專利名稱：人肝癌相關(guān)基因laptm4b的一個(gè)等位基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域中的一個(gè)等位基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用，特別是涉及人肝癌相關(guān)基因LAPTM4B的一個(gè)等位基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，據(jù)報(bào)道，全世界原發(fā)性肝癌每年的新增患者數(shù)超過(guò)100萬(wàn)人，其中70％集中在亞洲。我國(guó)肝癌患者約占全世界肝癌患者的40-45％，每年新增肝癌患者45萬(wàn)，并且呈不斷上升趨勢(shì)。肝癌不僅發(fā)病率高，而且隱匿、發(fā)展快、復(fù)發(fā)率和死亡率高，被稱為“癌中之王”。到醫(yī)院就診的肝癌患者大多為中或晚期，若不治療自然病程一般僅3-6個(gè)月。
腫瘤本質(zhì)上是細(xì)胞的遺傳性疾病。與肝癌相關(guān)的基因雖已發(fā)現(xiàn)很多，但肝癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制仍然不甚明了。目前發(fā)現(xiàn)的原癌基因按其編碼產(chǎn)物在細(xì)胞的定位及功能大體可以歸為四類，一類是編碼生長(zhǎng)因子的基因，包括sis、int-2、hst、fgf-5；第二類是編碼生長(zhǎng)因子受體的基因，包括erbB、erbB-2、fms、met、ros等；第三類是編碼細(xì)胞質(zhì)中信號(hào)傳導(dǎo)分子的基因，包括abl、src、ras、raf、yes、fgr、fes、lck、mos等；第四類是編碼細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)控分子的基因，包括，bcl-1、bcl-2等；第五類是編碼細(xì)胞核里同DNA相結(jié)合的蛋白質(zhì)(轉(zhuǎn)錄因子)的基因，例如myc、myb、fos、jun、B-lym、ski、ets、rel等基因。研究證實(shí)，和HCC的發(fā)生密切相關(guān)的主要有ras、src、myc、met、p53等基因。
闡明肝癌發(fā)病機(jī)制將有助于肝癌的預(yù)防、診斷和治療。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌的發(fā)病與個(gè)體的遺傳易感性相關(guān)。不同遺傳背景的個(gè)體對(duì)環(huán)境致癌因子的處理能力存在差異，導(dǎo)致個(gè)體患癌風(fēng)險(xiǎn)不同。個(gè)體的這種腫瘤遺傳易感性不同之本質(zhì)在于基因的多態(tài)型和多樣性。
本發(fā)明的發(fā)明人克隆了一個(gè)與人肝癌相關(guān)的基因LAPTM4B(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?2158110.X)，發(fā)現(xiàn)該基因在正常肝組織低表達(dá)，而在96.88％(31/32)人肝癌組織中表達(dá)上調(diào)。上調(diào)的程度與肝癌細(xì)胞的分化程度相關(guān)低分化者顯著上調(diào)，而高分化者上調(diào)較輕。在部分配對(duì)非癌肝組織中也可見表達(dá)輕度升高。研究表明LAPTM4B在細(xì)胞的增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)所啟動(dòng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中，以及肝癌的發(fā)生過(guò)程中扮演極其重要的角色。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)人肝癌相關(guān)基因LAPTM4B的等位基因及其編碼產(chǎn)物。
本發(fā)明所提供的人肝癌相關(guān)基因LAPTM4B的等位基因命名為L(zhǎng)APTM4B*2，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中的SEQ ID №1由2264個(gè)堿基組成，其讀碼框?yàn)樽?’端第17到1129位堿基。其中含有兩個(gè)拷貝的19bp DNA片段，19bp DNA片段的序列為gcttgg agctccagcagct。這兩個(gè)拷貝的19bp DNA片段在LAPTM4B等位基因nt124-nt161。
人肝癌相關(guān)基因的等位基因LAPTM4B*2編碼的蛋白LAPTM4B*2，是具有序列表中序列2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中的序列2是由370個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。
