卵巢惡性腫瘤標志物檢測試劑盒及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術中體外診斷試劑領域，涉及一種卵巢惡性腫瘤標志物檢測試劑盒的組成、制備方法及其應用，適用于卵巢上皮性惡性腫瘤的診斷預防和治療后監(jiān)測。
【背景技術】
[0002]卵巢上皮性惡性腫瘤是女性生殖器常見的三大惡性腫瘤之一，死亡率居婦科惡性腫瘤之首。卵巢上皮性惡性腫瘤的早期診斷對于降低死亡率具有重要意義。CA125是卵巢腫瘤細胞表面腫瘤相關抗原。微柱凝膠檢測方法目前已廣泛用于ABO血型、血清中不規(guī)則抗體的檢測以及其在交叉配血中，但在卵巢上皮性惡性腫瘤標記物的檢測中尚未見相關研宄報道。目前已存在的卵巢上皮性惡性腫瘤檢測技術有:ELISA法、化學發(fā)光免疫分析法、放射免疫分析技術、質(zhì)譜技術、高密度陣列雜交技術等，而這些試驗的操作程序復雜，需要時間長，并且所需設備儀器昂貴，因此檢測并不方便。而微柱凝膠免疫檢測技術廣泛應用于血型臨床檢查，而該技術在卵巢上皮性惡性腫瘤標記物檢測中應用尚未報道。微柱凝膠技術具有所需標本量少、無須洗滌、結果穩(wěn)定、易于判讀等優(yōu)點，有望成為卵巢惡性腫瘤標志物檢測的常規(guī)篩查技術，由于不需要大型儀器，且操作簡單，價格便宜，適合中小醫(yī)院及社區(qū)、鄉(xiāng)鎮(zhèn)醫(yī)院開展，為我們卵巢惡性腫瘤標志物前期篩查提供便利。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術之不足，提供一種靈敏度高、特異性好、操作簡單、價格便宜且質(zhì)量穩(wěn)定的卵巢惡性腫瘤標志物檢測試劑盒及其制備方法。
[0004]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:
一種卵巢惡性腫瘤標志物檢測試劑盒及其制備方法，所述試劑盒包括微柱凝膠卡、指示紅細胞，所述微柱凝膠卡上有多個微柱管，每個微柱管中均含有聚丙烯酰胺或葡聚糖凝膠顆粒；所述指示紅細胞是結合卵巢惡性腫瘤標志物的正常O型Rh陰性紅細胞或O型醛化紅細胞。
[0005]所述試劑盒的制備包括以下步驟:
一、微柱凝膠卡的制備
步驟一、凝膠懸浮介質(zhì)的配制
所述凝膠懸浮介質(zhì)配方如下:對羥基苯甲酸甲酯(5.0-6.5) XlO^4g / mL、對羥基苯甲酸丙醋(1.2~1.5) X 10_4g / mL、甘氨酸(1.6~1.9) X 10_2g / mL、氯化鈉(1.6-1.8)X 1^3g / mL、磷酸二氫鉀(2.0-2.4)X 1^4g / mL、磷酸氫二鈉(4.5~4.8)X l(T4g /mL,以上試劑混合后用蒸飽水溶解，調(diào)pH值為6.6-6.8 ；
步驟二、凝膠的制備
選用大小為30~60nm的聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠顆粒與步驟一配制的凝膠懸浮介質(zhì)按照體積比2:1~6:1的比例混合后配制成凝膠；
步驟三、分裝將步驟二配制的凝膠按照每管20~30 μ L的量，分別加入到微柱凝膠卡的微柱管中；
二、指示紅細胞的配制步驟一、紅細胞醛化
O紅細胞洗滌:將O型紅細胞在離心機3000rpm下離心lmin，然后棄上清，用0.9%的生理鹽水洗滌6~8次后配制成5%紅細胞；
2)醛化處理:在I)所得的5%紅細胞和2.5%戊二醛按照體積比5:1~2:1進行混合；
3)洗滌:將2)醛化后的紅細胞2500rpm離心2.5 min，用0.9%的生理鹽水溶液洗滌5~6 次；
4)保存:用0.9%生理鹽水溶液把紅細胞濃度調(diào)成20%，然后在4°C下進行儲存，有效期二年；
步驟二、抗CA125致敏醛化紅細胞的制備
1)配制:配制pH為6.6-7.5的磷酸鹽緩沖液(PBS)；
2)洗滌:取上述步驟一所得醛化后的紅細胞0.5 mL，用生理鹽水洗滌2~4次，PBS洗滌I次，在3000rpm下離心3 min后棄上清液，將得到的紅細胞懸浮于2mL PBS中；
