專(zhuān)利名稱(chēng)：重組人干擾素α8多肽編碼cDNA序列、制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及重組人干擾素α-8(rhIFNα8)多肽編碼cDNA序列及其在大腸桿菌中的表達(dá)和藥物應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干擾素(Interferon，IFN)是由細(xì)胞分泌的一類(lèi)具有抗病毒等多種生物活性的蛋白質(zhì)。它通過(guò)直接或間接作用于細(xì)胞干擾素效應(yīng)基因，表達(dá)多種效應(yīng)蛋白，從而發(fā)揮多樣性的生物學(xué)功能，作為一種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)物質(zhì)，干擾素屬于細(xì)胞因子。
經(jīng)國(guó)際干擾素命名委員會(huì)正式確定名稱(chēng)的干擾素種類(lèi)有IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNω、IFNτ等幾種，同一型別的干擾素又分為若干亞型，其中IFNα研究最多。迄今為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從人基因組中克隆了20余個(gè)IFNα基因。
IFNα8基因先后由Yelverton E，Leung D，Weck P，et al.，(NucleicAcids Res 1981，9(3)731-741)Goeddel，D.V.，Leung，D，W.，Dull，t，J..，etal.，(Nature 1981，290(5801)20-26)Bowden DW，Mao J，GiU T，etal.，(Gene 1984，27(1)87-99)等作者于1981、1981、1984年克隆獲得。研究表明，IFNα8基因定位于染色體9P22上，編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物為189個(gè)aa，其中前23個(gè)aa為信號(hào)肽，成熟的編碼多肽為166個(gè)aa。發(fā)明者采用健康中國(guó)人外周血及胎肝組織標(biāo)本為原料，經(jīng)總RNA抽提，IFNα通用引物逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)，克隆獲得了中國(guó)人IFNα8基因(見(jiàn)圖1)，經(jīng)序列分析比較與先前國(guó)外作者報(bào)道的序列完全一致，這為本發(fā)明的進(jìn)行奠定了良好基礎(chǔ)。
有關(guān)IFNα8生物活性檢測(cè)的研究亦見(jiàn)諸報(bào)道，其中較有代表的是Foster GR et al.，等的報(bào)道，研究表明，人IFNα8干擾素在IFNα各亞型中具有最高的抗病毒活性，且能誘導(dǎo)U1突變細(xì)胞株產(chǎn)生抗病毒狀態(tài)。(Foster GR et al.，Different relative activities of humancell-derived interferon-alpha subtypesIFN-alpha 8 has very highantiviral potency.J.Interferon Cytokine Res，1996(12)1027-1033).
FinterNB et al.，等采用WISH(人)、Hela(人)、MDBK(牛)、L929(小鼠)、RK13(家兔)、Vero(猴)等細(xì)胞株比較了IFNα1、α2、α8、αC、αF、Le等多種型別干擾素的抗病毒活性，結(jié)果IFNα8無(wú)論采用哪個(gè)系統(tǒng)，其抗病毒活性均屬較高。研究發(fā)現(xiàn)，不同重組干擾素對(duì)NK細(xì)胞的促進(jìn)作用有90倍的差異，其中α8(B)、α2(A)、α1(D)、αC較高，α6(K)、αF較低，α7(J)最低。(FinterNB et al.，J.Interferon Cytokine Res，1991(s)185.)迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)于IFNα8的商業(yè)開(kāi)發(fā)仍未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種可大量表達(dá)、純化的，經(jīng)突變、優(yōu)化的IFNα8編碼cDNA序列。
本發(fā)明公開(kāi)的rhIFNα8cDNA序列具有序列1、2所示的基因序列和編碼氨基酸序列。該序列是在天然hIFNα8cDNA序列的基礎(chǔ)上，根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏愛(ài)性，在保證編碼氨基酸序列不變的情況下，經(jīng)突變后獲得的。所述的rhIFNα8多肽分子量大小為20kda，pI值為4.9。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問(wèn)題是公開(kāi)上述rhIFNα8在大腸桿菌中的表達(dá)方法。