為了確定LAPTM4B的不同基因型與肝癌易感性的關(guān)系，本發(fā)明對(duì)基因組DNA進(jìn)行了LAPTM4B分型，將人肝癌相關(guān)基因LAPTM4B命名為L(zhǎng)APTM4B*1，在人群中得到的LAPTM4B的基因型別為*1/*1、*1/*2和*2/*2。研究發(fā)現(xiàn)基因型*2/*2的個(gè)體患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)比非*2/*2型個(gè)體高2.89倍，表明LAPTM4B *2/*2與肝癌的易感性密切相關(guān)。因此本發(fā)明提供的人肝癌相關(guān)基因LAPTM4B的等位基因LAPTM4B*2可以作為篩查肝癌易感人群和高危人群之目標(biāo)物的應(yīng)用，特別是基因型為L(zhǎng)APTM4B*2/*2者作為篩查肝癌易感和高危人群之靶標(biāo)物的準(zhǔn)確性更大。因此，由LAPTM4B*2/*2表達(dá)的蛋白質(zhì)或其抗體或者自人基因組中擴(kuò)增捕獲LAPTM4B的物質(zhì)為活性成分的試劑可用于制備篩查肝癌高危人群的試劑。
為了確定LAPTM4B基因型與其它癌癥易感性的關(guān)系，本發(fā)明對(duì)食道癌患者的LAPTM4B基因型的分布頻率進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)LAPTM4B與食道癌易感性無(wú)關(guān)。
為了確定等位基因*1和*2是否存在表達(dá)活性的差異，以及探索5’非翻譯區(qū)的19bp核苷酸序列在基因表達(dá)過(guò)程中所扮演的可能角色，本發(fā)明構(gòu)建了熒光素酶為報(bào)告基因的報(bào)告質(zhì)粒pGL3-*1/Luc和pGL3-*2/Luc，并通過(guò)轉(zhuǎn)染人肝癌BEL7402細(xì)胞分析了報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性，結(jié)果表明等位基因*2中的19bp的重復(fù)片段抑制了BEL7402細(xì)胞中啟動(dòng)子的活性，因此，19bp的重復(fù)片段在BEL7402細(xì)胞中可能為負(fù)性調(diào)控因子。
含有SEQ ID №1所述序列的表達(dá)載體及含有SEQ ID №1序列的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明公開了LAPTM4B的等位基因LAPTM4B*2，對(duì)基因組DNA進(jìn)行了LAPTM4B分型，并研究了不同基因型與肝癌易感性的關(guān)系以及與其它腫瘤的易感性的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)了其中一個(gè)基因型LAPTM4B*2/2與肝癌的易感性密切相關(guān)，從而為原發(fā)性肝癌易感和高危人群的篩查之準(zhǔn)確性提供了新的更確切的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)易患肝癌的高風(fēng)險(xiǎn)人群的評(píng)估和預(yù)防具有重大的意義。另外還可將LAPTM4B*2基因作為肝癌治療的靶基因，例如可通過(guò)最新發(fā)展的siRNA干擾技術(shù)阻抑LAPTM4B基因的表達(dá)；以及將LAPTM4B*2蛋白作為藥物作用的新靶點(diǎn)，研制以LAPTM4B*2蛋白為靶點(diǎn)的新藥。因此，有可能開發(fā)出抗肝癌的新途徑，是一項(xiàng)將產(chǎn)生重大社會(huì)效益的工程。
下面結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。


圖1為L(zhǎng)APTM4B等位基因的部分片段圖2為L(zhǎng)APTM4B的基因分型圖3等位基因*1和*2在BEL7402細(xì)胞系中表達(dá)活性的比較具體實(shí)施方式
患者及其正常對(duì)照組的來(lái)源所有57例肝癌患者年齡在35-70歲之間，平均年齡為54±6.0歲，男性患者50名，女性7名。外科組織來(lái)自外科手術(shù)。對(duì)照組B包括209名新生兒。采用新生兒出生時(shí)的臍靜脈血作為樣本。
所有109名食道癌患者年齡在30-70歲之間，平均年齡為55±5.4歲，男/女比例為76/33。外科組織來(lái)自外科手術(shù)。正常對(duì)照組S為116名無(wú)癥狀和臨床檢驗(yàn)沒有患食道癌的人群。外周血樣品被用來(lái)分離提取基因組DNA。
統(tǒng)計(jì)方法采用x2檢驗(yàn)和單因素ANOVA方差分析處理數(shù)據(jù)實(shí)施例1、LAPTM4B等位基因的克隆和測(cè)序
(1)DNA的分離根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的苯酚-氯仿法，從正常人、肝癌或食道癌患者的血液淋巴細(xì)胞或外科組織中提取基因組DNA。
