量子點(diǎn)陽離子交換信號放大技術(shù)檢測真菌毒素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種基于量子點(diǎn)陽離子交換和信號放大技術(shù)檢測真菌毒素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生物毒素又稱為天然毒素，是指來源于生物，包括動物、植物、微生物產(chǎn)生的對其它生物物種有毒害作用并不能自身復(fù)制的各種化學(xué)物質(zhì)。人類對生物毒素的最早體驗(yàn)源于頻發(fā)的食物中毒事件，而引起食物中毒的大部分均為生物毒素，并且以微生物毒素最常見。微生物毒素包括蛋白類毒素和真菌毒素，其中真菌毒素是由真菌產(chǎn)生的小分子次級代謝產(chǎn)物，可誘發(fā)多種疾病的產(chǎn)生，是糧食和飼料中的重要污染物，常見的黃曲霉毒素BI (AFBl)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)等均有致癌、致畸、致突變等作用，因此建立微生物毒素快速準(zhǔn)確靈敏的檢測方法，日益成為食品安全領(lǐng)域的重要研宄內(nèi)容，受到社會各界的高度重視。
[0003]真菌毒素的常規(guī)檢測手段主要包括儀器分析法和酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)，其中儀器分析法因設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)無法大面積推廣使用?；诳乖贵w反應(yīng)的ELISA檢測方法操作流程相對簡單，現(xiàn)階段已成為實(shí)驗(yàn)室診斷的常規(guī)手段，但其靈敏度和穩(wěn)定性容易受到眾多因素的干擾，尤其是傳統(tǒng)基于辣根過氧化物酶(HRP)的酶催化顯色法，在定性和定量檢測時常受到酶標(biāo)試劑、顯色時間、酶催化底物信號穩(wěn)定性等諸多因素的制約，影響了結(jié)果的均一性和準(zhǔn)確性。同時酶標(biāo)法檢測靈敏度有限，無法做到痕量檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種基于量子點(diǎn)陽離子交換和信號放大技術(shù)檢測真菌毒素的方法。
[0005]為解決技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是:
[0006]提供一種基于量子點(diǎn)陽離子交換和信號放大檢測真菌毒素的方法，是利用羧基修飾的水溶性砸化鎘/硫化鋅量子點(diǎn)(CdSe/ZnS，CdSe為核心，ZnS為殼層，表面由疏水配體包裹，最后包覆一層聚合物達(dá)到水溶性狀態(tài)，經(jīng)過羧基官能團(tuán)修飾后，可與特定生物分子進(jìn)行共價偶聯(lián))對真菌毒素單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記，使量子點(diǎn)上的羧基與抗體氨基在偶聯(lián)劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)的作用下形成穩(wěn)定的形成量子點(diǎn)標(biāo)記的單克隆抗體；然后以競爭ELISA模式對真菌毒素進(jìn)行檢測，并采用陽離子交換信號放大技術(shù)對結(jié)果進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)對真菌毒素的定性檢測和定量分析。
[0007]本發(fā)明中，所述的陽離子交換信號放大技術(shù)是指:通過陽離子交換方法置換出量子點(diǎn)標(biāo)記的真菌毒素單克隆抗體中的Cd2+，利用羅丹明(Rhod-5N)對Cd2+極度敏感產(chǎn)生熒光的原理進(jìn)行信號放大，并通過全波長酶標(biāo)儀(購自美國Molecular Devices ;型號M2)對熒光信號進(jìn)行檢測。
[0008]本發(fā)明中，所述的偶聯(lián)劑是1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)。
[0009]本發(fā)明中，所述真菌毒素是赭曲霉毒素、黃曲霉毒素、伏馬毒素、嘔吐毒素或玉米赤霉稀酮等中的任意一種。
[0010]本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)原理描述:
[0011]本發(fā)明利用量子點(diǎn)成分CdSe在Ag2+存在的條件下可以和Ag2+發(fā)生陽離子交換反應(yīng)，生成更穩(wěn)定的AgSe納米晶體和Cd2+，并利用熒光染料Rhod-5N對Cd2+極其敏感的這一特性，設(shè)計了基于量子點(diǎn)陽離子交換技術(shù)的檢測真菌毒素的方法，其下限可以達(dá)到皮克水平。
