的患者類型，即ER-α66-陰性的和ER-α36-陽性的。檢測本發(fā)明的多肽的存在的方法，也可以用于測定細(xì)胞對抗-雌激素藥的敏感性，并提供關(guān)于例如測定個(gè)體的適當(dāng)?shù)闹委熯M(jìn)程的信息。例如，醫(yī)生可以決定，具有ER-α36-陽性的乳腺腫瘤細(xì)胞的受試者，可能需要更高劑量的他莫昔芬，以克服對更低水平的抗性。
檢測ER-α66、ER-α46、ER-α36、ER-β或其組合的存在，也允許對比雌激素受體的比率。測定2種或更多種雌激素受體的比率，允許預(yù)測細(xì)胞對抗-雌激素藥(例如，他莫昔芬)的敏感性。例如，在本發(fā)明的該方面，測定細(xì)胞中ER-α36與ER-α46的比率、ER-α36與ER-α66的比率、ER-α36與ER-β的比率或其組合，并與對照細(xì)胞中的對應(yīng)比率進(jìn)行對比。這樣的比率在本文中稱作ER-α36比率。在一個(gè)實(shí)施例中，對照細(xì)胞可以是用抗-雌激素藥難以治療的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，對照細(xì)胞是用抗-雌激素藥不難治療的細(xì)胞。如果在實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中測定的上述ER-α36比率與在對照細(xì)胞中所述的ER-α36比率相同，則根據(jù)對照細(xì)胞的狀態(tài)，分類實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。例如，如果實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中ER-α36與ER-α66的比率與已知能耐他莫昔芬治療的對照細(xì)胞中ER-α36與ER-α66的比率相同，則將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞歸入耐他莫昔芬治療的。但是，如果實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中ER-α36與ER-α66的比率與不能耐他莫昔芬治療的對照細(xì)胞中ER-α36與ER-α66的比率相同，則將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞歸入不耐他莫昔芬治療的。在另一個(gè)實(shí)例中，將在實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中測定的ER-α36比率與已知能耐他莫昔芬治療的對照細(xì)胞中的對應(yīng)比率進(jìn)行對比，并與已知不能耐他莫昔芬治療的對照細(xì)胞中的比率進(jìn)行對比。然后如上所述，將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞歸入耐他莫昔芬治療的，或不耐他莫昔芬治療的。已知不耐他莫昔芬治療的對照細(xì)胞的一個(gè)實(shí)例是MCF7(ATTC保藏登記號HTB-22)。已知耐低劑量他莫昔芬治療的對照細(xì)胞的一個(gè)實(shí)例是MDA-MB-231。通過對比實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中的ER-α36比率，也可以將已知耐他莫昔芬治療的乳腺癌細(xì)胞用作對照細(xì)胞。
鑒別能結(jié)合本發(fā)明的多肽的試劑本發(fā)明也提供了鑒別能結(jié)合本發(fā)明的多肽的試劑的方法。這樣的方法也稱作篩選測定。該方法包括，組合本發(fā)明的多肽和試劑，和測定該試劑是否結(jié)合多肽。一般，測定試劑是否結(jié)合多肽，包括檢測試劑和多肽之間的復(fù)合物形成。測定復(fù)合物的方法包括，例如，直接檢測試劑與多肽的結(jié)合，和使用競爭結(jié)合測定，檢測試劑與多肽的結(jié)合。測定可以是無細(xì)胞的測定?？梢栽谟谢驔]有雌激素或抗-雌激素藥存在下，進(jìn)行測定。任選地，該方法也包括，測定試劑是否結(jié)合ER-α66多肽，例如具有SEQ ID NO18所述的氨基酸序列的多肽。優(yōu)選地，試劑不能結(jié)合ER-α66多肽。
使用本領(lǐng)域已知的組合文庫方法中的許多方法的任一種，包括生物學(xué)文庫，空間上可尋址的平行固相或液相文庫，需要解卷積的合成文庫方法，“一個(gè)珠子一種化合物(one-bead one-compound)”文庫方法，和使用親和色譜選擇的合成文庫方法，可以得到試劑。生物文庫方法包括肽文庫，而其它4種方法適用于肽、非肽寡聚物或小分子化合物文庫(Lam，Anticancer Drug Des.12145(1997))。在本領(lǐng)域可以找到關(guān)于合成分子文庫的方法的實(shí)例(見，例如DeWitt等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906909(1993)；Erb等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA9111422(1994)；Zuckermann等J.Med.Chem.372678(1994)；Cho等Science 2611303(1993)；Carrell等Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059(1994)；Carell等Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061(1994)；和Gallop等J.Med.Chem.371233(1994))。要篩選的潛在試劑的來源包括，例如，細(xì)菌和真菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，和植物和其它增殖體的細(xì)胞提取物。
化合物文庫可以存在于例如溶液中(例如HoughtenBio/Techniques 13412-421(1992))，或珠子上(Lam Nature 35482-84(1991))，芯片上(Fodor Nature 364555-556(1993))，細(xì)菌(美國專利號5,223,409)，孢子(美國專利號5,571,698；5,403,484；和5,223,409)，質(zhì)粒(Cull等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891865-1869(1992))，或噬菌體(Scott等Science 249386-390(1990)；Devlin Science 249404-406(1990)；Cwirla等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 876378-6382(1990)；和Felici J.Mol.Biol.222301-310(1991))。
通過例如用放射性同位素或酶標(biāo)記偶聯(lián)試劑，從而可以通過檢測復(fù)合物中的標(biāo)記的化合物，測定試劑與本發(fā)明的多肽的結(jié)合，來確定試劑結(jié)合本發(fā)明的多肽的能力。例如，可以用125I、35S、14C或3H直接地或間接地標(biāo)記試劑，并通過直接計(jì)數(shù)radioemmission或通過閃爍計(jì)數(shù)，檢測放射性同位素?；蛘?，可以用例如，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或螢光素酶，酶促地標(biāo)記試劑，并通過測定適當(dāng)?shù)牡孜锵虍a(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，檢測酶標(biāo)記。
以類似的方式，人們可以測定試劑改變(例如，刺激或抑制)本發(fā)明的多肽與多肽的已知配體(例如，本發(fā)明的多肽能天然地結(jié)合或與其相互作用的分子)的結(jié)合的能力。這樣的配體的實(shí)例是雌激素，以及抗-雌激素藥，例如他莫昔芬。在一個(gè)優(yōu)選的方面，通過監(jiān)控本發(fā)明的多肽的活性，可以測定試劑改變本發(fā)明的多肽與配體的結(jié)合的能力。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明的測定包括，使本發(fā)明的多肽接觸試劑，和測定試劑結(jié)合多肽的能力。如上所述，可以直接或間接地測定試劑與多肽的結(jié)合。在一個(gè)優(yōu)選的方面，測定包括使本發(fā)明的多肽接觸配體，已知后者能結(jié)合本發(fā)明的多肽，以形成測定混合物，并使測定混合物接觸試劑，和測定試劑優(yōu)先結(jié)合多肽(與配體相比)的能力。
在另一個(gè)方面，測定包括，使本發(fā)明的多肽接觸試劑，和測定試劑改變(例如，刺激或抑制)本發(fā)明的多肽的活性的能力。
在另一個(gè)方面，測定包括，篩選能改變(例如，刺激或抑制)本發(fā)明的多肽調(diào)節(jié)雌激素反應(yīng)元件的轉(zhuǎn)錄反式激活的能力的試劑，所述反式激活包括，例如，由ER-α66的AF-1和/或AF-2結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的活性。優(yōu)選地，使用融合多肽，其包含本發(fā)明的多肽和具有轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域或轉(zhuǎn)錄阻遏結(jié)構(gòu)域的多肽。具有轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域的多肽的一個(gè)實(shí)例是VP-16，且具有轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域或轉(zhuǎn)錄阻遏結(jié)構(gòu)域的其它有用多肽是本領(lǐng)域已知的。一般，這樣的融合多肽與多核苷酸組合使用，后者具有位于啟動(dòng)子上游的雌激素反應(yīng)元件，和可操作地連接的編碼序列。可以使用許多啟動(dòng)子，包括，例如，胸苷激酶啟動(dòng)子。優(yōu)選地，可操作地連接的編碼區(qū)能編碼檢測標(biāo)記，例如螢光素酶，或熒光多肽例如綠色熒光蛋白。一方面，在不存在試劑的情況下，在能促進(jìn)多核苷酸上存在的編碼區(qū)的表達(dá)的條件下，組合具有轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域的融合多肽、多核苷酸和試劑，并測定試劑改變轉(zhuǎn)錄的作用。任選地，ER-α66多肽和/或ERβ多肽也可以存在，且使用該測定來鑒別試劑，后者能改變(例如，刺激或抑制)本發(fā)明的多肽調(diào)節(jié)依賴于配體的和不依賴于配體的ER-α66多肽或ERβ的轉(zhuǎn)錄活性的能力。優(yōu)選地，細(xì)胞中存在融合多核苷酸，和包含位于啟動(dòng)子上游的雌激素反應(yīng)元件和可操作地連接的編碼序列的多核苷酸。無意進(jìn)行限制，預(yù)期能改變本發(fā)明的多肽調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄反式激活的能力的試劑，可以包括能改變本發(fā)明的多肽的構(gòu)象以增加或減少該能力的試劑。
