專利名稱：P53結(jié)合多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽或其部分，其能夠抑制腫瘤抑制蛋白p53的細(xì)胞凋亡活性；還涉及鑒定干擾所述多肽活性的試劑的篩選方法及具有所述活性的試劑。
細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡是多細(xì)胞器官通過其來調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量和分化的過程。此過程由誘導(dǎo)或防止細(xì)胞凋亡的因子來調(diào)控。細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)劑包括Bcl-2家族成員、caspase(半胱天冬氨酸蛋白酶)家族成員及它們的相關(guān)因子Apaf-1與Fadd。Caspase酶作為蛋白酶來合成，其在蛋白酶水解后活化。該活化的caspase酶隨后可誘導(dǎo)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的多種形態(tài)學(xué)與生物化學(xué)變化。線粒體通過釋放諸如細(xì)胞色素c、AIF及Diablo的前凋亡因子在活化過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。Bcl-2家族蛋白可控制上述從線粒體中的釋放；(例如Bcl-2與Bcl-x1抑制釋放；Bax與Bak誘導(dǎo)釋放)。
公開號為WO9953051的專利申請公開了具有促凋亡活性的細(xì)胞因子依賴蛋白p21。p21以細(xì)胞因子依賴的方式在髓樣/網(wǎng)織紅細(xì)胞中表達(dá)。這些細(xì)胞依賴IL-3生長，在沒有IL-3存在時，該p21的翻譯被誘導(dǎo)并引起細(xì)胞凋亡與細(xì)胞死亡。p21為細(xì)胞漿蛋白其移位至線粒體外膜來誘導(dǎo)促細(xì)胞凋亡活性。
腫瘤抑制蛋白同樣具有促凋亡活性腫瘤抑制基因編碼具有抑制細(xì)胞生長或分化功能的蛋白，因此對維持正常細(xì)胞的增殖、生長或分裂具有重要的作用。腫瘤抑制基因的突變可導(dǎo)致異常的細(xì)胞周期進(jìn)程，其中當(dāng)例如DNA損傷時，阻滯細(xì)胞周期的正常細(xì)胞周期控制點會被忽略并且損傷的細(xì)胞會不受控制地分裂。腫瘤抑制基因產(chǎn)物在細(xì)胞的所有部分(例如，細(xì)胞表面、細(xì)胞漿、細(xì)胞核)行使功能來防止損傷的細(xì)胞通過該細(xì)胞周期(即，G1，S，G2，M及細(xì)胞分裂)來傳代。
可論證地，目前該腫瘤抑制基因的研究熱點為p53。p53編碼作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用的蛋白并是細(xì)胞分裂周期的關(guān)鍵調(diào)控因子。1978年其作為與SV40巨大T細(xì)胞抗原親和結(jié)合的蛋白被發(fā)現(xiàn)。該p53基因編碼分子量為53kDa的393氨基酸多肽。受p53轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)的基因在其5′區(qū)包括p53識別序列。由于例如DNA損傷，該細(xì)胞的p53水平會升高，此時這些基因被活化。對p53有回應(yīng)的基因例子包括，mdm2、Bax及PIG-3。Bax與PIG-3參與了p53最重要的功能之一，細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用在我們未授權(quán)共同申請WO02/12325中，我們公開了稱為ASPP的蛋白家族，其可作為p53的特異活化劑，并且揭示了野生型p53在諸如人乳腺癌的腫瘤中被耐受的機(jī)制。我們還公開了稱為iASPP的ASPP家族成員抑制劑。iASPP為致癌基因并且是該ASPP家族中最保守的成員。iASPP是在C.elegans(線蟲的一種)中發(fā)現(xiàn)的唯一的ASPP樣蛋白。與人iASPP相似，C.elegans iASPP同樣可作為p53的關(guān)鍵性抑制劑。這些發(fā)現(xiàn)表明ASPP家族成員對p53功能的調(diào)節(jié)作用在多種屬間的進(jìn)化保守性。
C.elegans的iASPP在所有對人類細(xì)胞的分析中都能夠替代人iASPP。而且，相互替代研究表明，C.elegans p53的凋亡功能可分別被人的ASPP和iASPP增強或抑制。使用RNAi技術(shù)我們進(jìn)一步證明，iASPP為C.elegans中p53介導(dǎo)的凋亡的關(guān)鍵性抑制劑。所有的發(fā)現(xiàn)顯示，ASPP家族成員對p53的調(diào)節(jié)作用是進(jìn)化保守的。p53活性的控制在發(fā)育與腫瘤的發(fā)生中起著關(guān)鍵性作用。因此，抑制iASPP的致癌基因功能可提供治療表達(dá)野生型p53的腫瘤的重要的新策略。C.elegans與人iASPP的序列比較顯示在線蟲與人序列間具有保守區(qū)域，其似乎可解釋兩者蛋白間的功能保守性。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供編碼多肽或其序列變體的分離的核酸分子，其中所述的多肽是

圖1a或1b中所示多肽序列的片段，該片段選自i)由源自圖1a或1b中所示氨基酸序列中的約第128-224殘基的氨基酸殘基構(gòu)成的多肽片段；ii) 由源自圖1a或1b中所示氨基酸序列中的約第128-224殘基的氨基酸殘基構(gòu)成的多肽片段，其中所述的序列通過至少一個氨基酸殘基的添加、刪除或替代來修飾；及iii) 由(i)與(ii)定義的多肽，其中所述多肽基本上保留了圖1a或1b中所示多肽的生物活性。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述的核酸分子編碼由源自圖1a中所示序列的約第128-224氨基酸殘基構(gòu)成的多肽片段。優(yōu)選所述的核酸分子從人類中分離。
在本發(fā)明的可選擇的優(yōu)選實施方案中，所述的核酸分子編碼由源自圖1b中所示序列的約第128-224氨基酸殘基構(gòu)成的多肽片段。優(yōu)選所述的核酸分子從線蟲中分離。優(yōu)選所述的線蟲屬于新小桿線蟲種屬(Caenorhabditis spp)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述的核酸分子編碼多肽或其序列變體，該多肽可抑制圖1a或1b中所示氨基酸序列代表的多肽的活性。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述的核酸分子為cDNA。
在本發(fā)明的可選擇的優(yōu)選實施方案中，所述的核酸分子為基因組DNA。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，其提供本發(fā)明所述核酸編碼的多肽片段或其序列的變體。
顯而易見，該序列變體片段可保留該全長多肽的生物活性或者可選擇地具有競爭p53上結(jié)合位點的拮抗劑活性。通常，本發(fā)明所述的針對結(jié)合于p53的該多肽的特異性由結(jié)合平衡常數(shù)(binding equilibriumconstants)來表示。具有選擇性結(jié)合p53能力的多肽優(yōu)選具有至少約為107M-1的結(jié)合平衡常數(shù)，更優(yōu)選具有至少約為108M-1的結(jié)合平衡常數(shù)，最優(yōu)選具有至少約為109M-1的結(jié)合平衡常數(shù)。
序列變體，即片段多肽與參考多肽間可能有一個或更多個取代、添加、缺失、斷裂的氨基酸序列的不同，這些不同可以各種組合形式出現(xiàn)。優(yōu)選的變體是那些以保守氨基酸取代而不同于參考多肽的變體。這種取代是通過具有相似特性的另一種氨基酸來取代設(shè)定的氨基酸。下列非限制性列出的氨基酸為可考慮的保守替換(相似)a)丙氨酸、絲氨酸與蘇氨酸；b)谷氨酸與天冬氨酸；c)天冬酰胺與谷胺酰胺；d)精氨酸與賴氨酸；e)異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸與纈氨酸；及f)苯丙氨酸、酪氨酸與色氨酸。
本發(fā)明中的功能性等價物多肽是一種變體，其中一個或多個氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基取代，或者其中一個或多個氨基酸殘基包括取代基團(tuán)。保守取代是以脂肪氨基酸Ala、Val、Leu及Ile中的一種替換另一種；羥基殘基Ser與Thr間的相互交換；酸性殘基Asp與Glu間的交換；氨基殘基Asn與Gln間的替代；堿性殘基Lys與Arg間的交換；及芳香殘基Phe與Tyr間的交換。
此外，本發(fā)明還涉及與本文所述多肽序列、或其片段和功能性等價物多肽具有至少75％同一性的多肽序列。在一個實施方案中，該多肽與本文所示的氨基酸序列具有至少85％同一性，更優(yōu)選具有至少90％同一性，進(jìn)一步更優(yōu)選具有至少95％同一性，尤其更優(yōu)選具有至少97％同一性，及最優(yōu)選具有至少99％同一性。
如上所述，本發(fā)明的實施方案中還提供源自本文所述多肽的“顯性負(fù)性(dominant negative)”多肽。顯性負(fù)性多肽是蛋白的非活性變體，其通過與細(xì)胞器相互作用，從其相互作用的細(xì)胞器中替代活性蛋白或與該活性蛋白競爭，由此降低該活性蛋白的作用。例如，顯性負(fù)性受體，其可與配基結(jié)合但不傳遞結(jié)合該配基所產(chǎn)生的信號從而降低該配基表達(dá)的生物作用。同樣地，顯性負(fù)性催化非活性激酶，其可與靶蛋白正常地相互作用，但不磷酸化該靶蛋白，從而降低對細(xì)胞信號反應(yīng)的該靶蛋白的磷酸化。相似地，顯性負(fù)性轉(zhuǎn)錄因子，其可與另一種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合或與基因控制區(qū)域的啟動子位點結(jié)合但不促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄，從而通過占據(jù)啟動子結(jié)合位點而不促進(jìn)轉(zhuǎn)錄來降低正常轉(zhuǎn)錄因子的作用。
