專(zhuān)利名稱(chēng)：雌激素受體和使用方法
雌激素受體和使用方法本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00580007467. 8 (PCT/US2005/007857)，申請(qǐng)日為 2005 年 3 月 10日的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)“雌激素受體和使用方法”的分案申請(qǐng)。繼續(xù)申請(qǐng)數(shù)據(jù)本申請(qǐng)要求享有2004年3月10日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/552，067和2005 年1月13日提交的60/643，469的利益，其每篇都在這里引作參考。政府資助本文所述的發(fā)明是在健康和人類(lèi)服務(wù)部(D^artment of Health and Human Services)資助號(hào)CA84328的支持下完成的。美國(guó)政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
雌激素是在卵巢、睪丸和可能的腎上腺皮質(zhì)中形成的類(lèi)固醇化合物的總稱(chēng)。雌激素和具有雌激素活性的化合物的實(shí)例包括二乙基己烯雌酚、己烯雌酚二磷酸酯、己雌酚、聚磷酸雌二醇、溴苯雌酚、氯烯雌醚、己二烯雌酚、二乙基己烯雌酚、丙甲雌酚、雙醋羥雌酮、6， 9-去氫馬烯雌酮、馬烯雌酮、雌二醇、雌三醇、雌酮、乙炔雌二醇、美雌醇、mexestrol、雌三醇環(huán)戊醚和炔雌醚。雌激素調(diào)節(jié)生殖組織和乳房、心血管、骨、肝和腦組織中的多種生理過(guò)程。 雌激素也用在口服避孕藥中。雌激素的其它用途包括，緩解絕經(jīng)的不適，抑制泌乳，和治療骨質(zhì)疏松癥、先兆流產(chǎn)和各種功能性卵巢病癥?？勾萍に厮幈挥糜谥委熮D(zhuǎn)移性乳腺癌和晚期前列腺癌。雌激素的作用由雌激素受體介導(dǎo)。在1986年克隆了首個(gè)雌激素受體(ER) (Green 等，Nature, 320 :134(1986)和 Greene 等，Science, 231 1150 (1986))。在 1995 年之前， 認(rèn)為僅有一個(gè)負(fù)責(zé)天然的和合成的雌激素和抗雌激素藥的所有生理和藥理作用的雌激素受體。然而，在1995年，克隆了第二個(gè)雌激素受體(Kuiper等，PNAS，93 :5925 (1996))。發(fā)現(xiàn)的首個(gè)雌激素受體現(xiàn)在稱(chēng)作雌激素受體-α (ER- α )，而第二個(gè)雌激素受體稱(chēng)作雌激素受體-β (ER- β )。ER-α 和 ER-β 共有共同的結(jié)構(gòu)體系(Zhang 等，F(xiàn)EBS Letters, 546 :17(2003)和 Kong等，Biochem. Soc. Trans. ,31 :56(2003))。二者都由3個(gè)獨(dú)立的但是能相互作用的功能結(jié)構(gòu)域組成N-末端A/B結(jié)構(gòu)域、C或DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和D/E/F或配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (

圖1)。ER- α的N-末端結(jié)構(gòu)域編碼獨(dú)立于配體的激活功能(AF-I)，即參加與輔激活物的相互作用和靶基因的轉(zhuǎn)錄活化的區(qū)域。DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或C結(jié)構(gòu)域含有2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，其在受體二聚化和與特定的DNA序列的結(jié)合中起重要作用。C-末端D/E/F結(jié)構(gòu)域是一種配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其能介導(dǎo)配體結(jié)合、受體二聚化、核轉(zhuǎn)位和配體-依賴(lài)性的反式激活功能 (AF-2)。AF-I和AF-2對(duì)轉(zhuǎn)錄控制的相對(duì)貢獻(xiàn)以細(xì)胞特異性的和DNA 啟動(dòng)子特異性的方式變化(Berry 等，EMBO J.，9 :2811(1990)和 Tzukerman 等，Mol. Endocrin.，8 :21(1994)) 已經(jīng)表明，缺少ER-α基因的全長(zhǎng)基因產(chǎn)物的前173個(gè)氨基酸的46-kDa ER-α同種型(A/B或AF-I結(jié)構(gòu)域)，源自跳過(guò)外顯子1的ER-α基因的可變剪接(Flouriot等，EMBO J.，19 :4688(2000))。該可變剪接事件會(huì)產(chǎn)生mRNA，其在有利于翻譯起始的Kozak序列內(nèi)具有與原始可讀框的剩余部分符合讀框的AUG。因此，ER-a的該新同種型稱(chēng)作ER-a 46，而原始同種型稱(chēng)作 ER-α 66(Flouriot 等，EMB0J.，19 4688 (2000)) ER-α 46 形成同二聚體，并結(jié)合雌激素反應(yīng)元件(ERE)，且它也可以與ER-α 66形成異二聚體(Flouriot等，EMBO J.， 19 :4688(2000))。與ER-α 66同二聚體相比，ER-α 46同二聚體表現(xiàn)出更高的對(duì)ERE的親和力。而且，ER-α 46/66異二聚體比ER-α 66同二聚體優(yōu)先形成，且ER-α 46競(jìng)爭(zhēng)地起作用，以抑制由結(jié)合了配體的-ER-α 66的AF-I結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的反式激活，但是不影響AF-2-依賴(lài)性的反式激活(Floutiot等，EMBO J.，19 :4688 (2000))。因此，認(rèn)為ER-α 46是天然產(chǎn)生的ER-α同種型，其調(diào)節(jié)由ER-a 66的AF-I結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的雌激素信號(hào)傳導(dǎo)。ER-α能在大約15-30%內(nèi)腔(luminal)上皮細(xì)胞中表達(dá)，但是根本不在正常人乳房中的任何其它細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)。