在測定中，可能需要固定化本發(fā)明的多肽，它的配體，或試劑，以促進(jìn)分離復(fù)合的和非復(fù)合形式的一種或2種分子，以及實(shí)現(xiàn)測定的自動(dòng)化。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以提供融合蛋白，其能添加結(jié)構(gòu)域，后者允許本發(fā)明的多肽結(jié)合到基質(zhì)上。例如，具有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的融合多肽可以被吸附到谷胱甘肽瓊脂糖珠子(Sigma Chemical，St.Louis，Mo.)或谷胱甘肽-衍生的微量滴定板上，其再與試劑結(jié)合，并在有助于復(fù)合物形成的條件下(例如對于鹽和pH在生理?xiàng)l件下)，溫育混合物。溫育后，可以洗滌珠子或微量滴定板孔，以去除任何未結(jié)合的組分，并直接或間接地測量復(fù)合物形成，例如，如上所述?；蛘?，可以從基質(zhì)解離復(fù)合物，并測定結(jié)合水平。
在本發(fā)明的篩選測定中，也可以使用用于將多肽固定化到基質(zhì)上的其它技術(shù)。例如，使用生物素和鏈霉抗生物素蛋白的綴合物，可以固定化本發(fā)明的多肽。使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)(例如，生物素化試劑盒，Pierce Chemicals，Rockford，Ill.)，使用生物素-NHS(N-羥基-琥珀酰亞胺)，可以生物素化本發(fā)明的多肽，和例如，將所述多肽固定化在鏈霉抗生物素蛋白-涂覆的96-孔平板(Pierce Chemicals)的孔中?；蛘?，可以將能與本發(fā)明的多肽反應(yīng)的抗體衍生到平板的孔中，并通過抗體綴合，將未結(jié)合的本發(fā)明的多肽捕獲進(jìn)孔中。除了上述的GST-固定化的復(fù)合物的那些方法外，檢測這樣的復(fù)合物的方法包括，使用能與特異性地結(jié)合本發(fā)明的多肽的抗體反應(yīng)的抗體，免疫檢測復(fù)合物。
本發(fā)明也包括通過上述篩選測定鑒別出的新試劑，及其在本文所述的治療中的用途。
治療方法本發(fā)明還涉及治療受試者中的某些疾病的方法。該受試者是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人。如本文使用的，術(shù)語“疾病”指顯示特征性癥狀或一組癥狀的受試者的部分、器官或系統(tǒng)或其組合的正常結(jié)構(gòu)或功能的任何背離或中斷。疾病包括依賴于通過類固醇化合物激素受體(例如雌激素受體)的信號傳導(dǎo)的癌癥。這樣的疾病的實(shí)例稱作雌激素-有關(guān)的癌癥，且包括乳腺癌和前列腺癌。一般，通過評價(jià)與疾病有關(guān)的癥狀，確定受試者是否患有疾病，和受試者是否能對治療作出響應(yīng)。如本文使用的，術(shù)語“癥狀”指存在于受試者中的疾病的客觀證據(jù)。在本文中提及的與疾病有關(guān)的癥狀和這樣的癥狀的評價(jià)，是本領(lǐng)域常規(guī)的和已知的。依賴于通過類固醇化合物激素受體的信號傳導(dǎo)的癌癥的癥狀的實(shí)例包括，例如，腫瘤的存在和大小，和生物標(biāo)記的存在和量。生物標(biāo)記是存在于受試者中的化合物，一般是多肽，且指示著癌癥的進(jìn)展。生物標(biāo)記的實(shí)例包括，例如，Her-2表達(dá)，和細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)。
疾病的治療可以是預(yù)防性的，或者，可以在疾病發(fā)展后開始。預(yù)防性的治療，例如在受試者表現(xiàn)出疾病癥狀之前開始，在本文中稱作處于疾病發(fā)展的“危險(xiǎn)”中的受試者的治療。處于疾病發(fā)展的危險(xiǎn)中的受試者的實(shí)例，是具有與疾病有關(guān)的危險(xiǎn)因素(例如遺傳標(biāo)記)的人。能指示受試者具有發(fā)展某些癌癥(例如乳腺癌或前列腺癌)的素因的遺傳標(biāo)記的實(shí)例包括，BRAC1和/或BRAC2基因的改變。在發(fā)生本文所述的疾病之前、過程中或之后，可以進(jìn)行治療。在發(fā)展疾病之后開始的治療，可能減輕狀況之一的癥狀的嚴(yán)重性，或完全消除癥狀。
在有些方面，該方法一般包括，使細(xì)胞接觸組合物，后者包含有效量的能抑制本發(fā)明的多肽的活性的試劑，例如，使用本文所述的方法鑒別出的試劑。優(yōu)選地，這樣的試劑能結(jié)合本發(fā)明的多肽。在有些方面，試劑優(yōu)選地不是抗-雌激素藥。如本文使用的，“有效量”是能有效地在細(xì)胞中抑制本發(fā)明的多肽的活性、減少與疾病有關(guān)的癥狀、或其組合的量。一方面，組合物可以包括有效量的本發(fā)明的抗體。優(yōu)選地，使抗體共價(jià)附著于化療劑，例如，他莫昔芬。組合物可以任選地包含其它化療劑。使用離體模型和動(dòng)物模型，可以評價(jià)能否預(yù)期試劑或抗體(優(yōu)選地，抗體)在本發(fā)明的該方面起作用。這樣的模型是本領(lǐng)域已知的，且通常被公認(rèn)為疾病或治療人的方法的代表。這樣的動(dòng)物模型的優(yōu)選實(shí)例是裸鼠。例如，可以將乳腺癌細(xì)胞接種進(jìn)切除卵巢的雌性裸鼠的乳房脂墊中，隨后形成損害，并通過例如觸診、游標(biāo)卡尺測量和腫瘤重量進(jìn)行評價(jià)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型也可以得到。例如，用于研究前列腺癌的模型例如TRAMP模型(見，例如，Greenberg等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，922429-3443(1995))和用于研究乳腺癌的模型例如MMTV-Wnt-1模型(見，例如，Tsukamoto等，Cell，55619-625(1988))，被普遍公認(rèn)為人疾病的模型。
在另一個(gè)方面，使細(xì)胞接觸包含多核苷酸的組合物，其中多核苷酸會(huì)造成能編碼本發(fā)明的多肽的編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄后沉默。這樣的多核苷酸在本文中稱作沉默多核苷酸?？梢詫⒃摮聊嗪塑账嶙鳛镽NA多核苷酸，或作為包含能編碼和表達(dá)RNA多核苷酸的DNA多核苷酸的載體，導(dǎo)入細(xì)胞中?？梢允┯贸^一種類型的多核苷酸，例如，可以在本文的方法中，組合和使用設(shè)計(jì)用于沉默相同的mRNA的2種或更多種多核苷酸?；蛘?，可以一起使用2種或更多種多核苷酸，其中每種多核苷酸各自設(shè)計(jì)用于沉默不同的mRNA。
如本文使用的，術(shù)語“多核苷酸”指任意長度的核苷酸(核糖核苷酸、脫氧核苷酸或其組合)的聚合形式，且包括單鏈分子和雙鏈的雙鏈體。多核苷酸可以從天然來源直接得到，或可以在重組、酶或化學(xué)技術(shù)的輔助下制備。優(yōu)選地，分離本發(fā)明的多核苷酸。如本文使用的，“靶編碼區(qū)”和“靶編碼序列”指被沉默多核苷酸抑制其表達(dá)的編碼區(qū)。如本文使用的，“靶mRNA”是由靶編碼區(qū)編碼的mRNA。靶編碼區(qū)的實(shí)例是，能編碼ER-α36的核苷酸序列(SEQ ID NO21)、5′側(cè)翼核苷酸序列(SEQ ID NO20)或3′側(cè)翼核苷酸序列，包括由外顯子9編碼的核苷酸序列(SEQ ID NO25)。
沉默多核苷酸包括雙鏈RNA(dsRNA)多核苷酸。沉默多核苷酸的序列包括在本文中稱作有義鏈的一條鏈，其具有16至30個(gè)核苷酸，例如，16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸。有義鏈與靶mRNA基本上相同，優(yōu)選地相同。如本文使用的，術(shù)語“相同”指有義鏈的核苷酸序列具有與靶mRNA的部分相同的核苷酸序列。如本文使用的，術(shù)語“基本上相同”指有義鏈的序列與靶mRNA的序列存在1、2或3個(gè)核苷酸、優(yōu)選地1個(gè)核苷酸的差異，且剩余的核苷酸與mRNA的序列相同。有義鏈的這1、2或3個(gè)核苷酸稱作非互補(bǔ)的核苷酸。當(dāng)沉默多核苷酸包含基本上與靶mRNA相同的有義鏈時(shí)，1、2或3個(gè)非互補(bǔ)的核苷酸優(yōu)選地位于有義鏈的中央。例如，如果有義鏈?zhǔn)?1個(gè)核苷酸長，則非互補(bǔ)的核苷酸一般在核苷酸9、10、11或12處，優(yōu)選核苷酸10或11處。dsRNA多核苷酸的另一條鏈，在本文中稱作反義鏈，與有義鏈互補(bǔ)。術(shù)語“互補(bǔ)”指2個(gè)單鏈多核苷酸彼此堿基配對的能力，其中一個(gè)多核苷酸上的腺嘌呤與第二個(gè)多核苷酸上的胸腺嘧啶或尿嘧啶堿基配對，而一個(gè)多核苷酸上的胞嘧啶與第二個(gè)多核苷酸上的鳥嘌呤堿基配對。沉默多核苷酸也包括與dsRNA多核苷酸相對應(yīng)的雙鏈DNA多核苷酸。還包括與本文公開的有義鏈和反義鏈相對應(yīng)的單鏈RNA多核苷酸和單鏈DNA多核苷酸。應(yīng)當(dāng)理解，通過用尿嘧啶核苷酸替代每個(gè)胸苷核苷酸，可以將本文作為DNA序列公開的序列從DNA序列轉(zhuǎn)化成RNA序列。無意進(jìn)行限制，本發(fā)明的多核苷酸會(huì)造成靶編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄后沉默。在沉默中使用的多核苷酸的修飾，是本領(lǐng)域已知的，且可以如此修飾沉默多核苷酸。
也可以共價(jià)附著本發(fā)明的dsRNA沉默多核苷酸的有義和反義鏈，一般通過由核苷酸制成的間隔區(qū)實(shí)現(xiàn)。這樣的多核苷酸在本領(lǐng)域中經(jīng)常稱作短發(fā)夾RNA(shRNA)。在有義和反義鏈的堿基配對后，間隔區(qū)區(qū)域形成環(huán)。組成環(huán)的核苷酸的數(shù)目可以變化，且已經(jīng)報(bào)道了3至23個(gè)核苷酸的環(huán)(Sui等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA，99，5515-5520(2002)，和Jacque等，Nature，418，435-438(2002))。