(2)克隆和測(cè)序根據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?2158110.X的中國(guó)專利中的LAPTM4B基因序列3，設(shè)計(jì)合成了兩個(gè)引物(見圖1A)，F(xiàn)1(nt-1492--1472)5’GCGCTCGAGGCTCCAGGTGGAAGAGTGTGC 3’(5’末端引入XhoI酶切位點(diǎn)，即劃線部分)；R1(nt 16-35)5’GCGAAGCTTGGACTTGGCCATGTGACCCG 3’(5’末端引入HindIII酶切位點(diǎn)，即劃線部分)，通過(guò)PCR法從基因組DNA中克隆LAPTM4B第一外顯子的啟動(dòng)子及其前續(xù)部分的序列。
PCR產(chǎn)物用XhoI和HindIII酶切后克隆到熒光素酶載體pGL3-Basic(Promega)的多接頭連接位點(diǎn)上，得到pGL3-LAPTM4B，并進(jìn)行測(cè)序。
得到了LAPTM4B的一個(gè)新的等位基因，命名為L(zhǎng)APTM4B*2，同時(shí)將原來(lái)的LAPTM4B序列命名為L(zhǎng)APTM4B*1序列。LAPTM4B*2的序列為序列表中序列1。圖1(A)為L(zhǎng)APTM4B的啟動(dòng)子和第一外顯子的示意圖。長(zhǎng)方形框表示第一外顯子，黑色部分為編碼區(qū)，白色部分為非編碼區(qū)，灰色部分為19bp的DNA序列。橫線表示啟動(dòng)子，F(xiàn)1、F2、R1、R2分別為四條引物。該序列以起始密碼子ATG中的A編為+1。圖1(B)為L(zhǎng)APTM4B等位基因的部分序列和色譜圖。用下劃線標(biāo)記的是19bp的DNA序列。結(jié)果表明，LAPTM4B*1中含有一個(gè)拷貝的19bp DNA序列，LAPTM4B*2含有兩個(gè)拷貝的19bp DNA序列，并且它們銜接在LAPTM4B*1第一外顯子的5’非編碼區(qū)(nt-33--15)。
實(shí)施例2、LAPTM4B的基因分型設(shè)計(jì)一個(gè)以PCR為基礎(chǔ)的方法對(duì)正常人和肝癌患者血液樣品中的LAPTM4B進(jìn)行基因分型。根據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?2158110.X的中國(guó)專利申請(qǐng)中的LAPTM4B基因序列3中的19bp DNA序列的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)合成了兩個(gè)引物，F(xiàn)2(nt-85--65)5’GCCGACTAGGGGACTGGCGGA 3’；R2(nt 99-119)5’CGAGAGCTCCGAGCTTCTGCC 3’。
以基因組DNA為模板擴(kuò)增第一外顯子的部分序列。PCR條件96℃預(yù)變性5分鐘；94℃ 30秒，68℃30秒，72℃1分鐘，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果見圖2。泳道1，6，12，13表示LAPTM4B*1/*1中的204bp的核苷酸片段，泳道5，8，9，14，15表示LAPTM4B*2/*2中的223bp的核苷酸片段。泳道2，3，4，7，10，11表示LAPTM4B*1/*2中含有204bp和223bp兩個(gè)核苷酸片段。泳道M為Marker。結(jié)果表明在純合基因?qū)?1/*1或*2/*2中分別只有204bp或223bp DNA片段被擴(kuò)增，而在雜合基因?qū)?1/*2中，204bp和223bp的DNA片段同時(shí)被擴(kuò)增。因此，在中國(guó)人群中LAPTM4B的基因型可分為L(zhǎng)APTM4B*1/*1，*1/*2和*2/*2。
實(shí)施例3、肝癌患者和正常人群的LAPTM4B基因型和等位基因的分布本發(fā)明分析了209例中國(guó)正常人群和57例肝癌患者，其基因型出現(xiàn)的頻率比較見表1，用Hardy-Weinberg方程進(jìn)行數(shù)學(xué)期望分析結(jié)果。肝癌患者和正常人群的LAPTM4B等位基因*1和*2的頻率有顯著差異，其比例分別為0.51750.6746和0.48250.3254。正常人群出現(xiàn)LAPTM4B等位基因*1和*2的頻率分別為0.6746和0.3254，肝癌患者出現(xiàn)LAPTM4B等位基因*1和*2的頻率分別為0.5175和0.4825。肝癌組的基因型*1/*1(P＝0.029)和*2/*2(P＝0.003)出現(xiàn)的頻率與其對(duì)應(yīng)的正常對(duì)照組相比具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在肝癌組中，只有29.8％為基因型*1/*1，正常對(duì)照組中有45.93％為基因型*1/*1。而肝癌組中基因型*2/*2的頻率為26.32％，與對(duì)照組的11.01％相比，其出現(xiàn)的頻率顯著增加(P＜0.01)。分析表明基因型*2/*2的個(gè)體患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)比是*2/*2型個(gè)體的2.89倍。因此，LAPTM4B*2/*2等位基因與肝癌易感性相關(guān)。