雙標(biāo)記免疫熒光技術(shù)揭示，在正常的人和嚙齒動(dòng)物乳腺中，ER-α -表達(dá)細(xì)胞能與用增殖標(biāo)記物標(biāo)記的細(xì)胞分開(kāi)(Clarke等，Cancer Res. ,57 4987(1997))。在導(dǎo)管增生的最早期，ER-α表達(dá)會(huì)增加，甚至隨著異型的增加而增加更多，從而在低和中等核級(jí)的不典型導(dǎo)管增生和原位導(dǎo)管癌中的大部分細(xì)胞含有ER-α (Khan 等，Cancer Res.，54 :993 (1994)和 Lawson 等，Lancet，351 1787 (1994))。隨著 ER-α 表達(dá)的增加，受體表達(dá)和細(xì)胞增殖之間的反相關(guān)變得調(diào)節(jié)異常(Sioker等，Amer. Jour. Path.， 155 :1811 (1999))。大約70 %的侵入性乳腺癌表達(dá)ER- α，且這些腫瘤中的大部分含有 ER-α -陽(yáng)性的增殖細(xì)胞(Clarke 等，Cancer Res. ,57 :4987 (1997))。雌激素受體是能控制許多生理過(guò)程的配體-活化的轉(zhuǎn)錄因子核受體超家族的成員。該控制經(jīng)常通過(guò)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄來(lái)發(fā)生(Katzenellenbogen和Katzenellenbogen， Breast Cancer Res.，2 :335 (2000) ；Hull 等，J. Biol. Chem.，276 :36869 UOOl) ；McDonnell 和Norris，Science, 296 :1642 (2002))。雌激素受體使用多種機(jī)理，以激活或抑制它的靶基因的轉(zhuǎn)錄。這些機(jī)理包括(a)在雌激素反應(yīng)元件處，配體-占據(jù)的受體與DNA的直接相互作用，隨后是轉(zhuǎn)錄輔調(diào)節(jié)物(coregulator)或介質(zhì)復(fù)合物的募集，(b)配體-占據(jù)的ER 與其它轉(zhuǎn)錄因子相互作用，所述其它轉(zhuǎn)錄因子例如AP-I (Kushner等，J. Steroid Biochem. Mol. Biol. ,74 :311 (2000))、Spl (Safe, Vitam. Horm. ,62 :231 (2001))或 NF- κ B (McKay 和Cidlowski，Endocr. Rev.，20 :435(1999)),或(c)通過(guò)隔離一般的/普通的轉(zhuǎn)錄組分， 間接調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄(Harnish 等，Endocrinology, 141 :3403(2000)和 Speir 等，Circ. Res. ,87 :1006(2000))。另外，雌激素受體通過(guò)這些不同的機(jī)理調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的能力，似乎是細(xì)胞類(lèi)型特異性的，可能是由于在每種細(xì)胞類(lèi)型中可得到的轉(zhuǎn)錄輔調(diào)節(jié)因子的補(bǔ)體的差異(Cerillo 等，J. Steroid Biochem. Mol. Biol.，67 :79 (1998) ；Evans 等，Circ. Res.，89 823(2001) ；Maret 等，Endocrinology, 140 :2876 (1999))。同樣，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)依賴(lài)于配體的性質(zhì)，其中各種天然的和合成的選擇性的雌激素受體調(diào)節(jié)劑，通過(guò)這些不同機(jī)理中的每一種，起雌激素受體激動(dòng)劑或拮抗劑的作用(Siang和Brown, Science, 295 =2465(2002)； Katzenellenbogen 禾口 Katzenellenbogen, Science,295 :2380(2002) ；Margeat 等，J. Mol. Biol.，326 77 (2003) ；Dang 等，J. Biol. Chem.，278 :962 (2003))。存在由雌激素介導(dǎo)的另一個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，也稱(chēng)作“非經(jīng)典的”、“非基因組的”或 “膜信號(hào)傳導(dǎo)”途徑，其包含胞質(zhì)蛋白、生長(zhǎng)因子和其它膜-啟動(dòng)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑(Segars 等，Trends Endocrin. Met. , 13 :349 Q002))。已經(jīng)表明，幾種細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑能與快速的雌激素-啟動(dòng)的作用通訊腺苷酸環(huán)化酶途徑(Aronica等，PNAS，91 :8517 (1994))、磷脂酶 C 途徑(Le Mellay 等，J. Cell. Biochem. ,75 :138 (1999))、G-蛋白-偶聯(lián)的受體-活化的途徑(Razandi等，Mol. Endocrin.，13 :307(1999))和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK) 途徑(Watters等，Endocrinology, 138 :4030(1997))。但是，迄今為止描述的所有膜形式， 都與 ER- α 有關(guān)，但與 ER- β 無(wú)關(guān)(Segars 等，Trends Endocrin. Met.，13 :349 (2002))。病理上，雌激素信號(hào)傳導(dǎo)已經(jīng)與乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)(Summer 禾口 Fuqua，Semin. Cancer Biol. , 11 :339(2001) ；Turner 等，Endocr. Rev. , 15 :275(1994)； Farhat 等，F(xiàn)ASEB J.