沉默多核苷酸能造成靶編碼區(qū)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后抑制，也稱作沉默。不希望受理論的限制，導(dǎo)入細(xì)胞后，沉默多核苷酸會(huì)與靶mRNA雜交，并觸發(fā)細(xì)胞的內(nèi)切核酸酶以切割靶mRNA。結(jié)果是，抑制由mRNA編碼的多肽的表達(dá)。通過例如測量細(xì)胞中靶mRNA的量的減少，測量由mRNA編碼的多肽的量的減少，或通過測量由mRNA編碼的多肽的活性的降低，可以確定是否抑制了靶編碼區(qū)的表達(dá)。沉默多核苷酸可以存在于載體中。沉默多核苷酸也可以作為2個(gè)分開的互補(bǔ)的多核苷酸存在于載體中，其中的每一個(gè)都可以被表達(dá)，以產(chǎn)生dsRNA的有義和反義鏈，或作為含有有義鏈、環(huán)區(qū)和反義鏈的單個(gè)多核苷酸存在于載體中，其可以被表達(dá)，以產(chǎn)生具有dsRNA的有義和反義鏈的RNA多核苷酸。
使用本領(lǐng)域常規(guī)且已知的方法，可以設(shè)計(jì)沉默多核苷酸。例如，通過掃描編碼區(qū)AA二核苷酸序列，可以鑒別沉默多核苷酸；每個(gè)AA和mRNA的下游(3’)連續(xù)的16至30個(gè)核苷酸可以用作候選多核苷酸的有義鏈。候選多核苷酸是用于測試以確定其能否降低本發(fā)明的多肽之一的表達(dá)的多核苷酸。候選多核苷酸可以與位于能編碼多肽的區(qū)域、或位于mRNA的5′或3′非翻譯區(qū)中的核苷酸相同。任選地且優(yōu)選地，修飾候選多核苷酸，以包含1、2或3，優(yōu)選地1個(gè)不互補(bǔ)的核苷酸。其它方法是本領(lǐng)域已知的，且常規(guī)地用于設(shè)計(jì)和選擇候選多核苷酸。沉默多核苷酸可以，但不必，在有義鏈的5′端以二核苷酸AA開始。候選多核苷酸也可以包含1、2或3個(gè)核苷酸的突出端，一般在有義鏈、反義鏈或二者的3′端。一般，使用可公開得到的算法(例如，BLAST)，篩選候選多核苷酸，以對比候選多核苷酸序列和編碼序列?；谄渌紤]，一般消除可能與非-靶編碼區(qū)表達(dá)的mRNA形成雙鏈體的那些。然后，可以測試剩余的候選多核苷酸，以確定它們是否能抑制本文所述的多肽之一的表達(dá)。
通常，通過將候選多核苷酸導(dǎo)入能表達(dá)本發(fā)明的多肽的細(xì)胞，單個(gè)地測試候選多核苷酸?？梢泽w外地制備候選多核苷酸，然后導(dǎo)入細(xì)胞。體外合成的方法包括，例如，用常規(guī)的DNA/RNA合成儀進(jìn)行化學(xué)合成。合成多核苷酸和用于這樣的合成的試劑的商業(yè)供應(yīng)商是眾所周知的。體外合成的方法也包括，例如，使用在無細(xì)胞系統(tǒng)中的環(huán)狀或線狀載體的體外轉(zhuǎn)錄。
通過將能編碼候選多核苷酸的構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞，也可以制備候選多核苷酸。這樣的構(gòu)建體是本領(lǐng)域已知的，且包括例如，能編碼和表達(dá)候選多核苷酸的有義鏈和反義鏈的載體，和包含能編碼候選多核苷酸的有義鏈和反義鏈的序列的RNA表達(dá)盒，所述序列側(cè)接可操作地連接的調(diào)節(jié)序列，例如RNA聚合酶III啟動(dòng)子和RNA聚合酶III終止子，其會(huì)導(dǎo)致RNA多核苷酸的生產(chǎn)。細(xì)胞可以是離體的或體內(nèi)的。也可以在動(dòng)物模型中測試候選多核苷酸。
當(dāng)評價(jià)候選多核苷酸是否能起抑制本文所述的多肽之一的表達(dá)的作用時(shí)，可以測量含有候選多核苷酸的細(xì)胞中的靶mRNA的量，并與不含有候選多核苷酸的相同類型的細(xì)胞相對比。測量細(xì)胞中的mRNA水平的方法，是本領(lǐng)域已知的和常規(guī)的。這樣的方法包括定量RT-PCR。用于擴(kuò)增mRNA的引物和特定條件，依賴于mRNA而變化，且可以由熟練的技術(shù)人員容易地確定。其它方法包括，例如，RNA印跡和陣列分析。
用于評價(jià)候選多核苷酸是否能起抑制本文所述的多肽之一的表達(dá)的作用的其它方法包括監(jiān)控多肽。例如，可以使用測定來測量由mRNA編碼的多肽的量，或測量由mRNA編碼的多肽的活性的降低。用于測量多肽量的減少的方法包括，測定存在于含有候選多核苷酸的細(xì)胞中的多肽，并與不含有候選多核苷酸的相同類型的細(xì)胞相對比。例如，本發(fā)明的抗體可以用于例如蛋白免疫印跡、免疫沉淀或免疫組織化學(xué)。針對本文所述的多肽中的每一種的抗體都是可商業(yè)上得到的。也可以使用能測量本發(fā)明的多肽之一的活性降低的方法。
試劑盒本發(fā)明提供了試劑盒，其含有可以用于本發(fā)明的方法中的試劑，所述方法包括，例如，測定細(xì)胞是否能表達(dá)本發(fā)明的多肽。這樣的試劑盒可以含有包裝材料和本發(fā)明的抗體。醫(yī)學(xué)人員也可以將這樣的試劑盒用于配制含有本發(fā)明的抗體的組合物，例如藥物組合物。
包裝材料能為抗體提供保護(hù)環(huán)境。例如，包裝材料可以使抗體免受污染。另外，包裝材料可以將抗體保持在溶液中，以避免變干?？梢杂米靼b材料的合適的材料的實(shí)例包括，玻璃、塑料、金屬等?？梢允惯@樣的材料硅烷化，以避免抗體向包裝材料的粘附。
在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包含包裝材料，能特異性結(jié)合本發(fā)明的多肽的第一抗體，和能特異性結(jié)合ER-α66多肽的第二抗體。試劑盒可以任選地包含其它組分，例如緩沖液、反應(yīng)容器、第二抗體和注射器。
實(shí)施例實(shí)施例1小窩蛋白-1單倍體不足產(chǎn)生正常乳房上皮細(xì)胞的ER-α表達(dá)的激活和雌激素刺激的轉(zhuǎn)化使用從Harvard Medical School的Dr.Philip Leder的實(shí)驗(yàn)室得到的聚腺苷酸(poly-A)捕獲逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(RET)(Ishida等，Nucl.Acid Res.，27580(1999))，制備了來自正常人乳房上皮MCF10A細(xì)胞的細(xì)胞克隆的基因-捕獲文庫。簡而言之，該載體使用改進(jìn)的聚腺苷酸捕獲策略，以有效地鑒別功能基因，而無論它們在靶細(xì)胞中的表達(dá)狀態(tài)。強(qiáng)剪接受體和有效的多腺苷酸化信號的組合，確保了“捕獲的”基因的功能的完全破壞。在RET載體中包含無啟動(dòng)子的GFP cDNA，允許在活細(xì)胞中容易地監(jiān)控捕獲的基因的表達(dá)模式。使用含有RET載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染MCF10A細(xì)胞。然后，篩選細(xì)胞的G418-抗性，以確立基因-捕獲的MCF10A細(xì)胞文庫。通過G418選擇3周后，監(jiān)控在“捕獲的”基因的內(nèi)源性啟動(dòng)子控制下的GFP表達(dá)，然后選擇G418抗性和GFP表達(dá)克隆。該文庫代表著3×105獨(dú)立的感染的克隆，其中RET載體破壞了功能基因的一個(gè)等位基因。
認(rèn)為具有腫瘤抑制活性的基因的表達(dá)的喪失，會(huì)將轉(zhuǎn)化的表型賦予正常的MCF10A細(xì)胞。進(jìn)行軟瓊脂克隆測定，并鑒別來自獲得的無貼壁依賴性生長(轉(zhuǎn)化的表型的一個(gè)特征)的基因-捕獲的細(xì)胞文庫的細(xì)胞。超過100個(gè)來自G418-抗性的細(xì)胞文庫的陽性菌落(≥30細(xì)胞)能在軟瓊脂中生長，而親本MCF10A細(xì)胞不能。分離20個(gè)細(xì)胞克隆，擴(kuò)增，然后再在軟瓊脂中選擇3周，該軟瓊脂含有正常血清+10-8M 17b雌二醇(E2)和糊精包被的活性炭吸附的血清，其缺少類固醇激素。分離和擴(kuò)增能在含有額外的E2的軟瓊脂中表現(xiàn)處加速生長的4個(gè)細(xì)胞克隆(ST1、ST3、ST4和ST6)(圖3)。
使用3′RACE，其允許捕獲未知的位于候選基因的外顯子和聚腺苷酸尾巴之間的3′mRNA序列，來克隆潛在的基因，該基因的破壞會(huì)導(dǎo)致MCF10A細(xì)胞轉(zhuǎn)化。認(rèn)為MCF10A細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，是由于正雌激素信號傳導(dǎo)?？寺∮蒖ACE方法產(chǎn)生的純化的PCR片段，并測序。使用BLASTN搜索，來自2個(gè)克隆(ST1和ST3)的DNA序列相同地匹配位于染色體7上的小窩蛋白-1(Cav-1)外顯子-3的序列(GenBank登記號XM048940)。該結(jié)果表明，在至少2個(gè)克隆中破壞了Cav-1基因的等位基因。除了Cav-1以外，使用相同的技術(shù)，鑒別了2個(gè)其它的基因。在克隆ST4中破壞的基因是SPRR1B(GenBank登記號NT-004441.5)，即參與角質(zhì)化細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)組織的角質(zhì)蛋白/小脯氨酸-富集的蛋白家族的成員。來自克隆ST6的另一個(gè)基因是推定的新基因(GenBank登記號6599139)，尚不知其功能。
在親本MCF10A細(xì)胞中分析Cav-1蛋白水平，以測試Cav-1的表達(dá)水平是否在cav-1基因捕獲的細(xì)胞中降低。分析了上述的4個(gè)細(xì)胞克隆(ST1、3、4和6)和MCF10A-Ha-ras(被Ha-ras突變體轉(zhuǎn)化的MCF10A細(xì)胞)。與親本MCF10A細(xì)胞中的水平相比，Cav-1蛋白水平為所有轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的約1/2，如蛋白印跡分析所證實(shí)的(圖4)。該數(shù)據(jù)與當(dāng)僅僅cav-1基因的一個(gè)功能等位基因在ST1和ST3細(xì)胞中有功能時(shí)降低的Cav-1表達(dá)相一致。這表明，通過“基因捕獲”產(chǎn)生的Cav-1單倍體不足，會(huì)導(dǎo)致E2刺激的轉(zhuǎn)化。該數(shù)據(jù)也表明，Cav-1的下調(diào)，也參與由ST4和ST6細(xì)胞中的其它基因的破壞引起的轉(zhuǎn)化。
為了確定Cav-1單倍體不足產(chǎn)生雌激素-刺激的細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)化的機(jī)理，檢查上述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中ER-α和ER-β的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)所有4種轉(zhuǎn)化的細(xì)胞克隆都能以可與Ha-ras轉(zhuǎn)化的細(xì)胞相當(dāng)?shù)乃?，表達(dá)ER-α，而親本MCF10A細(xì)胞和HBL-100細(xì)胞(另一種正常的乳房上皮細(xì)胞系)，表達(dá)不可檢測水平的ER-α(圖5)。在所有測試的細(xì)胞中，ER-β表達(dá)沒有任何變化(圖5)。該數(shù)據(jù)表明，ER-α表達(dá)被激活，且這些轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中的雌激素信號傳導(dǎo)負(fù)責(zé)軟瓊脂上的雌激素-刺激的細(xì)胞生長。此前已經(jīng)表明，Ha-ras轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中的ER-α表達(dá)和雌激素信號傳導(dǎo)都被激活(Shekhar等，Int.J.Oncol.，13907(1998)和Shekhar等，Am.J.of Pathl.，1521129(1998))。該結(jié)果表明，Ras/MAPK途徑參與調(diào)節(jié)ER-α表達(dá)和正雌激素信號傳導(dǎo)。
