專利名稱：陽(yáng)離子交換樹脂和擴(kuò)張床集成技術(shù)一步純化分離麻黃堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種具有重要藥用價(jià)值的生物堿，即麻黃堿的制備工藝，即用陽(yáng)離子交換樹脂和擴(kuò)張床集成技術(shù)一步純化分離麻黃堿的方法。
背景技術(shù)：
麻黃堿(Ephedrine，C10H15NO)的學(xué)名是2-甲氨基-1-苯基-1-丙醇，屬于芳香族氨基醇衍生物，具有重要的藥用價(jià)值，多做成鹽酸鹽供實(shí)用，市場(chǎng)需求量極大。由于其分子結(jié)構(gòu)與腎上腺素結(jié)構(gòu)十分類似，因而具有興奮中樞神經(jīng)，收縮毛細(xì)血管，增強(qiáng)心肌收縮力等功能，并且具有利水消腫、宣肺平喘等功效。臨床主要用于預(yù)防哮喘發(fā)作和治療習(xí)慣性支氣管哮喘等病癥。目前，由于含PPA的藥物在世界范圍內(nèi)被停止使用，麻黃堿作為PPA的最佳替代品，僅國(guó)內(nèi)市場(chǎng)年需求量就凈增200余噸，同時(shí)，國(guó)際市場(chǎng)年需求量也發(fā)展到1600余噸(2001年數(shù)據(jù))。在美國(guó)國(guó)家處方委員會(huì)記錄的最常用高等植物提取藥用化合物中，麻黃堿占處方第5位。
目前臨床使用的麻黃堿的生產(chǎn)方法有植物提取法、人工有機(jī)合成法、微生物發(fā)酵法和細(xì)胞培養(yǎng)法。這些生產(chǎn)方法均涉及到產(chǎn)品的純化。實(shí)踐表明獲取高純度的麻黃堿制品遠(yuǎn)非易事，麻黃堿的純化是一個(gè)高難度、高成本的過(guò)程，不僅直接關(guān)系到產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，而且其成本常常占總成本的60％以上。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，其下游分離純化過(guò)程以二甲苯提取、草酸沉淀和結(jié)晶為主，存在毒性大、環(huán)境污染嚴(yán)重、生產(chǎn)周期長(zhǎng)，回收率低等問題，不符合21世紀(jì)綠色工業(yè)的要求。因而引起產(chǎn)學(xué)界的重視。捷克專利222947公開了降低L-麻黃堿生產(chǎn)成本的方法。中國(guó)專利95117443公開了一種鹽酸麻黃堿的萃取新工藝。中國(guó)專利98125186公開了一種細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)麻黃堿的方法。中國(guó)專利02104402采用固定床層析分離提取麻黃堿。這些已有的研究在減少有機(jī)溶劑的使用和提高產(chǎn)率等方面取得了一定的進(jìn)展，但仍存在純化步驟繁雜，過(guò)程集成度不高，導(dǎo)致產(chǎn)品收率偏低等問題。
蛋白質(zhì)擴(kuò)張床層析(expanded bed adsorption)技術(shù)是近十幾年來(lái)出現(xiàn)的一種新型生物分離模式，其充分體現(xiàn)了當(dāng)今生物分離技術(shù)中過(guò)程集成化的思想。該技術(shù)兼?zhèn)淞骰埠吞畛浯驳膬?yōu)勢(shì)，集料液中碎片清除、料液濃縮和目標(biāo)產(chǎn)物純化等步驟于一身，大大提高了目標(biāo)產(chǎn)物收率，降低了純化時(shí)間和費(fèi)用。目前在蛋白質(zhì)純化分離中的應(yīng)用已初顯成效，相關(guān)研究報(bào)道不少，有些已達(dá)到生產(chǎn)規(guī)模。但是在天然產(chǎn)物和中草藥活性組分純化等領(lǐng)域還未見研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服已有的麻黃堿純化方法毒性大、純化步驟繁雜、產(chǎn)品收率低的缺點(diǎn)。考慮麻黃堿溶于水后呈陽(yáng)離子狀態(tài)，可被離子交換劑吸附。因此，本發(fā)明將高度過(guò)程集成化的蛋白質(zhì)擴(kuò)張床層析技術(shù)引入麻黃堿的生產(chǎn)工藝中，開發(fā)了高效的可管道化操作的離子變換擴(kuò)張床層析設(shè)計(jì)替代傳統(tǒng)的麻黃堿下游分離工藝，簡(jiǎn)化了操作步驟，縮短了操作時(shí)間，提高了產(chǎn)品收率，更為重要的是避免了有機(jī)溶劑的使用，符合綠色環(huán)保要求。
