專利名稱：：多亞基多表位流感疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基于多亞基多表位肽的疫苗。特別是，本發(fā)明涉及引起對流感的保護性免疫的基于多亞基多表位肽的疫苗的用途。發(fā)明背景多表位疫苗已知B細胞表位、T輔助細胞表位和細胞毒性T淋巴細胞表位在這兩種免疫應(yīng)答中都起著重要作用。顯然，對于有效接種，應(yīng)該誘導(dǎo)廣譜且持久的體液和細胞應(yīng)答。對于具有高突變率的病毒如流感病毒和人免疫缺陷病毒仍然沒有廣譜且有效的疫苗。在抗原劑量和特異性B細胞應(yīng)答之間具有密切的關(guān)系。使用由與不同量的表位肽偶聯(lián)的相同量的載體蛋白組成的化學(xué)偶聯(lián)的載體蛋白和表位肽系統(tǒng)的研究已經(jīng)顯示，表位密度急劇地影響了T輔助細胞依賴的IgG應(yīng)答(Jegerlehner等人，EurJImmunol.(歐洲免疫學(xué)雜志)2002,32:3305-14)。Liu等人(Vaccine(免疫)200423(3):366-71)觀察到表位密度對用谷胱苷肽-s-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白免疫的小鼠和兔的體液應(yīng)答的積極效果，所述融合蛋白攜帶流感病毒的M2蛋白的不同拷貝數(shù)的M2e肽表位(1、2、4、8和16個拷貝)。在相同研究中，致死性攻擊測定顯示了具有更高表位密度的融合蛋白獲得了更高的存活率和更慢的體重減輕。已經(jīng)開發(fā)了多表位疫苗即包括一個以上表位的疫苗用于多種多樣的應(yīng)用。非詳盡列舉的例子包括例如美國專利第6，063，386號中公開的用于鏈球菌的重組多價疫苗；美國專利第6，828，416號中公開的用于治療瘧疾的疫苗，所述疫苗包括單一蛋白，所述單一蛋白包括從寄生蟲惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)的生活周期的不同階段得到的肽；在美國專利申請2007/0056315中公開的包括多肽的抗腫瘤免疫原性組合物，所述多肽包括前列腺干細胞抗原表位；以及抗HIV(國際公開WO01/24810)、風(fēng)疹病毒(參見國際公開WO93/14206)和丙型肝炎病毒(國際公開W001/21189)的多表位抗病毒疫苗。國際公開W02006/069262公開了包括用于在受試者中剌激免疫應(yīng)答的流感病毒蛋白的病原相關(guān)分子模式(PAMP)和表位的組合物、融合蛋白和多肽。PAMP是在微生物中發(fā)現(xiàn)的分子基序(例如蛋白、肽、核酸、碳水化合物、脂質(zhì))，其能夠在宿主中觸發(fā)先天免疫應(yīng)答，即用作佐劑。在一些實施方案中，融合蛋白包括多個拷貝的M2e流感表位。國際公開W02006/078657公開了包括黃病毒蛋白的一種或多種PAMP和多表位的類似融合蛋白和多肽。流感流感是由三種主要亞型A、B和C型流感病毒引起的疾病，它們根據(jù)其抗原決定簇來分類。流感病毒顆粒由單鏈RNA基因組組成，所述單鏈RNA基因組與核蛋白(NP)緊密相關(guān)且由脂蛋白包膜包封，所述脂蛋白包膜通過基質(zhì)蛋白(Ml)加襯并且攜帶兩個主要的表面糖蛋白抗原，血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)。HA和NA糖蛋白最容易改變；例如具有16種免疫類型的HA和9種不同NA類型，這提供了用于不同流感病毒亞型如H1N1或H3N2的基礎(chǔ)。A型流感病毒具有另外的跨膜糖蛋白M2，它在不同HN亞型之間高度保守。M2基因編碼在病毒顆粒細胞表面上表達為四聚體的具有96-97個氨基酸的蛋白。它由約24個細胞外氨基酸、約19個跨膜氨基酸和約54個細胞質(zhì)殘基組成(Lamb等人，Cell(細胞)1985;40:627-633)。A和B型流感病毒是人類中最常見的流感病因。流感對公眾健康產(chǎn)生巨大的影響，除了包括發(fā)病率和甚至死亡率的破壞性的健康問題以外，還具有嚴重的經(jīng)濟影響。感染可以是輕度、中度或重度，從無癥狀到輕微上呼吸道感染和氣管支氣管炎到嚴重、偶爾致死的病毒性肺炎。流感病毒具有給疫苗制備提供挑戰(zhàn)的兩個重要的免疫學(xué)特征。第一個涉及每幾年發(fā)生在表面糖蛋白中的基因改變，稱為"抗原性漂移"。該抗原改變產(chǎn)生了規(guī)避由現(xiàn)有疫苗所引起的抗性的病毒。公眾健康主要關(guān)注的第二特征是流感病毒，尤其A型流感病毒能夠交換基因材料且融合。稱為"抗原性漂移"的該過程導(dǎo)致了不同于兩種母體病毒的新菌株，它能夠是致命流行株。流感病毒抗原和疫苗牛產(chǎn)針對流感病毒的免疫受到了病毒抗原變異以及感染限制在呼吸粘膜的限制。目前可獲得的流感疫苗基于整個無活性病毒，呈遞在細菌細胞表面上的病毒蛋白，或者攜帶病毒抗原決定簇的鞭毛蛋白。HA是強的免疫原且是界定不同病毒株的血清學(xué)特異性的最重要的抗原。HA分子(75-80D)包括多個抗原決定簇，它們的幾種是在不同株中經(jīng)歷序列改變的區(qū)域(株特異性決定簇)和其它是在許多HA分子中保守的區(qū)域(共同決定簇)。由于這些變化，流感疫苗需要至少每幾年被改變。許多流感抗原以及由此制備的疫苗在本領(lǐng)域中是已知的。美國專利第4，474，757號公開了抗流感病毒感染的疫苗，其由對應(yīng)連接于適合的大分子載體如氨基酸的聚合物或破傷風(fēng)類毒素的HA的抗原性片段的合成肽組成。本發(fā)明的一些發(fā)明人的PCT國際公開W093/20846教導(dǎo)了抗多種不同流感病毒株的合成重組疫苗，其包括至少一種重組蛋白，所述重組蛋白包括鞭毛蛋白的氨基酸序列和流感病毒HA或NP的表位的至少一個氨基酸序列，或者所述嵌合蛋白的聚集體。在該方法之后，基于三種表位的合成重組抗流感疫苗被發(fā)現(xiàn)在小鼠中是高度有效的。