，10 :615 (1996) ；Beato 等，Cell，83 :851(1995) ；Dobrzycka 等，Endo. Rel. Cancer, 10 :517(2003)).結(jié)果，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)雌激素受體是大多數(shù)這樣的癌癥的開(kāi)始和發(fā)展所必需的。雌激素受體-陽(yáng)性的乳腺癌的當(dāng)前內(nèi)分泌療法主要針對(duì)雌激素水平、雌激素受體水平或雌激素和雌激素受體的活性設(shè)計(jì)。在早期乳腺癌的管理中，部分的抗雌激素藥他莫昔芬的使用，已經(jīng)清楚地證實(shí)了無(wú)疾病和總存活的增加。另外，近期的研究證實(shí)，他莫昔芬可以用作激素-依賴(lài)性的乳腺癌的化學(xué)預(yù)防劑。使用他莫昔芬的長(zhǎng)期療法的主要問(wèn)題是它的親子宮作用，這會(huì)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌的高風(fēng)險(xiǎn)，和對(duì)他莫昔芬的獲得性臨床抗性。這已經(jīng)導(dǎo)致了對(duì)更好的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)的迫切尋求，所述調(diào)節(jié)劑在各種雌激素反應(yīng)靶組織中表現(xiàn)出最佳的激動(dòng)或拮抗活性。因此，需要可以用于篩選能調(diào)節(jié)雌激素信號(hào)傳導(dǎo)的其它方法和材料，以及可以用于調(diào)節(jié)雌激素信號(hào)傳導(dǎo)的方法和材料。發(fā)明概述本發(fā)明提供了分離的抗體，其能特異性地結(jié)合SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列， 或其免疫原性片段，優(yōu)選地，SEQ ID NO :1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列。抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。任選地，抗體是人源化的抗體?？贵w可以共價(jià)地附著化合物，例如，化療劑或檢測(cè)標(biāo)記例如熒光標(biāo)記?？贵w可以存在于組合物中，且組合物可以包含藥學(xué)上可接受的載體。還提供了試劑盒，其包含本發(fā)明的抗體。本發(fā)明也提供了制備抗體的方法?？贵w可以是多克隆的或單克隆的。該方法包括， 給動(dòng)物施用具有SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列的多肽，或其免疫原性片段，優(yōu)選地，SEQ ID NO 1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列。該方法還包括從動(dòng)物分離抗體，其中該分離的抗體能特異性地結(jié)合氨基酸序列。多肽或其免疫原性亞基可以共價(jià)地附著載體多肽。分離可以包括，從動(dòng)物得到產(chǎn)生該抗體的細(xì)胞，和使用該細(xì)胞制備能產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。 本發(fā)明還包括通過(guò)該方法生產(chǎn)的多克隆抗體和通過(guò)該方法生產(chǎn)的單克隆抗體。本發(fā)明也涉及包含外源編碼區(qū)的細(xì)胞，其中該編碼區(qū)編碼包含SEQ ID N0:20的多肽。編碼區(qū)可以編碼具有與SEQ ID NO :20具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽，其中該多肽具有ER-α 36活性。編碼區(qū)可以可操作地連接到組成型啟動(dòng)子。細(xì)胞可以是真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。本發(fā)明還提供了表達(dá)這樣的多肽的細(xì)胞。本發(fā)明還提供了鑒別結(jié)合多肽的試劑的方法。該方法包括，組合包含SEQ ID Ν0 1所述的氨基酸序列的多肽和試劑，檢測(cè)試劑和多肽之間的復(fù)合物形成，檢測(cè)多肽活性的改變，或其組合。通過(guò)直接檢測(cè)試劑與多肽的結(jié)合，使用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定檢測(cè)試劑與多肽的結(jié)合，或其組合，可以檢測(cè)試劑與多肽的結(jié)合。任選地，該方法也包括，確定試劑是否結(jié)合包含 SEQ ID NO 18 的多肽。本發(fā)明還提供了檢測(cè)多肽的方法。一方面，該方法包括提供細(xì)胞，分析細(xì)胞中具有 ER- α 36活性和36kDa分子量的多肽，所述分子量如按照在十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠上電泳測(cè)得的，和確定細(xì)胞是否表達(dá)該多肽。細(xì)胞可以是離體的(ex vivo)或體內(nèi)的。細(xì)胞可以是，例如，腫瘤細(xì)胞，例如乳腺腫瘤細(xì)胞。分析可以包括，使細(xì)胞接觸能特異性地結(jié)合SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列，或其免疫原性片段的抗體。分析可以包括，擴(kuò)增 mRNA多核苷酸，以形成擴(kuò)增的多核苷酸。擴(kuò)增包括，使從細(xì)胞得到的多核苷酸接觸引物對(duì)， 后者能擴(kuò)增mRNA多核苷酸，其包括SEQ ID N0:22或SEQ ID NO :25，或其組合，其中擴(kuò)增的多核苷酸的存在表明該細(xì)胞表達(dá)多肽。引物對(duì)的一個(gè)引物可以選自SEQ ID N0:22的核苷酸，與SEQ ID NO 25的核苷酸互補(bǔ)的核苷酸，或其組合。本發(fā)明也提供了抑制細(xì)胞的ER-α 36活性的方法。該方法包括，使表達(dá)具有SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列的多肽的細(xì)胞接觸能抑制ER-a 36活性的化合物。這樣的化合物可以是能特異性地結(jié)合具有SEQ ID NO :1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列的多肽的抗體。細(xì)胞可以是體內(nèi)的或離體的，且任選地可以是ER-α 66陰性的，ER-α 46陰性的，或其組合。在有些方面，化合物不是抗雌激素藥。