天然的IFNα8cDNA序列克隆于pBV220載體上，導(dǎo)入大腸桿菌DH5α，經(jīng)檢測(cè)，基因不表達(dá)。采用DNA軟件分析發(fā)現(xiàn)，天然的IFNα8cDNA序列中含有許多大腸桿菌稀有密碼子，推測(cè)這可能就是IFNα8不表達(dá)的主要原因。本發(fā)明根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏愛(ài)性，在保證編碼氨基酸序列不變的情況下，人工合成了一段編碼基因均為大腸桿菌偏愛(ài)的IFNα8cDNA序列(見(jiàn)序列1)。為了進(jìn)一步提高目的基因表達(dá)水平，在IFNα8cDNA編碼區(qū)起始密碼子atg前還增加了一段核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列(見(jiàn)序列3)。此外，在IFNα8cDNA序列的5’端引入了EcoR I酶切位點(diǎn)，3’端終止密碼子(TAA)后增加了SalI酶切位點(diǎn)，進(jìn)而構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體pBV220/IFNα8，經(jīng)工程菌篩選，蛋白分離、純化、凍干后獲得目的蛋白。
本發(fā)明rhIFNα8在大腸桿菌中的表達(dá)包括下列步驟一、大腸桿菌重組表達(dá)載體pBV220/IFNα8的構(gòu)建1.IFNα8基因的亞克隆及與載體的連接首先將人工合成的IFNα8cDNA序列(序列1、2)及核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列(序列3)亞克隆在pUC18載體上，成pUC18/IFNα8。用EcoRI/Sal I雙酶切消化pUC18/IFNα8及大腸桿菌表達(dá)載體pBV220，回收IFNα8及載體片段。經(jīng)純化后，采用寶生物工程公司DNA連接試劑盒進(jìn)行連接(見(jiàn)圖2)，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，LB平板過(guò)夜培養(yǎng)。
2.工程菌篩選挑取LB平板上的陽(yáng)性菌落進(jìn)行酶切及測(cè)序鑒定。鑒定證實(shí)后的陽(yáng)性克隆接種于5ml液體LB培養(yǎng)液中，30℃，250rpn/min培養(yǎng)12-18小時(shí)。將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入50ml液體LB培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD值為0.4-0.6，突然提高溫度至42℃誘導(dǎo)4-5小時(shí)。離心收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果獲得了一株表達(dá)量很高的工程菌株。
二、工程菌發(fā)酵條件的摸索及優(yōu)化1.菌種的活化取-70℃、20％甘油保藏的菌種100ul，接種于含4ml LB培養(yǎng)基的試管中，加入氨芐青霉素使其終濃度為100ug/ml；32℃、220r/min培養(yǎng)10h左右，再按2％接種比例轉(zhuǎn)種于含50mlLB的三角瓶中，加入氨芐青霉素使其終濃度為100ug/ml；32℃、220r/min培養(yǎng)4h，成為活化種子液，4℃保存。
2.發(fā)酵種子液培養(yǎng)取活化的種子液，以1∶1000接種比例接種于含500ml LB培養(yǎng)基的1000ml三角瓶中，加入氨芐青霉素使其終濃度為100ug/ml。32℃、220r/min培養(yǎng)10h，OD600約為2.5。
3.發(fā)酵罐培養(yǎng)使用New Brunswick Scientific公司的BioFloIII型7L自動(dòng)控制發(fā)酵罐，發(fā)酵參數(shù)根據(jù)發(fā)酵液多參數(shù)監(jiān)測(cè)結(jié)果及經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行調(diào)整并優(yōu)化。
4.離心收菌得濕菌體5.菌體破碎三、重組蛋白IFNα8的分離、純化1.包涵體的洗滌(1)用20mM Tris.cl pH8.0，1mMEDTA洗滌破碎菌體，9000rpm×30min，棄上清。
(2)用0.2％Triton X-100，20mM Tris.cl pH8.0，1mM EDTA洗滌，9000rpm×30min，棄上清。
經(jīng)(1)、(2)洗滌，包涵體純度可達(dá)到了60％左右。
2.變性、復(fù)性、超濾(1)將洗滌好的包涵體以濕重計(jì)按1∶20(v/w)溶解于7M鹽酸胍，50mMTris.cl pH8.0，10mM β-巰基乙醇，10mM EDTA緩沖液中，室溫下攪拌4h，離心9000rpm×30min得透明上清液，即變性液。
(2)將變性液采用稀釋復(fù)性的方法進(jìn)行復(fù)性，復(fù)性緩沖液為2.5MVrea，50mMtris.cl，1mMETDA。復(fù)性時(shí)緩慢滴加變性液，使復(fù)性液蛋白終濃度為0.1-0.2mg/ml，復(fù)性時(shí)間36h。
(3)將蛋白復(fù)性液先過(guò)濾，再超濾(millipore)，得到超濾濃縮液。
3.柱層析純化(1)采用Q-sepharose FF陰離子交換柱先用20mM Tris.cl pH8.0平衡Q柱，再上樣，上樣完后首先用20mMTris.cl pH8.0洗脫，再用100mM NaCl階段洗脫，最后用400mMNaCl階段洗脫，280nm檢測(cè)洗脫蛋白峰，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，純度為85％左右。