如表2所示，不同基因型的患者并沒有表現(xiàn)出肝癌級(jí)別、階段或HBV感染的差異，83.3％患者HBV陽(yáng)性。
表1 肝癌患者和正常人群的LAPTM4B基因型的分布N(％) P值對(duì)照組B(n＝209)肝癌組(n＝57)LAPTM4B基因型*1/*1 96(45.93)17(29.82) 0.029a*1*/2 90(43.06)25(43.86) 0.914*2/*2 23(11.01)15(26.32) 0.003b等位基因的頻率*1 0.6746 0.5175*2 0.3254 0.4825aOR0.500，95％CI0.267-0.939；bOR2.888，95％CI1.390-6.003(OR患病風(fēng)險(xiǎn)，和95％CI為置信區(qū)間)。
表2用于LAPTM4B基因分型的肝癌患者的臨床資料LAPTM4B基因型*1/*1*1/*2*2/*2P值總?cè)藬?shù) 17 25 15男性14 24 12女性3 13NS腫瘤的級(jí)別G1 0 20G2 1 48G3 7 74G4 9 12 3NS腫瘤的階段I 0 00II 5 85III 4 73IV 8 10 7NSHBV感染陰性 1 44陽(yáng)性 13 16 10未確診 3 51 NSNS差異無(wú)顯著性實(shí)施例4、食道癌細(xì)胞中的基因型和等位基因的頻率為了確定LAPTM4B基因型是否與其它癌癥易感性相關(guān)，對(duì)來(lái)自同一地方的116例正常人群和109例食道癌患者進(jìn)行了分析。如表3所示，食道癌患者的LAPTM4B基因分型與其對(duì)照人群并無(wú)顯著差異。表明LAPTM4B等位基因與食道癌易感性無(wú)關(guān)。
同時(shí)，在不同地區(qū)(對(duì)照組B和對(duì)照組S來(lái)自不同地區(qū))的正常人群中LAPTM4B等位基因和基因型之間也無(wú)顯著差異，表明人群的LAPTM4B基因型的分布頻率并不存在地域的差異。
表3食道癌患者和正常人群的LAPTM4B基因型的分布
N(％)對(duì)照組B 對(duì)照組S 食道癌 P值(n＝209) (n＝116) (n＝109)LAPTM4B 基因型*1/*1 96(45.93)52(44.83)49(44.95)＞0.05*1/*2 90(43.06)49(42.24)48(44.04)＞0.05*2/*2 23(11.01)15(12.93)12(11.01)＞0.05等位基因的頻率*1 0.6746 0.6595 0.6697*2 0.3254 0.3405 0.3303實(shí)施例5、報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建和啟動(dòng)子的分析選擇LAPTM4B*1/*1或*2/*2的純合基因?qū)ψ鳛槟０鍢?gòu)建質(zhì)粒。以LAPTM4B*1/*1或*2/*2的基因組DNA為模板，用PCR引物F1和R1擴(kuò)增LAPTM4B第一外顯子上游的5’末端側(cè)翼序列(包括部分第一外顯子序列)。為了避免由于PCR擴(kuò)增引起的突變，使用了高保真的DNA聚合酶(Pfx Kit，Invitrogen)。LAPTM4B*1/*1和*2/*2的PCR產(chǎn)物用XhoI和HindIII酶切后，克隆到熒光素酶載體pGL3-Basic(Promega)的多接頭連接位點(diǎn)上，得到重組質(zhì)粒pGL3-*1/Luc和pGL3-*2/Luc，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，以驗(yàn)證沒有突變體產(chǎn)生。重組質(zhì)粒用Mini-Plasmid試劑盒(Qiagen)進(jìn)行分離純化。在24孔培養(yǎng)板上，按照說(shuō)明書上的方法用LipofectAMINE 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞BEL7402。LipofectAMINE 2000復(fù)合物含有pGL-3 Basic質(zhì)粒，pGL-3啟動(dòng)子質(zhì)粒(陽(yáng)性對(duì)照)或者含有無(wú)任何添加物的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。肝癌細(xì)胞BEL7402與轉(zhuǎn)染試劑溫浴6小時(shí)后，用不含有抗生素的胎牛血清為培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，收集細(xì)胞的溶解產(chǎn)物，并用POLARstar galaxy發(fā)光計(jì)(bMG Corporation)上的熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)(Promega)分析熒光素酶的活性。