使用磷酸-特異性的抗體，通過檢查ERK1/2的磷酸化水平，分析這些轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中的MAPK途徑的激活。發(fā)現(xiàn)ERK1/2在所有轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中都是高度地且組成型地磷酸化的，但是在MCF10A細(xì)胞中不是(圖6)。
總之，這些數(shù)據(jù)表明，在人乳腺癌發(fā)展過程中，Cav-1/Ras/MAPK途徑參與ER-α表達(dá)的激活，并與雌激素信號傳導(dǎo)途徑協(xié)作，以刺激轉(zhuǎn)化的細(xì)胞增殖。
實(shí)施例2雌激素受體α的一個(gè)同種型(ER-α36)的鑒別、克隆、表達(dá)和表征在上述工作的過程中，使用來自Research Diagnostic，INC.的大鼠抗-ER-α抗體(克隆H222)，在蛋白印跡分析中連續(xù)觀察到3個(gè)蛋白條帶(66-kDa、46-kDa和36-kDa)。H222抗體能識別ER-α的配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。為了排除46-kDa和36-kDa蛋白條帶是ER-α66的降解產(chǎn)物的可能性，如以前報(bào)道所暗示的(Abbondanza等，Steroids，584(1993))，使用含有8M脲的緩沖液，在培養(yǎng)平板中裂解細(xì)胞，并通過蛋白印跡分析進(jìn)行測試。在Cav-1單倍體不足的細(xì)胞ST1和ST3，和MCF7乳腺癌細(xì)胞中，能容易地觀察到3個(gè)不同的條帶(圖7)。這些結(jié)果指示著共有能被抗體H222識別的類似表位的ER-α同種型的存在。
通過文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)已經(jīng)克隆了ER-α的46-kDa同種型，其能起由ER-α66的AF-1結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的反式激活的顯性負(fù)抑制劑的功能(Flouriot等，EMBO J.，194688(2000))。后續(xù)檢索鑒別出了來自正常人子宮內(nèi)膜cDNA文庫(RZPD克隆編號DKFZp686N23123)的克隆，其含有5.4kb cDNA。該cDNA克隆攜帶310個(gè)氨基酸可讀框，其理論上可以生產(chǎn)預(yù)測分子量為35.7kDa的蛋白?？勺x框的cDNA序列與ER-α66基因的外顯子2-6的DNA序列100％匹配。cDNA的5′非翻譯區(qū)(5′UTR)表現(xiàn)出與ER-α66基因的第一個(gè)內(nèi)含子DNA序列734-907的100％同源性(ER-α66基因的34,233bp第一個(gè)內(nèi)含子的第一個(gè)堿基對稱作1)。因而，確認(rèn)ER-α36的轉(zhuǎn)錄物是從ER-α66基因的第一個(gè)內(nèi)含子中的以前沒有鑒別的啟動(dòng)子開始的。
來自ER-α66基因的第一個(gè)內(nèi)含子734-907的小的、非編碼的新外顯子稱作“外顯子1。然后，將外顯子1’直接剪接進(jìn)ER-α66基因的外顯子2，并從ER-α66基因的外顯子2延續(xù)到外顯子6。然后，將外顯子6剪接到位于ER-α66基因下游64,141bp的外顯子(GeneBank登記號AY425004，見表1)。能編碼最后27個(gè)氨基酸和4,293bp 3′非翻譯區(qū)的cDNA序列與來自染色體6q24.2-25.3(GeneBank登記號AL078582)上的克隆RP1-1304的基因組序列的連續(xù)序列100％匹配，從而表明該新ER-α同種型的剩余cDNA序列是從位于以前報(bào)道的ER-α66基因下游的一個(gè)4,374bp外顯子轉(zhuǎn)錄的。因而，該外顯子稱作外顯子9，以反映超過以前報(bào)道的8個(gè)外顯子的額外的外顯子(圖8)。通過鑒別剪接接合點(diǎn)處的完美的剪接供體和受體，支持了所有這些剪接事件。蛋白ER-α36可以由位于第二個(gè)外顯子中的完美的Kozak序列生產(chǎn)，即有于生產(chǎn)ER-α46的相同的起始密碼子(Flouriot等，EMBO J.，194688(2000))。ER-α36與ER-α66的區(qū)別在于，缺少轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域AF-1和AF-2，但是保留了二聚化、DNA-結(jié)合和局部的配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。它也具有額外的、獨(dú)特的27氨基酸結(jié)構(gòu)域，以替代由ER-α66的外顯子7和8編碼的最后138個(gè)氨基酸(圖1)。在這里，ER-α的該新的同種型稱作ER-α36。
根據(jù)生產(chǎn)商所述的方法，使用從人胎盤RNA制備的MarathonReady cDNA(Clonetech)的PCR，得到能編碼ER-α36的可讀框。根據(jù)DKFZp686N23123的cDNA序列，設(shè)計(jì)PCR引物對。5′引物是在末端具有EcoRI位點(diǎn)的5′-CGGAATTCCGAAGGGAAGTATGGCTATGGAATCC-3′(SEQ ID NO23)，且3′引物是在末端具有BamHI位點(diǎn)的5′-CGGGATCCAGAGGCTTTAGACACGAGGAAAC-3′(SEQ ID NO24)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠上的電泳，并觀察到預(yù)期的1.1kb DNA片段(圖9)。純化DNA片段，用EcoRI和BamHI消化，克隆進(jìn)pBluescript載體(pBS-ER-α36)，并完全測序。序列表現(xiàn)出與cDNA克隆DKFZp686N23123的100％同一性，表明ER-α36是可以從另一種來源克隆的ER-α的天然產(chǎn)生的同種型。圖10顯示了由可讀框編碼的預(yù)測的氨基酸序列。
使用含有ER-α66、ER-α46和ER-α36的表達(dá)載體，在人胚腎293細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染測定，以測試克隆的cDNA是否能生產(chǎn)ER-α36蛋白。將來自這些轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和MCF7細(xì)胞的全細(xì)胞提取物進(jìn)行蛋白印跡分析，其中單克隆抗體H222針對ER-α的配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Abbondanza等，Steroids，584(1993))。在ER-α36載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，生成了能被H222抗體識別的36kDa蛋白(圖11)。該蛋白的大小，和它不能與針對ER-α66的B-結(jié)構(gòu)域的抗體H226反應(yīng)，以及不能與識別ER-α66的C-末端的抗體HC 20反應(yīng)，表明ER-α同種型缺少ER-α66的N-末端和C-末端，從而導(dǎo)致缺少AF-1和AF-2結(jié)構(gòu)域的ER-α。
在ER-α36蛋白上，進(jìn)行一系列的計(jì)算機(jī)搜索。FindMod和SCANPROSITE算法預(yù)測了ER-α36中的3個(gè)豆蔻?；稽c(diǎn)，表明它可能位于外周膜。這與k-毗鄰(PSPORT II)算法相一致，后者預(yù)測21.7％、34.8％、17.4％和26％的ER-α36分別位于核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體和膜級分中。這與關(guān)于ER-α46的預(yù)測類似(分別是26.1％、30.4％、17.4％和26.1％)。相反地，73.9％8.7％、0.1％和17.3％的ER-α66具有可對比的預(yù)測。因而，ER-α66、ER-α46和ER-α36的有差異的區(qū)室化，表明每個(gè)受體的功能位點(diǎn)和主要作用可能是不同的。
還在位于ER-α66基因的第一個(gè)內(nèi)含子中的能編碼ER-α36的基因的推定的5′側(cè)翼區(qū)上，進(jìn)行了計(jì)算機(jī)搜索。發(fā)現(xiàn)TATA結(jié)合蛋白(TBP)識別序列位于cDNA起始位點(diǎn)的上游，且?guī)讉€(gè)Sp1、NF-κB和Ap1結(jié)合位點(diǎn)位于5′側(cè)翼區(qū)(圖12)。在ER-α36的5′上游區(qū)，鑒別出了完美的半雌激素反應(yīng)元件(ERE)，表明ER-α36能進(jìn)行E2-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。
實(shí)施例3ER-α36介導(dǎo)膜-啟動(dòng)的雌激素信號傳導(dǎo)，并在ER-陰性的乳腺癌中表達(dá)方法細(xì)胞培養(yǎng)，穩(wěn)定的細(xì)胞系的確立，和用E2-BSA-FITC進(jìn)行膜標(biāo)記。從位于Detroit，MI的Karmanos Cancer Institute，得到MCF10A細(xì)胞，并從ATCC得到人胚腎293細(xì)胞和所有乳腺癌細(xì)胞。在適當(dāng)?shù)慕M織培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO2氣氛中維持所有細(xì)胞。為了確立能表達(dá)重組ER-α36的穩(wěn)定的細(xì)胞，以1×105細(xì)胞/60-mm皿的密度，鋪平板HEK293細(xì)胞，24小時(shí)后，使用FuGene6轉(zhuǎn)染劑(Roche MolecularBiochemicals)，用由巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的ER-α36表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。通過將來自pBS-ER-α36的ER-α36的1.1-kb EcoRI-BamHIcDNA片段克隆進(jìn)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pCB6+的EcoRI和BamHI位點(diǎn)，構(gòu)建ER-α36表達(dá)載體。也將空載體轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，以用作對照。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，重新鋪平板細(xì)胞，并用500μg/ml G418(Invitrogen)選擇2周。擴(kuò)增得到的未克隆的G418-抗性的細(xì)胞群體，以產(chǎn)生用于進(jìn)一步分析的細(xì)胞。為了標(biāo)記能表達(dá)重組ER-α36的穩(wěn)定細(xì)胞的細(xì)胞表面，在4℃，用共價(jià)附著到E2β-半琥珀酸酯上的1μM異硫氰酸熒光素(FITC)-標(biāo)記的BSA(Sigma)，標(biāo)記細(xì)胞15分鐘，在新鮮制備的4％多聚甲醛中固定，并用含有DAPI的封固溶液進(jìn)行封固，以用于顯微鏡評價(jià)。