(2)采用干擾素單抗層析柱先用PBS平衡抗干擾素單抗層析柱，再上樣，最后經(jīng)PBS洗脫，收集到蛋白峰，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白純度大于99％。
本發(fā)明所要解決的再一技術(shù)問(wèn)題是公開(kāi)上述rhIFNα8在制備治療人或動(dòng)物腫瘤及病毒感染性疾病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明rhIFNα8可作為上述藥物的活性成份，制備各種生理上可以接受的各種液體制劑或凍干制劑。
本發(fā)明所述的腫瘤，包括各種惡性腫瘤，如實(shí)體癌和漿液性腫瘤等。
本發(fā)明所述的病毒感染性疾病包括HBV、HCV、HIV、HSV、HPV或流感病毒等感染引起的疾病。
用本發(fā)明rhIFNα8進(jìn)行體外抗病毒活性及動(dòng)物試驗(yàn)I.體外抗病毒活性檢測(cè)方法的建立及檢測(cè)分析一、原理rhIFN-α8效價(jià)測(cè)定采用細(xì)胞病變抑制法。不同濃度的rhIFN-α8加入人羊膜wish細(xì)胞培養(yǎng)后，用VSV水泡性口炎病毒攻擊，通過(guò)比較標(biāo)準(zhǔn)品與待檢品對(duì)wish細(xì)胞的病變抑制程度，計(jì)算出待檢品生物活性效價(jià)。
二、材料人α型干擾素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所)rhIFN-α8待檢品wish細(xì)胞株MEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)染色液50mg結(jié)晶紫加入20ml乙醇中，加水至100ml脫色液50％乙醇，50％蒸餾水，0.1％乙酸96孔培養(yǎng)板(NUNC公司)酶標(biāo)儀(model 550，Bio-rad公司)三、方法1.用含10％牛血清的MEM培養(yǎng)液調(diào)整wish細(xì)胞濃度為3.0×105/mL接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μl；37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)4-6h。
2.標(biāo)準(zhǔn)品與待檢品均用含7％牛血清的MEM稀釋至103IU/ml作為上樣起始濃度，在稀釋板上進(jìn)行4倍倍比稀釋后，(8個(gè)稀釋度)分別加入96孔板，每孔50ul，(每個(gè)稀釋度設(shè)復(fù)孔)同時(shí)設(shè)立細(xì)胞、病毒對(duì)照；37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)18-24h。
3.細(xì)胞板棄上清，加入劑量為100TCID50VSV病毒液，每孔100ul；37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)24h。
4.棄上清，每孔加入50ul結(jié)晶紫染色液，室溫放置30min。
5.流水小心沖去染色液，吸干殘留水分。每孔加入100ul脫色液，室溫放置3-5min后于酶標(biāo)儀570、630nm處測(cè)定O.D值。
6.由對(duì)照品和待測(cè)品曲線比較求出待測(cè)品活性單位。
四、結(jié)果對(duì)本實(shí)驗(yàn)室三批rhIFN-α8純化樣品進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，結(jié)果比活性均在107-108IU/mg范圍內(nèi)，表明純化樣品已初步達(dá)到生物制品規(guī)程要求。
II.rhIFNα8對(duì)HBV DNA轉(zhuǎn)基因小鼠的治療作用1.實(shí)驗(yàn)材料重組人IFNα8試驗(yàn)品由成都地奧制藥集團(tuán)公司制備(純度大于99％)。
HBV DNA轉(zhuǎn)基因Balb/c小鼠由空軍廣州醫(yī)院提供，雌雄各半。出廠前血液經(jīng)ELISA法檢測(cè)HBsAg、HBeAg，定量PCR檢測(cè)HBVDNA拷貝數(shù)，肝組織采用免疫組化檢測(cè)HBsAg、HBeAg表達(dá)，證實(shí)上述指標(biāo)均陽(yáng)性。
HBsAg、HBeAg ELISA檢測(cè)試劑由華美生物工程公司提供。
HBsAg、HBcAg免疫組化檢測(cè)一抗、二抗均由Gibco公司提供。
HBV DNA定量采用中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因診斷中心HBV DNA定量檢測(cè)試劑盒在PE7700型PCR儀上進(jìn)行。
陽(yáng)性對(duì)照藥重組人IFNα1b由深圳科興生物制品公司提供。
2.實(shí)驗(yàn)方法HBV DNA轉(zhuǎn)基因Balb/c小鼠于SPF環(huán)境中飼養(yǎng)。隨機(jī)分成給藥組(IFNα8，10萬(wàn)IU/只，按體重/公斤算相當(dāng)于人用劑量100倍)、給藥組(IFNα8，1萬(wàn)IU/只，按體重/公斤算相當(dāng)于人用劑量的10倍)、陽(yáng)性對(duì)照組(IFNα1b，1萬(wàn)IU/只)、陰性對(duì)照組4組，每組6只。