[0012]本發(fā)明采用量子點(diǎn)取代常規(guī)的辣根過氧化物酶(HRP)對抗體進(jìn)行標(biāo)記，并根據(jù)量子點(diǎn)的化學(xué)成分特性，利用陽離子交換技術(shù)對最終的檢測信號進(jìn)行放大，使得檢測的靈敏度大大提高，同時避免了常規(guī)ELISA檢測過程中，上述因素對結(jié)果造成的影響，相比酶催化顯色，本方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性大大提高，并且可以對待檢樣本中的微生物毒素進(jìn)行定性和定量分析。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0014](I)本發(fā)明利用新型熒光材料量子點(diǎn)對真菌毒素單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記，開發(fā)了真菌毒素快速檢測新技術(shù)，在提高檢測靈敏度和穩(wěn)定性的同時，縮短了檢測的時間，檢測真菌毒素時僅需45min。
[0015](2)本發(fā)明對待檢的真菌毒素的檢測靈敏度可以達(dá)到皮克水平；本發(fā)明中使用的量子點(diǎn)合成方便，成本低。
[0016](3)相對于【背景技術(shù)】，本方法具有高效、快捷、靈敏度高、檢測信號穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0017]發(fā)明原理介紹:
[0018]本發(fā)明通過量子點(diǎn)標(biāo)記真菌毒素單克隆抗體，采用競爭ELISA模式對真菌毒素進(jìn)行檢測，并通過量子點(diǎn)陽離子交換和信號放大技術(shù)，最終檢測反應(yīng)后的熒光信號值，即在最終顯色時，加入含熒光探針Rhod-5N和Ag2+的底物(0.0lM pH = 7.4醋酸鹽緩沖液配置)，量子點(diǎn)成分CdSe在Ag2+存在的條件下可以和Ag2+發(fā)生陽離子交換反應(yīng)，生成更穩(wěn)定的AgSe納米晶體和Cd2+，熒光染料Rhod-5N對Cd2+濃度極其敏感，通過酶標(biāo)儀在激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為551/575的條件下測定熒光數(shù)值。通過計算(樣本孔熒光值-陰性孔熒光值)/(陽性孔熒光值-陰性孔熒光值)進(jìn)行定性判斷，若比值< 0.9，說明該樣本中含有待檢真菌毒素，判定為陽性樣本，此時可通過設(shè)置梯度稀釋的真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品與對應(yīng)的熒光比值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對樣本中真菌毒素含量進(jìn)行定量分析。
[0019]本發(fā)明中，羧基修飾的量子點(diǎn)通常使用商品化的產(chǎn)品，具體的反應(yīng)濃度依據(jù)生產(chǎn)商推薦使用濃度來確定，不同生產(chǎn)商推薦數(shù)據(jù)略有變化。羧基修飾的量子點(diǎn)在偶聯(lián)劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)的作用下與真菌毒素單克隆抗體形成共價鍵，標(biāo)記時所用的真菌毒素單克隆抗體為自制或商品化、純化后的抗體(經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色鑒定，抗體重鏈輕鏈清晰，且占總蛋白濃度的90%以上)。
[0020]以下的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員更全面的了解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。本發(fā)明中的方法，具體包括以下步驟:
[0021](I)量子點(diǎn)與真菌毒素單克隆抗體的偶聯(lián)
[0022]取純化后的真菌毒素單克隆抗體(凝膠電泳鑒定，重鏈輕鏈清晰，且占總蛋白濃度的90%以上)，溶解于0.01M, pH = 7.4的磷酸鹽緩沖液中(PBS);取50 μ I濃度為8 μΜ的羧基修飾的量子點(diǎn)置于2ml EP管中，加入300 μ g待標(biāo)記的真菌毒素單克隆抗體，使反應(yīng)總體系為400 μ I ;加入抗體后若體積不足，則用1mM的硼酸鹽緩沖液補(bǔ)齊；持續(xù)混勻反應(yīng)5min后，加入15 μ I濃度為10mg/ml的偶聯(lián)劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC);室溫震蕩反應(yīng)2h后，離心去除反應(yīng)過程中產(chǎn)生的團(tuán)聚物，上清液經(jīng)超濾管(購自Millipore，貨號UFC503096)濃縮后，用尺寸排阻色譜柱純化；色譜柱填料為SuperdexG200 (購自GE公司，貨號為17-1043-10)，純化后的量子點(diǎn)標(biāo)記的真菌毒素單克隆抗體保存于4°C冰箱，備用；
[0023](2)最佳檢測條件的確定
[0024]采取競爭ELISA檢測模式，即包被真菌類毒素偶聯(lián)抗原，待檢樣本與量子點(diǎn)標(biāo)記的真菌毒素單克隆抗體等體積混勻后加入孔中，37°C恒溫培養(yǎng)箱作用45min，洗去非特異性結(jié)合；通過陽離子交換和信號放大技術(shù)，并使用全波長酶標(biāo)儀對最終的熒光信號進(jìn)行檢測；