測(cè)序結(jié)果表明LAPTM4B*2和LAPTM4B*1的啟動(dòng)子相同，并沒有發(fā)現(xiàn)LAPTM4B等位基因*1和*2的啟動(dòng)子序列存在差別。
實(shí)施例6、等位基因LAPTM4B*2和LAPTM4B*1翻譯活性的比較為了確定等位基因*1和*2是否存在表達(dá)活性的差異，以及探索5’非翻譯區(qū)的19bp核苷酸序列在基因表達(dá)過(guò)程中所扮演的可能角色，將等位基因*1和*2的啟動(dòng)子和第一外顯子的部分序列克隆到pGL-3 Basic載體的熒光素酶基因的上游并轉(zhuǎn)染到BELT402細(xì)胞中，該細(xì)胞系是從人肝癌組織中分離出來(lái)的，其基因型為 結(jié)果如圖3所示，其中1、2、3分別表示LAPTM4B的啟動(dòng)子和第一外顯子、重組質(zhì)粒pGL3-*1/Lue和pGL3-*2/Luc的部分片段的示意圖。pGL-3-*1/Luc中的熒光素酶活性(19910±1154)與pGL-3-*2/Luc(16099±983)相比具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＝0.002)，表明等位基因*2中的19bp的重復(fù)片段抑制了BEL7402細(xì)胞中啟動(dòng)子的活性，使其活性降低19％，因此，該19bp的串聯(lián)重復(fù)片段在BEL7402細(xì)胞中可能為負(fù)性調(diào)控因子。
序列表<160>2<210>1<211>2264<212>DNA<213>人屬人(Homo sapiens)<400>1gaatctcgac ccttgaatgg agttacacga acggccagat gaaagaagga aggcccggac 60ctccactcag ggccgactag gggactggcg gagggtgcac gctgatggat ttactcaccg 120ggtgcttgga gctccagcag ctgcttggag ctccagcagc tggctggagc ccgcgatgac 180gtcacggact cgggtcacat ggccgagtcc gccccgcccc ctccccgtcc ccgccgctgc 240agccgtcgcc ttcggagcga agggtaccga cccggcagaa gctcggagct ctcggggtat 300cgaggaggca ggcccgcggg cgcacgggcg agcgggccgg gagccggagc ggcggaggag 360ccggcagcag cggcgcggcg ggctccaggc gaggcggtcg acgctcctga aaacttgcgc 420gcgcgctcgc gccactgcgc ccggagcgat gaagatggtc gcgccctgga cgcggttcta 480ctccaacagc tgctgcttgt gctgccatgt ccgcaccggc accatcctgc tcggcgtctg 540gtatctgatc atcaatgctg tggtactgtt gattttattg agtgccctgg ctgatccgga 600tcagtataac ttttcaagtt ctgaactggg aggtgacttt gagttcatgg atgatgccaa 660catgtgcatt gccattgcga tttctcttct catgatcctg atatgtgcta tggctactta 720cggagcgtac aagcaacgcg cagcctggat catcccattc ttctgttacc agatctttga 780ctttgccctg aacatgttgg ttgcaatcac tgtgcttatt tatccaaact ccattcagga 840atacatacgg caactgcctc ctaattttcc ctacagagat gatgtcatgt cagtgaatcc 900tacctgtttg gtccttatta ttcttctgtt tattagcatt atcttgactt ttaagggtta 960cttgattagc tgtgtttgga actgctaccg atacatcaat ggtaggaact cctctgatgt1020cctggtttat gttaccagca atgacactac ggtgctgcta cccccgtatg atgatgccac1080tgtgaatggt gctgccaagg agccaccgcc accttacgtg tctgcctaag ccttcaagtg1140ggcggagctg agggcagcag cttgactttg cagacatctg agcaatagtt ctgttatttc1200acttttgcca tgagcctctc tgagcttgtt tgttgctgaa atgctacttt ttaaaattta1260gatgttagat tgaaaactgt agttttcaac atatgctttg ctggaacact gtgatagatt1320