舉例的疫苗包括鞭毛蛋白嵌合體，所述鞭毛蛋白嵌合體包括HA91-108表位、在所有H3株中保守且誘發(fā)抗流感中和抗體的來自HA的B細胞表位，以及誘導(dǎo)MHC限制性免疫應(yīng)答的一種或兩種T輔助細胞或CTLNP表位(分別是NP55-69和NP147-158)。包括三種以上所述嵌合體的組合的疫苗被認為提供了對病毒感染的最佳保護。本發(fā)明的一些發(fā)明人的美國專利第6，740，325號教導(dǎo)了基于合成肽的人流感疫苗，其包括流感病毒的至少4種表位，所述流感病毒表位與人細胞反應(yīng)，所述表位包括(i)—種B細胞血凝素(HA)表位；(ii)能夠結(jié)合于許多HLA分子的一種T輔助細胞血凝素(HA)或核蛋白(NP)表位；以及(iii)限于不同人群特別是特定民族或種族群中的最普遍的HLA分子的至少兩種細胞毒性淋巴細胞(CTL)核蛋白(NP)或基質(zhì)蛋白(M)表位。流感肽表位能夠在重組沙門氏菌鞭毛蛋白內(nèi)表達。該疫苗要求至少四種嵌合多肽的煩瑣制備。本發(fā)明的一些發(fā)明人的PCT國際公開W02007/066334公開了能引起長期且交叉株保護的疫苗，其包括多種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包括至少兩種流感病毒肽表位，其中至少一種表位是A型流感病毒基質(zhì)蛋白M肽表位，第二表位是血凝素HA肽表位。還有，在該情況下，流感肽表位能夠在重組沙門氏菌鞭毛蛋白內(nèi)表達。哺乳動物常常具有對鞭毛抗原的獲得性免疫應(yīng)答。然而，臨床數(shù)據(jù)已經(jīng)顯示，動物流感中的有效劑量的重組鞭毛蛋白在人受試者中具有不利效果，包括高燒，可能歸因于高鞭毛蛋白/抗原比率。還懷疑，高濃度的鞭毛蛋白對心臟具有瞬時效果。因此，對于能夠誘導(dǎo)具有寬特異性、持久的體液和細胞應(yīng)答的基于流感肽表位的疫苗存在著未滿足的需求。還對具有簡化生產(chǎn)和質(zhì)量控制過程的疫苗存在著需求。發(fā)明概述本發(fā)明提供了流感疫苗，其克服了已知的抗流感的疫苗的缺陷，包括高載體與抗原比率和高佐劑與抗原比率的不利效果。本發(fā)明的疫苗包括多肽，所述多肽包括多個拷貝的多種流感病毒肽表位，提供了多重多樣性、高密度的疫苗。根據(jù)本發(fā)明，多亞基多表位多肽能夠作為分離的多肽或作為融合蛋白來重組產(chǎn)生，或者通過連接多種合成肽來合成產(chǎn)生，或者可以與外部佐劑混合或配制。本發(fā)明的多亞基多肽含有流感病毒B細胞表位、T輔助細胞表位和細胞毒性淋巴細胞(CTL)表位的組合。所述表位優(yōu)選選自血凝素(HA)肽、基質(zhì)蛋白(M1和M2)肽和核蛋白(NP)肽。所述表位具有對抗幾種人流感亞型的可證明的交叉保護活性且因為它們改進的能力被選擇來誘導(dǎo)細胞和體液免疫應(yīng)答。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的幾種多亞基多肽即使不偶聯(lián)于載體蛋白或者不是載體蛋白的一部分的情況下在引起免疫應(yīng)答中是有活性的。此外，由于由該多肽攜帶的免疫原性表位的高密度和多樣化，該疫苗引起了強的免疫應(yīng)答，甚至不需要佐劑。另外，大量不同免疫原性表位在單一多肽中的包含有利于生產(chǎn)工序和質(zhì)量控制。在第一方面，本發(fā)明提供了合成或重組多肽，其包括多種流感病毒肽表位，各表位在單一多肽中存在至少兩次。在本發(fā)明的上下文中，"多亞基"多肽是含有多個重復(fù)(至少兩個，典型地至少三個或更多)的，不必相鄰的多肽的氨基酸鏈的多肽。術(shù)語"多亞基多表位"因此涉及含有多個重復(fù)的多種表位的多肽。根據(jù)該方面，本發(fā)明提供了合成或重組的流感多表位多肽，其包括以交替的順序聚合物結(jié)構(gòu)(W3.)n或者以嵌段共聚物結(jié)構(gòu)(X》n(X2)n(X丄.(Xjn排列的多個拷貝的多種流感病毒肽表位。根據(jù)本發(fā)明的合成或重組的流感多表位多肽選自由以下組成的組i.B(X^X^.Xm)nB;以及ii.B(Xi)nZ(X2)nZ...(Xm)nB;其中B是1-4個氨基酸殘基的任選序列；n在每次出現(xiàn)時獨立地是2_50的整數(shù)；m是3-50的整數(shù)；&，X2...Xm的每一個是由4-24個氨基酸殘基組成的流感肽表位；Z在每次出現(xiàn)時是鍵或1-4個氨基酸殘基的間隔子；且其中多肽中的氨基酸殘基的最大數(shù)是約1000。根據(jù)一些實施方案，n在每次出現(xiàn)時獨立地是2-50的整數(shù)；m是3-15的整數(shù)；X「Xm的每一個是選自由4-24個氨基酸殘基組成的B細胞型表位、T輔助細胞(Th)型表位和細胞毒性淋巴細胞(CTL)型表位組成的組的流感肽表位；且多肽中的氨基酸殘基的最大數(shù)是約600。7[OO32]根據(jù)其它實施方案，流感肽表位選自由血凝素(HA)肽、M1肽、M2肽和核蛋白(NP)肽組成的組。根據(jù)一些具體實施方案，m是9且n是3-5的整數(shù)。根據(jù)其它實施方案，流感肽表位選自由SEQIDNO:1至SEQIDNO:82組成的組。根據(jù)一些具體實施方案，流感肽表位選自根據(jù)表1的表位El-E9:表1:流感肽表位El至E9<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>根據(jù)更多的具體實施方案，流感肽表位由以下組成HA354-372(El，SEQIDNO:82)、HA91-108(E2，SEQIDNO:48)、M12-12(E3，SEQIDNO:25)、HA150-159(E4，SEQIDN0:52)、HA143-149(E5，SEQIDNO:51)、NP206-229(E6，SEQIDNO:64)、HA307-319(E7，SEQIDNO:59)、NP335—350(E8，SEQIDNO:69)，以及NP380—393(E9，SEQIDNO:70)。還根據(jù)其它實施方案，多肽序列選自由以下組成的組SEQIDNO:84、SEQIDNO:86和SEQIDNO:88。