細(xì)胞中顯性負(fù)性多肽表達(dá)的最終結(jié)果是活性蛋白功能的降低。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可評價出蛋白顯性負(fù)性變體的潛在可能，并使用常用的突變產(chǎn)生技術(shù)來產(chǎn)生一種或多種顯性負(fù)性變體多肽。例如，給出本文所教導(dǎo)的iASPP多肽，本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可通過特定位點突變、掃描突變、部分基因缺失或斷裂及其它類似方法可修飾該iASPP多肽序列。可參見例如美國專利第5,580,723號及Sambrook等人的Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員隨后可對該突變多肽種群的所選活性的降低(例如，p53結(jié)合、凋亡的調(diào)節(jié))和/或這種活性的保持進(jìn)行檢測。其它產(chǎn)生和檢測顯性負(fù)性蛋白變體的方法對本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員是顯而易見的。
本發(fā)明的另一方面是提供含有本發(fā)明的核酸的載體。
在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的方法中，所述的載體是為基因表達(dá)而進(jìn)行常規(guī)適應(yīng)性改造后的表達(dá)載體。
通常所述的適應(yīng)性改造包括，例如但不限于，介導(dǎo)細(xì)胞/組織特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列(啟動子序列)的制定。這些啟動子序列可以是細(xì)胞/組織特異的、誘導(dǎo)的或組成型的。
啟動子是本領(lǐng)域公認(rèn)的術(shù)語，其包括(為澄清目的)例如但不限于下列特征。增強子元件是順式作用核酸序列，經(jīng)常出現(xiàn)在基因轉(zhuǎn)錄起始位點的5’區(qū)(增強子還可出現(xiàn)在基因序列的3’區(qū)或甚至位于內(nèi)含子序列中，因此其位置是獨立的)。增強子具有提高該增強子連接的基因的轉(zhuǎn)錄效率的作用。增強子的活性是對應(yīng)于反式作用轉(zhuǎn)錄因子(多肽)的，該因子能夠特異結(jié)合于增強子元件。這種轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合/活性(參見EukaryoticTranscription Factors，by David S Latchman，Academic Press Ltd，San Diego)是針對一些環(huán)境因素的反應(yīng)，該因素包括例如但不限于，中間代謝產(chǎn)物(例如，葡萄糖，脂質(zhì))，環(huán)境作用因子(例如，光，熱)。
啟動子元件還包括所謂的TATA框及RNA聚合酶起始選擇(RIS)序列，其具有選擇轉(zhuǎn)錄起始位點的功能。這些序列還可結(jié)合具有促進(jìn)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄起始選擇的功能的多肽。
適應(yīng)性改造還包括選擇性標(biāo)記與自我復(fù)制序列的制定，其均可促進(jìn)所述載體在真核細(xì)胞或原核宿主中的維持。自我維持的載體稱為游離載體(episomal vectors)。因這些分子可結(jié)合較大DNA片段(30-50kb DNA)，因而游離載體是所需要的。這種游離載體如國際公開WO98/07876中所述。
可促進(jìn)載體編碼的基因的表達(dá)的適應(yīng)性改造包括轉(zhuǎn)錄終止/多聚腺苷酸化(polyadenylation)序列的制定。這還包括內(nèi)在核糖體插入位點(IRES)的制定，其具有最大化安排在雙順反子或多順反子表達(dá)級聯(lián)反應(yīng)中的載體編碼的基因的表達(dá)。
表達(dá)控制序列還包括所謂的位點控制區(qū)域(LCRs)。這些表現(xiàn)出位置獨立性的調(diào)控元件，當(dāng)在小鼠中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因構(gòu)建分析時可將數(shù)量依賴的表達(dá)復(fù)制到所連接的基因。LCRs包括將轉(zhuǎn)基因從相鄰異染色質(zhì)的沉默作用隔離的調(diào)控元件，參見Grosveld et al.，Cell(1987)，51975-985。
這些適應(yīng)性改造是本領(lǐng)域所公知的。目前有許多關(guān)于通常表達(dá)載體構(gòu)建及重組DNA技術(shù)的出版文獻(xiàn)。請參見Sambrook et al(1989)MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，ColdSpring Harbour，NY及其參考文獻(xiàn)；Marston，F(xiàn)(1987)DNA CloningTechniquesA Practical Approach Vol III IRL Press，Oxford UK；DNACloningF M Ausubel et al，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，Inc.(1994)。
本發(fā)明的另一方面還提供使用本發(fā)明的核酸或載體來轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
優(yōu)選地，所述的宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，例如使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(baculovirus expression system)的來自秋粘蟲(Spodoptera frugiperda)種屬的昆蟲細(xì)胞。此種表達(dá)系統(tǒng)較適合于例如其中該多肽需要進(jìn)行翻譯后修飾的情況。宿主細(xì)胞和細(xì)胞株可以是原核的(例如E.coli)或真核的(例如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、酵母表達(dá)系統(tǒng)及昆蟲細(xì)胞中的重組桿狀病毒表達(dá))。優(yōu)選使用諸如人、小鼠、倉鼠、豬、山羊、靈長類動物等哺乳動物的細(xì)胞。它們可以是較寬范圍的各種組織細(xì)胞類型，并包括原代細(xì)胞和細(xì)胞株。具體的實施例包括角化細(xì)胞、外周血白血病、成纖維細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞及胚胎干細(xì)胞。這些表達(dá)載體要求該相關(guān)序列即上述那些核酸可操作地連接到啟動子上。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供本發(fā)明的多肽作為藥物的用途。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供本發(fā)明的核酸作為藥物的用途。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述的藥物進(jìn)一步包括稀釋劑、載體或賦形劑。
當(dāng)給藥時，本發(fā)明的治療性組合物能以藥物可接受的制劑形式來給藥。此制劑可常規(guī)含有藥物可接受含量的鹽、緩沖成分、防腐劑、適宜的載體、諸如佐劑與細(xì)胞因子的輔助免疫加強試劑及可選擇地其它治療試劑，例如化療試劑。
本發(fā)明的治療可通過常規(guī)途徑給予，包括注射或隨時間逐步灌輸。該給藥可例如是口服、靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、腔內(nèi)、皮下或透皮的。當(dāng)使用抗體進(jìn)行治療時，優(yōu)選的給藥途徑為通過肺氣霧劑給藥。制備含抗體的氣霧劑給藥系統(tǒng)的技術(shù)是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的。通常，此系統(tǒng)應(yīng)使用不顯著減弱諸如抗體決定簇結(jié)合能力的抗體生物特性的成分(參見例如，Sciarra and Cutie，“Aerosols，”inRemington′s PharmaceuticalSciences，18th edition，1990，pp 1694-1712；在此引用作為參考)。本領(lǐng)域所述技術(shù)人員無需進(jìn)行不必要的試驗就可確定制備抗體氣霧劑的各種參數(shù)和條件。當(dāng)使用本發(fā)明的反義制劑時，優(yōu)選緩慢的靜脈內(nèi)給藥。
本發(fā)明的組合物以有效劑量給藥?！坝行┝俊笔侵附M合物單獨或與其它制劑一起使用而達(dá)到所希望的治療效果時的量。在治療諸如癌癥的特定疾病的情況下，所希望的治療效果是抑制該疾病的進(jìn)程。該效果可能包括僅僅臨時性地減慢該疾病的進(jìn)程，雖然更優(yōu)選其永久性地阻斷該疾病的進(jìn)程。其可通過常規(guī)的方法來監(jiān)測或根據(jù)本發(fā)明所述的診斷方法來監(jiān)測。
此劑量依賴于所治療的特定疾病狀態(tài)、該疾病狀態(tài)的嚴(yán)重程度、該個體患者的各項參數(shù)，包括年齡、身體狀況、身高與體重、治療的時間、協(xié)同治療(如果有)的特性、特定的給藥途徑及健康從業(yè)者知識與經(jīng)驗范圍內(nèi)的其它因素來決定。這些因素是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員所公知的并可通過常規(guī)試驗得出。通常，優(yōu)選單獨使用該成分的最大劑量或使用其組合物的最大劑量，該劑量是根據(jù)合理的醫(yī)學(xué)判斷得出的最大安全劑量。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員應(yīng)理解，由于醫(yī)學(xué)原因、心理原因或其它各種實際的原因?qū)е禄颊呖蓤猿质褂幂^低劑量或耐受劑量。
為了采用適合對患者給藥的單位重量或體積能產(chǎn)生所希望的治療效果，上述方法中使用的該藥物組合物優(yōu)選是無菌的并含有有效劑量的顯性負(fù)性iASPP或編碼顯性負(fù)性iASPP的核酸。該治療效果的測量可以通過例如測定被該顯性負(fù)性iASPP-1組合物通過上述的受體系統(tǒng)抑制的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、測量諸如基因表達(dá)的下游作用、或測量該iASPP組合物的生理作用例如腫瘤衰退、疾病癥狀的減少、凋亡的調(diào)節(jié)等等來進(jìn)行。
根據(jù)不同的參數(shù)，特別是根據(jù)給藥的形式和該個體的狀態(tài)，來選擇給予該個體的顯性負(fù)性iASPP多肽或核酸的劑量。其它因素包括所需治療期限。在個體對初始應(yīng)用劑量的治療反應(yīng)不充分的情況下，可使用患者耐受允許范圍內(nèi)的更高的劑量(或通過不同的、更局限的給藥途徑使用有效的更高劑量)。