3)酸化:加入2mL37° C 的 PBS/5mgTCA ；37° C 水浴振蕩 15 min ；
4)洗滌:生理鹽水洗滌I次，PBS洗滌I次后懸浮于2mLPBS中；
5)標記:加入2mL抗CA125溶液;37。C下水浴振蕩60min ；
6)快速用生理鹽水洗滌5次，PBS洗滌I次，用PBS保存?zhèn)溆谩?br>[0006]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明卵巢惡性腫瘤標志物檢測試劑盒靈敏度高，特異性好，質(zhì)量穩(wěn)定，檢測過程耗時短，方法簡便易行，結果易于判定，可同時對大量樣本進行檢測，易于自動化，能夠使卵巢上皮性惡性腫瘤檢測技術成為臨床常規(guī)檢測項目。
【具體實施方式】
[0007]本發(fā)明卵巢惡性腫瘤標志物檢測試劑盒主要包括:微柱凝膠卡、指示紅細胞，所述微柱凝膠卡上有多個微柱管，每個微柱管中含有聚丙烯酰胺或葡聚糖凝膠顆粒；所述指示紅細胞是結合卵巢惡性腫瘤標志物的正常O型Rh陰性紅細胞或O型醛化紅細胞；
卵巢惡性腫瘤標志物檢測試劑盒的制備方法如下:
一、微柱凝膠卡的制備步驟一、凝膠懸浮介質(zhì)的配制
所述凝膠懸浮介質(zhì)配方如下:對羥基苯甲酸甲酯(5.0-6.5) XlO^4g / mL、對羥基苯甲酸丙醋(1.2~1.5) X 10_4g / mL、甘氨酸(1.6~1.9) X 10_2g / mL、氯化鈉(1.6-1.8)X 1^3g / mL、磷酸二氫鉀(2.0-2.4)X 1^4g / mL、磷酸氫二鈉(4.5~4.8)X l(T4g /mL,以上試劑混合后用蒸飽水溶解，調(diào)pH值為6.6-6.8 ；
步驟二、凝膠的制備
選用大小為30~60nm的聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠顆粒與步驟一配制的凝膠懸浮介質(zhì)按照體積比2:1?6:1的比例混合后配制成凝膠；
步驟三、分裝
將步驟二配制的凝膠按照每管20~30 μ L的量，分別加入到微柱凝膠卡的微柱管中； 二、指示紅細胞的配制
步驟一、紅細胞醛化
1)紅細胞洗滌:將O型紅細胞在離心機3000rpm下離心lmin，然后棄上清，用0.9%的生理鹽水洗滌6-8次后配制成5%紅細胞；
2)醛化處理:在I)所得的5%紅細胞和2.5%戊二醛按照體積比5:1~2:1進行混合；
3)洗滌:將2)醛化后的紅細胞2500rpm離心2.5 min,用0.9%的生理鹽水溶液洗滌5~6 次；
4)保存:用0.9%生理鹽水溶液把紅細胞濃度調(diào)成20%，然后在4°C下進行儲存，有效期二年；
步驟二、抗CA125致敏醛化紅細胞的制備
1)配制:配制pH為6.6-7.5的磷酸鹽緩沖液(PBS)；
2)洗滌:取上述步驟一所得醛化后的紅細胞0.5 mL，用生理鹽水洗滌2~4次，PBS洗滌I次，在3000rpm下離心3 min后棄上清液，將得到的紅細胞懸浮于2mL PBS中；
3)酸化:加入2mL37° C 的 PBS/5mgTCA ；37° C 水浴振蕩 15 min ；
4)洗滌:生理鹽水洗滌I次，PBS洗滌I次后懸浮于2mLPBS中；
5)標記:加入2mL抗CA125溶液;37。C下水浴振蕩60min ；
6)快速用生理鹽水洗滌5次，PBS洗滌I次，用PBS保存?zhèn)溆谩?br>[0008]三、卵巢惡性腫瘤標志物檢測試劑盒的使用
1)將抗CA125致敏的醛化紅細胞50μ L與病人的血清25 μ L加入到微柱管中，于37°C下反應10~15min ；
2)將微柱凝膠卡在專用離心機離心，900rpm下離心2min，1500rpm下離心3min，取出后肉眼判定結果，并作記錄；
3)結果判定標準:當血清中有被檢物質(zhì)時，抗原抗體反應時，凝集的紅細胞在離心力的作用下不能通過凝膠而留在凝膠上層或游離在凝膠中，呈現(xiàn)陽性反應；而當血清中沒有被檢物質(zhì)時，抗原抗體沒有反應時，未凝集的紅細胞在離心力的作用下可通過凝膠而沉積在微柱凝膠管的底部，呈現(xiàn)陰性反應。