根據(jù)一些實施方案，所述多肽包括以下列交替的順序聚合物結(jié)構(gòu)[ElE2E3E4E5E6E7E8E9]n排列的九種不同流感病毒肽表位，其中n是3或5;E1是HA354-372(SEQIDN0:82)，E2是HA91-108(SEQIDNO:48)，E3是M12-12(SEQIDNO:25)，E4是HA150-159(SEQIDN0:52)，E5是HA143-149(SEQIDN0:51)，E6是NP206-229(SEQIDNO:64)，E7是HA307-319(SEQIDNO:59)，E8是NP335-350(SEQIDNO:69)，以及E9是NP380-393(SFQIDNO:70)。根據(jù)其它實施方案，所述多肽包括以下列嵌段共聚物結(jié)構(gòu)[E1E1E1-E2E2E2-E3E3E3-E4E4E4-E5E5E5-E6E6E6-E7E7E7-E8E8E8-E9E9E9]排列的九種不同流感病毒肽表位的三個重復(fù)其中El是HA354-372(SEQIDN0:82)，E2是HA91-108(SEQIDNO:48)，E3是M12-12(SEQIDNO:25)，E4是HA150-159(SEQIDNO:52)，E5是HA143-149(SEQIDNO:51)，E6是NP206-229(SEQIDNO:64)，E7是HA307-319(SEQIDNO:59)，E8是NP335-350(SEQIDNO:69)，以及E9是NP380-393(SEQIDNO:70)。還根據(jù)其它實施方案，所述多肽包括以下列交替的順序聚合物結(jié)構(gòu)[ElE2E3E4E5]e排列的五種不同B細胞型流感病毒肽表位的六個重復(fù)，其中El是HA354-372(SEQIDN0:82)，E2是HA91-108(SEQIDN0:48)，E3是M12-12(SEQIDNO:25)，E4是HA150-159(SEQIDN0:52)，E5是HA143-149(SEQIDNO:51)。根據(jù)其它實施方案，所述多肽包括以下列交替的順序聚合物結(jié)構(gòu)[E7E8E9E6]e排列的四種不同T細胞型流感病毒肽表位的六個重復(fù)，其中E6是NP206-229(SEQIDNO:64)，E7是HA307-319(SEQIDN0:59)，E8是NP335-350(SEQIDNO:69)，以及E9是NP380-393(SEQIDNO:70)。還根據(jù)其它實施方案，所述多肽包括以下列交替的順序聚合物結(jié)構(gòu)[E7E8E9E6]n排列的四種不同T細胞型流感病毒肽表位的四個重復(fù)，其中n是6，且其中E6是NP206-229(SEQIDN0:64)，E7是HA307-319(SEQIDNO:59)，E8是NP335-350(SEQIDNO:69)，以及E9是NP380-393(SEQIDNO:70)，且其中所述多亞基多肽與載體蛋白融合。根據(jù)其它實施方案，所述多肽包括以下列嵌段共聚物結(jié)構(gòu)[E2E2E2E2E2E2-E1E1E1E1E1E1-E3E3E3E3E3E3-E4E4E4E4E4E4-E5E5E5E5E5E5-E6E6EE6E6E66-E7E7E7E7E7E7-E8E8E8E8E8E8-E9E9E9E9E9E9]排列的九種不同流感病毒肽表位的六個重復(fù)，其中El是HA354-372(SEQIDN0:82)，E2是HA91-108(SEQIDN0:48)，E3是M12-12(SEQIDNO:25)，E4是HA150-159(SEQIDN0:52)，E5是HA143-149(SEQIDNO:51)，E6是NP206-229(SEQIDNO:64)，E7是HA307-319(SEQIDNO:59)，E8是NP335-350(SEQIDNO:69)，以及E9是NP380-393(SEQIDNO:70)。在多種實施方案中，所述多肽包括每一表位的至少兩個重復(fù)，典型地每一表位的至少三個重復(fù)，可選擇地至少四個重復(fù)，可選擇地至少五個重復(fù)，可選擇地每一表位的至少六個重復(fù)，最高每一表位的至少50個重復(fù)。為了改進表位暴露于免疫系統(tǒng)，所述表位優(yōu)選通過間隔子分隔，根據(jù)某些實施方案，所述間隔子由單個氨基酸組成，根據(jù)其它實施方案，所述間隔子包括至少一個氨基酸或者是肽。優(yōu)選地，所述間隔子由l-4個中性氨基酸殘基組成。根據(jù)具體實施方案，所述合成或重組流感多表位多肽由以交替的順序聚合物結(jié)構(gòu)(XA;)n或嵌段共聚物結(jié)構(gòu)(X》n(X丄(X3)n.(Xjn排列的多個拷貝的多種流感病毒肽表位組成。在本發(fā)明的該方面的一些實施方案中，所述多亞基多表位多肽包括至少兩種流感肽表位，其中至少一種選自由B細胞型表位、T輔助細胞(Th)型表位和細胞毒性淋巴細胞(CTL)型表位組成的組。在一些實施方案中，所述流感肽表位選自由血凝素(HA)肽表位、基質(zhì)蛋白(M1或M2)肽表位和核蛋白(NP)肽表位組成的組。在某些優(yōu)選實施方案中，所述肽表位選自由根據(jù)表1的表位El至E9組成的組。提供了多個示例性實施方案，包括選自表l中的表位，其中用于各表位的重復(fù)的數(shù)目是相同或不同的，且其中所述多肽能夠以交替順序聚合物結(jié)構(gòu)或嵌段共聚物結(jié)構(gòu)排列。術(shù)語"交替順序聚合物"結(jié)構(gòu)表示在多肽中含有的所有表位的單個拷貝順序地排列，且該排列順序地重復(fù)等于重復(fù)數(shù)的次數(shù)。例如，如果多亞基多表位多肽包括交替序列結(jié)構(gòu)的三種表位&、&和&的四個重復(fù)，那么所述多肽具有以下聚合物結(jié)構(gòu)XAX3-X^2X3-XJ2X3-XJ2X3，還寫為^2^]4。術(shù)語"嵌段共聚物"結(jié)構(gòu)表示在所述多肽中含有的單個表位的所有拷貝相鄰地排列。例如，包括嵌段共聚物結(jié)構(gòu)的三種表位&、^和^的四個重復(fù)的類似的多亞基多表位多肽具有下列聚合物結(jié)構(gòu)XAXA-XJJJ廠X3X3X3X3，還寫為[A]4-[B]4-[C]4。根據(jù)一些實施方案，所述間隔子的至少一個氨基酸對所述多肽的片段誘導(dǎo)了特殊構(gòu)象(例如脯氨酸殘基)。