通常，根據(jù)本領(lǐng)域的任何標(biāo)準(zhǔn)步驟，顯性負(fù)性iASPP的劑量以1ng～約500mg、及10ng～100mg組方和給藥。當(dāng)使用編碼顯性負(fù)性iASPP的核酸時，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的步驟通常組方和給予1ng～0.1mg的劑量。其它iASPP組合物的給藥方案是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的，其中劑量、注射時間表、注射位點、給藥方式(例如腫瘤內(nèi))等等可從上述方案中變換得到。對非人的哺乳動物給予iASPP組合物可以在與上述基本相同的條件下進(jìn)行，如為了試驗?zāi)康幕驅(qū)游镞M(jìn)行治療的目的。。本文所述的個體為哺乳動物(優(yōu)選人)，包括非人的靈長類動物、牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓或嚙齒動物。
當(dāng)給藥時，本發(fā)明的藥物制劑以藥物可接受的劑量及在藥物可接受的組合物中應(yīng)用。術(shù)語“藥物可接受”指非毒性材料，其不干擾活性成分的生物活性的效力。這種制劑可常規(guī)含有鹽、緩沖劑、防腐劑、適宜的載體及可選擇的其它治療試劑。當(dāng)用于藥物時，該鹽應(yīng)是藥物可接受的，但非藥物可接受的鹽可方便地用于制備其藥物可接受鹽，且并不排除在本發(fā)明的范圍之外。這樣的藥理學(xué)及藥物可接受的鹽包括但不限于，由以下的酸制備的鹽類鹽酸、溴化氫、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、檸檬酸、蟻酸、丙二酸、琥珀酸等等。同樣藥物可接受的鹽也可制備為堿金屬或堿土金屬鹽，諸如鈉、鉀或鈣鹽。
iASPP組合物如果需要可與藥物可接受載體組合。本文所用術(shù)語“藥物可接受載體”指一種或多種更適宜的適合對人給藥的固體或液體填充劑、稀釋劑或包被物質(zhì)。術(shù)語“載體”表示天然或合成的、有機(jī)或無機(jī)成分，將活性成分與其組合使應(yīng)用更加方便。該藥物組合物成分相互之間能夠共混，且可與本發(fā)明的分子共混，且混合后不存在本質(zhì)上減弱所需的藥理效力的相互作用。
該藥物組合物可含有適合的緩沖劑包括乙酸鹽；檸檬酸鹽；硼酸鹽；磷酸鹽。
該藥物組合物還可包括，可選擇地，適合的諸如氯化芐烷銨；氯丁醇；對羥基苯甲酸酯(parabens)及硫汞撒(thimerosal)的防腐劑。
該藥物組合物可方便地制成單位劑量的形式，并通過任何藥劑學(xué)領(lǐng)域公知的方法制備。所有方法都包括將活性試劑與載體結(jié)合的步驟，該載體由一種或多種輔助成分組成。通常，通過將活性化合物均一地和密切地與液體載體、細(xì)分的固體載體或二者結(jié)合制備該組合物，如果需要，可成型該產(chǎn)品。
適合口服給藥的組合物可以制成諸如膠囊、片劑、藥糖塊的分散的單位形式，每單位含有預(yù)定劑量的活性化合物。其它組合物包括在水性液體和非水性液體中的懸浮液或諸如糖漿、酏劑或乳劑。
適合腸道外給藥的組合物方便包括無菌水性或非水性的iASPP多肽或核酸的制劑，其優(yōu)選與受者的血液等張。根據(jù)公知的方法使用適合的分散劑或潤濕劑及懸浮劑來制備該制劑。該無菌的注射用制劑還可以是在非毒性腸道外可接受稀釋劑或溶劑中的無菌注射溶液或懸浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液?？墒褂玫目山邮艿妮d體和溶劑包括水、林格氏(Ringer′s)溶液及等張氯化鈉溶液。此外，無菌不易揮發(fā)的油類可作為溶劑或懸浮介質(zhì)常規(guī)使用。為實現(xiàn)此目的，可使用任何溫和的非揮發(fā)油，包括合成的單或二甘油脂。此外，諸如油酸的脂肪酸可用于注射制劑中。適合口服、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)等等給藥的載體組方可參見Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA。
本發(fā)明的另一方面提供含有本發(fā)明核酸的轉(zhuǎn)基因非人動物。
本發(fā)明還包括轉(zhuǎn)基因非人動物。本文所用“轉(zhuǎn)基因非人動物”包括具有一種或多種整合在生殖細(xì)胞株和/或體細(xì)胞中的外源性核酸分子的非人動物。因此該轉(zhuǎn)基因動物包括具有通過同源重組獲得的純合或雜合基因的“基因敲出”動物，具有游離基因或染色體整合表達(dá)載體的動物等等。本領(lǐng)域公知地，通過同源重組使用胚胎干細(xì)胞可制備基因敲出動物。可通過本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的cre/lox系統(tǒng)或其它重組酶系統(tǒng)來促使該重組體的形成。在特定的實施方案中，該重組酶系統(tǒng)本身可進(jìn)行條件表達(dá)，例如，在特定的組織或細(xì)胞類型中，在特定的胚胎或胚胎后發(fā)育階段，可通過加入增加或較低表達(dá)的化合物等等來誘導(dǎo)。通常，在該系統(tǒng)使用的條件表達(dá)載體可利用與所需基因表達(dá)形式協(xié)同的多種啟動子(例如時間或空間的)。條件啟動子還可被可操作地連接到iASPP家族核酸分子來促進(jìn)這些核酸分子以被調(diào)控或有條件的方式表達(dá)。如上所述iASPP活性或表達(dá)的反式作用負(fù)調(diào)控因子也可被可操作地連接到條件啟動子上。這種反式作用調(diào)控因子包括反義核酸分子、編碼顯性負(fù)性分子的核酸分子、對iASPP核酸特異的核酶分子等等。該轉(zhuǎn)基因非人動物可用于直接檢測疾病狀態(tài)的診斷或治療的生物化學(xué)或生理學(xué)作用的試驗中，該疾病狀態(tài)以增加或降低的iASPP表達(dá)為特征。其它用途是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員顯而易見的。
本發(fā)明的另一方面還提供該多肽或其片段在鑒定抑制所述多肽與p53結(jié)合的試劑的篩選方法中的用途。
本發(fā)明的另一方面還提供鑒定抑制多肽或其片段與p53結(jié)合的試劑的篩選方法，包括i)形成含有如下成分的制劑a)本發(fā)明的多肽；及b)含有(a)中所述多肽結(jié)合位點的p53多肽或其片段；ii)提供至少一種待檢測的試劑；及iii)測定該試劑針對(a)中所述多肽與(b)所述多肽結(jié)合的活性。
在本發(fā)明優(yōu)選的方法中所述試劑是多肽，優(yōu)選肽。
在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，所述肽包括選自GPEETD；DGPEETD；TTLSDG；AEFGDE或PRNYFG的氨基酸序列。
在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，所述肽為至少6個氨基酸殘基長度。優(yōu)選所述多肽的長度選自至少7個氨基酸殘基；8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20氨基酸殘基長度?？蛇x擇地，所述肽的長度為至少20氨基酸殘基；30；40；50；60；70；80；90；或100氨基酸殘基長度。
在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的方法中，所述肽由選自GPEETD；DGPEETD；TTLSDG；AEFGDE或PRNYFG序列的氨基酸序列構(gòu)成。
對該肽試劑氨基酸序列的修飾可增強該肽與其靶序列的結(jié)合和/或穩(wěn)定性對本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員是顯而易見的。此外，該肽的修飾還可增加該肽在體內(nèi)的穩(wěn)定性，從而減少抑制iASPP與p53的結(jié)合所必需的該肽的有效劑量。這將進(jìn)一步減少體內(nèi)產(chǎn)生的不必要的副作用。修飾包括例如但不限于，乙?；王０坊?。可選擇地或優(yōu)選地，所述的修飾包括使用修飾的氨基酸制備肽的重組或合成形式。對本領(lǐng)域所述技術(shù)人員來說，顯而易見地修飾的氨基酸包括例如但不限于，4-羥基脯氨酸、5-羥基賴氨酸、N6-乙酰賴氨酸、N6-甲基賴氨酸、N6，N6-二甲基賴氨酸、N6，N6，N6-三甲基賴氨酸、環(huán)己基丙氨酸、D-氨基酸、鳥氨酸。其它的修飾包括具有C2、C3或C4烷基R基團(tuán)的氨基酸，該基團(tuán)可選被選自鹵素(例如F、Br、I)、羥基或C1-C4烷氧基的1、2或3個取代基取代。
對本領(lǐng)域所述技術(shù)人員來說，顯而易見地保留p53結(jié)合活性的肽可通過環(huán)化作用來修飾。環(huán)化作用是本領(lǐng)域公知的(參見Scott et al ChemBiol(2001)，8801-815；Gellerman et al J.Peptide Res(2001)，57277-291；Dutta et al J.Peptide Res(2000)，8398-412；Ngoka and Gross J Amer SocMass Spec(1999)，10360-363。
在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的方法中，所述的拮抗劑是抗體或抗體結(jié)合部分。優(yōu)選所述的抗體為單克隆抗體或其結(jié)合部分。
抗體，也稱為免疫球蛋白，是對外來分子(抗原)具有特異性的蛋白分子。免疫球蛋白(Ig)為一類結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白，其由兩對多肽鏈構(gòu)成一對輕(L)(低分子量)鏈(κ或λ)和一對重(H)鏈(γ、α、μ、δ與ε)，所用4條鏈通過二硫鍵連接在一起。H與L鏈都具有與抗原結(jié)合的區(qū)域并在一種Ig分子到另一種分子間具有高度可變性。此外，H與L鏈含有非可變或恒定(constant)區(qū)。
L鏈含有兩個功能區(qū)域。在給定類型的L鏈中，其羧基末端功能區(qū)域基本相同并稱為“恒定”(C)區(qū)。L鏈與L鏈間的氨基末端區(qū)域不同，構(gòu)成與抗體的結(jié)合位點。由于它的可變性，其稱為“可變”(V)區(qū)。Ig分子的H鏈分為α、μ、δ、ε與γ(其具有一些亞型)幾類。裝配好的Ig分子由含有一種或多種亞型的相同的H與L鏈構(gòu)成，并以其含有的H鏈來命名。因此，有5種Ig同種型IgA、IgM、IgD、IgE及IgG(并依據(jù)該H鏈的恒定區(qū)的不同而具有4種亞型，即IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)。有關(guān)抗體結(jié)構(gòu)及其各種功能的更詳細(xì)的論述可參見，Using AntibodiesAlaboratory manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press.