用藥開(kāi)始前、用藥開(kāi)始后2周、4周、8周分別采取小鼠眶靜脈血各0.4ml，用藥開(kāi)始前、4周、8周分別手術(shù)采取小鼠肝組織標(biāo)本。
給藥組及陽(yáng)性對(duì)照組采用脛前肌肉注射法給予相應(yīng)藥物，隔日一次，共5次，陰性組采用同樣方法給予與陽(yáng)性組等量的0.9％NS液注射。
所取血液標(biāo)本用于ELISA檢測(cè)、HBV DNA定量檢測(cè)，肝組織標(biāo)本用于HBsAg、HBeAg免疫組化檢測(cè)。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)血清HBV DNA定量檢測(cè)結(jié)果表1 血清HBV DNA定量檢測(cè)結(jié)果(拷貝數(shù)/ml)給藥組 給藥組n n 陽(yáng)性對(duì)照組 n 陰性組 n(10萬(wàn)U/只) (1萬(wàn)U/只)治療前 3.51×1076 8.02×1066 4.42×1076 7.88×10762周3.90×1046 7.62×1036 7.88×1046 4.38×10664周1.25×1035 4.56×1035 6.42×1035 5.76×10768周6.50×1065 3.78×1065 5.35×1065 9.36×1076(2)血清HBsAg、HBeAg變化情況血清HBsAg在各組給藥前后均陽(yáng)性，陽(yáng)性率無(wú)變化。HBeAg在給藥前后陰性率變化見(jiàn)表2。
表2血清HBeAg陽(yáng)性率變化情況治療前 (％)2周 (％) 4周 (％) 8周 (％)給藥組 100 1006/66/6 4/5 (80％) 5/5 (100％)(10萬(wàn)U/只)％％給藥組100 1006/66/6 4/5 (80％) 5/5 (100％)(1萬(wàn)U/只) ％％陽(yáng)性組 6/6100 6/6 1006/6 (100％) 6/6 (100％)陰性組 6/6100 6/6 1006/6 (100％) 6/6 (100％)(3)肝組織免疫組化變化情況陽(yáng)性組及給藥組均見(jiàn)HBsAg表達(dá)減弱，HBcAg變化不明顯。
4.結(jié)論
IFNα8及IFNα1b對(duì)HBV DNA轉(zhuǎn)基因小鼠均具有抗病毒作用，大劑量及小劑量IFNα8療效無(wú)明顯差異。


圖1IFNα8基因瓊脂糖凝膠電泳圖其中M為核酸分子量Marker，由下至上依次為200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp，1為IFNα基因，長(zhǎng)度約500bp圖2重組表達(dá)載體pBV220/IFNα8質(zhì)粒構(gòu)建3pBV220/IFNα8重組表達(dá)載體酶切鑒定電泳圖其中M為核酸分子量Marker，由下至上依次為250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp、3000bp、3500bp、4000bp、5000bp、6000bp、8000bp、9000bp、10000bp、，1、2、3、4為pBV220/IFNα8載體基因，長(zhǎng)度約4500bp圖4pBV220/IFNα8工程菌發(fā)酵產(chǎn)物SDS-PAGE電泳圖其中M為蛋白質(zhì)分子量Marker，由下至上依次為14200da、20100da、24000da、29000da、36000da、45000da、66000da，1、2、3為pBV220/IFNα8載體表達(dá)產(chǎn)物，1、2為經(jīng)優(yōu)化發(fā)酵條件產(chǎn)物，目的基因表達(dá)產(chǎn)物約為22Kda圖5經(jīng)純化工程菌發(fā)酵液產(chǎn)物SDS-PAGE電泳圖其中M為蛋白質(zhì)分子量Marker，由下至上依次為14200da、20100da、24000da、29000da、36000da、45000da、66000da，1、2、3為pBV220/IFNα8載體表達(dá)產(chǎn)物，1為最終純化產(chǎn)物。目的基因表達(dá)產(chǎn)物約為22Kda具體實(shí)施方式
實(shí)施例1大腸桿菌重組表達(dá)載體pBV220/IFNα8的構(gòu)建1.IFNα8基因的突變和優(yōu)化根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏愛(ài)性，在保證編碼氨基酸序列不變的情況下，人工合成了一段編碼基因均為大腸桿菌偏愛(ài)的IFNα8 cDNA序列(見(jiàn)序列1)。為了進(jìn)一步提高目的基因表達(dá)水平，在IFNα8cDNA編碼區(qū)起始密碼子atg前還增加了一段核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列(見(jiàn)序列3)。此外，在IFNα8cDNA序列的5’端引入了EcoRI酶切位點(diǎn)，3’端終止密碼子(TAA)后增加了SalI酶切位點(diǎn)。