還根據(jù)其它實施方案，所述間隔子包括可切割的序列。根據(jù)一個實施方案，所述可切割的間隔子被細胞內(nèi)酶切割。根據(jù)另一個具體實施方案，所述可切割的間隔子包括蛋白酶特異性可切割的序列。根據(jù)一些實施方案，多亞基多肽優(yōu)選不與載體融合蛋白軛合且缺乏載體融合蛋白。在其它實施方案中，本發(fā)明的多肽可以進一步包括載體序列，即所述肽表位被插入到載體多肽的序列內(nèi)或者偶聯(lián)于載體序列。根據(jù)一些實施方案，所述多亞基多肽作為包括載體序列的重組融合蛋白產(chǎn)生。在一些具體實施方案中，所述載體序列是細菌鞭毛蛋白或其一部分。在某些實施方案中，所述多表位多肽被插入在鞭毛蛋白的高可變區(qū)，從而形成含有多亞基多表位多肽的重組鞭毛蛋白融合蛋白。在其它實施方案中，所述多肽融合到所述載體蛋白的氨基端或羧基端部分。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供了編碼流感多表位多肽的分離的多核苷酸序列。根據(jù)一些實施方案，分離的多核苷酸序列編碼選自由SEQIDNO:84、SEQIDNO:86和SEQIDNO:88組成的組的多肽序列。根據(jù)具體實施方案，分離的多核苷酸序列包括選自由SEQIDNO:83、SEQIDNO:85和SEQIDNO:87組成的組的序列。還根據(jù)又一個方面，本發(fā)明提供了用于抗流感而免疫受試者的疫苗組合物，其包括至少一種合成或重組的流感多表位多肽，所述多肽包括以交替順序聚合物結(jié)構(gòu)(XA;)n或嵌段共聚物結(jié)構(gòu)(X》n(X丄(X3)n.(Xjn排列的多個拷貝的多種流感病毒肽表位。根據(jù)一些實施方案，所述疫苗組合物包括至少兩種此類多肽。根據(jù)一些實施方案，所述疫苗包括兩種多肽，其中第一多肽包括多種B細胞型流感病毒肽表位，且第二多肽包括多種T細胞型流感病毒肽表位。根據(jù)一個具體實施方案，所述第一多肽是多肽權(quán)利要求18[E1E2E3E4E5]6，其中El是HA354-372(SEQIDN0:82)，E2是HA9H08(SEQIDNO:48)，E3是M12-12(SEQIDN0:25)，E4是HA150-159(SEQIDNO:52)，E5是HA143-149(SEQIDNO:51);且所述第二多肽是多肽[E7E8E9E6]6，其中E6是NP206-229(SEQIDNO:64)，E7是HA307-319(SEQIDN0:59)，E8是NP335-350(SEQIDNO:69)，以及E9是NP380-393(SEQIDNO:70)，或者所述第二多肽是包括多肽[E7E8E9E6]n的融合載體蛋白，其10中n是6，且其中E6是NP206-229(SEQIDN0:64)，E7是HA307-319(SEQIDN0:59)，E8是NP335-350(SEQIDNO:69)，且E9是NP380-393(SEQIDNO:70)。本發(fā)明的另一個方面提供了用于免疫受試者的疫苗，所述疫苗包括多亞基多表位多肽，所述多肽包括多種流感病毒肽表位。在一些實施方案中，所述疫苗包括每一表位的至少三個重復(fù)，可選擇地至少四個重復(fù)，可選擇地至少五個重復(fù)，可選擇地每一表位的至少六個重復(fù)。在一些實施方案中，所述表位被間隔子分隔，所述間隔子可以是單個氨基酸或至少兩個氨基酸的肽。在一些實施方案中，所述疫苗包括至少兩種流感肽表位，其中至少一種表位選自由B細胞型表位、T輔助細胞(Th)型表位和CTL型表位組成的組。在一些實施方案中，所述流感肽表位選自由血凝素(HA)肽表位、M1肽表位、M2肽表位和NP肽表位組成的組。在優(yōu)選實施方案中，所述肽表位選自由以上表1中的表位El至E9組成的組。在一個實施方案中，所述疫苗包括根據(jù)交替順序聚合物結(jié)構(gòu)[E1E2E3E4E5E6E7E8E9]3排列的九種表位E1-E9的三個重復(fù)。在另一個實施方案中，所述疫苗包括根據(jù)交替的順序聚合物結(jié)構(gòu)[E1E2E3E4E5E6E7E8E9]5排列的九種表位的五個重復(fù)。還在又一個實施方案中，所述疫苗包括根據(jù)嵌段共聚物結(jié)構(gòu)[El]3-[E2]3-[E3]3-[E4]3-[E5]3_[E6]3-[E7]3-[E8]3-[E9]3排列的九種表位的三個重復(fù)。還在又一個實施方案中，所述疫苗包括根據(jù)嵌段共聚物結(jié)構(gòu)[El]6-[E2]6-[E3]6-[E4]6-[E5]6-[E6]6-[E7]6-[E8]6-[E9]6排列的九種表位的六個重復(fù)。本發(fā)明的另一個方面提供了包括多亞基多表位多肽的抗流感的疫苗，其中第一多肽包括多種B細胞型流感病毒肽表位，且第二多肽包括多種T細胞型流感病毒肽表位。所述多表位多肽的每一個可以是具有載體蛋白的融合蛋白的一部分。根據(jù)一些實施方案，本發(fā)明的疫苗組合物不含有佐劑。根據(jù)其它實施方案，該疫苗還包括佐劑。藥學(xué)上可接受的佐劑包括但不限于油包水乳劑、脂質(zhì)乳劑和脂質(zhì)體。根據(jù)具體實施方案，所述佐劑選自由以下組成的組Montanide、明礬、胞壁酰二肽、Gelvac、甲殼質(zhì)微顆粒、脫乙酰殼多糖、霍亂毒素亞基8、111^1^1(1@和1^0&1^11^。根據(jù)目前的優(yōu)選實施方案，佐劑是1401^111(^@。在一些實施方案中，疫苗被配制用于肌內(nèi)、鼻內(nèi)、口服、腹膜內(nèi)、皮下、局部、皮內(nèi)和透皮遞送。在一些實施方案中，所述疫苗鼻內(nèi)施用。在其它實施方案中，所述疫苗肌內(nèi)施用。還在其它實施方案中，所述疫苗皮內(nèi)施用。根據(jù)又一個實施方案，本發(fā)明提供了在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和提供抗流感保護的方法，包括將含有至少一種合成或重組流感多表位多肽的疫苗組合物施用于受試者，所述多肽包括以交替順序聚合物結(jié)構(gòu)(XAX3…)n或嵌段共聚物結(jié)構(gòu)(X》n(X》n(X3)n...