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述的片段為Fab片段。
在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，所述的抗體選自F(ab′)2，F(xiàn)ab，F(xiàn)v與Fd片段；及含有CDR3區(qū)的抗體。
優(yōu)選所述的片段為單鏈抗體可變區(qū)(scFV′s)或功能域抗體。如果用雜交瘤來產(chǎn)生特異單克隆抗體，本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知地可通過RT PCR來分離scFV′s，該scFV′s分離自從所述雜交瘤提取的mRNA。可選擇地，可使用噬菌體展示篩選技術(shù)來鑒定表達(dá)scFV′s的克隆。功能域抗體是抗體最小的結(jié)合部分(大約13kDA)。此技術(shù)的例子如美國專利第6,248,516、6,291,158、6,127,197號及歐洲專利EP0368684，其在此全部引用作為本文的參考。
修飾的抗體或變體抗體與參考抗體間可能有一個或多個可以各種組合形式出現(xiàn)的取代、添加、缺失、斷裂形成的氨基酸序列的不同。優(yōu)選的變體是由參考多肽通過保守氨基酸取代變化所得的變體。這種取代是通過具有相似特性的另一種氨基酸來取代設(shè)定的氨基酸。下列非限制性列出的氨基酸為可考慮的保守替換(相似)a)丙氨酸、絲氨酸與蘇氨酸；b)谷氨酸與天冬氨酸；c)天冬酰胺與谷胺酰胺；d)精氨酸與賴氨酸；e)異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸與纈氨酸；及f)苯丙氨酸、酪氨酸與色氨酸。最優(yōu)選的是表現(xiàn)出增強生物活性的變體。
優(yōu)選的所述抗體為人源化或嵌合抗體。
通過重組方法產(chǎn)生含有抗體可變區(qū)與人抗體不變或恒定區(qū)的嵌合抗體。
通過重組方法來產(chǎn)生將抗體互補決定區(qū)(CDRs)與人抗體的恒定區(qū)(C)及可變區(qū)(V)的框架區(qū)組合的人源化抗體。
嵌合抗體為重組抗體，其中所有的小鼠或大鼠抗體的V區(qū)與人抗體C區(qū)組合。人源抗體為重組雜交抗體，其將嚙齒動物抗體V區(qū)的互補決定區(qū)與人抗體V區(qū)的框架區(qū)融合。還使用人抗體的C區(qū)。該互補決定區(qū)(CDRs)位于抗體重鏈與輕鏈的N末端中，其中含有V區(qū)可變部分的大部分。這些區(qū)域在抗體分子表面形成環(huán)(loops)。這些環(huán)提供了抗體與抗原結(jié)合的表面非人動物的抗體會激起針對外源抗體的免疫反應(yīng)并被從循環(huán)中去除。由于上述重組雜交抗體中的嚙齒動物(即外源)抗體的數(shù)量已經(jīng)減少，而人抗體區(qū)不會引起免疫反應(yīng)，因此當(dāng)注入人體時嵌合與人源化抗體的抗原性已經(jīng)降低。這樣可導(dǎo)致免疫反應(yīng)減弱并減少對該抗體的清除。顯然，這對在人類疾病治療中使用治療性抗體是非常有利的。人源化抗體設(shè)計為具有較少的“外源”抗體區(qū)域，因此被認(rèn)為致免疫性比嵌合抗體更低。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其中所述的分子從線蟲中分離，該核酸分子可與圖1b中表示的核酸序列雜交。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述核酸分子在嚴(yán)格的雜交條件下雜交。優(yōu)選所述的線蟲選自新小桿線蟲屬(Caenorhabditis spp)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供含有圖1b所代表氨基酸的分離多肽，該多肽可通過至少1個氨基酸殘基的添加、刪減或取代來修飾。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面本發(fā)明提供動物的治療方法，該方法包括給予能誘導(dǎo)p53凋亡活性的有效劑量的本發(fā)明多肽或核酸或載體。
在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，所述的治療是對癌癥的治療。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供含有選自GPEETD；DGPEETD；TTLSDG；AEFGDE或PRNYFG的氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述的肽為至少6個氨基酸殘基長度。優(yōu)選所述肽的長度選自至少7個氨基酸殘基；8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20氨基酸殘基長度?？蛇x擇地，所述肽的長度為至少20氨基酸殘基；30；40；50；60；70；80；90；或100氨基酸殘基長度。
在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，所述肽由選自GPEETD；DGPEETD；TTLSDG；AEFGDE；或PRNYFG序列的氨基酸序列構(gòu)成。
根據(jù)本發(fā)明另一方面，本發(fā)明提供含有至少一種本發(fā)明的肽及至少1種抗癌試劑的藥物組合物。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述的抗癌試劑選自順鉑；卡鉑；環(huán)磷酰胺；美法侖(左旋苯丙氨酸氮芥)；卡莫司?。话奔椎?；5-氟尿嘧啶；阿糖胞苷；巰基嘌呤；柔紅霉素；阿霉素；表阿霉素；長春花堿；長春新堿；放線菌素；絲裂霉素C；紫杉醇；左旋天冬酰胺；粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)；依托泊甙；秋水仙素；甲磺酸去鐵胺(deferoxaminemesylate)；及喜樹堿。
根據(jù)本發(fā)明另一優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供含有本發(fā)明肽及至少一種抗體或其活性結(jié)合部分的復(fù)合物。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述的抗體或片段為細(xì)胞特異抗體。優(yōu)選所述的細(xì)胞是癌癥細(xì)胞。
本發(fā)明的肽與特異細(xì)胞(優(yōu)選癌癥細(xì)胞)結(jié)合抗體的復(fù)合物能夠靶定所述的肽到細(xì)胞上。通常，該復(fù)合物會被內(nèi)在化，并在細(xì)胞內(nèi)釋放該肽以向其靶標(biāo)傳輸該肽。制備抗體與肽的復(fù)合物的手段是本領(lǐng)域公知的，包括使用例如雙功能交聯(lián)劑，其可以是異-雙功能的或同-雙功能的。這些交聯(lián)劑是可分解的從而促進(jìn)所述肽的釋放。癌癥特異細(xì)胞標(biāo)志物為本領(lǐng)域公知的。例如腫瘤排斥抗原前體細(xì)胞。這些包括例如但不限于，腫瘤排斥抗原的MAGE、BAGE、GAGE及DAGE家族，參見Schulz et al ProcNatl Acad Sci USA，1991，88，pp991-993，其在此引用作為參考。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供治療優(yōu)選為人的動物的方法，包括給予有效劑量的本發(fā)明的肽，其中所述動物將得益于由此誘導(dǎo)的凋亡作用。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供治療優(yōu)選為人的動物的方法，包括給予有效劑量的本發(fā)明的組合物，其中所述動物將得益于由此誘導(dǎo)的凋亡作用在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，所述的治療是癌癥治療。
現(xiàn)僅以舉例的方式、并參考以下的附圖來描述本發(fā)明的實施方案圖1a為人iASPP的核酸序列；圖1b為線蟲C.elegans iASPP的核酸序列；圖2a為人iASPP的氨基酸序列；圖2b為線蟲C.elegans iASPP的氨基酸序列；圖3顯示FITC標(biāo)記的DGPEETD肽(3a)與TTLSDG肽(3b)可滲入細(xì)胞；圖4所示為與各種肽特別是DGPEETD孵育后，p53對Bax啟動子的刺激作用；圖5所示為在DGPEETD肽存在下DNA的UV損傷后，U2SO人腫瘤細(xì)胞株中p53反式作用的激活；
圖6所示為顯示線蟲C.elegans的iASPP與p53間相互作用的不同實驗；圖7所示為線蟲C.elegans的iASPP與人iASPP的同源性比較；及圖8所示為顯示線蟲C.elegans的iASPP與p53間相互作用的進(jìn)一步實驗；圖9所示為RNAi對C.elegans的iASPP表達(dá)的作用；圖10所示為iASPP中的p53接觸位點；圖11所示為肽對Bax-Luc報道基因反式作用水平的影響。用Bax報道基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞并暴露于UV(20J/m2)。肽以所述的兩種不同濃度加入到培養(yǎng)液中24小時；圖12所示為12小時肽對Pig3報道基因活性的影響。反式活化的細(xì)胞生長在含兩種不同濃度Arg-標(biāo)簽肽的培養(yǎng)液中。左邊的柱狀圖代表25μM濃度的反式作用活性，而右側(cè)的為50μM濃度的。此處使用Yap肽作為對照肽來代替p9。除對照外，用順鉑(3μg/ml)處理細(xì)胞；圖13所示為各種化療藥物對p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用；圖14a所示為ASPP1、ASPP2或iASPP的反義或si-RNA與抗腫瘤試劑阿霉素的活性組合的作用效果；圖14b所示為ASPP1、ASPP2或iASPP的反義或si-RNA與抗腫瘤試劑順鉑的活性組合的作用效果；圖15所示為抑制肽與順鉑的組合對ASPP1、ASPP2及iASPP的活性。
材料與方法細(xì)胞培養(yǎng)、抗體及質(zhì)粒Saos-2、MCF-7及U2OS細(xì)胞生長在含有10％FCS、100IU/ml青霉素-鏈霉素及2mM谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)液中。抗p53抗體DO-1與DO-13為單克隆抗體而CM-1為p53特異的家兔多克隆抗體。V5與9E10抗原決定簇分別由小鼠單克隆抗體V5與9E10識別。小鼠單克隆抗體PC-10對PCNA蛋白特異。CD20Leu為對細(xì)胞表面標(biāo)志CD20特異的FITC連接單克隆抗體(Becton Dickinson)。針對ASPP1與ASPP2的小鼠與家兔抗體如上所述1。針對iASPP(RLQPALPPEAQSVPELEE肽)的小鼠與家兔抗體的制備如Harlow與Lane13所述。本發(fā)明中使用的所有表達(dá)質(zhì)粒由CMV即刻早期啟動子驅(qū)動。通過V5抗原決定簇來標(biāo)記ASPP1、iASPP與Ce-iASPP而通過9E10抗原決定簇來標(biāo)記Ce-p53。