2.IFNα8基因的亞克隆及與載體的連接基因克隆及連接的具體方法參照薩姆布魯克等所著《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)。首先將人工合成的IFNα8 cDNA序列及核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列亞克隆在pUC18載體上，成pUC18/IFNα8。用EcoRI/Sal I雙酶切消化pUC18/IFNα8及大腸桿菌表達(dá)載體pBV220，回收IFα8及載體片段。經(jīng)純化后，采用寶生物工程公司DNA連接試劑盒進(jìn)行連接(見(jiàn)圖2)，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，LB平板過(guò)夜培養(yǎng)。
3.工程菌篩選挑取LB平板上的陽(yáng)性菌落進(jìn)行酶切及測(cè)序鑒定(酶切鑒定電泳見(jiàn)圖3)。鑒定證實(shí)后的陽(yáng)性克隆接種于5ml液體LB培養(yǎng)液中，30℃，250rpm/min培養(yǎng)12-18小時(shí)。將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入50ml液體LB培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD值為0.4-0.6，突然提高溫度至42℃誘導(dǎo)4-5小時(shí)。離心收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果獲得了一株表達(dá)量很高的工程菌株。
實(shí)施例2 工程菌發(fā)酵及IFNα8目的蛋白的分離純化工藝一、工程菌發(fā)酵1.培養(yǎng)液配制(1)種子液培養(yǎng)基500mlTryptone5gYeast Extract2.5gNaCl 5g加去離子水定容至500ml，在121℃，1.034×105Pa高壓蒸氣滅菌20min。
(2)基礎(chǔ)培養(yǎng)基Tryptone44gYeast Extract 22gNaCl 44g加去離子水定容至3800ml，隨發(fā)酵罐在121℃，1.034×105Pa高壓蒸氣滅菌20min。
(3)磷酸鹽緩沖液K2HPO4·3H2O 28.5gKH2PO417g加去離子水定容至120ml，在121℃，1.034×105Pa高壓蒸氣滅菌20min。
(4)補(bǔ)料培養(yǎng)基I葡萄糖 40g加去離子水定容至80mlMgSO4·7H2O 4g加去離子水定容至20ml在121℃，1.034×105Pa高壓蒸氣滅菌20min。
(5)補(bǔ)料培養(yǎng)基IITryptone20g加去離子水定容至100mlYeast Extract 40g加去離子水定容至200ml在121℃，1.034×105Pa高壓蒸氣滅菌20min。
維生素溶液 10ml微量金屬溶液10ml(6)補(bǔ)料培養(yǎng)基IIITryptone30g加去離子水定容至150mlYeast Extract 10g加去離子水定容至50ml葡萄糖 60g
加去離子水定容至120ml在121℃，1.034×105Pa高壓蒸氣滅菌20min。
2.菌種的活化取-70℃、20％甘油保藏的菌種100ul，接種于含4mlLB培養(yǎng)基的試管中，加入氨芐青霉素使其終濃度為100ug/ml；32℃、220r/min培養(yǎng)10h左右，再按2％接種比例轉(zhuǎn)種于含50mlLB的三角瓶中，加入氨芐青霉素使其終濃度為100ug/ml；32℃、220r/min培養(yǎng)4h，成為活化種子液，4℃保存。
3.發(fā)酵種子液培養(yǎng)取活化的種子液，以1∶1000接種比例接種于含500ml LB培養(yǎng)基的1000ml三角瓶中，加入氨芐青霉素使其終濃度為100ug/ml。32℃、220r/min培養(yǎng)10h，OD600約為2.5。
4.發(fā)酵罐培養(yǎng)使用New Brunswick Scientific公司的BioFloIII型7L自動(dòng)控制發(fā)酵罐，發(fā)酵參數(shù)如下time temp stir airpH PO2OD60000:0030-32℃2500.47.3100 接種01:0030-32℃2500.47.396.30.3202:0030-32℃2501.07.382.00.5403:0030-32℃2501.07.360.50.9604:0030-32℃3001.47.355.21.5405:0030-32℃3502.07.365.42.5206:0030-32℃3502.47.350.85.3507:0030-32℃4002.47.345.08.2008:0030-32℃4002.47.328.310.5309:0040-42℃4503.06.752.112.1610:0040-42℃4503.06.736.718.5611:0040-42℃4503.06.730.221.1212:0040-42℃4503.06.742.524.32注用HCl、NaOH調(diào)節(jié)pH，接種時(shí)加入磷酸鹽緩沖液，01:00用泵加入補(bǔ)料I；04:00用泵加入補(bǔ)料II；07:00用泵加入補(bǔ)料III。
5.離心收菌得濕菌體230g。
6.菌體破碎及凝膠電泳(SDS-PAGE電泳結(jié)果見(jiàn)圖4)。
二、蛋白質(zhì)分離、純化1.包涵體的洗滌(1)用20mM Tris.cl pH8.0，1mMEDTA洗滌，9000rpm×30min，棄上清。