(Xm)n排列的多個拷貝的多種流感病毒肽表位。所述疫苗的施用途經(jīng)選自肌內(nèi)、鼻內(nèi)、口服、腹膜內(nèi)、皮下、局部、皮內(nèi)和透皮遞送。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，所述疫苗鼻內(nèi)、肌內(nèi)或皮內(nèi)施用。根據(jù)本發(fā)明的多肽用于制備抗流感的用于免疫的疫苗組合物的用途以及根據(jù)本發(fā)明的分離的多肽用于生產(chǎn)多核苷酸的用途也是在本發(fā)明的范疇內(nèi)。本發(fā)明中公開的全部多亞基多肽能夠作為重組蛋白、融合蛋白來生產(chǎn)，以及通過化學(xué)合成來生產(chǎn)。相應(yīng)地，本發(fā)明的另一個方面提供了重組蛋白，所述蛋白包括多亞基多表位多肽，所述多肽包括多種流感病毒肽表位。在一些實施方案中，所述多肽被插入到細菌鞭毛蛋白的高可變區(qū)內(nèi)。本發(fā)明的另一個方面提供了融合蛋白，所述融合蛋白包括至少一種多亞基多表位多肽和至少一種其它多肽。在一些實施方案中，所述多肽與細菌鞭毛蛋白或其一部分融合。在一個具體實施方案中，包括根據(jù)嵌段共聚物結(jié)構(gòu)[El]6-[E2]6-[E3]6-[E4]6-[E5]6-[E6]6-[E7]e-[E8]e-[E9]e排列的九種多肽的六個重復(fù)的所述多肽與細菌鞭毛蛋白或其一部分融合。本發(fā)明的另一個方面提供了包括通過間隔子連接的多種合成肽表位的合成多亞基多肽，所述間隔子選自由鍵、氨基酸和包含至少兩個氨基酸的肽組成的組。本發(fā)明還包括用于抗流感免疫的合成多亞基多肽。從以下給出的詳細說明可以清楚本發(fā)明的其它實施方案和全部應(yīng)用范圍。然而，應(yīng)該理解的是，該詳細說明和具體實施例雖然指示了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但僅僅為了舉例說明而給出，因為根據(jù)本詳細說明，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的許多變化和改動對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。附圖簡述圖1A和1B顯示了包括以交替順序聚合物結(jié)構(gòu)(HA354-372—HA91-108—Ml，2-12—HA150-159—HA143-149—NP206-229—HA307-319—NP335-350—NP380_393)5排列的九種流感肽表位的五個重復(fù)的多亞基多肽。(A)用于產(chǎn)生多亞基多肽的構(gòu)建體的核苷酸序列(SEQIDNO:83);(B)由A的核苷酸序列編碼的多亞基多肽的氨基酸序列(SEQIDNO:84)。九種表位的第一序列中的表位被下劃線。圖2A和2B顯示了包括以嵌段共聚物結(jié)構(gòu)(HA354-372)3—-(HA91_108)3—-(Ml2-12)3-—(HA150-159)3-—(HA143-149)3-—(NP206-229)3-—(HA307-319)3-—(NP335-350)f一(NP380-393)3排列的九種流感肽表位的三個重復(fù)的多亞基多肽。(A)用于生產(chǎn)所述多肽的構(gòu)建體的核苷酸序列(SEQIDNO:85)。(B)所述多亞基多肽的氨基酸序列(SEQIDNO:86)。第一表位的三個重復(fù)被下劃線。圖3A和3B顯示了包括以交替順序聚合物結(jié)構(gòu)(HA354-372—-HA91-108—-Ml，2-12—HA150-159—HA143-149—NP206-229—HA307-319—NP335-350—NP380_393)3排列的九種流感肽表位的三個重復(fù)的多亞基多肽。(A)用于生產(chǎn)所述多肽的構(gòu)建體的核苷酸序列(SEQIDNO:87)。(B)多亞基多肽的氨基酸序列(SEQIDNO:88)。九種表位的第一序列中的表位被下劃線。圖4顯示了用兩種多亞基疫苗#11和#14接種的小鼠的對幾種流感病毒株的細胞免疫應(yīng)答。測定對兩種不同濃度的剌激病毒的細胞免疫應(yīng)答，且以用剌激病毒孵育的淋巴細胞的增殖指數(shù)來顯示。圖5顯示了多亞基疫苗#14對抗高致死劑量的小鼠適應(yīng)的流感病毒H3N2株(A/得克薩斯/1/77)的保護效應(yīng)。疫苗的保護效應(yīng)通過與對照小鼠(PBS)相比接種的小鼠肺中病毒滴度顯著減小來證實。圖6A和6B顯示了幾種多亞基疫苗在保護小鼠免遭病毒攻擊的效力。多亞基疫苗#11、#12和#14的保護效應(yīng)通過以下被證明在用致死劑量的小鼠適應(yīng)的流感病毒H3N2株(A/得克薩斯/1/77)感染之后與對照(PBS)小鼠相比接種的小鼠的更高存活率(圖6A);以及與對照(50%Gly/PBS)小鼠相比，接種的小鼠肺中顯著更低的病毒載量(圖6B)。圖7比較了用包括在PBS中的50X甘油中的多亞基構(gòu)建體(#11、#12和#14)或者在具有不完全弗氏佐劑的乳劑中的多亞基構(gòu)建體(#11_IFA、ftl2-IFA和ftl4-IFA)的幾種疫苗免疫小鼠的效力。不同疫苗的保護效應(yīng)和IFA的效應(yīng)通過在用小鼠適應(yīng)的流感病毒H3N2株(A/得克薩斯/1/77)攻擊之后與對照小鼠相比接種小鼠的存活率來測量。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了包括多種流感病毒肽表位的多亞基多表位多肽和基于這些多肽的疫苗。根據(jù)本發(fā)明的多肽包括每一表位的至少二個重復(fù)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的多肽包括每一表位的至少三個重復(fù)。本發(fā)明還提供了基于此類多肽的疫苗及其使用方法。由流感蛋白衍生的肽表位可用于制備抗流感的疫苗。然而，單獨的每一肽對于免疫系統(tǒng)幾乎是不可見的，其被快速降解并且引起了不充分的免疫應(yīng)答。