本發(fā)明還提供了分離的多肽，其包含SEQ ID NO=I的氨基酸13-27所述的氨基酸序列，優(yōu)選地SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列，更優(yōu)選地，SEQ ID NO :20所述的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，分離的多肽與SEQ ID NO :20具有至少70%同一性，其中該多肽具有 ER-α 36活性。本發(fā)明也包括SEQ ID NO :1的免疫原性片段。當(dāng)這些術(shù)語(yǔ)出現(xiàn)在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中時(shí)，術(shù)語(yǔ)“包含”和其變體不具有限制含義。除非另有限定，可互換地使用“一個(gè)(a)”、“一個(gè)(an)”、“該(the) ”和“至少一個(gè)”，且指一個(gè)或多于一個(gè)。附圖簡(jiǎn)述圖1解釋了人雌激素受體-a (ER-α)同種型的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)代表。顯示了結(jié)構(gòu)域 (用A-F標(biāo)記的)、氨基酸序列編號(hào)、AF-I和AF-2、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和二聚化結(jié)構(gòu)域。也指示了磷酸化位點(diǎn)和每個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能。圖2是證實(shí)ER-α的膜和基因組信號(hào)傳導(dǎo)途徑之間的可能的通訊的示意圖。Cav_l 代表小窩蛋白-1，ER-α，雌激素受體-α ；RTK，受體酪氨酸激酶；Ras，Ras癌基因；Mek， MAP/ERK激酶；MAPK，促分裂原活化蛋白激酶；PI3K，磷酸肌醇-三磷酸激酶；AKT，蛋白激酶 13 ；PDKl，磷酸肌醇-依賴(lài)性的蛋白激酶；RSK，p90核糖體S6激酶。圖3是顯示在有雌二醇(E》存在下，pRET-感染的MCFlOA細(xì)胞在軟瓊脂中生長(zhǎng)成大菌落的照片。STl克隆在含有E2的軟瓊脂中表現(xiàn)出快速生長(zhǎng)。分別包括MCF7和MCFlOA 細(xì)胞作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。圖4是顯示pRET-感染的MCFlOA細(xì)胞中的小窩蛋白_1 (Cavl)表達(dá)的下調(diào)的蛋白印跡。通過(guò)使用兔抗-Cav-I抗體(N20)的蛋白印跡，分析來(lái)自不同細(xì)胞系的等量的全細(xì)胞提取物。用箭標(biāo)指示Cav-I的位置，且在每個(gè)泳道上面指示在每個(gè)泳道中分析的細(xì)胞提取物。圖5是顯示pRET-感染的MCFlOA細(xì)胞中的ER-α表達(dá)的下調(diào)的蛋白印跡。通過(guò)使用針對(duì)ER-a (H222)和ER-β的抗體的蛋白印跡，分析來(lái)自不同細(xì)胞系的等量的全細(xì)胞提取物。用箭標(biāo)指示ER-α和ER-β的位置，且在每個(gè)泳道上面指示在每個(gè)泳道中分析的細(xì)胞提取物。圖6是顯示pRET-感染的MCFlOA細(xì)胞中的ERK1/2磷酸化的活化的蛋白印跡。通過(guò)使用針對(duì)ERK1/2和磷酸化的ERK1/2的抗體的蛋白印跡，分析來(lái)自細(xì)胞系的等量的全細(xì)胞提取物。圖7是顯示3種ER-α蛋白在Cav-Ι單倍體不足(haploinsuff icient)細(xì)胞STl 和ST3和MCF7乳腺癌細(xì)胞中的存在的蛋白印跡。通過(guò)使用針對(duì)ER-α的Η222抗體的蛋白印跡，分析來(lái)自細(xì)胞系的等量的全細(xì)胞提取物。用箭標(biāo)指示ER- α 66、ER- α 46和ER- α 36 的位置，且在每個(gè)泳道上面指示在每個(gè)泳道中分析的細(xì)胞提取物。圖8描繪了人ER-α基因的基因組組織。用箭標(biāo)指示多個(gè)啟動(dòng)子的位置。用AUG 和UGA指示翻譯起始和終止位置。用編號(hào)的框顯示外顯子。也用框中的外顯子1'顯示內(nèi)含子1。下圖顯示了 ER-α同種型的mRNA結(jié)構(gòu)。用AAA指示聚腺苷酸化位點(diǎn)。圖9是瓊脂糖凝膠的圖片，它顯示了通過(guò)PCR分離能編ER- α 36的可讀框的cDNA。 用箭標(biāo)指示cDNA在凝膠中的位置。圖10顯示了 ER-α 36可讀框的預(yù)測(cè)的氨基酸序列。用氨基酸序列(SEQ ID NO 20)左側(cè)的編號(hào)，指示氨基酸位置。ER- α 36獨(dú)有的最后的27個(gè)氨基酸標(biāo)有下劃線(xiàn)(SEQ ID NO :1)。圖11顯示了 ER-α 66、ER-α 46和ER-α 36的蛋白印跡分析。標(biāo)記為ER-α 66、 ER-α 46和ER-a 36的泳道代表著用能編碼所述的雌激素受體同種型的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、并在轉(zhuǎn)染后2天裂解的HEK 293細(xì)胞的分離的培養(yǎng)物。用抗-ER-α抗體0122 ，免疫檢測(cè)每種轉(zhuǎn)染子的裂解物。來(lái)自MCF7細(xì)胞的細(xì)胞提取物用作陽(yáng)性對(duì)照。用箭標(biāo)指示ER-α 66、 ER- α 46 禾口 ER- α 36 的位置。圖12顯示了 (a)能編碼ER-α 36且包含ER-α 36啟動(dòng)子的基因的5'側(cè)翼序列的DNA序列(SEQ ID NO 22)，和(b)能編碼ER- α 36且包含由外顯子9編碼的核苷酸的基因的3'側(cè)翼序列的DNA序列(SEQ ID NO :25)。在5'側(cè)翼序列中，推定的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)標(biāo)有下劃線(xiàn)，且也指示了能結(jié)合核酸序列的蛋白。也用箭標(biāo)指示了 cDNA的起始位點(diǎn)。圖13顯示了不同的乳腺癌細(xì)胞MCF10A、T47D、MCF7和MDA-MB-231中的ER-α 36 的RNA印跡分析。用箭標(biāo)指示了 ER- α 36和肌動(dòng)蛋白的位置。