(2)用0.2％Triton X-100，20mM Tris.cl pH8.0，1mM EDTA洗滌，9000rpm×30min，棄上清。
經(jīng)(1)、(2)洗滌，包涵體純度達(dá)到了60％左右。
2.變性、復(fù)性、超濾(1)將洗滌好的包涵體以濕重計(jì)按1∶20(v/w)溶解于7M鹽酸胍，50mMTris.cl pH8.0，10mM β-巰基乙醇，10mM EDTA緩沖液中，室溫下攪拌4h，離心9000rpm×30min得透明上清液，即變性液。
(2)將變性液采用稀釋復(fù)性的方法進(jìn)行復(fù)性，復(fù)性緩沖液為2.5MVrea，50mMtris.cl，1mMETDA。復(fù)性時(shí)緩慢滴加變性液，使復(fù)性液蛋白終濃度為0.1-0.2mg/ml，復(fù)性時(shí)間36h。
(3)將蛋白復(fù)性液先過(guò)濾，再超濾(millipore)，得到超濾濃縮液。
3.柱層析純化(1)采用Q-sepharose FF陰離子交換柱先用20mM Tris.cl pH8.0平衡Q柱，再上樣，上樣完后首先用20mMTris.cl pH8.0洗脫，再用100mM NaCl階段洗脫，最后用400mMNaCl階段洗脫，280nm檢測(cè)洗脫蛋白峰，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，純度為85％左右。
(2)采用干擾素單抗層析柱先用PBS平衡抗干擾素單抗層析柱，再上樣，最后經(jīng)PBS洗脫，收集到蛋白峰，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白純度大于99％(純化的目的蛋白SDS-PAGE電泳見(jiàn)圖5)。
序列表序列1、2 rhIFNα8cDNA基因序列、rhIFNα8cDNA基因氨基酸序列ATG TGT GAT CTT CCT CAG ACT CAT TCT CTT GGT AAT CGT CGT GCT 45Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg AlaCTT ATT CTT CTT GCT CAG ATG CGT CGT ATT TCT CCT TTT TCT TGT 90Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser CysCTT AAG GAT CGT CAT GAT TTT GAG TTT CCT CAG GAG GAG TTT GAT 135Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe AspGAT AAG CAG TTT CAG AAG GCT GAG GCT ATT TCT GTT CTT CAT GAG 180Asp Lys Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His GluATG ATT GAG CAG ACT TTT AAT CTT TTT TCT ACT AAG GAT TCT TCT 225Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser SerGCT GCT CTT GAT GAG ACT CTT CTT GAT GAG TTT TAT ATT GAG CTT 270Ala Ala Leu Asp Glu Thr Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Ile Glu LeuGAT CAG CAG CTT AAT GAT CTT GAG TCT TGT GTT ATG CAG GAG GTT 315Asp Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ser Cys Val Met Gln Glu ValGGT GTT ATT GAG TCT CCT CTT ATG TAT GAG GAT TCT ATT CTT GCT 360Gly Val Ile Glu Ser Pro Leu Met Tyr Glu Asp Ser Ile Leu AlaGTT CGT AAG TAT TTT CAG CGT ATT ACT CTT TAT CTT ACT GAG AAG 405Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu LysAAG TAT TCT TCT TGT GCT TGG GAG GTT GTT CGT GCT GAG ATT ATG 450Lys Tyr Ser Ser Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile MetCGT TCT TTT TCT CTT TCT ATT AAT CTT CAG AAG CGT CTT AAG TCT 495Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ile Asn Leu Gln Lys Arg Leu Lys SerAAG GAG TGA 504Lys Glu Trm序列3重組表達(dá)載體pBV220/IFNα8核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列圖GAA TTC aac agg aga ctt tct g atg
權(quán)利要求