本發(fā)明的目的是通過(guò)如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供麻黃堿的純化方法，包括如下步驟1)將經(jīng)常規(guī)麻黃植物提取法、合成法、微生物發(fā)酵法或細(xì)胞培養(yǎng)法得到的經(jīng)0.05M稀鹽酸處理的含鹽酸麻黃堿的原始料液收集，2～3倍緩沖液A稀釋；2)用緩沖液A平衡擴(kuò)張床層析柱(見附圖1)中的陽(yáng)離子交換介質(zhì)，介質(zhì)裝填高度11±0.2cm，選擇合適流速，經(jīng)蠕動(dòng)泵上樣，待床層擴(kuò)張穩(wěn)定30min后，上樣液迅速由緩沖液切換為步驟1)的懸浮料液(使用攪拌器獲得含有植物碎片的懸浮液)。待穿透點(diǎn)達(dá)到5～20％時(shí)，停止料液進(jìn)樣，馬上用緩沖液清洗4～5個(gè)柱體積，直至目標(biāo)物基線趨于恒定。再用洗脫液B和C進(jìn)行兩步階躍洗脫。收集第二個(gè)洗脫峰的洗脫液，最后將此洗脫液濃縮，得到純化的鹽酸麻黃堿。操作過(guò)程中，通過(guò)擴(kuò)張床高度調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)層析柱上部的活塞保持在擴(kuò)張的吸附劑液面上方1～2cm處，整個(gè)操作過(guò)程，流體均從擴(kuò)張床底部進(jìn)樣，在吸附和清洗過(guò)程中保持1.3倍擴(kuò)張比，洗脫過(guò)程中保持1.1倍擴(kuò)張比。
所述步驟1)的緩沖液A為pH5.0的0.01M醋酸鹽緩沖液(乙酸鈉-冰乙酸)，pH7.2的0.01M磷酸鹽緩沖液(磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉)，pH9.9的0.01M甘氨酸緩沖液(甘氨酸-氫氧化鈉)，優(yōu)選為pH7.2的磷酸鹽緩沖液；所述步驟2)的一級(jí)洗脫液B為含0.1M NaCl的pH7.2的磷酸鹽緩沖液，洗脫2.2個(gè)柱體積；所述步驟2)的二級(jí)洗脫液C為含1.0M NaCl的pH7.2的磷酸鹽緩沖液，洗脫18個(gè)柱體積；所述步驟2)的擴(kuò)張床裝置如附圖1所示，主要由玻璃柱(90cm×16mm I.D.)、液體分布器(優(yōu)選為120目的不銹鋼絲網(wǎng)和均勻開孔，孔徑為1mm左右的不銹鋼墊片)、攪拌器、高效蠕動(dòng)泵、紫外檢測(cè)儀和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)等組成。
所述步驟2)的陽(yáng)離子交換介質(zhì)包括Streamline SP，CM Sephadex，003×7Styrene DVB，001×7Styrene DVB，優(yōu)選為苯乙烯系陽(yáng)離子交換樹脂001×7Styrene DVB；所述步驟2)的上樣鹽酸麻黃堿含量?jī)?yōu)選為1～3mg/ml；所述步驟2)的流速以擴(kuò)張比為操作參比，優(yōu)選為在吸附和清洗過(guò)程中保持1.3倍擴(kuò)張比，洗脫過(guò)程中保持1.1倍擴(kuò)張比。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的純化方法使用陽(yáng)離子交換介質(zhì)和擴(kuò)張床集成技術(shù)，通過(guò)選用合適的吸附介質(zhì)和操作條件，確保床層內(nèi)的液相返混程度控制在經(jīng)典的蛋白質(zhì)擴(kuò)張床層析范圍內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)鹽酸麻黃堿的高效吸附，并通過(guò)控制清洗和洗脫條件，使得在清洗和一級(jí)洗脫過(guò)程中能夠有效去除雜質(zhì)。