當多個拷貝的免疫原性肽被作為單一多肽呈遞給免疫系統(tǒng)時，表位特異性免疫應(yīng)答的幅度增強。例如，基于含有單一拷貝的一種流感肽表位的重組鞭毛蛋白融合蛋白的疫苗提供了大約l:28的表位/鞭毛蛋白比率。通過使用在若干拷貝的每一個中含有多種表位的多表位疫苗，可以獲得高達2:l的表位/鞭毛蛋白比率。本發(fā)明公開了與已知的構(gòu)建體和構(gòu)型相比具有增強的免疫原性的多亞基多表位多肽。所述多肽各自含有多種表位，其中每一表位在多個拷貝中重復(fù)。每一表位的多個拷貝或重復(fù)可以作為每一表位的嵌段是鄰接的?？蛇x擇地，所述多種表位可以出現(xiàn)在預(yù)定序列中，其中該序列在所述多肽內(nèi)重復(fù)多次。這些類型的多種表位的構(gòu)型現(xiàn)在均顯示了在賦予受試者抗流感免疫性中具有出乎意料的優(yōu)異結(jié)果。為了方便起見，在此描述在本說明書、實施例和權(quán)利要求中使用的某些術(shù)語。術(shù)語"抗原呈遞"是指抗原在與動物的主要組織相容性復(fù)合體I類或II類分子(MHC-I或MHC-II)或人的HLA-I和HLA-II相關(guān)的細胞表面上表達。術(shù)語"免疫原性"或"免疫原性的"涉及物質(zhì)剌激或引起免疫應(yīng)答的能力。例如通過測定該物質(zhì)特異性的抗體的存在來測定免疫原性。通過本領(lǐng)域已知的方法例如使用ELISA測定來檢測抗體的存在。流感表位可以分類為B細胞型、T細胞型或B細胞型和T細胞型兩者，取決于它們引起的免疫應(yīng)答的類型。B細胞或T細胞表位的定義不是明確的；例如，一種肽表位能夠誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，但同時該表位能夠具有一種序列，該序列能夠結(jié)合于人HLA分子，使得它容易到達CTL，因此對于該特定表位為雙B細胞和T細胞分類。"CTL"、"殺傷T細胞"、"細胞毒性T細胞"是識別和溶解靶細胞的一組分化T細胞，所述靶細胞攜帶在防御病毒感染和癌細胞中發(fā)揮作用的特異性外來抗原。"T輔助細胞"或"Th"是在被特異性抗原剌激時釋放促進B細胞和殺傷T細胞的活化和功能的細胞因子的任何T細胞。術(shù)語"重組鞭毛蛋白融合蛋白"是指包括嵌合在其序列內(nèi)的肽表位或多亞基多表位多肽的鞭毛蛋白多肽，或者可選擇地是指在其N或C端與肽表位或多亞基多表位多肽融合的鞭毛蛋白多肽的一部分。這里所使用的"氨基酸序列"是指寡肽、肽、多肽或蛋白序列及其片段，以及天然存在的或合成的分子。在說明書和權(quán)利要求中，術(shù)語"間隔子"表示任何化合物，它可以存在于多肽序列中，在末端之一或者在兩個表位之間。優(yōu)選地，所述間隔子由l-4個氨基酸殘基組成。所述間隔子可以包括能夠被酶促方法切割的序列，或者可以自發(fā)地分解。所述間隔子可以對多肽實施或誘導(dǎo)有益的構(gòu)象。所述間隔子可任選地包括蛋白酶特異性可切割的序列。肝燃錢隨表份根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，肽表位由選自由HA、M1、M2和NP組成的組中的流感蛋白衍生。所述表位還可以根據(jù)它們的類型B細胞型、Th型和CTL型來選擇。應(yīng)該注意的是，本文所列舉的肽表位僅為了舉例的目的提供。流感病毒蛋白在分離物之間改變，從而對于每一流感蛋白提供了多種變體序列。相應(yīng)地，本發(fā)明包括了具有一個或多個氨基酸替代、添加或刪除的肽表位。基質(zhì)蛋白M1是流感病毒顆粒的主要結(jié)構(gòu)組分，且形成脂質(zhì)細胞衍生的包膜的內(nèi)層。在病毒顆粒內(nèi)和在感染的細胞中，在病毒復(fù)制的后期，Ml蛋白與病毒核糖核蛋白(vRNP)關(guān)聯(lián)，所述病毒核糖核蛋白由病毒RNA分子、多個拷貝的核蛋白和保持病毒RNA末端的病毒聚合酶的三個亞基組成。Ml的N端結(jié)構(gòu)域是指M1蛋白的氨基酸1到大約氨基酸20?；|(zhì)蛋白M2是導(dǎo)致空泡內(nèi)基質(zhì)和核蛋白復(fù)合物的解離的氫離子通道。該離子通道釋放能夠使病毒RNA進入感染細胞的核并且引發(fā)病毒復(fù)制的基因組?？沽鞲械闹委熚镔|(zhì)，如金剛烷胺和金剛乙胺通過阻斷M2活性來起作用。B型流感具有稱為NB的對應(yīng)蛋白；雖然在M2和NB之間沒有序列相似性，但它們均為跨膜蛋白，且可以共有相似的功能。M2蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域是A型流感病毒的跨膜蛋白，在所有A型流感株中幾乎沒有變異。M2的N端結(jié)構(gòu)域是指該跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列N端。表2提供了可以用于制備根據(jù)本發(fā)明的多亞基多肽的Ml和M2肽表位的示例性列表。表2.Ml和M2肽表位<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>核蛋白(NP)是特異性抗原組之一，它在A型、B型和C型流感病毒之間有區(qū)分。與HA相反，NP是高度保守的，在所有A型流感病毒中94%保守。A型流感病毒NP特異性抗體不具有病毒中和活性，但NP是與所有A型病毒交叉反應(yīng)的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的重要耙(Townsend，JExpMed1984160(2):552-63)。CTL識別對應(yīng)流感NP分子的線性區(qū)域的短合成肽。血凝素(HA)是嵌合到流感包膜中的糖蛋白三聚體。它負責(zé)病毒連接和穿透到宿主細胞。HA的抗體中和病毒感染性。該分子的抗原變異造成流感的頻繁爆發(fā)和通過免疫對感染的弱控制(Ada禾口Jones，CurrTopMicrobialImmunol1986;128:1-54)。流感病毒RNA聚合酶是由以1:1:1比率存在的三種聚合酶(P)蛋白PB1、PB2和PA組成的雜合物。