自組裝多肽d-RADA16-RGD及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，設(shè)及一種自組裝多膚d-RADA16-RGD及 其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨缺損是指由于外傷、感染、腫瘤切除或先天性疾病等導(dǎo)致的骨質(zhì)缺如，破壞了骨 骼的連續(xù)性和完整性而形成較大的間隙。隨著建筑、交通事故W及人口老齡化的增加，骨缺 損患者日趨增多，對(duì)患者的生活質(zhì)量及社會(huì)的衛(wèi)生事業(yè)投入有重要的影響。大段骨缺損無(wú) 法自行愈合，其修復(fù)需要有天然或者人造的材料支架提供結(jié)構(gòu)支撐和骨誘導(dǎo)作用。如何選 擇或者制備既有良好生物活性又有適當(dāng)生物力學(xué)性能的可推廣的天然或者人造骨修復(fù)材 料是加快骨形成和提高骨愈合質(zhì)量的前提，也是生物醫(yī)學(xué)工程和臨床工作者研究的熱點(diǎn)和 難點(diǎn)。
[0003] 目前應(yīng)用于臨床或者在研的骨修復(fù)材料眾多，但均難W兼有良好生物活性和適當(dāng) 生物力學(xué)性能。自體骨材料移植是骨缺損移植的金標(biāo)準(zhǔn)，成骨能力強(qiáng)，成骨迅速。但是自體 骨移植難W在臨床推廣，主要面臨的挑戰(zhàn)是：1)W創(chuàng)傷修復(fù)創(chuàng)傷，取骨量有限；2)供骨區(qū)形 成新的骨缺損，易發(fā)生骨區(qū)疼痛、傷口感染等并發(fā)癥;3)移植骨與骨缺損的形態(tài)、大小等方 面難W很好的匹配等。而同種異體骨或異種異體骨面臨著新骨替代緩慢、生物力學(xué)性狀差、 骨來(lái)源受限等問(wèn)題，還可引起免疫排異反應(yīng)、疾病傳播等風(fēng)險(xiǎn)。人造骨材料主要有生物陶瓷 (如徑基憐灰石、憐酸Ξ巧和生物活性玻璃)和骨水泥(如憐酸巧骨水泥和丙締酸醋類骨水 泥)等，其來(lái)源廣泛，具有較好的生物相容性，但吸收及降解緩慢甚至不降解、需二次手術(shù)取 出，骨誘導(dǎo)及成骨能力較差，導(dǎo)致骨修復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)和愈合質(zhì)量降低。鑒于運(yùn)些現(xiàn)狀，研究出 既有自體骨的優(yōu)點(diǎn)，又可批量化生產(chǎn)的復(fù)合生物活性材料用于骨移植是當(dāng)今治療骨缺損研 究的熱點(diǎn)。
[0004] Zhang等發(fā)現(xiàn)第一條自組裝短膚（Self-assembly peptide，SAP)，命名為Zuotin， 膚序列為n-AEAEAKAKAEAEAKAK-c化AKl6-Π )，其中A為丙氨酸，E為谷氨酸，Κ為賴氨酸。在水 溶液或者人體內(nèi)的體液環(huán)境中，ΕΑΚ16-ΙΙ帶有疏水端殘基(丙氨酸構(gòu)成)和親水端殘基(帶 正電荷的賴氨酸和帶負(fù)電荷的谷氨酸構(gòu)成）。依靠其化學(xué)互補(bǔ)性和結(jié)構(gòu)的兼容性，自組裝短 膚在適當(dāng)?shù)臈l件下，能自發(fā)地形成β-sheet二級(jí)結(jié)構(gòu)，再組裝成有序排列的納米纖維，繼而 相互交織成Ξ維支架。后大量的科學(xué)實(shí)驗(yàn)致力于研究自組裝短膚的設(shè)計(jì)、制備W及生物學(xué) 應(yīng)用，包括 RAD16-1 (n-RADARADARADARADA-c )，RAD16-11 (n-RARADADARARADADA-c )，ΕΑΚ16-1 (n-AEAKAEAKAEAKAEAK-c)，EAK16-Π (n-AEAEAKAKAEAEAKAK-c)等。納米纖維的直徑在 10- 20皿之間，而交織后形成的Ξ維支架孔徑波動(dòng)在5-200皿之間，其形成的微環(huán)境與細(xì)胞外基 質(zhì)非常相似。自組裝多膚來(lái)源于氨基酸的合成，所形成的Ξ維支架具有良好的組織相容性、 生物活性和可降解性。更重要的是，它不但能作為緩慢釋放生長(zhǎng)因子、藥物的載體，而且功 能基序（functional motif，F(xiàn)M)如RGD，IKVAV，YIGSR和PHSRN應(yīng)用于多膚修飾，能顯著提高 其生物活性。