aactgtagaa ttcttcctgt acgattgggg atataatggg cttcactaac cttccctagg1380cattgaaact tcccccaaat ctgatggacc tagaagtctg cttttgtacc tgctgggccc1440caaagttggg catttttctc tctgttccct ctcttttgaa aatgtaaaat aaaaccaaaa1500atagacaact ttttcttcag ccattccagc atagagaaca aaaccttatg gaaacaggaa1560tgtcaattgt gtaatcattg ttctaattag gtaaatagaa gtccttatgt atgtgttaca1620agaatttccc ccacaacatc ctttatgact gaagttcaat gacagtttgt gtttggtggt1680aaaggatttt ctccatggcc tgaattaaga ccattagaaa gcaccaggcc gtgggagcag1740tgaccatctg ctgactgttc ttgtggatct tgtgtccagg gacatggggt gacatgcctc1800gtatgtgtta gagggtggaa tggatgtgtt tggcgctgca tgggatctgg tgcccctctt1860ctcctggatt cacatcccca cccagggccc gcttttacta agtgttctgc cctagattgg1920ttcaaggagg tcatccaact gactttatcg agtggaattg ggatatattt gatatacttc1980tgcctaacaa catggaaaag ggttttcttt tccctgcaag ctacatccta ctgctttgaa2040cttccaagta tgtctagtca ccttttaaaa tgtaaacatt ttcagaaaaa tgaggattgc2100cttccttgta tgcgcttttt accttgacta cctgaattgc aagggatttt tatatattca2160tatgttacaa agtcagcaac tctcctgttg gttcattatt gaatgtgctg taaattaagt2220tgtttgcaat taaaacaagg tttgcccaca aaaaaaaaaa aaaa 2264<210>2<211>370<212>PRT<213>人屬人(Homo sapiens)<400>2Met Glu Leu His Glu Arg Pro Asp Glu Arg Arg Lys Ala Arg Thr1 5 10 15Ser Thr Gln Gly Arg Leu Gly Asp Trp Arg Arg Val His Ala Asp20 25 30Gly Phe Thr His Arg Val Leu Gly Ala Pro Ala Ala Ala Trp Ser35 40 45Ser Ser Ser Trp Leu Glu Pro Ala Met Thr Ser Arg Thr Arg Val
50 55 60Thr Trp Pro Ser Pro Pro Arg Pro Leu Pro Val Pro Ala Ala Ala65 70 75Ala Val Ala Phe Gly Ala Lys Gly Thr Asp Pro Ala Glu Ala Arg80 85 90Ser Ser Arg Gly Ile Glu Glu Ala Gly Pro Arg Ala His Gly Arg95 100 105Ala Gly Arg Glu Pro Glu Arg Arg Arg Ser Arg Gln Gln Arg Arg110 115 120Gly Gly Leu Gln Ala Arg Arg Ser Thr Leu Leu Lys Thr Cys Ala125 130 135Arg Ala Arg Ala Thr Ala Pro Gly Ala Met Lys Met Val Ala Pro140 145 150Trp Thr Arg Phe Tyr Ser Asn Ser Cys Cys Leu Cys Cys His Val155 160 165Arg Thr Gly Thr Ile Leu Leu Gly Val Trp Tyr Leu Ile Ile Asn170 175 180Ala Val Val Leu Leu Ile Leu Leu Ser Ala Leu Ala Asp Pro Asp185 190 195Gln Tyr Asn Phe Ser Ser Ser Glu Leu Gly Gly Asp Phe Glu Phe200 205 210Met Asp Asp Ala Asn Met Cys Ile Ala Ile Ala Ile Ser Leu Leu215 220 225Met Ile Leu Ile Cys Ala Met Ala Thr Tyr Gly Ala Tyr Lys Gln230 235 240Arg Ala Ala Trp Ile Ile Pro Phe Phe Cys Tyr Gln Ile Phe Asp245 250 255Phe Ala Leu Asn Met Leu Val Ala Ile Thr Val Leu Ile Tyr Pro260 265 270Asn Ser Ile Gln Glu Tyr Ile Arg Gln Leu Pro Pro Asn Phe Pro275 280 285Tyr Arg Asp Asp Val Met Ser Val Asn Pro Thr Cys Leu Val Leu