它們在流感毒力中的作用還沒有完全被闡明。HA、NP、PBl和PB2肽表位的非限制性例子在表3中列舉。表3:HA、NP和PB肽表位<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>嵌合或重纟目分子"嵌合蛋白"、"嵌合多肽"或"重組蛋白"可互換地使用，且是指流感多亞基多肽，其可操作地連接于除了由其衍生肽表位的多肽以外的多肽。本發(fā)明的多亞基多表位多肽可以通過在表達載體本身中表達或者作為嵌合蛋白來制備。產(chǎn)生包括一種或多種流感肽表位的嵌合或重組蛋白的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。編碼一種或多種流感肽表位的核酸序列能夠被插入到表達載體中，用于制備在宿主細胞中增殖和表達的多聚核苷酸構(gòu)建體。編碼包括幾種表位的多個重復(fù)的多肽例如多亞基多表位多肽的核酸構(gòu)建體，可以通過連接在其3'和5'端攜帶適當?shù)南拗菩晕稽c的更小的多聚核苷酸構(gòu)建體來制備。在一個非限制性例子中，本發(fā)明的嵌合多肽包括具有下列多肽之一的流感肽表位的嵌合體鞭毛蛋白、霍亂毒素、破傷風(fēng)毒素、卵清蛋白、結(jié)核熱休克蛋白、白喉類毒素、來自呼吸道合胞病毒的G蛋白、來自腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitides)的外膜蛋白、水泡性口膜炎病毒的核蛋白、水泡性口膜炎病毒的糖蛋白、惡性瘧原蟲抗原谷氨酸富集蛋白、裂殖子表面蛋白3或病毒包膜蛋白。這里所使用的術(shù)語"表達載體"和"重組表達載體"是指DNA分子，例如質(zhì)粒、鞭毛蛋白或病毒，其含有用于表達重組肽表位所需要的期望的適當核酸序列，以便在特定宿主細胞中表達。這里使用的"可操作地連接"是指至少兩個序列的功能性連接。可操作地連接包括在啟動子和第二序列例如本發(fā)明的核酸之間的連接，其中啟動子序列引發(fā)和介導(dǎo)對應(yīng)所述第二序列的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。可以通過表達載體來提供肽表位轉(zhuǎn)錄所需要的調(diào)節(jié)區(qū)?；虮磉_所需要的調(diào)節(jié)區(qū)的精確性質(zhì)可以在載體和宿主細胞之間改變。通常，需要能夠結(jié)合RNA聚合酶且啟動可操作地關(guān)聯(lián)的核酸序列的轉(zhuǎn)錄的啟動子。調(diào)節(jié)區(qū)可以包括涉及起始轉(zhuǎn)錄和翻譯的那些5'非編碼序列，例如TATA框、加帽序列、CAAT序列等。所述編碼序列的3'非編碼區(qū)域可以含有轉(zhuǎn)錄終止調(diào)節(jié)序列，例如終止子和多腺苷酸化位點。還可以提供翻譯起始密碼子(ATG)。為了將所述核酸序列克隆到載體的克隆位點，在核酸合成過程中添加提供適當?shù)南嗳菪韵拗菩晕稽c的連接體或接合體。例如，可以通過使用含有需要的限制性酶切位點的引物的PCR擴增DNA將期望的限制性酶切位點引入DNA片段中。包括可操作地與調(diào)節(jié)區(qū)關(guān)聯(lián)的肽表位序列的表達構(gòu)建體可以直接引入到適當?shù)乃拗骷毎杏糜诒磉_和產(chǎn)生多亞基多表位多肽本身或作為重組融合蛋白?？梢允褂玫谋磉_載體包括但不限于質(zhì)粒、黏粘、噬菌體、噬菌粒、鞭毛蛋白或修飾的病毒。通常，此類表達載體包括用于載體在適當宿主細胞中增殖的功能復(fù)制起點、用于插入所期望的基因序列的一個或多個限制性核酸內(nèi)切酶位點和一個或多個選擇標志物。包括表達載體和多亞基多肽的重組多聚核苷酸構(gòu)建體然后應(yīng)該轉(zhuǎn)移到在其中它能夠復(fù)制和被表達的細菌宿主細胞中。這能夠通過本領(lǐng)域已知的方法來實現(xiàn)。所述表達載體與相容性原核或真核宿主細胞一起使用，所述宿主細胞能夠由細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物和人衍生。根據(jù)一個非限制性例子，所述表達載體是如US6，130,082中公開的鞭毛蛋白載體。根據(jù)其它具體實施方案，質(zhì)粒載體含有具有獨特的限制性位點的fliC鞭毛蛋白基因，其中所述多亞基多肽被插入到鞭毛蛋白的高可變區(qū)，且含有所述多表位多肽的重組鞭毛蛋白融合蛋白在缺乏鞭毛的突變沙門氏菌或大腸桿菌中表達。表達所述重組鞭毛蛋白融合蛋白的宿主細胞可以被制成活疫苗。多亞某多肽的牛產(chǎn)—旦被宿主細胞表達，多亞基多肽能夠通過許多蛋白純化方法從不希望的組分中分離。一種此類方法使用在重組蛋白上的多聚組氨酸標簽。多聚組氨酸標簽由添加到重組蛋白中通常在N端或C端的至少六個組氨酸(His)殘基組成。多聚組氨酸標簽常常用于在大腸桿菌或其它原核表達系統(tǒng)中表達的加多聚組氨酸標簽的重組蛋白的親和純化。通過離心來收獲所述細菌細胞，且獲得的細胞沉淀能夠通過物理方式溶解或者用洗滌劑或酶如溶菌酶來溶解。粗溶菌產(chǎn)物在此階段含有所述重組蛋白以及由細菌衍生的幾種其它蛋白，并且用親和介質(zhì)如NTA-瓊脂糖、HisPur樹脂或Talon樹脂孵育粗溶菌產(chǎn)物。這些親和介質(zhì)含有結(jié)合金屬離子，鎳或鈷，所述多聚組氨酸標簽以微摩爾親和力結(jié)合于所述金屬離子。該樹脂然后用磷酸緩沖液洗滌以除去不與鈷或鎳離子特異相互作用的蛋白?？梢酝ㄟ^添加20mM咪唑來改進洗滌效率，且然后通常用150-300mM咪唑來洗脫蛋白。隨后可以使用限制性內(nèi)切酶、內(nèi)切蛋白酶或外切蛋白酶(exoprotease)來除去多聚組氨酸標簽。用于純化加組氨酸標簽的蛋白的試劑盒可以例如從Qiagen購買。另一種方法是通過生產(chǎn)包涵體，所述包涵體是無活性的蛋白聚集體，它可以在重組多肽在原核生物中表達時形成。雖然cDNA可以適當?shù)鼐幋a用于可翻譯的mRNA，所產(chǎn)生的蛋白可以不適當?shù)卣郫B，或者所添加的肽表位的疏水性可以引起重組多肽變得不溶。