1.重組人干擾素α-8，其特征在于具有下述基因序列ATG TGT GAT CTT CCT CAG ACT CAT TCT CTT GGT AAT CGT CGT GCT45Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg AlaCTT ATT CTT CTT GCT CAG ATG CGT CGT ATT TCT CCT TTT TCT TGT90Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser CysCTT AAG GAT CGT CAT GAT TTT GAG TTT CCT CAG GAG GAG TTT GAT 135Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe AspGAT AAG CAG TTT CAG AAG GCT CAG GCT ATT TCT GTT CTT CAT GAG 180Asp Lys Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His GluATG ATT CAG CAG ACT TTT AAT CTT TTT TCT ACT AAG GAT TCT TCT 225Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser SerGCT GCT CTT GAT GAG ACT CTT CTT GAT GAG TTT TAT ATT GAG CTT 270Ala Ala Leu Asp Glu Thr Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Ile Glu LeuGAT CAG CAG CTT AAT GAT CTT GAG TCT TGT GTT ATG CAG GAG GTT 315Asp Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ser Cys Val Met Gln Glu ValGGT GTT ATT GAG TCT CCT CTT ATG TAT GAG GAT TCT ATT CTT GCT 360Gly Val Ile Glu Ser Pro Leu Met Tyr Glu Asp Ser Ile Leu AlaGTT CGT AAG TAT TTT CAG CGT ATT ACT CTT TAT CTT ACT GAG AAG 405Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu LysAAG TAT TCT TCT TGT GCT TGG GAG GTT GTT CGT GCT GAG ATT ATG 450Lys Tyr Ser Ser Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile MetCGT TCT TTT TCT CTT TCT ATT AAT CTT CAG AAG CGT CTT AAG TCT 495Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ile Asn Leu Gln Lys Arg Leu Lys SerAAG GAG TGA 504Lys Glu Trm
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人干擾素α-8，其特征在于所述的rhIFNα8多肽分子量大小為22kda，pI值為4.9。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人干擾素α-8在大腸桿菌中的表達(dá)方法，其特征在于在IFNα8 cDNA編碼區(qū)起始密碼子atg前增加一段核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列，在IFNα8 cDNA序列的5’端引入EcoRI酶切位點(diǎn)，3’端終止密碼子TAA后增加SalI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體pBV220/IFNα8，然后經(jīng)工程菌篩選，蛋白分離、純化、凍干后獲得目的蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組人干擾素α-8在大腸桿菌中的表達(dá)方法，其特征在于其中所述的在IFNα8 cDNA編碼區(qū)起始密碼子atg前增加一段核糖體結(jié)合位點(diǎn)，其序列為GAA TTC aac agg aga ctt tct g atg