圖14顯示了 ER- α 36對(duì)ER- α 66和ER- β的AF-1和AF-2結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)反式激活活性的抑制。(+Ε》，Ε2處理的細(xì)胞；(-Ε》，未用Ε2處理的細(xì)胞。圖15顯示，ER-a 36能介導(dǎo)由E2刺激的膜-啟動(dòng)的MAPK激酶途徑。(a)蛋白印跡顯示了用雌二醇-17 β (E2 β )處理ER 36-293細(xì)胞，會(huì)誘導(dǎo)Mekl/2和ERK1/2的快速磷酸化。P-Mekl/2和P-ERK1/2,分別是Mekl/2和ERK1/2的磷酸化形式。(b)血清(而不是E2 β )會(huì)誘導(dǎo)對(duì)照載體-293細(xì)胞中的ERK1/2的磷酸化。P-ERK1/2是ERK1/2的磷酸化形式。(c)不同的雌激素和抗雌激素藥會(huì)誘導(dǎo)ER36-293細(xì)胞中的ERK1/2的快速磷酸化。 P-ERK1/2是ERK1/2的磷酸化形式。(d)他莫昔芬處理能組成型地刺激ER36-293細(xì)胞中的 ERK1/2磷酸化。P-ERK1/2是ERK1/2的磷酸化形式。圖16表明，ER-α 36能介導(dǎo)Ε2 β誘導(dǎo)的MAI3K激酶核信號(hào)傳導(dǎo)，并刺激細(xì)胞生長(zhǎng)。 (a) E2 β對(duì)MAPK激酶核信號(hào)傳導(dǎo)的作用。用5XGal4_LUC，即含有5個(gè)DNA結(jié)合位點(diǎn)的螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒，和含有與Gal4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的ELK轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域的Gal-ELK 表達(dá)載體(上圖)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染了 ER36-293和對(duì)照載體-293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞培養(yǎng)物維持在沒(méi)有雌激素的培養(yǎng)基中36小時(shí)，然后加入E2 β (InM或IOnM) 12小時(shí)。具有標(biāo)準(zhǔn)差的螢
9光素酶活性代表著一式兩份進(jìn)行的超過(guò)3次實(shí)驗(yàn)。(b)E2i3和抗雌激素藥能刺激ER36493 細(xì)胞的生長(zhǎng)。顯示了在490nm的吸光度數(shù)據(jù)。平均了超過(guò)5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；顯示了平均值和SEM。還通過(guò)成對(duì)的t-檢驗(yàn)，評(píng)價(jià)了這些結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。ER36-293和載體-293 細(xì)胞的P-值小于0. 001。圖17表明，ER- α 36主要是基于膜的雌激素受體。(a)蛋白印跡分析ER-α 36在不同的確立的乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)。剝離相同的印跡，并用抗-肌動(dòng)蛋白抗體探測(cè)，以確保等量裝載。(b) ER-α 36在ER-α 36轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。用ER-α 36特異性的抗體，免疫印跡不同的亞細(xì)胞級(jí)分中的ER-α 36。W，全細(xì)胞裂解物；ΡΜ，質(zhì)膜；C，胞質(zhì)溶膠；N，核。通過(guò)免疫印跡質(zhì)膜、胞質(zhì)溶膠、核和高爾基體的各種蛋白標(biāo)記，檢查亞細(xì)胞級(jí)分純度。5' NT, 5'核苷酸酶；D4-GDI，GDP解離抑制劑；mSin3A，組蛋白重構(gòu)復(fù)合物的組分； COPB，β外被蛋白。圖18表明，Ε2 β能促進(jìn)ER- α 66陰性的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231在軟瓊脂中的生長(zhǎng)。在不存在Ε2β (0)、存在IOnM Ε2 β (Ε2)、存在IOnM Ε2 β和IOnM他莫昔芬(Ε2+ΤΑΜ) 和存在單獨(dú)的IOnM他莫昔芬(TAM)的情況下，使MDA-MB-231細(xì)胞在軟瓊脂上生長(zhǎng)3周。圖19表明，Ε2 β能誘導(dǎo)ER- α 66陰性的乳腺癌細(xì)胞MDA_MB_231中的膜啟動(dòng)的雌激素信號(hào)傳導(dǎo)。用雌二醇-17 β (E2 β )處理MDA-MB-231細(xì)胞，會(huì)誘導(dǎo)ERK1/2的快速磷酸化。用Ε2β (IOnM)處理細(xì)胞不同的時(shí)間點(diǎn)，使所述細(xì)胞裂解，并使用磷酸化依賴(lài)性的和非依賴(lài)性的抗體，通過(guò)蛋白印跡進(jìn)行分析。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的詳述已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，小窩蛋白-1 (Cav-I)系統(tǒng)的下調(diào)會(huì)組成型激活促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK)途徑，激活雌激素受體-a (ER-α)的表達(dá)，和觸發(fā)正雌激素信號(hào)傳導(dǎo)。該發(fā)現(xiàn)首次提供了活化的ΜΑΗ(信號(hào)傳導(dǎo)和乳房腫瘤發(fā)生(尤其是由雌激素刺激的乳腺癌發(fā)展)之間的清楚的聯(lián)系。該發(fā)現(xiàn)有力地提示，Cav-I通過(guò)協(xié)調(diào)MAPK和雌激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑之間的通訊，在維持乳房上皮細(xì)胞的正常生長(zhǎng)中起重要作用，且它的下調(diào)可能有助于這2個(gè)重要途徑的調(diào)節(jié)異常，這最終導(dǎo)致乳腺腫瘤發(fā)生。圖2顯示了雌激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑和ΜΑΗ(信號(hào)傳導(dǎo)途徑的示意圖。還已經(jīng)鑒別和克隆了雌激素受體-α同種型。