[0005] 自組裝短膚可分為左旋短膚和右旋短膚，目前多數(shù)研究主要集中在左旋自組裝短 膚，并發(fā)現(xiàn)其在骨、軟骨、屯、肌、神經(jīng)和創(chuàng)傷修復(fù)等方面有重要應(yīng)用前景。而右旋自組裝短膚 研究甚少。有研究證實(shí)右旋氨基酸組成的膚鍵較左旋氨基酸組成的膚鍵更加穩(wěn)定，對(duì)抵制 體內(nèi)生物蛋白酶的降解和作為生物材料移植可能有一定的價(jià)值。已有研究發(fā)現(xiàn)右旋自組裝 短膚在止血和創(chuàng)傷修復(fù)的潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明所要解決現(xiàn)有自組裝短膚多為左旋，右旋自組裝短膚研究較少 的問(wèn)題，提供一種自組裝多膚d-RADA16-RGD及其制備方法和應(yīng)用。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一種自組裝多膚d-RADA16-RGD，所述多膚 序列為：
[000引 Ac-(Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala)2-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Se;r-C0N 出。 [0009]進(jìn)一步的，組成所述多膚的氨基酸均為右旋氨基酸。
[0010]本發(fā)明還公開(kāi)了一種自組裝多膚d-RADA16-RGD的制備方法，膚鏈合成采用化oc/ PyBOP方法，在合成儀上將Rink Amide樹脂置于反應(yīng)容器，加入巧甲氧幾基-氨基酸進(jìn)行反 應(yīng)，一個(gè)氨基酸拼接完成后，再拼接下一個(gè)氨基酸，所述巧甲氧幾基-氨基酸的加入順序按 照所述多膚序列從C端的順序加入，每個(gè)巧甲氧幾基-氨基酸加入同時(shí)，加入與所述巧甲氧 幾基-氨基酸等量的六氣憐酸苯并Ξ挫-1-基-氧基Ξ化咯烷基憐(PyBOP)試劑、1-徑基苯并 =挫化0BT)試劑和甲基嗎嘟(NMM)試劑。
[0011] 進(jìn)一步的，包括W下步驟：
[0012] 1)用N，N-二甲基甲酯胺(DMF)浸泡反應(yīng)容器中的Rink Amide樹脂，浸泡洗涂后加 入相同摩爾的第一個(gè)氨基酸Fmoc-Ser (tBu)-OH、所述PyBOP試劑、冊(cè)BT試劑和NMM試劑，反應(yīng) 20分鐘；
[OOU] 2)然后用DMF洗涂，再加入配制好的六氨化晚溶液，此步用來(lái)脫除樹脂上的巧甲氧 幾基保護(hù)基團(tuán)，浸泡大約10分鐘，在脫除巧甲氧幾基后，用DMF或二氯甲燒洗涂所述Rink Amide樹脂，把六氨化晚清洗干凈，W確保下一步反應(yīng)的順利進(jìn)行(六氨化晚顯強(qiáng)堿性，不利 于接膚反應(yīng)）；
[0014] 3)取反應(yīng)的第二個(gè)氨基酸Fmoc-Asp(0tBu)-OH和相同摩爾的所述PyBOP試劑、NMM 試劑和冊(cè)BT試劑，然后一起加入到已經(jīng)脫掉巧甲氧幾基基團(tuán)的Lys-Merrifield resin中， 反應(yīng)20分鐘；
[0015] 4)重復(fù)步驟2);
[0016] 5)選擇合適的巧甲氧幾基-氨基酸，重復(fù)步驟3)和步驟4)，總計(jì)進(jìn)行22個(gè)循環(huán)；