DNA轉(zhuǎn)染該轉(zhuǎn)染混合物包括用2.5M CaCl2來沉淀的1×HBS緩沖液(280mMNaCl，10mM KCl，1.4mM Na2HPO4.2H2O，12mM葡萄糖，39mM HEPES，調(diào)至pH 6.9-7.3)中的感興趣DNA。該轉(zhuǎn)染混合物滴加到細(xì)胞中并在6小時后用DMEM沖洗。洗滌后16-24小時，在報道裂解緩沖液(Promega)中裂解細(xì)胞以方便熒光酶分析與Western印記或在NP40裂解緩沖液中裂解細(xì)胞以方便Western印記或免疫共沉淀過程。
反式作用分析為進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，在轉(zhuǎn)染前24小時將5×105Saos-2細(xì)胞接種于6cm平皿中。以如下的含量轉(zhuǎn)染多種組合的質(zhì)粒DNA。所有轉(zhuǎn)染分析包含1μg的報道質(zhì)粒。如所示使用50ng野生型人p53、100ng的表達(dá)C.elegans p53的質(zhì)粒、4μg的ASPP2、或8μg ASPP1、5μg人iASPP或7.5μg Ce-iASPP。轉(zhuǎn)染后，沖洗后16-24小時在報道基因裂解緩沖液(Promega，WI，USA)中裂解該細(xì)胞并使用熒光素酶分析試劑盒(Luciferase Assay kit(Promega，WI，USA))來分析。通過高于空載體活性的轉(zhuǎn)染質(zhì)?；钚詠頊y定特定報道基因的活化倍數(shù)?？赏ㄟ^將每次分析中作用于啟動子的p53與ASPP組合的活性除以單獨p53的活性來獲得由ASPP作用引起的p53反式作用活性的增加倍數(shù)。
細(xì)胞轉(zhuǎn)化分析從Biowhittaker獲得的大鼠胚胎成纖維細(xì)胞(REFS)生長于含DMEM培養(yǎng)液的90mm平皿中直到50％的融合單層。隨后如上所述14進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化。簡單來說，如所示將2μg EJ ras 6.6、2μg pCE(ELA)、5μg pCB6-16E、5μg野生型人p53、1μg或5μg人或線蟲C.elegans iASPP轉(zhuǎn)染入該REFS細(xì)胞中。所有細(xì)胞用相同劑量的表達(dá)neo基因的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染。隨后用400μg/ml G418選擇該細(xì)胞并在轉(zhuǎn)染后3-4周后分選該形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)化的克隆。
流式細(xì)胞術(shù)為進(jìn)行FACS分析，在轉(zhuǎn)染前24-48小時將106Saos-2細(xì)胞接種在10cm平板中。隨后用2μg表達(dá)CD20的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染該細(xì)胞。用CD20的表達(dá)來作為轉(zhuǎn)染的標(biāo)志物。該轉(zhuǎn)染包括如所示的1μg人p53或4μg Ce-P53、10μg ASPP1與ASPP2，2μg Bax、15μg反義iASPP、7.5μg-10μg人iASPP或7.5μg Ce-iASPP質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后36小時，使用4mM EDTA/PBS收集貼壁與懸浮細(xì)胞并通過FITC連接的抗CD20抗體CD20Leu來標(biāo)記細(xì)胞。對于每個實驗，僅用不含CD20的對照載體來轉(zhuǎn)染一皿細(xì)胞。在與那些共轉(zhuǎn)染CD20質(zhì)粒的細(xì)胞相同條件下隨后用CD20Leu抗體標(biāo)記這些細(xì)胞來作為陰性對照。該缺少CD20質(zhì)粒表達(dá)的細(xì)胞用于設(shè)置基線來對CD20陽性(因此為轉(zhuǎn)染的)細(xì)胞進(jìn)行選門。在用抗體CD20Leu標(biāo)記后，固定該細(xì)胞并用碘化丙啶(propidium iodide，PI)標(biāo)記該細(xì)胞。如上所述15使用流式細(xì)胞儀(Becton Dickson)來分析所有表達(dá)CD20的細(xì)胞的DNA含量。
蛋白生物化學(xué)對于western印記，用1×PBS來洗滌生長為單層的細(xì)胞并用NP40裂解緩沖液(1％Nonidet P40，50mM Tris pH8.0，150mM NaCl，1mM EDTA pH8.0)或用熒光素酶報道基因裂解緩沖液來裂解細(xì)胞。使用BioRad蛋白分析系統(tǒng)(BioRad)測定該細(xì)胞提取物相對于標(biāo)準(zhǔn)曲線的蛋白濃度。將15-100μg提取物與5×樣品緩沖液混合并加載在SDS-PAGE凝膠上。將該凝膠濕轉(zhuǎn)至到Protran硝化纖維素膜上并在10％脫脂奶粉1×PBS來封閉產(chǎn)生的斑點。處理后的斑點用一抗來孵育，該一抗是用組織培養(yǎng)液或未稀釋的雜交瘤上清來制備的，并用適合的HRP連接的二抗(Dako)來孵育。每一步間用重復(fù)變換的TBST(10mM Tris pH 8.0，150mM NaCl，0.5％Tween 20)來洗滌該斑點。在使用ECL底物溶液(Amersham Life Science)后，將該斑點曝光于hyperfilm底片上。
為進(jìn)行免疫共沉淀，在冰上在NP40裂解緩沖液中將細(xì)胞裂解30分鐘，并在4℃用蛋白G小珠進(jìn)行預(yù)清潔1小時。測定該蛋白含量并將1000μg提取物與預(yù)結(jié)合于蛋白G小珠的抗體在4℃孵育4小時。在NP40裂解緩沖液中洗滌該小珠兩次并在NET緩沖液(50mM Tris pH8.0，150mM NaCl，1mMEDTA pH 8.0)中洗滌兩次。該IP小珠與5×樣品緩沖液混合并加載在SDS-PAGE凝膠上。
體外翻譯與體外免疫共沉淀體外翻譯ASPP家族成員與p53并使用TNT T7 Quick coupled轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)(Promega)通過35S-甲硫氨酸來標(biāo)記。如圖1E中所示實驗，除p53與ASPP2外，再加入15μl、30μl與45μl的體外iASPP翻譯裂解物。使用家兔抗p53抗體CMl來檢測未標(biāo)記p53的存在。
如圖6A所示，5-10μl人iASPP裂解物(未標(biāo)記)與15μl含有體外翻譯的Ce-p53的裂解物孵育。該蛋白混合物在30℃共翻譯1hr。200μl磷酸鹽緩沖液(PBS)隨后加入到該蛋白混合物中并在4℃于旋轉(zhuǎn)中再孵育1小時。將固化在蛋白G凝膠小珠上的抗V5抗體加入該結(jié)合反應(yīng)中并在轉(zhuǎn)動中于4℃孵育16小時。該小珠隨后用PBS洗滌。該結(jié)合蛋白釋放在SDS凝膠樣本緩沖液中并用10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)來分析。用放射性自顯影來檢測Ce-p53，在Western印記后用抗V5抗體來檢測人iASPP。對于這些圖的剩余部分，用35S-甲硫氨酸來標(biāo)記該蛋白并使用所述的抗體來進(jìn)行上述免疫共沉淀。使用放射性自顯影來觀察結(jié)果。
以35S-甲硫氨酸與35S-半胱氨酸體內(nèi)標(biāo)記細(xì)胞含或不含轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的U2OS細(xì)胞(如圖1A和2C所示)用PBS洗滌并隨后與不含甲硫氨酸與半胱氨酸的DMEM中的250μci/ml35S-甲硫氨酸與250μci的35-半胱氨酸在37℃孵育2小時。隨后在收集前用PBS洗滌細(xì)胞。如圖2C所示，轉(zhuǎn)染后24小時該細(xì)胞用35S-甲硫氨酸與35S-半胱氨酸體內(nèi)標(biāo)記2hrs。表達(dá)CD20的細(xì)胞(轉(zhuǎn)染細(xì)胞)用FITC-連接抗CD20抗體標(biāo)記。隨后將生物素連接抗FITC抗體加入到該細(xì)胞沉淀，孵育后，該細(xì)胞與鏈霉素抗生素連接的磁珠混合來分離該表達(dá)CD20的細(xì)胞。該細(xì)胞隨后用NP40裂解緩沖液來裂解并用小鼠抗iASPP抗體來進(jìn)行該蛋白的免疫共沉淀。該免疫共沉淀用NET緩沖液洗滌并用SDS-PAGE與放射自顯影來解析。
細(xì)胞固定生長在30mm平皿的細(xì)胞單層用1×PBS洗滌。用1ml 4％多聚甲醛固定該細(xì)胞15分鐘，并隨后用1×PBS洗滌。用1ml 0.2％Triton-X100的I×PBS來通透該細(xì)胞2分鐘并用1×PBS洗滌3次來洗除固定液。在組織培養(yǎng)液中配制適合濃度的一抗并將其加入到該平皿中3小時。該平皿用1×PBS來洗滌，在組織培養(yǎng)液中配制供應(yīng)商推薦的稀釋濃度(Sigma，UK)的抗家兔TRITC(四甲異硫氰酸若丹明，Tetramethyl rhodamineisothiocyanate)或抗小鼠FITC(異硫氰酸熒光素，F(xiàn)luorescein isothiocyanate)并將其加入到該平皿中1小時。用1×PBS洗滌該細(xì)胞并在空氣中干燥。使用Citifluor封閉試劑(Citifluor，UK)滴加到該細(xì)胞的表面并在上面放置蓋玻片。在該蓋玻片上面滴加浸油，使用Zeiss Axiophot熒光顯微鏡來觀察該免疫復(fù)合物。使用抗體9E10與V5來分別檢測抗原決定簇標(biāo)記的Ce-p53(9E10)、人iASPP(V5)及Ce-iASPP(V5)的表達(dá)。用DO.1抗體來檢測人p53。
Ce-p53與Ce-iASPP cDNA的克隆使用Promega Access試劑盒通過RT-PCR方法來產(chǎn)生攜帶Ce-ape-1(iASPP)與CE-cep-1(p53)的完全編碼區(qū)域的cDNAs，將其克隆至pCR4-TOPO(Invitrogen)載體中并測序。隨后將C.elegans的p53與iASPP分別以9E10和V5抗原決定簇的表達(dá)框架亞克隆進(jìn)入哺乳動物表達(dá)載體pcDNA3中。預(yù)計該全長Ce-ape-1會反式拼接到SLl(Y.KOHARA，未出版)。