用雌激素和抗雌激素藥進(jìn)行細(xì)胞刺激，和MTT測定。處理前，在含有2.5％糊精包被的活性炭吸附的胎牛血清的無酚紅培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞48-72小時(shí)，然后用PBS洗滌，并置于新鮮的無酚紅的、無血清的含有0.1μg/ml BSA和5μg/ml胰島素的培養(yǎng)基中12小時(shí)。在37℃，在無血清的培養(yǎng)基中刺激休眠細(xì)胞不同的時(shí)間段。不同的雌激素和抗雌激素藥購自Steraloids Inc.。BSA-E2β購自Sigma。
對于3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-聯(lián)苯基四唑溴化物(MTT)測定，將懸浮細(xì)胞加入96-孔培養(yǎng)板的每個(gè)孔中，達(dá)到1×103細(xì)胞/孔的終濃度，并在37℃，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。將含有10nM E2β、10nM他莫昔芬或4OH-他莫昔芬或7.2nM UO126(Calbiochem)的培養(yǎng)基加入每個(gè)孔中48小時(shí)。如生產(chǎn)商推薦的，用CellTiter96 AqueousOne Solution細(xì)胞增殖測定試劑盒(Bio Rad)進(jìn)行MTT測定。使用微量平板讀數(shù)器(Promega)來測量在490nm的吸光度。
細(xì)胞分級分離測定。如Marquez等(Oncogene，20，5420-5430(2001))所述，進(jìn)行細(xì)胞分級分離。
蛋白印跡分析，間接免疫熒光和抗體。對于蛋白印跡分析，用RIPA緩沖液破碎細(xì)胞，在凝膠裝載緩沖液中煮沸，并在10％ SDS-PAGE凝膠上分離。電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore)。用各種抗體探測濾器，并用適當(dāng)?shù)腍RP-綴合的第二抗體(Santa CruzBiotechnology)和ECL試劑Perkin Elmer Life Sciences)顯現(xiàn)。
針對ERK1/2(K-23)的抗體購自Santa Cruz Biotechnology。用于分析MAP激酶途徑的活化的抗體包括磷酸化形式的Mekl和ERK1/2，且購自Cell Signaling Technology。大鼠抗-ER-α抗體(H222)購自Research Diagnostic Inc.。COPB(Y-20)的抗體、mSin3A(AK-11)和5′核苷酸酶(H-300)購自Santa Cruz biotechnology Inc.。D4-GDI(克隆97A1015)購自Upstate Biotechnology。
在兔子中，產(chǎn)生了多克隆抗-ER-α36抗體，其針對根據(jù)ER-α36獨(dú)有的ER-α36 C-末端區(qū)域的最后15個(gè)氨基酸的合成肽抗原(AlphaDiagnostic Inc.)。使用用于產(chǎn)生抗體的合成肽的親和柱，純化抗體。還已經(jīng)在不能表達(dá)內(nèi)源ER-α36的ER-α36表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中，測試了抗體的特異性。免疫熒光測定表明，僅僅在具有ER-α36-表達(dá)載體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染子中，檢測到抗-ER-α36抗體的免疫反應(yīng)信號，但是在能表達(dá)缺少C-末端的突變體ER-α36的轉(zhuǎn)染子中沒有檢測到，表明ER-α36抗體是高度特異性的。
DNA轉(zhuǎn)染和螢光素酶測定。對于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染測定，使亞接種(subseed)在6孔皿中的HEK293細(xì)胞，在無酚紅、含2.5％無類固醇胎牛血清的培養(yǎng)基中生長至60-70％匯合。洗滌細(xì)胞，并用共5μg質(zhì)粒(2μg報(bào)告質(zhì)粒2X ERE-tk-Luc，以及1.5μg表達(dá)載體pSG5，單獨(dú)的1.5μg pSG hERα66或1.5μg pSG hERβ，或連同1.5μg ER-α36表達(dá)載體)和FuGene6試劑(Roche MolecularBiochemicals)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。使用含有2個(gè)置于胸苷激酶啟動(dòng)子上游的ERE(雞卵黃原蛋白A2基因的-331至-289序列)的報(bào)告質(zhì)粒(2XERE-tk-Luc，從Katarine Pettersson博士，Karolinska Institute，瑞典得到)。也從Katarine Pettersson博士得到含有ER-α66和β的表達(dá)載體。從Zafar Nawaz博士(Creighton University Medical Center，Omaha，Nebraska)得到ER-α46的表達(dá)載體。在測定螢光素酶活性之前，用或不用E2(10nM)處理細(xì)胞12小時(shí)。使用來自Promega的螢光素酶測定試劑盒，進(jìn)行螢光素酶測定。值對應(yīng)著超過3個(gè)分開的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
RNA提取和RNA印跡分析。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用Trizol(Invitrogen)分離了總細(xì)胞RNA。通過電泳，在1.2％甲酰胺/甲醛凝膠上分離10μg總RNA，并印跡在尼龍膜(Hybond-N，AmershamPharmacia Biotech)上。使印跡預(yù)雜交1小時(shí)，并在65℃，在Quick-Hybridization溶液(Amersham Pharmacia Biotech)中雜交2小時(shí)。探針包含來自ER-α36獨(dú)有的ER-α36 3′非翻譯區(qū)的410bp cDNA片段，和來自BD Clonetech的β-肌動(dòng)蛋白DNA探針。用32P dCTP和Rediprime II DNA標(biāo)記試劑盒(Amersham Biotech)標(biāo)記DNA探針。使用在-70℃過夜的增感屏，使印跡放射自顯影。剝離相同的膜，并用標(biāo)記的β-肌動(dòng)蛋白DNA探針重新探測，以證實(shí)等量裝載。
乳腺癌標(biāo)本和免疫組織化學(xué)測定。從中國杭州劭逸夫醫(yī)院病理科得到石蠟-包埋的人乳腺癌標(biāo)本。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用UltraSensitiveTMS-P試劑盒(Maixin-Bio，中國)，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，其中分別使用ER-α66特異性的抗體(LabVisionCorporation，美國)和ER-α36特異性的抗體作為第一抗體。
結(jié)果為了進(jìn)一步證實(shí)ER-α36是ER-α66的天然產(chǎn)生的同種型，對來自正常乳房上皮細(xì)胞系MCF10A，和ER-陽性的和-陰性的(即，ER-α66-陽性的和-陰性的)乳腺癌細(xì)胞的總RNA進(jìn)行RNA印跡分析。使用RT-PCR方法，用根據(jù)ER-α36獨(dú)有的ER-α36 3′非翻譯區(qū)設(shè)計(jì)的引物對(5′GCAAAGAAGAGAATCCTGAACTTGCATCCT(SEQ ID NO26)和5′TTAGTCAGGTATTTAATAACTAGGAATTG(SEQ ID NO27))，合成DNA探針。RNA印跡分析表明，在ER-陽性的(即，ER-α66-陽性的)乳腺癌細(xì)胞MCF7中，鑒別出了估計(jì)大小為5.6kb的單個(gè)的mRNA，但是在MCF10A細(xì)胞中沒有(圖13)。令人驚奇地，ER-α36也在MDA-MB-231細(xì)胞中表達(dá)，后者是眾所周知的ER-陰性的(即，ER-α66-陰性的)乳腺癌細(xì)胞系(圖13)。該數(shù)據(jù)表明，在乳腺癌細(xì)胞中，且甚至在缺少ER-α66的乳腺癌細(xì)胞中，能表達(dá)ER-α36mRNA的預(yù)測大小的轉(zhuǎn)錄物。
ER-α36能抑制結(jié)合配體的-和未結(jié)合配體的-ER-α66和-β的反式激活活性。我們首先測試，缺少AF-1和AF-2結(jié)構(gòu)域的ER-α36是否能保留任何轉(zhuǎn)錄活性。使用能表達(dá)螢光素酶的報(bào)告構(gòu)建體，其含有2個(gè)位于胸苷激酶啟動(dòng)子上游的雌激素反應(yīng)元件(ERE)(2X ERE-tk-Luc)，在HEK293細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染測定。選擇HEK293細(xì)胞系，是因?yàn)橐郧皥?bào)道，ER-α66的AF-1和-2能在HEK293細(xì)胞中同樣較好地起作用(Denger等，Mol.Endocrinol.，15，2064-2077(2001))。如圖14所示，我們發(fā)現(xiàn)，在有和沒有E2β存在下，ER-α36沒有表現(xiàn)出內(nèi)在的轉(zhuǎn)錄活性，這與ER-α36缺少轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域的發(fā)現(xiàn)相一致。然后，我們估計(jì)了ER-α36在由ER-α66的AF-1和-2結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反式激活活性中的調(diào)節(jié)功能。在有和沒有E2β存在下，ER-α36的共表達(dá)，強(qiáng)烈抑制了ER-α66的反式激活活性(圖14)，表明ER-α36能抑制由ER-α66的AF-1和-2結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的反式激活活性。而且，ER-α36也能抑制ER-β的依賴于配體的和不依賴于配體的反式激活活性(圖14)。