該工藝集料液碎片清除、產(chǎn)物濃縮和初步純化等單元操作于一體，減少了操作步驟，從而使得采用本方法所得的產(chǎn)品回收率較傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑萃取法提高了22％，達(dá)到86％，純化因子高達(dá)22，產(chǎn)品純度達(dá)到85％(見表1)，相當(dāng)于傳統(tǒng)工業(yè)提取工藝在氯化鈣置換后，精致4～5次才能達(dá)到的純度。因此，本發(fā)明不僅可以避免使用傳統(tǒng)工藝中毒性較大的二甲苯，還可顯著減輕后續(xù)分離的負(fù)擔(dān)，該方法步驟簡(jiǎn)單，僅一步層析即可達(dá)到較高純化效果，比已有技術(shù)節(jié)省工藝和操作人員數(shù)，從而成本低廉，易于推廣。
表1 采用擴(kuò)張床集成技術(shù)從原料液中一步純化鹽酸麻黃堿的層析結(jié)果



圖1為本發(fā)明的擴(kuò)張床層析柱(90cm×16mm I.D.)結(jié)構(gòu)示意2為本發(fā)明的鹽酸麻黃堿的擴(kuò)張床線性梯度洗脫層析圖譜(實(shí)施例2)，其中上樣鹽酸麻黃堿初濃度為1.39mg/ml；B液含0.1M NaCl的pH7.2的0.01M磷酸鹽緩沖液；C液含1.0M NaCl的pH7.2的0.01M磷酸鹽緩沖液；梯度線性A→B(596ml)；上樣平均流速為493cm/h，洗脫流速平均為523cm/h。
圖3為本發(fā)明的鹽酸麻黃堿的擴(kuò)張床二級(jí)階躍洗脫層析圖譜(實(shí)施例3)，其中上樣鹽酸麻黃堿初濃度為1.45mg/ml；一級(jí)洗脫液含0.1M NaCl的pH7.2的0.01M磷酸鹽緩沖液；二級(jí)洗脫液含1.0M NaCl的pH7.2的0.01M磷酸鹽緩沖液；上樣平均流速為476cm/h，洗脫流速平均為517cm/h。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、麻黃堿原料液的制備我國(guó)是生產(chǎn)天然麻黃堿的主要國(guó)家，鑒于我國(guó)絕大部分廠家采用植物提取法生產(chǎn)麻黃堿。因此，本發(fā)明使用的麻黃堿的原料液采用常規(guī)植物提取法獲得，具體過(guò)程如下將麻黃草破碎，稱取麻黃草細(xì)粉150克，加入5倍體積0.05M稀鹽酸煎煮40min(煮沸后計(jì)時(shí))，傾出上層藥液，再加入2倍體積酸水煎煮30min，兩次藥液合并，2～3倍緩沖液A(0.01M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉，pH7.2)稀釋，獲得粗提鹽酸麻黃堿原料液。反相層析法測(cè)得原料液中鹽酸麻黃堿含量為1.4mg/ml左右，純度為3.8％(鹽酸麻黃堿/雜質(zhì)，重量比)左右。
實(shí)施例2、鹽酸麻黃堿的線性梯度洗脫純化(確定優(yōu)化的洗脫條件)自制90cm×16mm I.D.的擴(kuò)張床層析柱，材質(zhì)為玻璃，采用的介質(zhì)為苯乙烯系陽(yáng)離子交換樹脂001×7Styrene DVB，填充高度為11±0.2cm，緩沖液A(0.01M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉，pH7.2)平衡層析介質(zhì)，經(jīng)蠕動(dòng)泵上樣，保持?jǐn)U張比為1.3，待床層擴(kuò)張穩(wěn)定30min后，上樣液迅速由緩沖液切換為實(shí)施例1中經(jīng)常規(guī)植物提取法獲得的粗提鹽酸麻黃堿原料液的懸浮液(使用攪拌器獲得含有植物碎片的懸浮液)。待穿透點(diǎn)達(dá)到87％時(shí)，停止料液進(jìn)樣，馬上用緩沖液清洗8個(gè)柱體積，直至目標(biāo)物基線趨于恒定。