[0017] 6)接完多膚的所述化nk Amide樹脂用甲醇清洗后干燥，然后加入無(wú)水甲醇并冰浴 至|J-20°C時(shí)緩慢的通入氨氣，使其溫度保持在(TCW下，通入氨氣時(shí)間為90分鐘，然后密封振 搖24小時(shí)取出，過(guò)濾收集濾液并濃縮抽干(運(yùn)一步是將多膚從樹脂上切下并酷胺化），再加 入事先配好并預(yù)冷的切膚試劑，25°C下攬拌反應(yīng)3小時(shí)，取出過(guò)濾，收集濾液；所述Rink Amide樹脂用少量Ξ氣乙酸洗涂，將洗涂液與所述濾液合并，濃縮后冷卻，然后加入冷乙酸 使多膚沉淀，離屯、收集沉淀，真空干燥，得粗品。
[0018] 7)將所述粗品用高效液相色譜法純化后即得。
[0019] 進(jìn)一步的，所述切膚試劑包括氣乙酸(TFA)、苯硫基甲燒(thioanisole)、苯酪 (地enol)、水(water)、甲乙硫酸化DT)和異丙基硅烷(TIS)。
[0020] 進(jìn)一步的，所述切膚試劑W質(zhì)量百分比計(jì)包括:Ξ氣乙酸(TFA)81.5%、苯硫基甲 燒(thioanisole)5%、苯酪(phenol)5%、水(water)5%、甲乙硫酸化DT)2.5%和Ξ異丙基 硅烷(TIS)l%。
[0021 ]進(jìn)一步的，所述六氨化晚溶液為30%六氨化晚的DMF溶液。
[0022 ] 本發(fā)明還公開(kāi)了上述自組裝多膚d-RADAl 6-RGD在制備組織工程材料中的應(yīng)用。
[0023] 進(jìn)一步的，所述多膚序列為：
[0024] Ac-(Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala)2-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Se;r-C0N 出。
[0025] 進(jìn)一步的，所述組織工程材料包括人造骨修復(fù)材料。
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可W獲得包括W下技術(shù)效果：
[0027] 1)本發(fā)明設(shè)計(jì)并合成了自組裝多膚d-RADA16-RGD:多膚序列Ac-(Arg-Ala-Asp- Ala-Arg-Ala-Asp-Ala)2-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Se;r-CONH2,所有組成的氨基酸為右旋氨基 酸，且多膚經(jīng)功能基序RGD修飾。
[00%] 2)本發(fā)明的自組裝多膚d-RADA16-RGD來(lái)源于氨基酸的合成，所形成的Ξ維支架具 有良好的組織相容性和生物活性。更重要的是，它不但能作為緩慢釋放生長(zhǎng)因子、藥物的載 體，而且功能基序（functional motif，F(xiàn)M)如RGD應(yīng)用于短膚修飾，能顯著提高其骨誘導(dǎo)性 和成骨能力。
[0029] 3)本發(fā)明的自組裝多膚d-RADA16-RGD，制備方法簡(jiǎn)單，使用方便，易于操作，骨修 復(fù)效果好，對(duì)骨修復(fù)具有重要促進(jìn)作用，能廣泛應(yīng)用于臨床骨缺損病癥。
[0030] 當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品必不一定需要同時(shí)達(dá)到W上所述的所有技術(shù)效果。
【附圖說(shuō)明】
[0031] 此處所說(shuō)明的附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā) 明的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：
[0032] 圖1為本發(fā)明自組裝多膚d-RADA16-RGD實(shí)施例中的圓二色譜圖。
[0033] 圖2為本發(fā)明自組裝多膚d-RADA16-RGD實(shí)施例中的透射電鏡圖。
[0034] 圖3為本發(fā)明自組裝多膚d-RADA16-RGD實(shí)施例中的流變儀分析圖。
[0035] 圖4A為本發(fā)明自組裝多膚d-RADA16-RGD應(yīng)用實(shí)施例中股骨外側(cè)裸缺損修復(fù)術(shù)1- RADA1