ER-α36能介導(dǎo)膜-啟動(dòng)的雌激素信號傳導(dǎo)途徑。以前的報(bào)道已經(jīng)表明，E2β能刺激MAPK/ERK途徑的迅速活化(Razandi等，Mol.Endocrinol.，13，307-319(1999)，Watters等，Endocrinol.，138，4030-4033(1997)，和Migliaccio等，EMBO J.，15，1292-1300(1996))。為了確定ER-α36是否參與該信號傳導(dǎo)途徑，我們在不能表達(dá)內(nèi)源ER-α的HEK293細(xì)胞中，確立了能表達(dá)外源ER-α36的穩(wěn)定細(xì)胞。用不可透過膜的異硫氰酸熒光素(FITC)-綴合的E2β-BSA(E2β-BSA-FITC)，溫育全部ER-α36轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞。用E2β-BSA-FTIC，牢固地標(biāo)記ER-α36轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的細(xì)胞表面，且不用E2β-BSA-FITC標(biāo)記用空載體轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞。從用或不用E2β(10nM)處理各種時(shí)間長度的休眠細(xì)胞，制備細(xì)胞裂解物。通過使用依賴于和不依賴于磷酸化狀態(tài)的抗體的免疫印跡，測量ERK活化。在5分鐘內(nèi)，在用ER-α36表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，觀察到持續(xù)約45分鐘的ERK1/2的磷酸化的10-倍增加，但是在用空載體轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞中沒有(圖15a和15b)。但是，在這些對照細(xì)胞中，血清(20％，10分鐘)能激活ERK1/2(圖15b)，表明MAPK信號傳導(dǎo)途徑在這些細(xì)胞中沒有總體缺陷。而且，在ER-α36轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，對E2β響應(yīng)也能激活Mek1，即能磷酸化和激活ERK1/2的激酶(圖15a)。為了進(jìn)一步證實(shí)膜-啟動(dòng)的雌激素信號傳導(dǎo)能激活ERK1/2，還用E2β-BSA(不可透過膜的形式的E2β)處理了ER-α36轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在E2β-BSA處理的細(xì)胞中，也觀察到了ERK1/2磷酸化的強(qiáng)烈活化(圖15a)。
ER-α36能介導(dǎo)由不同雌激素和抗雌激素藥刺激的MAPK信號傳導(dǎo)途徑的活化。我們還用雌酮(E1)、17β-雌二醇(E2β)、17α-雌二醇(E2α)、雌三醇(E3)或雌四醇(E4)，處理ER-α36轉(zhuǎn)染的細(xì)胞10分鐘，并發(fā)現(xiàn)除了E1以外的所有這些雌激素都能以非常類似的水平激活ERK1/2磷酸化，表明ER-α36可以以類似的水平識別這些雌激素(圖15c)。然后，我們在實(shí)驗(yàn)中包含了抗雌激素藥，包括他莫昔芬、4OH-他莫昔芬、ICI-182,780，以測試ER-α36介導(dǎo)的雌激素信號傳導(dǎo)是否對抗雌激素藥敏感。他莫昔芬、4OH-他莫昔芬和純抗-雌激素藥ICI-182,780不能阻斷由ER-α36介導(dǎo)的ERK1/2活化。相反地，與單獨(dú)的E2β介導(dǎo)的作用相比，該作用甚至更強(qiáng)烈(圖15c)。當(dāng)用單獨(dú)的1μM他莫昔芬(可以鈍化ER-α66和β的濃度)處理ER-α36轉(zhuǎn)染的細(xì)胞時(shí)，觀察到了持續(xù)超過8小時(shí)的強(qiáng)烈的且持久的ERK1/2活化(圖15d)。但是，相同濃度的他莫昔芬在用空表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的對照293細(xì)胞中沒有作用。
ER-α36能介導(dǎo)E2-刺激的細(xì)胞增殖。為了進(jìn)一步確定ER-α36介導(dǎo)的雌激素活化的MAPK途徑是否可以導(dǎo)致細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄信號傳導(dǎo)，我們檢查了膜-啟動(dòng)的雌激素信號傳導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄因子Elk(MAPK/ERK信號傳導(dǎo)途徑的下游效應(yīng)物)的能力。我們使用ERK-反應(yīng)性的GAL-Elk嵌合轉(zhuǎn)錄因子，其由融合到人Elk1的ERK-反應(yīng)性的反式激活結(jié)構(gòu)域上的酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染了能表達(dá)ER-α36的293細(xì)胞，并在有E2β存在下，測量它對GAL4-結(jié)合報(bào)告基因的表達(dá)的體內(nèi)活性。報(bào)告基因是5XGal4-LUC，即含有5個(gè)Gal4 DNA結(jié)合位點(diǎn)的螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒。使用細(xì)菌β-半乳糖苷酶表達(dá)載體來控制轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞培養(yǎng)物維持在無雌激素的培養(yǎng)基中36小時(shí)，然后加E2β(10nM)12小時(shí)。具有標(biāo)準(zhǔn)差的螢光素酶活性代表著超過3個(gè)一式兩份地進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。ER-α36轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的雌激素治療，會(huì)誘導(dǎo)Elk/Gal4融合蛋白-介導(dǎo)的報(bào)告基因的反式激活的約2倍增加，而E2β對用空載體轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞中的Elk/Gal4融合蛋白的轉(zhuǎn)錄活性沒有作用(圖16a)。
我們接著研究了ER-α36是否可以介導(dǎo)雌激素-刺激的細(xì)胞增殖。通過MTT測定，評價(jià)了在有和沒有E2β存在下，ER-α36轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和對照細(xì)胞的增殖。E2β處理能刺激ER-α36轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的增殖，而E2β對用空表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞的生長沒有作用(圖16b)。包含抗雌激素藥，包括他莫昔芬和4OH-他莫昔芬，不能阻斷E2β-刺激的細(xì)胞生長(圖16b)。單獨(dú)的他莫昔芬或4OH-他莫昔芬，能強(qiáng)烈刺激ER-α36轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的生長。但是，MAPK途徑的特異性的抑制劑UO126，能強(qiáng)烈抑制E2β刺激的細(xì)胞的生長。這些數(shù)據(jù)表明，ER-α36-介導(dǎo)的膜雌激素信號傳導(dǎo)能通過MAPK/ERK信號傳導(dǎo)途徑的活化，刺激細(xì)胞生長。數(shù)據(jù)也表明，抗雌激素藥也能通過ER-α36刺激細(xì)胞生長。
ER-α36主要是基于膜的雌激素受體。為了進(jìn)一步表征ER-α36，我們已經(jīng)成功地開發(fā)了多克隆抗-ER-α36抗體，它針對ER-α36獨(dú)有的ER-α36 C-末端區(qū)域的15個(gè)氨基酸。使用用于產(chǎn)生抗體的合成肽的親和柱，純化抗體。使用該抗體蛋白印跡分析從正常的乳房上皮細(xì)胞和確定的乳腺癌細(xì)胞系制備的蛋白，證實(shí)在一些乳腺癌細(xì)胞中有37-kDa分子量的單個(gè)蛋白條帶，但是在正常的乳房上皮細(xì)胞中沒有(圖17a)。ER-α36在MDA-MB-231、MDA-MB436和HB3396細(xì)胞，3個(gè)眾所周知的ER-α66陰性的乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)，且也在ER-α66陽性的乳腺癌細(xì)胞MCF7中表達(dá)，但是在T47D中不表達(dá)(圖17a)，這與我們的ER-α36在ER-α66陰性的乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)的RNA印跡數(shù)據(jù)相一致。為了進(jìn)一步評價(jià)ER-α36在ER-α66陰性的乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)的可能性，使用抗-ER-α36特異性的抗體在透化的MDA-MB-231細(xì)胞中的間接免疫熒光測定和共聚焦顯微鏡術(shù)，表明ER-α36在ER-α66陰性的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)和核上表達(dá)。
為了進(jìn)一步估計(jì)細(xì)胞中的ER-α36區(qū)室化，進(jìn)行亞細(xì)胞分級分離測定，以從ER-α36轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞分離核、質(zhì)膜和胞質(zhì)溶膠。通過免疫檢測，從不同的級分鑒別ER-α36。高百分比的ER-α36(約50％)位于質(zhì)膜上，且低百分比位于胞質(zhì)溶膠(約40％)和核(約10％)中。為了排除不同級分的交叉污染，用不同的標(biāo)記蛋白，包括mSin3A(核)、GDP解離抑制劑(胞質(zhì)溶膠)、5′核苷酸酶(質(zhì)膜)和β-COP(高爾基體)，通過蛋白印跡分析，檢查級分純度。這些結(jié)果證實(shí)，在不同的級分中沒有污染。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ER-α36主要是基于膜的雌激素受體(圖17b)。