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組人干擾素α-8在大腸桿菌中的表達(dá)方法，其特征在于所述的大腸桿菌表達(dá)載體為pBV220。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組人干擾素α-8在大腸桿菌中的表達(dá)方法，其特征在于其中所述的大腸桿菌重組表達(dá)載體pBV220/IFNα8的構(gòu)建包括1)IFNα8基因的亞克隆及與載體的連接將IFNα8 cDNA序列及核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列亞克隆在pUC18載體上，成pUC18/IFNα8；用EcoRI/SalI雙酶切消化pUC18/IFNα8及大腸桿菌表達(dá)載體pBV220，回收IFNα8及載體片段，經(jīng)純化后，采用DNA連接試劑盒進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，LB平板過(guò)夜培養(yǎng)；2)工程菌篩選挑取LB平板上的陽(yáng)性菌落進(jìn)行酶切及測(cè)序鑒定；鑒定證實(shí)后的陽(yáng)性克隆接種于5ml液體LB培養(yǎng)液中，30℃，250rpm/min培養(yǎng)12-18小時(shí)；將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入50ml液體LB培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD值為0.4-0.6，突然提高溫度至42℃誘導(dǎo)4-5小時(shí)；離心收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，即得。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組人干擾素α-8在大腸桿菌中的表達(dá)方法，其特征在于其中所述的重組蛋白IFNα8的分離、純化包括1)包涵體的洗滌(1)用20mM Tris.cl pH8.0，1mMEDTA洗滌破碎菌體，9000rpm×30min，棄上清；(2)用0.2％Triton X-100，20mM Tris.cl pH8.0，1mM EDTA洗滌，9000rpm×30min，棄上清；2)變性、復(fù)性、超濾(1)將洗滌好的包涵體以濕重計(jì)按1∶20(v/w)溶解于7M鹽酸胍，50mMTris.cl pH8.0，10mM β-巰基乙醇，10mM EDTA緩沖液中，室溫下攪拌4h，離心9000rpm×30min得透明上清液，即變性液；(2)將變性液采用稀釋復(fù)性的方法進(jìn)行復(fù)性，復(fù)性緩沖液為2.5MVrea，50mMtris.cl，1mMETDA。復(fù)性時(shí)緩慢滴加變性液，使復(fù)性液蛋白終濃度為0.1-0.2mg/ml，復(fù)性時(shí)間36h；(3)將蛋白復(fù)性液先過(guò)濾，再超濾(millipore)，得到超濾濃縮液；3)柱層析純化(1)采用Q-sepharose FF陰離子交換柱先用20mM Tris.cl pH8.0平衡Q柱，再上樣，上樣完后首先用20mMTris.cl pH8.0洗脫，再用100mM NaCl階段洗脫，最后用400mMNaCl階段洗脫，280nm檢測(cè)洗脫蛋白峰；(2)采用干擾素單抗層析柱先用PBS平衡抗干擾素單抗層析柱，再上樣，最后經(jīng)PBS洗脫，收集到蛋白峰。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組人干擾素α-8在大腸桿菌中的表達(dá)方法，其特征在于用該方法獲得的重組人干擾素α-8，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白純度大于99％。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人干擾素α-8在制備治療人或動(dòng)物腫瘤及病毒感染性疾病藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組人干擾素α-8的應(yīng)用，其特征在于rhIFNα8可作為上述藥物的活性成份，制備各種生理上可以接受的各種液體制劑或凍干制劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組人干擾素α-8的應(yīng)用，其特征在于所述的腫瘤，包括各種惡性腫瘤，如實(shí)體癌和漿液性腫瘤等。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組人干擾素α-8的應(yīng)用，其特征在于所述的病毒感染性疾病包括HBV、HCV、HIV、HSV、HPV或流感病毒等感染引起的疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組人干擾素α8多肽及其在大腸桿菌中的表達(dá)和應(yīng)用。本發(fā)明重組人干擾素α8是根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏愛(ài)性，經(jīng)編碼cDNA序列突變獲得的。為提高目的蛋白表達(dá)水平、純化效率，又對(duì)cDNA序列進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體pBV220/IFN α8，經(jīng)工程菌篩選，蛋白分離、純化、凍干后獲得。本發(fā)明重組人干擾素α8多肽可用于腫瘤或HBV、HCV、HIV等病毒感染性疾病的治療。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1534044SQ0311605
公開(kāi)日2004年10月6日 申請(qǐng)日期2003年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月28日
發(fā)明者茍興華, 陳守春, 李伯剛, 劉忠榮, 韓雷, 李德華, 梁波, 劉玉應(yīng) 申請(qǐng)人:成都地奧制藥集團(tuán)有限公司