接著進(jìn)行線性梯度洗脫，洗脫度由洗脫液B(0.1M NaCl，0.01M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉，pH7.2)和洗脫液C(1.0M NaCl，0.01M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉，pH7.2)調(diào)節(jié)(見附圖2)。收集洗脫液，最后將此洗脫液濃縮，得到純化的鹽酸麻黃堿。操作過(guò)程中，通過(guò)擴(kuò)張床高度調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)層析柱上部的活塞保持在擴(kuò)張的吸附劑液面上方1～2cm處，整個(gè)操作過(guò)程，流體均從擴(kuò)張床底部進(jìn)樣，在吸附和清洗過(guò)程中保持1.3倍擴(kuò)張比，洗脫過(guò)程中保持1.1倍擴(kuò)張比。上樣平均流速為493cm/h，洗脫平均流速為523cm/h。
反相層析法測(cè)得洗脫液中鹽酸麻黃堿的收率為47％，純度為48％、純化因子為12、雜質(zhì)去除率為96％，實(shí)施例2表明料液中被吸附的雜質(zhì)能夠被鹽濃度0.1M的洗脫液有效去除，并且實(shí)施例2還提示我們，操作中過(guò)高的穿透點(diǎn)和線性梯度洗脫方式致使目標(biāo)物收率較低，因此在操作中應(yīng)控制穿透點(diǎn)在5～20％為宜，以此指導(dǎo)實(shí)施例3的設(shè)計(jì)。
實(shí)施例3、鹽酸麻黃堿的階躍洗脫純化(優(yōu)化的洗脫條件)
自制90cm×16mm I.D.的擴(kuò)張床層析柱，材質(zhì)為玻璃，采用的介質(zhì)為苯乙烯系陽(yáng)離子交換樹脂001×7Styrene DVB，填充高度為11±0.2cm，緩沖液A(0.01M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉，pH7.2)平衡層析介質(zhì)，經(jīng)蠕動(dòng)泵上樣，保持?jǐn)U張比為1.3，待床層擴(kuò)張穩(wěn)定30min后，上樣液迅速由緩沖液切換為實(shí)施例1中經(jīng)常規(guī)植物提取法獲得的粗提鹽酸麻黃堿原料液的懸浮液(使用攪拌器獲得含有植物碎片的懸浮液)。待穿透點(diǎn)達(dá)到17％時(shí)，停止料液進(jìn)樣，馬上用緩沖液清洗4個(gè)柱體積，直至目標(biāo)物基線趨于恒定。接著進(jìn)行兩步階躍梯度洗脫，一級(jí)洗脫液為含0.1M NaCl的pH7.2的0.01M磷酸鹽緩沖液，洗脫2.2個(gè)柱體積；二級(jí)洗脫液為含1.0M NaCl的pH7.2的0.01M磷酸鹽緩沖液，洗脫18個(gè)柱體積。收集第二個(gè)洗脫峰的洗脫液，最后將此洗脫液濃縮，得到純化的鹽酸麻黃堿。操作過(guò)程中，通過(guò)擴(kuò)張床高度調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)層析柱上部的活塞保持在擴(kuò)張的吸附劑液面上方1～2cm處，整個(gè)操作過(guò)程，流體均從擴(kuò)張床底部進(jìn)樣，在吸附和清洗過(guò)程中保持1.3倍擴(kuò)張比，洗脫過(guò)程中保持1.1倍擴(kuò)張比。上樣平均流速為476cm/h，洗脫平均流速為517cm/h。
反相層析法測(cè)得洗脫液中鹽酸麻黃堿的收率為86.3％，純度為84.9％、純化因子22.3、雜質(zhì)去除率為96.1％。
使用本發(fā)明提供的純化方法，操作簡(jiǎn)便，操作費(fèi)用低，生產(chǎn)周期顯著縮短，產(chǎn)品的收率高、純度達(dá)到84.9％，更為重要的是避免了有機(jī)溶劑的使用，符合綠色環(huán)保要求。
權(quán)利要求