ER-α36在ER-α66陰性的乳腺癌標(biāo)本中表達(dá)。為了進(jìn)一步確定ER-α36與人乳腺癌的關(guān)聯(lián)，我們使用特異性的抗-ER-α36抗體，通過免疫組織化學(xué)測定，檢查了人乳腺癌標(biāo)本中的ER-α36表達(dá)模式。人乳房組織的原位分析表明乳腺癌中ER-α36的上調(diào)。對ER蛋白陽性的細(xì)胞被染成褐色，且核被蘇木精染成藍(lán)色。在35個(gè)檢查的乳腺癌標(biāo)本病例中，其中的21個(gè)(60％)是對ER-α36染色陽性的，且其中的21個(gè)(60％)是對ER-α66陽性的(表2)。與我們的RNA和蛋白印跡分析相一致，對ER-α66染色陰性的14個(gè)中的11個(gè)(78％)乳腺癌標(biāo)本是對ER-α36染色陽性的，表明大部分ER-陰性的(即，ER-α66-陰性的)乳腺癌仍能表達(dá)ER-α36。在人導(dǎo)管癌中發(fā)現(xiàn)的正常組織切片中的ER-α36的原位染色，表明ER-α36僅僅在內(nèi)腔上皮細(xì)胞中表達(dá)，且主要定位于細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜。腫瘤切片來自人浸潤性導(dǎo)管癌和侵入性導(dǎo)管癌。所有21個(gè)ER-α36陽性的標(biāo)本病例都表現(xiàn)出主要在細(xì)胞核以外的ER-α36免疫染色模式，這與ER-α66的主要核染色相反。類似于ER-α66，在臨近的正常組織中的一些內(nèi)腔上皮細(xì)胞也是對ER-α36染色陽性的。這些結(jié)果證實(shí)，類似于ER-α66，ER-α36在2/3檢查的人乳腺癌中表達(dá)，并表明，ER-α36可能參與ER-α66-陰性的乳腺癌的發(fā)展。
表2.ER-α36和66表達(dá)人乳腺癌中的免疫染色研究
在該研究中，已經(jīng)鑒別、克隆和表征了ER-α的新變體ER-α36。該ER-α同種型是從ER-α66基因的第一個(gè)內(nèi)含子中的以前未鑒別的啟動(dòng)子開始的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。推定的ER-α36的啟動(dòng)子區(qū)含有位于ER-α36 cDNA起始位點(diǎn)上游的TATA結(jié)合蛋白(TBP)識別序列，和幾個(gè)Sp1、NF-kB和Ap1結(jié)合位點(diǎn)(圖12)。我們已經(jīng)克隆了ER-α36的5′側(cè)翼區(qū)，并證實(shí)它具有強(qiáng)啟動(dòng)子活性。而且，在ER-α36的5′側(cè)翼區(qū)，鑒別出了完美的半個(gè)ERE位點(diǎn)，表明ER-α36進(jìn)行了ER-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。
ER-α36蛋白與由ER-α66基因的外顯子2-6編碼的ER-α66蛋白相同。該同種型沒有以前鑒別出的具有反式激活活性的結(jié)構(gòu)域，AF-1和-2。實(shí)際上，ER-α36反式激活活性的分析，證實(shí)ER-α36缺少內(nèi)在的轉(zhuǎn)錄活性。但是，ER-α36能有效地抑制由結(jié)合配體的-和未結(jié)合配體的-ER-α66和-β的AF-1和-2結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的反式激活活性，表明ER-α36是基因組雌激素信號傳導(dǎo)的有效抑制劑。該發(fā)現(xiàn)類似于以前的報(bào)道，即缺少AF-1結(jié)構(gòu)域的ER-α46能起抑制ER-α66的AF-1活性的有力競爭劑的功能。
能觸發(fā)迅速的雌激素信號傳導(dǎo)的基于質(zhì)膜的ER的存在，是長期有爭議的，這是因?yàn)樯形创_立該受體的分子同一性。以前，Razandi使用轉(zhuǎn)染測定，報(bào)道了ER-α66和-β都可以啟動(dòng)膜雌激素信號傳導(dǎo)，盡管其中僅僅非常小的百分比在細(xì)胞表面上表達(dá)(Razandi等，Mol.Endocrinol.，13，307-319(1999))，表明除了它們在基因組雌激素信號傳導(dǎo)中的傳統(tǒng)作用以外，這些ER可能參與膜-啟動(dòng)的雌激素信號傳導(dǎo)。最近，ER-α的46-kDα同種型定位在細(xì)胞表面，且發(fā)現(xiàn)它能介導(dǎo)雌激素-刺激的eNOS磷酸化(Li等，Pro.Natl.Acad.Sci.USA，100，4807-4812(2003))。在這里，我們證實(shí)了，另一種ER-α變體ER-α36主要定位在質(zhì)膜上，并介導(dǎo)由膜-啟動(dòng)的雌激素信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)的MAPK/ERK途徑的激活。而且，由于ER-α36完全缺少內(nèi)在的反式激活活性，且僅僅起基因組雌激素信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)劑的作用，所以ER-α36可能主要起基于膜的雌激素受體的作用，以介導(dǎo)膜-啟動(dòng)的雌激素信號傳導(dǎo)。以前，已經(jīng)報(bào)道，一些E2β-介導(dǎo)的迅速作用發(fā)生在ER-α基因敲除的(aERKO)小鼠的神經(jīng)元中，且這些作用不能被ICI 182,780阻斷(Gu等，Endocrinology，140，660-666(1999))，表明存在超過一種膜-啟動(dòng)的雌激素信號傳導(dǎo)途徑。我們在這里證實(shí)，抗雌激素藥不能阻斷ER-α36-介導(dǎo)的MAPK/ERK激活，表明ER-α36參與以前描述的抗-雌激素藥不敏感的信號傳導(dǎo)途徑。由于通過小鼠ER-α基因的第一個(gè)編碼外顯子(在產(chǎn)生ER-α36的轉(zhuǎn)錄物時(shí)跳過的外顯子)的插入破壞生成了αERKO小鼠，所以ER-α36的小鼠對應(yīng)物的生產(chǎn)，可能在這些敲除的小鼠中保持正常。因而，ER-α36可能有助于在這些小鼠中觀察到的剩余的雌激素作用。近來，Toran-Allerand等(J.Neuroscience 22，8391-8401(2002))報(bào)道了估計(jì)分子量為63-65kDa的新的質(zhì)膜-有關(guān)的雌激素受體(ER-X)的存在。ER-X表現(xiàn)出與ER-α36的一些相似性，例如與ER-α66的配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體反應(yīng)，和對E2α和β同樣好地響應(yīng)。但是，這2種受體的分子同一性期待著ER-X的克隆和測序。
我們還已經(jīng)表明，ER-α36能促進(jìn)MAPK/ERK途徑的膜-啟動(dòng)的激活，該激活會(huì)導(dǎo)致雌激素-刺激的細(xì)胞增殖。因而，缺少內(nèi)在的轉(zhuǎn)錄活性的ER-α36，足以促進(jìn)雌激素-刺激的細(xì)胞生長，這支持了以前的報(bào)道，即ER-α66的轉(zhuǎn)錄上無活性的突變體會(huì)誘導(dǎo)DNA合成。這些數(shù)據(jù)一起表明，可能不需要ER的轉(zhuǎn)錄活性，來促進(jìn)雌激素-刺激的細(xì)胞生長。令人驚奇地，我們也觀察到，在實(shí)驗(yàn)階段(48小時(shí))，抗雌激素藥例如他莫昔芬，能強(qiáng)烈激活MAPK/ERK信號傳導(dǎo)，并刺激細(xì)胞生長。該發(fā)現(xiàn)與下述觀點(diǎn)很好地符合，即他莫昔芬起雌激素信號傳導(dǎo)的激動(dòng)劑和拮抗劑的作用，并暗示ER-α36也可能參與膜-啟動(dòng)的抗-雌激素藥信號傳導(dǎo)。
眾所周知，具有ER-α66陽性表型的乳腺癌細(xì)胞(ER-陽性的乳腺癌)是更分化的，且具有比ER-α-陰性的腫瘤更低的轉(zhuǎn)移潛力(McGuire，W.L.Prognostic factors in primary breast cancer.CancerSurv.5，527-536(1986))。有趣地，ER-α36不僅僅在ER-α66-陽性的乳腺癌亞型中表達(dá)，而且在大多數(shù)檢查的ER-α66陰性的乳腺癌中表達(dá)。為確認(rèn)這些結(jié)果，已經(jīng)報(bào)道雌激素信號傳導(dǎo)能在MDA-MB-231細(xì)胞中誘導(dǎo)PI3K/Akt途徑的迅速激活，其不能被雌激素拮抗劑阻斷(Tsai等，Cancer Res..61，8390-8392(2001))，這可以解釋為通過不依賴于ER的途徑的雌激素信號傳導(dǎo)。還已經(jīng)表明，高濃度的他莫昔芬能誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞凋亡(Mandleker等，Apoptosis6，469-477(2001))。這些數(shù)據(jù)有力地表明，ER-α66-陰性的乳腺癌仍然可能保持由膜-啟動(dòng)的信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的雌激素或抗-雌激素藥作用。
通過用獨(dú)特的27氨基酸結(jié)構(gòu)域替代ER-α66的12個(gè)螺旋中的最后5個(gè)螺旋(螺旋8-12)，其可以改變ER-α36的配體-結(jié)合特異性和親和力，ER-α36也具有獨(dú)特的配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。實(shí)際上，我們發(fā)現(xiàn)ER-α36能引起膜-啟動(dòng)的信號傳導(dǎo)，這與對E2α和β，E3和E4的響應(yīng)一樣好。因而，ER-α36似乎具有比ER-α66更廣的配體-結(jié)合譜，這使得ER-α36成為促有絲分裂的信號傳導(dǎo)的潛在地更有效的介質(zhì)。ER-α36的配體-結(jié)合特異性和親和力的進(jìn)一步分析，有助于設(shè)計(jì)對ER-α36特異性的抗雌激素藥，所述藥可以用于治療ER-α陰性的(即，ER-α66-陰性的)乳腺癌。
實(shí)施例4E2β能促進(jìn)ER-α66陰性的MDA-MB-231細(xì)胞在軟瓊脂中的生長為了確定在有和沒有組合的或分開的E2β和他莫昔芬存在下，在軟瓊脂中的無貼壁依賴性的生長，將500MDA-MB-231細(xì)胞懸浮在3ml 3.5％(wt/vol)瓊脂中，后者含有無酚紅的添加了10％無E2的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。然后，將細(xì)胞覆蓋到5個(gè)復(fù)制的60mm皿中的0.7％(wt/vol)瓊脂上，后者含有無酚紅的添加了10％無E2的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。給軟瓊脂上的細(xì)胞覆蓋添加了10％無E2的胎牛血清的培養(yǎng)基，其含有或沒有1nM E2β，或與1nM他莫昔芬相組合。3周后，使用倒置顯微鏡，給菌落打分。如圖18所示，我們發(fā)現(xiàn)，E2處理能強(qiáng)烈促進(jìn)ER-α66陰性的MDA-MB-231細(xì)胞在軟瓊脂中的無貼壁依賴性的生長，而抗-雌激素藥他莫昔芬會(huì)抑制E2β的作用，表明ER-α66陰性的MDA-MB-231細(xì)胞能保持對雌激素信號傳導(dǎo)的響應(yīng)性，推測是通過ER-α36。