[0009]本發(fā)明卵巢惡性腫瘤標志物檢測試劑盒可以具有優(yōu)良的特異性、靈敏度以及長達I年的保存期，是在于整個體系中各種成分的協(xié)同作用:微柱凝膠卡上排列有多個微柱管可以完成多次檢測；緩沖體系可以維持微柱凝膠卡反應體系需要的PH ;低鹽濃度體系可以保證凝膠顆粒得到充分溶脹且凝膠顆粒直徑在所需要的范圍內(nèi)；潤滑體系可以保證凝膠顆粒之間適當?shù)臐櫥芰Γ货ヮ惙栏瘎┛梢苑乐鼓z或抗體因為細菌繁殖而失效；丙烯?；哪z可以保證凝膠顆粒之間合適的間隙。
【主權項】
1.一種卵巢惡性腫瘤標志物檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于:所述試劑盒包括微柱凝膠卡、指示紅細胞，所述微柱凝膠卡上有多個微柱管，每個微柱管中均包括若干個聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠顆粒；所述指示紅細胞是結合卵巢惡性腫瘤標志物的正常O型Rh陰性紅細胞或O型醛化紅細胞； 所述試劑盒的制備包括以下步驟: 一、微柱凝膠卡的制備 步驟一、凝膠懸浮介質(zhì)的配制 所述凝膠懸浮介質(zhì)配方如下:對羥基苯甲酸甲酯(5.0-6.5) XlO^4g / mL、對羥基苯甲酸丙醋(1.2~1.5) X 10_4g / mL、甘氨酸(1.6~1.9) X 10_2g / mL、氯化鈉(1.6-1.8)X 1^3g / mL、磷酸二氫鉀(2.0-2.4)X 1^4g / mL、磷酸氫二鈉(4.5~4.8)X l(T4g /mL,以上試劑混合后用蒸飽水溶解，調(diào)pH值為6.6-6.8 ； 步驟二、凝膠的制備 選用大小為30~60nm的聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠顆粒與步驟一配制的凝膠懸浮介質(zhì)按照體積比2:1?6:1的比例混合后配制成凝膠；步驟三、分裝 將步驟二配制的凝膠按照每管20~30 μ L的量，分別加入到微柱凝膠卡的微柱管中； 二、指示紅細胞的配制 步驟一、紅細胞醛化 O紅細胞洗滌:將O型紅細胞在離心機3000rpm下離心lmin，然后棄上清，用0.9%的生理鹽水洗滌6~8次后配制成5%紅細胞； 2)醛化處理:在I)所得的5%紅細胞和2.5%戊二醛按照體積比5:1~2:1進行混合； 3)洗滌:將2)醛化后的紅細胞2500rpm離心2.5 min,用0.9%的生理鹽水溶液洗滌5~6 次； 4)保存:用0.9%生理鹽水溶液把紅細胞濃度調(diào)成20%，然后在4°C下進行儲存，有效期二年； 步驟二、抗CA125致敏醛化紅細胞的制備 1)配制:配制pH為6.6-7.5的磷酸鹽緩沖液(PBS)； 2)洗滌:取上述步驟一所得醛化后的紅細胞0.5 mL，用生理鹽水洗滌2~4次，PBS洗滌I次，在3000rpm下離心3 min后棄上清液，將得到的紅細胞懸浮于2mL PBS中； 3)酸化:加入2mL37° C 的 PBS/5mgTCA ；37° C 水浴振蕩 15 min ； 4)洗滌:生理鹽水洗滌I次，PBS洗滌I次后懸浮于2mLPBS中； 5)標記:加入2mL抗CA125溶液;37。C下水浴振蕩60min ； 6)快速用生理鹽水洗滌5次，PBS洗滌I次，用PBS保存?zhèn)溆谩?br>【專利摘要】本發(fā)明涉及一種卵巢惡性腫瘤標志物檢測試劑盒及其制備方法，所述試劑盒包括微柱凝膠卡、指示紅細胞，其制備方法包括微柱凝膠卡的制備和指示紅細胞的制備。本發(fā)明卵巢惡性腫瘤標志物檢測試劑盒靈敏度高，特異性好，質(zhì)量穩(wěn)定，檢測過程耗時短，方法簡便易行，結果易于判定，可同時對大量樣本進行檢測，易于自動化，能夠使卵巢上皮性惡性腫瘤檢測成為臨床常規(guī)檢測項目。
【IPC分類】G01N33/531, G01N33/574
【公開號】CN104991064
【申請?zhí)枴緾N201510361775
【發(fā)明人】王布強, 徐丹
【申請人】江陰金悅達生物技術有限公司
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2015年6月27日