1.一種用陽(yáng)離子交換樹脂和擴(kuò)張床集成技術(shù)一步純化分離麻黃堿的方法，包括如下步驟1)將經(jīng)常規(guī)麻黃植物提取法、合成法、微生物發(fā)酵法或細(xì)胞培養(yǎng)法得到的經(jīng)0.05M稀鹽酸處理的含鹽酸麻黃堿的原始料液收集，2～3倍緩沖液A稀釋，緩沖液A為pH 5.0的0.01M醋酸鹽緩沖液(乙酸鈉-冰乙酸)，pH 7.2的0.01M磷酸鹽緩沖液(磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉)，pH 9.9的0.01M甘氨酸緩沖液(甘氨酸-氫氧化鈉)，優(yōu)選為pH 7.2的磷酸鹽緩沖液；2)用緩沖液A平衡擴(kuò)張床層析柱中的陽(yáng)離子交換介質(zhì)，經(jīng)蠕動(dòng)泵上樣，待床層擴(kuò)張穩(wěn)定30min后，上樣液迅速由緩沖液切換為步驟1)的懸浮料液(使用攪拌器獲得含有植物碎片的懸浮液)，待穿透點(diǎn)達(dá)到5～20％時(shí)，停止料液進(jìn)樣，馬上用緩沖液清洗4～5個(gè)柱體積，直至目標(biāo)物基線趨于恒定，再用洗脫液B和C進(jìn)行兩步階躍洗脫，一級(jí)洗脫液B為含0.1MNaCl的pH 7.2的磷酸鹽緩沖液，洗脫2.2個(gè)柱體積，二級(jí)洗脫液C為含1.0M NaCl的pH7.2的磷酸鹽緩沖液，洗脫18個(gè)柱體積，收集第二個(gè)洗脫峰的洗脫液，最后將此洗脫液濃縮，得到純化的鹽酸麻黃堿，操作過(guò)程中，通過(guò)擴(kuò)張床高度調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)層析柱上部的活塞保持在擴(kuò)張的吸附劑液面上方1～2cm處。
2.如權(quán)利要求1所述的麻黃堿的純化方法，其特征在于，所述步驟2)的擴(kuò)張床層析柱的液體分布器為120目的不銹鋼絲網(wǎng)和均勻分布直徑為1mm左右孔的不銹鋼墊片。
3.如權(quán)利要求1所述的麻黃堿的純化方法，其特征在于，所述步驟2)的陽(yáng)離子交換介質(zhì)包括Streamline SP，CM Sephadex，003×7 Styrene DVB，001×7 Styrene DVB，優(yōu)選為苯乙烯系陽(yáng)離子交換樹脂001×7 Styrene DVB。
4.如權(quán)利要求1所述的麻黃堿的純化方法，其特征在于，所述步驟2)的上樣鹽酸麻黃堿含量為1～3mg/ml。
5.如權(quán)利要求1所述的麻黃堿的純化方法，其特征在于，所述步驟2)的流速以擴(kuò)張比為操作參比，在吸附和清洗過(guò)程中保持1.3倍擴(kuò)張比，洗脫過(guò)程中保持1.1倍擴(kuò)張比。
6.如權(quán)利要求1所述的麻黃堿的純化方法，其特征在于將高度過(guò)程集成化的蛋白質(zhì)擴(kuò)張床層析技術(shù)引入天然產(chǎn)物和中草藥活性組分的生產(chǎn)工藝中，開發(fā)了高效的可管道化操作的離子交換擴(kuò)張床層析設(shè)計(jì)替代傳統(tǒng)的麻黃堿下游分離工藝。
全文摘要
本發(fā)明提供一種環(huán)境友好的麻黃堿的純化方法，具體步驟如下2～3倍緩沖液A稀釋經(jīng)常規(guī)麻黃植物提取法、合成法、微生物發(fā)酵法或細(xì)胞培養(yǎng)法得到的經(jīng)0.05M稀鹽酸處理的含鹽酸麻黃堿的原始料液，采用苯乙烯系陽(yáng)離子樹脂001×7 Styrene DVB裝填的帶特定設(shè)計(jì)液體分布器的擴(kuò)張床一步吸附鹽酸麻黃堿，采用含0.1M NaCl和1.0M NaCl的pH 7.2的0.01M磷酸鹽緩沖液進(jìn)行兩步階躍洗脫，收集第二個(gè)洗脫峰的洗脫液，得到純化的鹽酸麻黃堿。本方法避免了有機(jī)溶劑二甲苯的使用，產(chǎn)品的收率較傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑萃取法提高了22％，達(dá)到86％，產(chǎn)品純度達(dá)到85％。
文檔編號(hào)C07C215/00GK1704398SQ20041004276
公開日2005年12月7日 申請(qǐng)日期2004年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月26日
發(fā)明者陳衛(wèi)東, 蘇志國(guó) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所