從位于原始的66-kDa ER-α (ER-α 66)基因的第一個(gè)內(nèi)含子中的啟動(dòng)子，產(chǎn)生了雌激素受體-α的該36_kDa同種型(ER- α 36)。ER- α 36不同于ER- α 66，因?yàn)樗鄙?個(gè)轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域(AF_1和AF_2)， 但是保留了 DNA-結(jié)合、二聚化和大部分的配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。ER-α 36的結(jié)構(gòu)表明，ER-α 36 是雌激素信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)劑。ER-a 36也可以介導(dǎo)雌激素信號(hào)傳導(dǎo)的膜作用，因?yàn)樗饕谫|(zhì)膜上表達(dá)，且也在胞質(zhì)溶膠和核中表達(dá)。已經(jīng)將ER-β視作ER-a 66介導(dǎo)的雌激素信號(hào)傳導(dǎo)的組成型調(diào)節(jié)劑。發(fā)現(xiàn)缺少 AF-I結(jié)構(gòu)域的ER- α 46可以二聚化成ER- α 66，并抑制由ER- α 66的AF-1結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的反式激活活性，這表明ER-CI46在由ER-CI66的AF-I結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的功能活性中起調(diào)節(jié)作用。 ER- α 36缺少AF-I和AF-2結(jié)構(gòu)域。因而，認(rèn)為ER- α 36會(huì)抑制由ER- α 66的AF-I和AF-2 介導(dǎo)的生物功能，以及由ER- α 46的AF-2介導(dǎo)的功能。利用ER- α 36和ER- α 46介導(dǎo)的調(diào)節(jié)，其二者可能在不同的組織中以不同的水平表達(dá)，ER-a 66可以在不同的靶組織中不同地起作用。認(rèn)為這樣的機(jī)理能解釋不同生物過(guò)程中的雌激素信號(hào)傳導(dǎo)的多效性作用。
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本發(fā)明的多肽和肽模仿物(p^tidomimetic)本發(fā)明提供了多肽。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“多肽”泛指通過(guò)肽鍵連接到一起的2個(gè)或更多個(gè)氨基酸的聚合物。術(shù)語(yǔ)肽、寡肽和蛋白都包含在多肽的定義中，且這些術(shù)語(yǔ)可互換地使用。應(yīng)當(dāng)理解，這些術(shù)語(yǔ)不意味著氨基酸聚合物的特定長(zhǎng)度，它們也無(wú)意暗示或區(qū)分多肽是否由重組技術(shù)、化學(xué)或酶促合成生成，或是天然產(chǎn)生。本文公開(kāi)和描述了本發(fā)明范圍內(nèi)的多肽的多個(gè)實(shí)例。在天然產(chǎn)生的多肽或多核苷酸的情況下，優(yōu)選地，分離這樣的多肽或多核苷酸，并任選地純化。“分離的”多肽或多核苷酸是從它的天然環(huán)境分開(kāi)和分離的多肽或多核苷酸。“純化的”多肽或多核苷酸是至少60%地不含、優(yōu)選地75%地不含和最優(yōu)選地 90%地不含它們天然地伴隨的其它組分的多肽或多核苷酸。認(rèn)為在它們天然發(fā)生的生物外面生產(chǎn)(例如，通過(guò)化學(xué)或重組方法)的多肽和核苷酸，是定義的分離的和純化的，因?yàn)樗鼈儚奈创嬖谟谔烊画h(huán)境中。“外源多肽”指外來(lái)多肽，即通常不存在于細(xì)胞中的多肽，或通常存在于細(xì)胞中、但是已經(jīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)入細(xì)胞中(例如，通過(guò)導(dǎo)入能編碼該多肽的多核苷酸)的多肽。本發(fā)明的多肽可以是生物活性的。這樣的生物活性在本文中稱(chēng)作“ER-a 36活性”。 可以用于確定本發(fā)明的多肽是否是生物活性的生物測(cè)定的實(shí)例包含，使能表達(dá)該多肽的細(xì)胞接觸雌激素或抗-雌激素藥，并測(cè)定在有雌激素或抗-雌激素藥存在的情況下，與不表達(dá)本發(fā)明的多肽的對(duì)照細(xì)胞中的MAPK活性相比，MAPK途徑的活性是增高還是降低。優(yōu)選地， MAPK活性是ERK 1/2和Mek 1/2的磷酸化，且優(yōu)選地，在有抗-雌激素藥存在的情況下，本發(fā)明的多肽誘導(dǎo)的ERK1/2的磷酸化不減少。優(yōu)選地，ER-a 36活性是膜啟動(dòng)的。通過(guò)暴露能表達(dá)具有對(duì)不同配體的ER-α 36活性的多肽的細(xì)胞，可以測(cè)量ER-α 36活性?？梢允褂玫呐潴w的實(shí)例，包括但不限于，雌酮(El)、17 α-雌二醇(Ε2α)、17β-雌二醇(Ε2β)、雌三醇(Ε3)、雌四醇(estetrol) (E4)或附著到不可透過(guò)膜的分子，例如牛血清清蛋白(BSA)的雌激素。通常，當(dāng)待測(cè)ER- α 36活性限于膜啟動(dòng)的ER- α 36活性時(shí)，使用附著到不可透過(guò)膜的分子上的雌激素。使用的雌激素的量可以變化，且優(yōu)選地，在InM至IOnM的范圍內(nèi)。暴露于雌激素的細(xì)胞優(yōu)選地是休眠細(xì)胞。該暴露允許發(fā)生5-90分鐘，然后裂解細(xì)胞，并通過(guò) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離存在于細(xì)胞中的多肽。將分離的多肽轉(zhuǎn)移到膜上后，使用針對(duì)非磷酸化和磷酸化形式的ERK 1/2和Mek 1/2的抗體，評(píng)價(jià)MAI3K途徑的活化。任選地， 可以包括抗-雌激素藥，例如他莫昔芬、40Η-他莫昔芬或ICI-182，780，以確定ERK 1/2的磷酸化是否對(duì)抗雌激素藥不敏感。本發(fā)明提供了具有SEQ ID NO :20所述的氨基酸序列的多肽。該多肽，和本文所述的有關(guān)多肽，在本文中也稱(chēng)作ER-α 36、ER_ α 36同種型和ER受體α 36-亞基。如圖1所示， 當(dāng)與ER- α 66同種型相比較時(shí)，ER- α 36同種型缺少氨基-末端氨基酸殘基1_183，羧基-末端氨基酸殘基430-595，且在它的C-末端具有27個(gè)氨基酸殘基的添加(見(jiàn)表1)。