實(shí)施例5E2β能誘導(dǎo)ER-α66陰性的MDA-MB-231細(xì)胞中的膜-啟動(dòng)的雌激素信號傳導(dǎo)為了確定E2β是否能誘導(dǎo)ER-α66陰性的MDA-MB-231中的膜-啟動(dòng)的雌激素信號傳導(dǎo)，用1nM E2β處理血清饑餓的MDA-MB-231細(xì)胞不同的時(shí)間段。對于蛋白印跡分析，用RIPA緩沖液破壞細(xì)胞，在凝膠裝載緩沖液中煮沸，并在10％ SDS-PAGE凝膠上分離。電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore)。用針對ERK1/2(K-23)的抗體(Santa Cruz Biotechnology)，或針對磷酸化形式的ERK1/2使用的抗體(Cell Signaling Technology)，探測濾器。如圖19所示，用雌二醇-17β(E2β)處理MDA-MB-231細(xì)胞，會(huì)誘導(dǎo)ERK1/2的快速磷酸化。這些數(shù)據(jù)有力地提示，E2β能刺激ER-α66陰性的MDA-MB-231細(xì)胞中的MAPK途徑的激活。
所有出版物、專利和專利申請，都在本文中引作參考。盡管已經(jīng)參照其中的某些優(yōu)選的實(shí)施方案，描述了本發(fā)明的前面的說明書，且已經(jīng)闡述了許多細(xì)節(jié)用于解釋目的，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠明白，其它實(shí)施方案也能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，且可以明顯改變本文所述的某些細(xì)節(jié)，而不脫離本發(fā)明的基本原理。
權(quán)利要求
1.分離的抗體，其能特異性地結(jié)合SEQ ID NO1所述的氨基酸序列，或其免疫原性片段。
2.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
3.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是多克隆抗體。
4.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是人源化的抗體。
5.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體共價(jià)附著到化合物。
6.權(quán)利要求5的抗體，其中所述化合物是化療劑。
7.權(quán)利要求5的抗體，其中所述化合物是檢測標(biāo)記。
8.權(quán)利要求7的抗體，其中所述檢測標(biāo)記是熒光標(biāo)記。
9.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體能特異性地結(jié)合SEQ ID NO1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列。
10.組合物，其包含權(quán)利要求1的抗體。
11.權(quán)利要求10的組合物，還包含藥學(xué)上可接受的載體。
12.制備抗體的方法，其包含給動(dòng)物施用包含SEQ ID NO1所述的氨基酸序列，或其免疫原性片段的多肽，和從該動(dòng)物分離抗體，其中所述分離的抗體能特異性地結(jié)合該氨基酸序列。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述多肽或其免疫原性亞基共價(jià)附著到載體多肽上。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述分離包含從動(dòng)物得到能產(chǎn)生該抗體的細(xì)胞，該方法還包含使用該細(xì)胞制備能產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。
15.通過權(quán)利要求12的方法生產(chǎn)的多克隆抗體。
16.通過權(quán)利要求14的方法生產(chǎn)的單克隆抗體。
17.包含外源編碼區(qū)的細(xì)胞，其中所述編碼區(qū)能編碼包含SEQ IDNO20的第一個(gè)多肽，或包含與SEQ ID NO20具有至少90％同一性的氨基酸序列的第二個(gè)多肽，其中所述第二個(gè)多肽具有ER-α36活性。
18.權(quán)利要求17的細(xì)胞，其中所述編碼區(qū)可操作地連接到組成型啟動(dòng)子上。
19.權(quán)利要求17的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
20.權(quán)利要求17的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。
21.能表達(dá)外源多肽的細(xì)胞，其中所述多肽包含SEQ ID NO20，或包含與SEQ ID NO20具有至少90％同一性且具有ER-α36活性的氨基酸序列。
22.權(quán)利要求21的細(xì)胞，其中所述編碼區(qū)可操作地連接到組成型啟動(dòng)子上。
23.權(quán)利要求21的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
24.權(quán)利要求21的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。
25.鑒別能結(jié)合多肽的試劑的方法，該方法包含組合包含SEQ ID NO1所述的氨基酸序列的多肽和試劑，和檢測試劑和多肽之間的復(fù)合物形成。
26.權(quán)利要求25的方法，其中通過選自下述的方法，檢測所述試劑與多肽的結(jié)合直接檢測試劑與多肽的結(jié)合，和使用競爭結(jié)合測定檢測試劑與多肽的結(jié)合。
27.權(quán)利要求25的方法，還包含，確定試劑是否能結(jié)合包含SEQID NO18的多肽。
28.權(quán)利要求25的方法，還包含，確定試劑是否能抑制多肽的ER-α36活性。
29.檢測多肽的方法，其包括提供細(xì)胞，分析細(xì)胞中具有ER-α36活性和36kDa分子量的多肽，所述分子量如按照十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠上的電泳測得的，和確定細(xì)胞是否表達(dá)該多肽。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述細(xì)胞是離體的。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述腫瘤是乳腺腫瘤。
33.權(quán)利要求29的方法，其中所述細(xì)胞是體內(nèi)的。
34.權(quán)利要求30的方法，其中所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
35.權(quán)利要求31的方法，其中所述腫瘤是乳腺腫瘤。
36.權(quán)利要求29的方法，其中所述分析包含，使細(xì)胞接觸能特異性地結(jié)合SEQ ID NO1所述的氨基酸序列，或其免疫原性片段的抗體。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述抗體共價(jià)附著到檢測標(biāo)記上。
38.權(quán)利要求37的抗體，其中所述檢測標(biāo)記是熒光標(biāo)記。
39.權(quán)利要求29的方法，其中所述分析包含，擴(kuò)增mRNA多核苷酸，以形成擴(kuò)增的多核苷酸，其中所述擴(kuò)增包含，使從細(xì)胞得到的多核苷酸接觸引物對，后者能擴(kuò)增mRNA多核苷酸，其包括SEQ IDNO22或SEQ ID NO25，或其組合，其中擴(kuò)增的多核苷酸的存在表明該細(xì)胞表達(dá)多肽。
40.權(quán)利要求39的方法，其中引物對的一個(gè)引物選自SEQ IDNO22的核苷酸，與SEQ ID NO25的核苷酸互補(bǔ)的核苷酸，或其組合，且其中每個(gè)引物具有至少15個(gè)核苷酸。
41.抑制細(xì)胞的ER-α36活性的方法，其包含，使能表達(dá)包含SEQID NO1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列的多肽的細(xì)胞，接觸能抑制ER-α36活性的化合物。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述化合物包含能特異性地結(jié)合包含SEQ ID NO1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列的多肽的抗體。
43.權(quán)利要求41的方法，其中所述細(xì)胞是體內(nèi)的。
44.權(quán)利要求41的方法，其中所述細(xì)胞是ER-α66陰性的。
45.權(quán)利要求41的方法，其中所述細(xì)胞是ER-α46陰性的。
46.權(quán)利要求41的方法，其中所述化合物不是抗-雌激素藥。
47.分離的多肽，其包含SEQ ID NO1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列。
48.權(quán)利要求47的分離的多肽，還包含SEQ ID NO1的氨基酸1-12。
49.權(quán)利要求48分離的多肽，還包含SEQ ID NO20所述的氨基酸序列。
50.分離的多核苷酸，其與SEQ ID NO20具有至少70％同一性，其中所述多肽具有ER-α36活性。
51.SEQ ID NO1的免疫原性片段。
52.試劑盒，其包含能特異性地結(jié)合SEQ ID NO1所述的氨基酸序列的分離的抗體和包裝材料。
全文摘要
本發(fā)明提供了分離的多肽，其氨基酸序列與SEQID NO20具有至少70％同一性，其中該多肽具有ER－α36活性。本發(fā)明還提供了鑒別能能結(jié)合這樣的多肽的試劑的方法，檢測這樣的多肽的方法，和改變這樣的多肽的活性的方法。還提供了能特異性地結(jié)合SEQ ID NO1所述的氨基酸序列，或其免疫原性片段的抗體，和制備和使用這樣的抗體的方法。
文檔編號C07K16/00GK1930188SQ200580007467
公開日2007年3月14日 申請日期2005年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月10日
發(fā)明者王兆一 申請人:克賴頓大學(xué)