RNA干擾(RNAi)與細(xì)胞死亡體(corpse)分析通過已建立的步驟利用給予或微注射方法來進(jìn)行RNAi(Fire et al.，1998；Timmons and Fire，1998)。為使用RNAi消除Ce-iASPP與Ce-p53活性，首先對N2動物進(jìn)行Ce-iASPP RNAi給予。隨后，將20只F1動物從飼養(yǎng)盤移出，用Ce-p53 dsRNA注射并放回獨立的Ce-iASPP dsRNA飼養(yǎng)盤。Ce-iASPP(Ce-p53 dsRNA注射+/-)飼養(yǎng)動物的F2子代用SYTO12標(biāo)記，并用所述的方法12來計數(shù)凋亡的細(xì)胞。因此，由于所有動物已進(jìn)行Ce-iASSP飼養(yǎng)RNAi，兩群體間檢測到的凋亡細(xì)胞死亡體平均數(shù)量的任何差異都有可能是Ce-p53 dsRNA注射的結(jié)果。
實施例iASPP為ASPP家族的最保守成員序列分析表明，C.elegans p53基因(cep-1)為p53家族中不同的成員；盡管如此，ASPP的必需殘基及DNA結(jié)合活性仍表現(xiàn)出保守性3，4。因此對C.elegans基因組的ASPP同源性進(jìn)行了搜尋并發(fā)現(xiàn)F46F3.4為唯一的編碼與ASPP家族所有三個成員具有顯著序列同源性的蛋白的C.elegans基因。依據(jù)由ape-1(RNAi)(見如下)產(chǎn)生的突變型，對應(yīng)F46F3.4的基因被命名為ape-1(為了凋亡增強因子)；然而，其蛋白產(chǎn)物自此以下稱為Ce-iASPP。Ce-iASPP含有769個氨基酸；序列比較顯示該Ce-iASPP的C末端與其它ASPP成員相比是最保守的區(qū)域(圖7)。以往發(fā)現(xiàn)該ASPP2的C末端與p53相互作用。此外，除一個外所有參與此相互作用的殘基(7個中的6個)在iASPP與Ce-iASPP內(nèi)都是保守的。綜合這些結(jié)果表明Ce-iASPP與人與C.elegans的p53都能作用。通過體外免疫共沉淀可檢測此作用。如圖8b所示，Ce-iASPP可與人和Ce-p53作用。通過相互的免疫共沉淀可進(jìn)一步證實Ce-p53與Ce-iASPP間的相互作用(圖8B，右側(cè)圖)。
Ce-iASPP含有在其它ASPP家族成員中存在的錨蛋白(ankyrin)重復(fù)序列和SH3結(jié)構(gòu)域并在人類細(xì)胞的胞漿和細(xì)胞核中表達(dá)(圖8C)。人iASPP的表達(dá)以細(xì)胞核為主但在細(xì)胞漿中也同樣能檢測到。人與C.elegans p53均主要在轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞核中表達(dá)(圖8C)。由于ASPP與iASPP可分別正調(diào)控與負(fù)調(diào)控p53的凋亡功能，我們檢測了Ce-iASPP對p53活性的作用。當(dāng)Ce-iASPP與人p53在哺乳動物細(xì)胞中共表達(dá)時，其對p53的反式作用與促凋亡功能產(chǎn)生很小的降低作用，推測是通過抑制內(nèi)源性ASPP的功能所致。然而在ASPP1或ASPP2存在下，共表達(dá)Ce-iASPP可防止ASPP1或ASPP2刺激p53的反式作用和促凋亡功能，并能達(dá)到與人iASPP相同的程度(圖8D)。此外，由于在相同的條件下人和C.elegans iASPP都不能抑制Bax誘導(dǎo)的凋亡作用，因此兩者的抑制凋亡能力均為p53依賴的(圖8E)。iASPP抑制p53活性的能力并不是降低p53的表達(dá)所致(圖8F)。類似人iASPP，Ce-iASPP同樣具有致癌活性。Ce-iASPP的表達(dá)可增加ras與E1A的活性轉(zhuǎn)化。此外，Ce-iASPP的表達(dá)可抑制野生型人p53的抑制劑功能(圖8G)。這些結(jié)果表明，Ce-iASPP更像是人iASPP的而不是ASPP的一種不同種間具有相同功能的基因組(orthologue)。同樣，Ce-iASPP抑制p53的功能表明，通過ASPP蛋白家族對p53促凋亡功能的調(diào)節(jié)是進(jìn)化保守的。
通過ASPP蛋白家族對p53功能的調(diào)節(jié)是進(jìn)化保守的由于人與C.elegans p53間有限的序列相似性，盡管與ASPP接觸的大多數(shù)Ce-p53殘基是保守的，但還不清楚Ce-p53是否能在哺乳動物細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。如果Ce-iASPP抑制人p53活性的方式與人iASPP的相似，這將支持通過ASPP家族對p53功能的調(diào)節(jié)是進(jìn)化保守的。這還表明，Ce-p53的活性也可通過ASPP蛋白家族來調(diào)節(jié)。為驗證這些觀點，通過免疫共沉淀來測試Ce-p53體外與人ASPP家族成員的相互作用能力。如圖6A所示，Ce-p53與ASPP2和iASPP相互作用。Ce-p53的表達(dá)能以與人p53相似的效力來誘導(dǎo)人類細(xì)胞的凋亡。明顯地，特定的人ASPP、ASPP2表達(dá)可將Ce-p53誘導(dǎo)凋亡的能力顯著增強到與人p53相似的程度，并且人iASPP的表達(dá)也可抑制Ce-p53的促凋亡功能(圖6B)。此外，人與C.elegans的iASPP可抑制Ce-p53誘導(dǎo)凋亡到相同的程度(圖6C)。同時也檢測了Ce-p53對諸如Bax-luc的p53靶基因啟動子的反式作用能力，發(fā)現(xiàn)比人p53低很多。有意思的是，共表達(dá)ASPP2與Ce-p53可產(chǎn)生少量的但可檢測到的Ce-p53反式作用功能的增強，表明人ASPP家族能以與調(diào)節(jié)人p53相似的方式來調(diào)節(jié)Ce-p53(圖6D)。由ASPP2誘導(dǎo)的Ce-p53反式作用功能的少量增加并沒有在mdm2啟動子上發(fā)現(xiàn)。所有這些結(jié)果表明人與C.elegans p53間存在的保守殘基可滿足p53的促凋亡功能及ASPP家族對p53的調(diào)節(jié)，且對其是至關(guān)重要的。
iASPP為進(jìn)化保守的體內(nèi)p53抑制劑如人p53、C.elegans p53的最重要功能之一是其響應(yīng)DNA損傷而誘導(dǎo)生殖細(xì)胞凋亡的能力3，4。已知共表達(dá)人或C.elegans iASPP可抑制哺乳動物細(xì)胞中p53的促凋亡功能，我們推測Ce-iASPP也可相似地保護(hù)C.elegans生殖細(xì)胞防止凋亡引起的細(xì)胞死亡。體內(nèi)使用RNA介導(dǎo)的干擾技術(shù)(RNAi)可說明此問題5。內(nèi)源性Ce-iASPP的缺失可增加生殖細(xì)胞發(fā)生凋亡的數(shù)量，表明Ce-iASPP的正常功能是抑制凋亡(圖9A，泳道1及5、6)。當(dāng)對缺失C.elegans CED-3caspase酶的突變進(jìn)行RNAi時，檢測不到由Ce-iASPP缺失引起的生殖細(xì)胞凋亡的增加，表明凋亡的核心機(jī)制參與了此過程(圖9A，泳道3和4)6。我們還獲得了其它支持如下推測的證據(jù)，Ce-iASPP的主要作用是抑制Ce-p53的促凋亡活性，該活性通常由基因毒性應(yīng)激反應(yīng)來刺激3，4。首先，發(fā)現(xiàn)Ce-iASPP缺失后的C.elegans生殖細(xì)胞發(fā)生凋亡數(shù)量的增加可被同時由RNAi產(chǎn)生的Ce-p53的缺失抵消(圖9A，對比泳道5、6及8)。此外，RNAi引起的Ce-iASPP與Ce-p53的同時缺失不能完全消除凋亡，而是使生殖細(xì)胞發(fā)生凋亡的數(shù)量回到野生型生理水平。其次，在野生型線蟲暴露于100-Gy放射性照射(IR)后，檢測的凋亡生殖細(xì)胞群增加的數(shù)量并不比暴露或不暴露于100-Gy IR時由RNAi產(chǎn)生的Ce-iASSP缺失的數(shù)量多(圖9A，泳道2和7)。這些結(jié)果清楚地證明，iASPP為C.elegans中p53功能的重要抑制劑，盡管我們不能排除基因敲出可顯現(xiàn)Ce-iASPP具有的另外活性的可能性。由于ASPP家族對p53的調(diào)節(jié)是高度保守的，很可能iASPP在其它生物體包括人類中也是p53的關(guān)鍵性抑制劑。
本文還證明iASPP為至今鑒定的系統(tǒng)發(fā)生中最保守的p53抑制劑并且是ASPP家族中進(jìn)化最保守的成員。顯然，ASPP家族成員調(diào)節(jié)p53促凋亡功能的能力在線蟲C.elegans與人之間是保守的。這可認(rèn)為p53的促凋亡功能比其誘導(dǎo)細(xì)胞周期停留的功能更保守；此觀點與最近觀察到的線蟲C.elegans與果蠅p53的異位表達(dá)誘導(dǎo)凋亡而不引起細(xì)胞周期停留的現(xiàn)象一致3，4，7，8。在C.elegans中，p53介導(dǎo)的凋亡對維持可發(fā)生DNA損傷的生殖細(xì)胞的精確度有重要作用3，4。有意思的是，p53最重要的腫瘤抑制劑功能也與其誘導(dǎo)凋亡的能力有關(guān)。因此，ASPP家族成員，這類進(jìn)化保守的p53調(diào)節(jié)劑，肯定在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。
原癌蛋白iASPPiASPP與N末端刪減的ASPP2變體53BP2而不是全長ASPP具有更多的序列相似性。iASPP的表達(dá)可抑制p53促凋亡功能。如53BP2，iASPP對p53促凋亡功能的最有意義的作用是通過其作為ASPP的競爭者而介導(dǎo)的。然而在線蟲C.elegans中，iASPP是唯一與人ASPP家族具有同源性的基因。因此iASPP在C.elegans中直接抑制p53的促凋亡功能。相似的機(jī)制可存在于哺乳動物中。與此一致，iASPP的反義RNA可在U2OS與MCF7細(xì)胞中誘導(dǎo)3～5倍的凋亡細(xì)胞的增加。在后者的模型中，ASPP可通過除去iASPP施加于p53的負(fù)性作用而刺激p53的促凋亡功能。在順鉑處理的U2OS和MCF7細(xì)胞中，iASPP反義RNA沒能產(chǎn)生顯著的凋亡的增加，其原因可能是由于順鉑通過增加ASPP的活性來刺激p53的促凋亡功能。這可進(jìn)而解釋為什么ASPP反義RNA的表達(dá)可產(chǎn)生對順鉑誘導(dǎo)的凋亡的顯著抑制作用。同樣在此條件下，iASPP的抗凋亡功能也是明確的。因此p53的促凋亡功能由iASPP負(fù)性調(diào)節(jié)并由ASPP正性調(diào)節(jié)。這兩種對立信號的競爭可決定p53促凋亡的狀態(tài)并最終決定細(xì)胞的命運。不管iASPP是作為ASPP的重要的負(fù)性調(diào)節(jié)劑還是p53的直接抑制劑，iASPP與ASPP對p53結(jié)合的競爭對p53促凋亡的功能是關(guān)鍵的。與此模型一致，p53與ASPP2復(fù)合含量的變化會在DNA損傷的反應(yīng)中觀察到。誘導(dǎo)死亡或活存的信號似乎可調(diào)節(jié)p53與iASPP和ASPP復(fù)合的比例。