[0025]競爭ELISA的最佳檢測條件主要包括抗原最佳包被與量子點(diǎn)標(biāo)記單克隆抗體的最佳使用濃度，該條件可通過棋盤法來確定:以pH = 9.5的碳酸鹽緩沖液梯度稀釋真菌毒素偶聯(lián)抗原，包被于白色不透明96孔板，洗滌封閉后，加入梯度稀釋的量子點(diǎn)標(biāo)記的真菌毒素單克隆抗體，與梯度包被的偶聯(lián)抗原在37°C恒溫培養(yǎng)箱中避光條件下交叉作用45min后，洗滌后置于吸水紙上扣干，加入200 μ I顯色液；顯色液以pH = 7.4的0.0lM醋酸鹽緩沖液配置，分別含 5 μ M/L Rod-5N(購自 life technologies，貨號 R-1420)和 300 yM/LAg2+(AgNO3,國藥集團(tuán)，貨號10018461);室溫放置5min后，全波長酶標(biāo)儀在激發(fā)波長與發(fā)射波長分別為551/575的條件下讀取熒光數(shù)值；
[0026]選取不同熒光值所對應(yīng)的抗原包被與量子點(diǎn)標(biāo)記抗體作用濃度，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，即白色不透明96孔板包被毒素偶聯(lián)抗原，洗滌封閉后，取50 μ I梯度稀釋的真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品與50 μ I稀釋后的量子點(diǎn)標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行預(yù)混后加入孔中，37°C培養(yǎng)箱避光作用45min，并同時設(shè)置陰性與陽性對照(陰性對照:50 μ I真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液與50 μ I量子點(diǎn)標(biāo)記的真菌毒素單克隆抗體稀釋液混勻后加入反應(yīng)孔；陽性對照:50 μ I真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液與50 μ I量子點(diǎn)標(biāo)記的真菌毒素單克隆抗體混勻后加入反應(yīng)孔中)，作用后洗滌并置于吸水紙上扣干，加入200 μ I顯色液，室溫放置5min后，全波長酶標(biāo)儀在激發(fā)波長與發(fā)射波長分別為551/575的條件下讀取熒光數(shù)值，以真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的熒光比值(標(biāo)準(zhǔn)品孔熒光值-陰性孔熒光值)/(陽性孔熒光值-陰性孔熒光值)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，對所得的若干標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析，分別計算半數(shù)抑制率即熒光比值為0.5(IC5(i)所對應(yīng)的真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度，選取最低值所對應(yīng)的抗原包被與量子點(diǎn)標(biāo)記單克隆抗體作用濃度作為檢測時的最佳濃度；
[0027](3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與實(shí)際樣本的檢測
[0028]將偶聯(lián)抗原用pH = 9.5的碳酸鹽緩沖液稀釋到確定的最佳包被濃度，加入到96孔板中，100 μ I/孔，4°C放置過夜，洗滌封閉后，分別取50 μ I的待檢樣品、梯度稀釋的真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品與50 μ I最佳濃度的量子點(diǎn)標(biāo)記單克隆抗體預(yù)混，然后加入孔中37°C培養(yǎng)箱避光作用45min，洗滌并置于吸水紙上扣干，加入200 μ I顯色液；室溫作用5min后以全波長酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光檢測，激光波長發(fā)射波長分別為551nm和575nm ;將得到的梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的熒光比值擬合成標(biāo)準(zhǔn)曲線即以真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的熒光比值(標(biāo)準(zhǔn)品孔熒光值-陰性孔熒光值)/(陽性孔熒光值-陰性孔熒光值)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，對待檢樣品中是否含有目標(biāo)真菌毒素進(jìn)行判定；若比值>0.9即抑制率< 10%，判定為陰性；如比值彡0.9即抑制率> 10%，判定為陽性；若為陽性，則根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣本中真菌毒素含量進(jìn)行定量分析。
[0029]本發(fā)明中，所述待檢測的真菌毒素是黃曲霉毒素BI (AFBl)、赭曲霉毒素A(OTA)、伏馬毒素(FBI)、嘔吐毒素(D0N)、玉米赤霉烯酮(ZEN)等中的任意一種。
[0030]以下的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員更全面的了解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0031]實(shí)施例:采用競爭ELISA對赭曲霉毒素OTA的進(jìn)行快速檢測
[0032]以赭曲霉OTA單克隆抗體和量子點(diǎn)(羧基修飾的水溶性量子點(diǎn)