雌激素受體α異構(gòu)體包括ER-α 36、ER-α 46、ER-α 66。雌激素受體β異構(gòu)體包括ER-β。本發(fā)明也提供了雌激素受體，其包括ER-α 36同種型。無(wú)意進(jìn)行限制，認(rèn)為ER-α 36同種型能通過(guò)與ER- α 66、ER- α 46或ER- β形成二聚體，通過(guò)調(diào)節(jié)雌激素受體功能，來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)雌激素的反應(yīng)。而且，認(rèn)為ER- α 36缺少活化因子1 (AF-I)和活化因子2 (AF-2)活性，并因而缺少內(nèi)在的轉(zhuǎn)錄活性。但是，認(rèn)為ER- α 36保留了完整的二聚化結(jié)構(gòu)域，其允許ER- α 36與 ER- α 46,ER- α 66或ER- β 二聚化。認(rèn)為該相互作用允許ER- α 36調(diào)節(jié)含有雌激素受體的ER- α 46、ER- α 66 禾口 ER- β 的活性 c表 1氨基酸和核苷酸序列
權(quán)利要求
1.分離的抗體，其能特異性地結(jié)合SEQID NO :1所述的氨基酸序列的免疫原性片段， 所述免疫原性片段含有至少5個(gè)連續(xù)氨基酸。
2.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
3.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是多克隆抗體。
4.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是人源化的抗體。
5.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是抗體片段。
6.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體共價(jià)附著到化合物。
7.權(quán)利要求6的抗體，其中所述化合物是化療劑。
8.權(quán)利要求6的抗體，其中所述化合物是檢測(cè)標(biāo)記。
9.權(quán)利要求8的抗體，其中所述檢測(cè)標(biāo)記是熒光標(biāo)記。
10.組合物，其包含權(quán)利要求1的抗體。
11.權(quán)利要求10的組合物，還包含藥學(xué)上可接受的載體。
12.制備抗體的方法，其包括給動(dòng)物施用包含SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列的免疫原性片段的多肽，和從該動(dòng)物分離抗體，其中所述免疫原性片段含有至少5個(gè)連續(xù)的氨基酸，所述分離的抗體能特異性地結(jié)合該免疫原性片段。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述多肽共價(jià)附著到載體多肽上。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述分離包含從動(dòng)物得到能產(chǎn)生該抗體的細(xì)胞，該方法還包含使用該細(xì)胞制備能產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。
15.通過(guò)權(quán)利要求12的方法生產(chǎn)的多克隆抗體。
16.通過(guò)權(quán)利要求14的方法生產(chǎn)的單克隆抗體。
17.包含外源編碼區(qū)的細(xì)胞，其中所述編碼區(qū)能編碼包含SEQIDNO :20的第一個(gè)多肽， 或包含與SEQ ID NO :20具有至少90%同一性的氨基酸序列的第二個(gè)多肽，其中所述第二個(gè)多肽具有ER-α 36活性。
18.權(quán)利要求17的細(xì)胞，其中所述編碼區(qū)可操作地連接到組成型啟動(dòng)子上。
19.權(quán)利要求17的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
20.權(quán)利要求17的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。
21.能表達(dá)外源多肽的細(xì)胞，其中所述多肽包含SEQID NO :20，或包含與SEQ ID NO: 20具有至少90%同一性且具有ER- α 36活性的氨基酸序列。
22.權(quán)利要求21的細(xì)胞，其中所述編碼區(qū)可操作地連接到組成型啟動(dòng)子上。
23.權(quán)利要求21的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
24.權(quán)利要求21的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。
25.鑒別能結(jié)合多肽的試劑的方法，該方法包含組合包含SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列的多肽和試劑，和檢測(cè)試劑和多肽之間的復(fù)合物形成。
26.權(quán)利要求25的方法，其中通過(guò)選自下述的方法，檢測(cè)所述試劑與多肽的結(jié)合直接檢測(cè)試劑與多肽的結(jié)合，和使用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定檢測(cè)試劑與多肽的結(jié)合。
27.權(quán)利要求25的方法，還包含，確定試劑是否能結(jié)合包含SEQIDNO 18的多肽。
28.權(quán)利要求25的方法，還包含，確定試劑是否能抑制多肽的ER-α36活性。
29.檢測(cè)多肽的方法，其包括提供離體細(xì)胞，確定所述細(xì)胞中是否表達(dá)具有36kDa分子量且具有如SEQ ID NO :20所示氨基酸序列或與SEQ ID NO :20具有至少90%同一性的多肽，所述分子量如按照十二烷基硫酸鈉 (SDS)-聚丙烯酰胺凝膠上的電泳測(cè)得。
30.檢測(cè)多肽的方法，其包括提供離體細(xì)胞，確定所述細(xì)胞中是否表達(dá)具有36kDa分子量且含有SEQ ID NO 1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列的多肽，所述分子量如按照十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠上的電泳測(cè)得。