作為p53的抑制劑，iASPP可增強諸如人乳頭狀瘤病毒和腺病毒的ras加E7或E1A的原癌基因而不是ras加突變p53的原癌基因的轉(zhuǎn)化活性。由于已知E7與ElA是誘導(dǎo)p53依賴凋亡的9，因而上述現(xiàn)象特別有意思。雖然E7和E1A結(jié)合并滅活Rb的腫瘤抑制劑功能時，它們的原癌功能由于其活化p53依賴凋亡的功能而大大降低?？梢种朴蒃7和E1A誘導(dǎo)的凋亡的蛋白可增強E7和E1A的原癌功能。因此，如顯性負(fù)性p53突變，iASPP可通過抑制p53的促凋亡功能來刺激E7和E1A的致癌功能。特別需要指出的是，在本文所述的環(huán)境條件下，iASPP在與ras共作用轉(zhuǎn)化REFs時并不如突變p53、p53H175或p53L173活性高。其部分原因是由于試驗中的iASPP的低水平表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，iASPP與突變p53的轉(zhuǎn)化活性的差別也可由其它已知的突變p53的活性導(dǎo)致，這些活性不依賴于其作為絕對的p53顯性負(fù)性抑制劑的能力。然而，其給予細(xì)胞對抗UV與順鉑細(xì)胞毒作用的能力表明在表達(dá)野生型p53的人腫瘤中會出現(xiàn)過表達(dá)iASPP。與此一致，在表達(dá)野生型p53的人乳腺癌中iASPP的表達(dá)增加。大多數(shù)表達(dá)高水平iASPP的腫瘤(8個中的7個)也表達(dá)野生型p53和正常水平的ASPP，表明iASPP是體內(nèi)ASPP的抑制劑。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)在60％的表達(dá)野生型p53的人乳腺癌腫瘤中，ASPP1和ASPP2的表達(dá)水平下調(diào)。綜上，ASPP家族成員的異常表達(dá)可能是所檢查的人乳腺癌中幾乎80％的病例的發(fā)病原因。ASPP家族成員由位于不同染色體上的3種不同基因編碼(資料未顯示)。我們并不清楚為什么表現(xiàn)為ASPP下調(diào)的人乳腺癌發(fā)生次數(shù)遠(yuǎn)比表現(xiàn)為iASPP表達(dá)增加的次數(shù)高。然而，ASPP家族成員在不同人腫瘤類型中的表達(dá)形式可能不同。具有改變的ASPP表達(dá)的腫瘤比例在不同的腫瘤類型中也有區(qū)別。無論怎樣，抑制iASPP的致癌功能可提供新的重要的治療表達(dá)野生型p53的腫瘤的策略。
ASPP家族對p53的進(jìn)化保守調(diào)節(jié)序列比較顯示在人與C.elegans的iASPP氨基酸序列之間具有38％的同一性；其中在錨蛋白重復(fù)序列與SH3結(jié)構(gòu)域內(nèi)，其同源性高達(dá)78％(人iASPP的154-227殘基與Ce-iASPP的557-630的殘基中，55/74殘基是相似的)。接觸p53的大多數(shù)iASPP殘基是保守的。人與C.elegans iASPP間的結(jié)構(gòu)保守性可由它們在人細(xì)胞中調(diào)節(jié)p53功能的能力來反應(yīng)。如人iASPP，C.elegans iASPP可與細(xì)胞株中的人p53相互作用，并抑制其反式作用及促凋亡功能。ASPP/P53調(diào)節(jié)的保守性在對人細(xì)胞中的C.elegansp53的研究中被進(jìn)一步證明。值得注意并且有必要指出的是，人與C.elegans p53的序列同源性是非常有限的(在蛋白水平有13.7％同一性)。這兩個物種間同源性的最高水平在非常有限的區(qū)域內(nèi)可到達(dá)約50％(9殘基/18殘基是相似的)。然而，在晶體結(jié)構(gòu)上一致的許多ASPP2所接觸的殘基在人與C.elegans p53間是保守的(8個殘基中的5個是保守的)。C.elegans p53與人ASPP家族成員體外的相互作用有力地說明了這些保守殘基的重要性。顯然，C.elegans p53在人細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡是非常有效的。與人p53相似，C.elegans p53的促凋亡功能可分別由人的ASPP與iASPP進(jìn)行正負(fù)調(diào)節(jié)。這些結(jié)果第一次證明，雖然人與C.elegans的p53存在有限的序列同源性，但p53的促凋亡功能是保守的。人與C.elegans p53間少數(shù)關(guān)鍵殘基的保守性對ASPP家族成員體內(nèi)體外調(diào)節(jié)p53促凋亡功能是足夠的。
與人p53比較，C.elegans p53表現(xiàn)很小的反式作用諸如Bax和PIG3的人p53靶基因的能力(資料未顯示)。盡管在凋亡中Bax為p53最常作用的靶基因，但其并不是p53誘導(dǎo)凋亡中所需要的唯一的靶基因。已知p53可對超過20種促凋亡基因產(chǎn)生反式作用，但至今沒有一種被證明是p53誘導(dǎo)凋亡所不可缺失的。在人類基因組中有超過4000種公認(rèn)的p53靶基因，而它們中的多數(shù)是促凋亡基因11。有可能Ce-p53也可如人p53那樣有效地反式活化這些其它人p53靶基因中的一部分。但至今我們的試驗還沒有發(fā)現(xiàn)屬于此類別的基因。盡管由Ce-p53誘導(dǎo)的人體細(xì)胞中的人Bax-luc報道基因反式作用不是非常強烈，但有必要指出，ASPP的共表達(dá)只在Bax的啟動子上而不是mdm2上刺激Ce-p53反式作用功能。此種ASPP作用的形式與以人p53觀察到的類似?？蛇x擇地，Ce-p53可不依賴其轉(zhuǎn)錄活性來誘導(dǎo)凋亡；已知人p53是通過轉(zhuǎn)錄依賴及非依賴途徑來誘導(dǎo)凋亡的12。不管Ce-p53在人細(xì)胞中怎樣誘導(dǎo)凋亡，最明顯而重要的事實是，人ASPP蛋白家族調(diào)節(jié)Ce-p53和人p53促凋亡功能的途徑是相似的。在對人細(xì)胞的所有檢測中Ce-iASPP也可完全替代人iASPP。這些結(jié)果有力地說明，ASPP家族對p53功能的調(diào)節(jié)從線蟲到人是保守的。p53與ASPP家族的聯(lián)系表明，ASPP家族對p53的調(diào)節(jié)將在癌癥治療手段的開發(fā)中成為新的靶標(biāo)。可通過增強ASPP活性和去除iASPP活性使表達(dá)野生型p53的腫瘤對治療敏感。
化療藥物改變ASPP家族蛋白功能由于50％的人腫瘤存在野生型p53，治療癌癥的一種途徑可以是恢復(fù)腫瘤細(xì)胞中p53的誘導(dǎo)凋亡作用。實際上，化療與放療試劑可產(chǎn)生DNA損傷，其可活化腫瘤細(xì)胞中的功能性p53。然而由這些藥物影響的作用途徑是不同的，并且腫瘤細(xì)胞為活存可產(chǎn)生一些保護(hù)性策略。如上所述，ASPP1和ASPP2可通過刺激p53在促凋亡基因啟動子上的DNA結(jié)合與反式作用功能來特異增強p53的促凋亡功能(Samuels-Lev et al.，2001)，而iASPP是非常保守的p53抑制劑(Bergamaschi et al.，2003)。綜上，這表明化療試劑可影響ASPP蛋白家族的功能，其進(jìn)而改變后續(xù)的p53促凋亡反應(yīng)，并因此在癌癥治療藥物的有效性中發(fā)揮作用。
特別地，用試驗對如下假說進(jìn)行了驗證，通過調(diào)節(jié)ASPP的活性可使化療藥物在發(fā)生DNA損傷的細(xì)胞株中的作用更有效。
使用化療試劑來研究細(xì)胞株中誘導(dǎo)的凋亡是否直接與p53的表達(dá)水平有關(guān)。使用Pig3啟動子(Pig3-luc 17mer)來轉(zhuǎn)染U-20S和MCF7細(xì)胞并用各種化療藥物(阿霉素、順鉑、依托泊甙、秋水仙素、甲磺酸去鐵胺(DFO)、柔紅霉素、喜樹堿及5-氟尿嘧啶)來處理這些細(xì)胞。
24小時后檢測熒光素酶的水平，見圖13。結(jié)果表明，由熒光素酶測量的藥物誘導(dǎo)的凋亡并不與p53蛋白的水平直接相關(guān)(例如，比較阿霉素與順鉑的反應(yīng))，表明p53單獨并不能引起促凋亡基因的活化。有可能該ASPP蛋白對各種化療藥物的反應(yīng)不同，由此產(chǎn)生可觀察到的Pig3活化與p53蛋白表達(dá)水平的差異。
為驗證ASPPs是否在此過程發(fā)揮作用，使用短干擾RNA(si-RNA)(Elbashir et al.，2001)和反義RNA來抑制ASPP基因的表達(dá)。將產(chǎn)生si-RNA的序列克隆至pSuper質(zhì)粒中(Brummelkamp et al.，2002)。由于依據(jù)使用藥物的不同促凋亡基因的反應(yīng)不同，在U-20S細(xì)胞中對阿霉素與順鉑的作用都進(jìn)行了檢測。Pig3-熒光素酶與反義或si-iASPP一起轉(zhuǎn)染(圖14A和14B)。結(jié)果顯示反義ASPP1或反義ASPP2都能減少阿霉素對Pig3-熒光素酶的誘導(dǎo)(圖14A)但iASPP的反義或si-RNA分子不引起減少。p53的si-RNA可防止阿霉素的反應(yīng)(圖14A)。相反，反義ASPP1或反義ASPP2對Pig3啟動子的順鉑誘導(dǎo)作用具有很小的作用，但iASPP的si-RNA可引起顯著的增加。而且p53的siRNA可防止順鉑的反應(yīng)。
這些資料表明，在U-20S細(xì)胞中阿霉素與ASPP1和ASPP2共同作用可誘導(dǎo)內(nèi)源性p53的活性，但iASPP可抑制順鉑誘導(dǎo)的內(nèi)源性p53的活性?？赡苁撬幬飳SPP或iASPP的調(diào)節(jié)作用導(dǎo)致了這些不同的效果。
iASPP/p53結(jié)合的破裂可增強凋亡并可潛在用于癌癥的治療中用合成的分子來抑制p53/iASPP的相互作用可導(dǎo)致p53陽性應(yīng)激細(xì)胞中p53介導(dǎo)的凋亡。
已知p53可結(jié)合于iASPP的C末端部分；特異接觸的氨基酸如圖10所示。含有特異iASPP序列的3種不同的肽被用于抑制iASPP/p53的結(jié)合并檢測了其對促凋亡基因的作用，如圖10。該3種肽連接了Tat序列和FITC。
最初使用UV放射線激活p53檢測了這些肽對p53對Bax啟動子的反式作用的影響。如圖11。不影響iASPP & p53相互作用的對照肽只對Bax啟動子的熒光素酶活性有輕微的影響。然而，以50μM肽加入肽3、6或7可引起報道基因活性增加約2倍。在100μM水平一些肽的活性降低。