290 295 300Ile Ile Leu Leu Phe Ile Ser Ile Ile Leu Thr Phe Lys Gly Tyr305 310 315Leu Ile Ser Cys Val Trp Asn Cys Tyr Arg Tyr Ile Asn Gly Arg320 325 330Asn Ser Ser Asp Val Leu Val Tyr Val Thr Ser Asn Asp Thr Thr335 340 345Val Leu Leu Pro Pro Tyr Asp Asp Ala Thr Val Asn Gly Ala Ala350 355 360Lys Glu Pro Pro Pro Pro Tyr Val Ser Ala365 370
權(quán)利要求
1.人肝癌相關(guān)基因LAPTM4B的等位基因LAPTM4B*2，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)之氨基酸序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的等位基因LAPTM4B*2，其特征在于所述基因?yàn)樾蛄斜碇械腟EQ ID №1。
3.人肝癌相關(guān)基因LAPTM4B的等位基因LAPTM4B*2編碼的蛋白LAPTM4B*2，是具有序列表中序列2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)，其特征在于它是具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。
5.含有權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求1所述基因的細(xì)胞系。
7.人肝癌相關(guān)基因LAPTM4B的等位基因LAPTM4B*2作為篩查肝癌易感和高危人群試劑的標(biāo)的物的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用是基因型為L(zhǎng)APTM4B*2/*2的基因型作為篩查肝癌易感和高危人群的試劑之標(biāo)的物的應(yīng)用。
9.以針對(duì)權(quán)利要求3所述蛋白質(zhì)或其抗體或者自人基因組中擴(kuò)增捕獲LAPTM4B的物質(zhì)為活性成分的試劑。
10.權(quán)利要求1所述基因和/或權(quán)利要求3所述蛋白質(zhì)在制備檢測(cè)肝癌及其他相關(guān)腫瘤的試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了人肝癌相關(guān)基因LAPTM4B的一個(gè)等位基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用。該基因是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)之氨基酸序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明對(duì)LAPTM4B的基因進(jìn)行分型，發(fā)現(xiàn)基因型LAPTM4B＊2/＊2與肝癌的易感性密切相關(guān)，從而為原發(fā)性肝癌的高危人群的篩查及篩查的準(zhǔn)確性提供了新的更確切的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)易患肝癌的高風(fēng)險(xiǎn)人群的評(píng)估和預(yù)防具有重大的意義。另外，還可將LAPTM4B＊2蛋白作為藥物作用的新靶點(diǎn)，研制以LAPTM4B＊2蛋白為靶點(diǎn)的新藥。因而據(jù)此，有可能開發(fā)出防治肝癌的新途徑，這是一項(xiàng)將產(chǎn)生重大社會(huì)效益的工程。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1539968SQ0310978
公開日2004年10月27日 申請(qǐng)日期2003年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月21日
發(fā)明者周柔麗, 邵根澤, 張青云, 芮靜安, 張頁(yè), 彭聰, 魏渲輝, 劉歆榮, 張莎, 林明 申請(qǐng)人:北京大學(xué)