31.權(quán)利要求四或30的方法，其中所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述腫瘤是乳腺腫瘤。
33.權(quán)利要求四或30的方法，其中所述確定包括，使細(xì)胞接觸能特異性地結(jié)合SEQID NO 1所述的氨基酸序列，或其免疫原性片段的抗體。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述抗體共價(jià)附著到檢測(cè)標(biāo)記上。
35.權(quán)利要求34的抗體，其中所述檢測(cè)標(biāo)記是熒光標(biāo)記。
36.權(quán)利要求四或30的方法，其中所述確定包括，擴(kuò)增mRNA多核苷酸，以形成擴(kuò)增的多核苷酸，其中所述擴(kuò)增包含，使從細(xì)胞得到的多核苷酸接觸引物對(duì)，后者能擴(kuò)增mRNA多核苷酸，其包括SEQ IDN0:22或SEQ ID NO :25，或其組合，其中擴(kuò)增的多核苷酸的存在表明該細(xì)胞表達(dá)多肽。
37.權(quán)利要求36的方法，其中引物對(duì)的一個(gè)引物選自SEQID NO 22的核苷酸，與SEQ ID NO 25的核苷酸互補(bǔ)的核苷酸，或其組合，且其中每個(gè)引物具有至少15個(gè)核苷酸。
38.抑制細(xì)胞的ER-α36活性的方法，其包括使能表達(dá)包含SEQID NO 1的氨基酸 13-27所述的氨基酸序列的多肽的細(xì)胞，接觸能抑制ER-α 36活性的化合物。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述化合物包含權(quán)利要求1-9任一所述的抗體。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述化合物包含能特異性地結(jié)合包含SEQID Ν0:1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列的多肽的抗體。
41.權(quán)利要求38的方法，其中所述細(xì)胞是離體的。
42.權(quán)利要求38的方法，其中所述細(xì)胞是ER-α66陰性的。
43.權(quán)利要求38的方法，其中所述細(xì)胞是ER-α46陰性的。
44.權(quán)利要求38的方法，其中所述化合物不是抗-雌激素藥。
45.在體外抑制細(xì)胞中的ERK1/2或ΜΕΚ1/2磷酸化的方法，其包括使細(xì)胞接觸權(quán)利要求1-9任一所述的抗體；其中，所述細(xì)胞能表達(dá)具有36kDa分子量、能結(jié)合雌激素且包含SEQ ID NO :1的氨基酸 13-27所述的氨基酸序列的多肽，所述分子量如按照十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠上的電泳測(cè)得，且所述抗體的劑量能夠抑制雌激素和SEQ ID N0:20的結(jié)合。
46.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述抗體能特異性地結(jié)合包含SEQID N0:1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列的多肽。
47.分離的多肽，其由SEQID NO :1的氨基酸1-27所述的氨基酸序列或其修飾的序列組成，所述修飾的序列是通過(guò)添加、取代或缺失一個(gè)或多個(gè)鄰接的或不鄰接的氨基酸來(lái)修飾的SEQ ID NO :1的氨基酸1-27，并且所述修飾的序列能夠刺激產(chǎn)生結(jié)合SEQ ID N0:1的氨基酸1-27的抗體。
48.分離的多肽，其由SEQID NO :1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列或其修飾的序列組成，所述修飾的序列是通過(guò)添加、取代或缺失一個(gè)或多個(gè)鄰接的或不鄰接的氨基酸來(lái)修飾的SEQ ID NO 1的氨基酸13-27，并且所述修飾的序列能夠刺激產(chǎn)生結(jié)合SEQ ID NO 1的氨基酸13-27的抗體。
49.分離的多肽，含有共價(jià)附著到載體多肽上的權(quán)利要求47或48所述的多肽。
50.分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求47-49任一所述的多肽。
51.SEQ ID NO 1的免疫原性片段，含有SEQ ID NO=I中的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸。
52.試劑盒，其包含權(quán)利要求1-9任一所述的分離的抗體和包裝材料。
53.權(quán)利要求1-9任一所述的抗體用于制備診斷試劑的用途，所述診斷試劑用于區(qū)分雌激素陽(yáng)性和雌激素陰性的癌癥。
54.權(quán)利要求53的用途，所述區(qū)分雌激素陽(yáng)性和雌激素陰性的癌癥是通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞中是否表達(dá)具有36kDa分子量且能夠結(jié)合雌激素或抗雌激素的多肽，所述分子量如按照十二烷基硫酸鈉(SDQ -聚丙烯酰胺凝膠上的電泳測(cè)得。
55.權(quán)利要求1-9任一所述的抗體用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療個(gè)體中雌激素相關(guān)的癌癥，其中所述抗體能夠抑制雌激素與細(xì)胞的SEQ ID N0:20的結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明提供了分離的多肽，其氨基酸序列與SEQ ID NO20具有至少70％同一性，其中該多肽具有ER-α36活性。本發(fā)明還提供了鑒別能能結(jié)合這樣的多肽的試劑的方法，檢測(cè)這樣的多肽的方法，和改變這樣的多肽的活性的方法。還提供了能特異性地結(jié)合SEQ ID NO1所述的氨基酸序列，或其免疫原性片段的抗體，和制備和使用這樣的抗體的方法。
文檔編號(hào)C07K16/00GK102504025SQ20111035182
公開(kāi)日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2005年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月10日
發(fā)明者王兆一 申請(qǐng)人:克賴(lài)頓大學(xué)