使用Pig3熒光素酶報道基因進(jìn)行進(jìn)一步試驗。該Pig3基因通過與Bax不同的途徑被p53反式活化。p53通過常規(guī)的轉(zhuǎn)錄功能域來反式活化Bax(El-Deiry et al.，1992)(Bourdon et al.，1997)，而p53通過重復(fù)序列(TGYCC)n來結(jié)合該Pig3啟動子，其中Y＝C或T(Polyak et al.，1997)。在群體間該重復(fù)序列的數(shù)目是多種多樣的(Contente et al.，2002)。使用含有10個或17個重復(fù)序列的兩種報道基因，此時對兩者的反應(yīng)不同。其它要考慮的變量為時間和肽的濃度及在細(xì)胞中該肽的分布因為p53與iASPP大部分為核蛋白。
在此試驗中使用第二代肽，該肽除標(biāo)簽不同外其它與上述相同。這些肽加入9個精氨酸殘基標(biāo)簽，推測該標(biāo)簽可使這些肽更好地滲入到細(xì)胞中(Lindsay，2002)。在此情況下，使用包括從ASPP2序列來源的肽7(見圖10)和不同對照肽(Yap)。用順鉑來處理細(xì)胞并且肽以兩種不同濃度(25μM and 50μM)應(yīng)用12小時，結(jié)果如圖15所示。雖然在結(jié)果中存在一些變化，但P3-iASPP或P7-iASPP肽與對照Yap肽和順鉑處理的反應(yīng)比較顯示了報道基因活性的本質(zhì)上的增加，表明化療中誘導(dǎo)的凋亡可通過使用iASPP肽抑制劑來增強。
權(quán)利要求
1.編碼多肽或其序列變體的分離的核酸分子，其中所述的多肽是圖1a或1b中代表的多肽序列的片段，該片段選自i)由源自圖1a或1b中所示氨基酸序列的約第128-224殘基的氨基酸殘基構(gòu)成的多肽片段；ii)由源自圖1a或1b中所示氨基酸序列的約第128-224殘基的氨基酸殘基構(gòu)成的多肽片段，其中所述的序列通過至少一個氨基酸殘基的添加、刪除或替代來修飾；及iii)由(i)與(ii)定義的多肽，其中所述多肽基本上保留所述圖1a或1b中代表的多肽的生物活性。
2.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中所述的分子編碼由源自圖1a所示序列的約第128-224氨基酸殘基構(gòu)成的多肽片段。
3.如權(quán)利要求2所述的核酸分子，其中所述的分子從人類中分離。
4.如權(quán)利要求1或2所述的核酸分子，其中所述的分子編碼由源自圖1b所示序列的約第128-224氨基酸殘基構(gòu)成的多肽片段。
5.如權(quán)利要求4所述的核酸分子，其中所述分子從線蟲中分離。
6.如權(quán)利要求5所述的核酸分子，其中所述的線蟲屬于新小桿線蟲種屬。
7.如權(quán)利要求1～6中任一權(quán)利要求所述的核酸分子，其中所述分子編碼多肽或其序列變體，所述多肽可抑制圖2所示氨基酸序列所代表的多肽的活性。
8.如權(quán)利要求1～7中任一權(quán)利要求所述的核酸分子，其中所述的核酸分子為cDNA。
9.如權(quán)利要求1～7中任一權(quán)利要求所述的核酸分子，其中所述的核酸分子為基因組DNA。
10.由如權(quán)利要求1～9中任一權(quán)利要求所述的核酸分子編碼的多肽片段或其序列的變體。
11.含有如權(quán)利要求1～9中任一權(quán)利要求所述的核酸分子的載體。
12.如權(quán)利要求11所述的載體，其中所述的載體為表達(dá)載體。
13.使用如權(quán)利要求1～9中任一權(quán)利要求所述的核酸分子，或者如權(quán)利要求11或12所述的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求1～9中任一權(quán)利要求所述的核酸分子作為藥物的用途。
15.如權(quán)利要求10所述的多肽作為藥物的用途。
16.如權(quán)利要求14或15所述的核酸或多肽進(jìn)一步含有稀釋劑、載體或賦形劑。
17.含有如權(quán)利要求1～9中任一權(quán)利要求所述的核酸分子的轉(zhuǎn)基因非人動物。
18.如權(quán)利要求10所述的多肽或其片段在鑒定抑制所述多肽與p53結(jié)合的試劑的篩選方法中的用途。
19.鑒定抑制多肽或其片段與p53結(jié)合的試劑的篩選方法，包括i)形成含有如下成分的制劑c)本發(fā)明的多肽；及d)含有(a)中所述多肽結(jié)合位點的p53多肽或其片段；ii)提供至少一種待檢測的試劑；及iii)測定所述試劑針對(a)中所述多肽與(b)所述多肽結(jié)合的活性。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的試劑是多肽。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的多肽是肽。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的多肽是抗體或其結(jié)合部分。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的抗體是單克隆抗體。
24.如權(quán)利要求22或23所述的方法，其中所述的片段是Fab片段。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的Fab片段選自F(ab′)2、Fab、Fv及Fd片段；及CDR3區(qū)。
26.如權(quán)利要求23～25中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的抗體為人源化的。
27.如權(quán)利要求23～25中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的抗體為嵌合抗體。
28.一種分離的核酸分子，其中所述的分子從線蟲中分離，所述核酸分子與圖1b中所示核酸序列雜交，其中所述的核酸分子編碼p53的抑制劑。
29如權(quán)利要求28所述的核酸分子，其中所述的分子在嚴(yán)格的條件下雜交。
30.如權(quán)利要求28或29所述的核酸分子，其中所述的線蟲屬于新小桿線蟲種屬。
31.含有圖2b中所示氨基酸的分離的多肽，或者通過至少一個氨基酸殘基的添加、刪減或取代進(jìn)行修飾的變體多肽，并且所述多肽是p53的抑制劑。
32.一種動物的治療方法，包括給予能誘導(dǎo)p53凋亡活性的有效劑量的如權(quán)利要求10所述的多肽。
33.一種動物的治療方法，包括給予能誘導(dǎo)p53凋亡活性的有效劑量的如權(quán)利要求1～9中任一權(quán)利要求所述的核酸分子或如權(quán)利要求11或12所述的載體。
34.如權(quán)利要求32或33所述的方法，其中所述的治療是對癌癥的治療。
35.含有選自DGPEETD；GPEETD；TTLSDG；AEFGDE或PRNYFG的氨基酸序列的肽。
36.如權(quán)利要求35所述的肽，其中所述的肽的長度為至少6個氨基酸殘基。
37.如權(quán)利要求35所述的肽，其中所述的肽的長度選自至少7個氨基酸殘基；8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個氨基酸殘基。
38.如權(quán)利要求3 5所述的肽，其中所述的肽的長度選自至少20個氨基酸殘基；30、40、50、60、70、80、90或100個氨基酸殘基長度。
39.如權(quán)利要求35所述的肽，其中所述的肽由選自DGPEETD；GPEETD；TTLSDG；AEFGDE或PRNYFG的氨基酸序列構(gòu)成。
40.如權(quán)利要求35～39任一權(quán)利要求所述的肽，其中所述的肽進(jìn)一步包括多個精氨酸殘基。
41.如權(quán)利要求40所述的肽，其中所述的多個精氨酸殘基為至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個精氨酸殘基長度。
42.選自DGPEETD；GPEETD；TTLSDG；AEFGDE或PRNYFG的肽作為藥物的用途。
43.含有選自DGPEETD；GPEETD；TTLSDG；AEFGDE或PRNYFG的肽的藥物組合物。
44.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中所述的組合物進(jìn)一步包括載體、稀釋劑或賦形劑。
45.含有至少一種如權(quán)利要求35～42中任一權(quán)利要求所述的肽和至少一種抗癌試劑的藥物組合物。
46.如權(quán)利要求45所述的藥物組合物，其中所述的抗癌試劑選自順鉑；卡鉑；環(huán)磷酰胺；美法侖；卡莫司??；氨甲蝶呤；5-氟尿嘧啶；阿糖胞苷；巰基嘌呤；柔紅霉素；阿霉素；表阿霉素；長春花堿；長春新堿；放線菌素；絲裂霉素C；紫杉醇；左旋天冬酰胺；G-CSF；依托泊甙；秋水仙素；甲磺酸去鐵胺；及喜樹堿。
47.如權(quán)利要求46所述的藥物組合物，其中所述的試劑為順鉑。
48.如權(quán)利要求46所述的藥物組合物，其中所述的試劑為阿霉素。
49.含有如權(quán)利要求35～42中任一權(quán)利要求所述的肽及抗體或其結(jié)合部分的復(fù)合物。
50.如權(quán)利要求49所述的復(fù)合物，其中所述的抗體或結(jié)合部分為細(xì)胞特異性抗體。
51.如權(quán)利要求49或50所述的復(fù)合物，其中所述的抗體為癌癥細(xì)胞特異性抗體。
52.一種優(yōu)選為人的動物的治療方法，包括給予有效劑量的如權(quán)利要求35～41中任一權(quán)利要求所述的肽，其中所述動物得益于由此誘導(dǎo)的凋亡作用。
53.一種優(yōu)選為人的動物的治療方法，包括給予有效劑量的如權(quán)利要求43～48中任一權(quán)利要求所述的組合物或如權(quán)利要求49～51中任一權(quán)利要求所述的復(fù)合物，其中所述動物得益于由此誘導(dǎo)的凋亡作用。
54.如權(quán)利要求52或53所述的方法，其中所述的治療是對癌癥的治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及多肽或其部分，其可抑制腫瘤抑制劑蛋白p53的促凋亡活性，并包括鑒定阻礙所述多肽活性的試劑的篩選方法。
文檔編號C07K14/47GK1692126SQ200380100536
公開日2005年11月2日 申請日期2003年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月7日
發(fā)明者盧欣, 帕特麗夏·庫瓦巴拉, 戴維·塞爾伍德 申請人:路德維希癌癥研究院, 基因研究有限公司, Ucl十字有限公司