容易通過本領(lǐng)域公知的方法來提純包涵體。用于提純包涵體的各種工序在本領(lǐng)域中是已知的。在一些實施方案中，通過離心從細菌溶菌產(chǎn)物中回收包涵體，并且用洗滌劑和螯合劑洗滌，以便從聚集的重組蛋白中除去盡可能多的細菌蛋白。為了獲得可溶性蛋白，洗滌的包涵體溶于變性劑中，釋出的蛋白然后通過稀釋或滲析逐漸除去變性劑來再折疊(例如在Molecularcloning:alaboratorymanual(分子克隆實驗室手冊)，第三片反，Sambrook，J.和Russell，D.W.，2001;CSHLPress中所描述的)。可選擇地，所述重組鞭毛蛋白融合蛋白保持形成完整鞭毛的能力。用于純化完整鞭毛的各種工序在本領(lǐng)域中是已知的。在一個實施方案中，由細菌的親代的鞭毛蛋白缺失的非運動性菌株表達的重組鞭毛蛋白分子產(chǎn)生了功能鞭毛。疫苗制劑本發(fā)明的疫苗包括多表位多肽或包含多表位多肽的重組融合蛋白和任選的佐劑。所述疫苗可以被配制用于以多種不同方式之一施用。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，所述疫苗鼻內(nèi)施用。所述疫苗制劑可以任何便利的方式應(yīng)用到淋巴組織。然而，優(yōu)選將它作為液流或液滴應(yīng)用到鼻通道的壁上。鼻內(nèi)組合物能夠例如以液體形式配制為滴鼻劑、噴霧劑，或者適合于吸入，配制為粉劑、霜劑或乳劑。該組合物能夠含有多種添加劑，例如佐齊U、賦形齊U、穩(wěn)定劑、緩沖劑或防腐劑。20為了簡單應(yīng)用，所述疫苗組合物優(yōu)選在適于以滴鼻劑或氣溶膠的形式分布所述多肽或重組融合蛋白的容器中供應(yīng)。在某些優(yōu)選實施方案中，所述疫苗被配制用于粘膜遞送，尤其鼻部遞送(Arnon等人，Biologicals(生物制品)2001;29(3-4):237-42;Ben-Yedidia等人，IntImmunol.(國際免疫學(xué))1999;11(7):1043-51)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，施用為口服，且所述疫苗可以例如以片劑的形式提供，或者在明膠膠囊或微膠囊內(nèi)包裹。還在又一個實施方案中，所述疫苗被配制用于胃腸外施用。在一些實施方案中，所述疫苗被配制用于大規(guī)模接種，例如與噴射注射器或一次性用藥筒一起使用。還根據(jù)又一個實施方案，所述施用是肌內(nèi)。還根據(jù)又一個實施方案，所述施用是皮內(nèi)。專門設(shè)計用于皮內(nèi)投入疫苗的針在本領(lǐng)域中是已知的，例如特別是公開在6，843，781和7，250，036中。根據(jù)其它實施方案，所述施用用無針注射器進行。這些形式的制劑對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是常識。脂質(zhì)體提供了用于抗原遞送和呈遞的另一遞送系統(tǒng)。脂質(zhì)體是由包圍一個通常含水中心的磷脂和其它甾醇組成的雙層囊泡，在所述含水中心中抗原或其它產(chǎn)物能夠被包封。脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)是高度多樣的，許多類型是在從約25nm到約500ym的納米級到微米級的范圍內(nèi)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體可有效遞送治療劑到皮膚和粘膜表面。脂質(zhì)體能夠進一步被修飾，用于例如通過將特異性抗體并入到表面膜來靶向遞送，或者被改變成包封細菌、病毒或寄生蟲。完整的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的平均生存時間或半衰期可以在包括某些聚合物例如聚乙二醇時延長，允許在體內(nèi)延長釋放。脂質(zhì)體可以是單層的或多層的。疫苗組合物可以通過以下方式配制將抗原或抗原/佐劑復(fù)合物包封在脂質(zhì)體中，以形成脂質(zhì)體包封的抗原，并且將脂質(zhì)體包封的抗原與包含疏水性物質(zhì)的連續(xù)相的載體混合。如果在第一步中不使用抗原/佐劑復(fù)合物，可以將適合的佐劑添加到脂質(zhì)體包封的抗原、脂質(zhì)體包封的抗原和載體的混合物、或者在載體與脂質(zhì)體包封的抗原混合之前的載體中。該方法的順序可以取決于使用的佐劑的類型。典型地，當使用佐劑如明礬時，首先將佐劑和抗原混合，以形成抗原/佐劑復(fù)合物，隨后用脂質(zhì)體包封抗原/佐劑復(fù)合物。得到的脂質(zhì)體包封的抗原然后與所述載體混合。術(shù)語"脂質(zhì)體包封的抗原"可以是指單獨的抗原的包封或者抗原/佐劑復(fù)合物的包封，取決于上下文。這促進了佐劑和抗原之間的密切接觸，且在使用明礬作為佐劑時，至少部分可以是免疫應(yīng)答的原因。當使用其它佐劑時，所述抗原可以首選在脂質(zhì)體中被包封，得到的脂質(zhì)體包封的抗原然后混合到疏水性物質(zhì)中的佐劑中。在配制基本上不含水的疫苗組合物中，抗原或抗原/佐劑復(fù)合物用脂質(zhì)體包封，并與疏水性物質(zhì)混合。在疏水性物質(zhì)包水的乳劑中配制疫苗時，所述抗原或抗原/佐劑復(fù)合物在水性介質(zhì)中用脂質(zhì)體包封，然后將該水性介質(zhì)與疏水性物質(zhì)混合。在乳劑的情況下，為了保持疏水性物質(zhì)在連續(xù)相中，含有脂質(zhì)體的水性介質(zhì)可以在混合下按等份添加到疏水性物質(zhì)中。在所有配制方法中，脂質(zhì)體包封的抗原可以根據(jù)情況在與疏水性物質(zhì)或水性介質(zhì)混合之前冷凍干燥。在一些情況下，抗原/佐劑復(fù)合物可以用脂質(zhì)體包封，隨后冷凍干燥。在其它情況下，所述抗原可以用脂質(zhì)體包封，隨后添加佐劑，然后冷凍干燥，以形成具有外21部佐劑的冷凍干燥的脂質(zhì)體包封的抗原。還在另外的例子中，抗原可以用脂質(zhì)體包封，隨后在添加佐劑之前冷凍干燥。冷凍干燥可以促進在佐劑和抗原之間的良好相互作用，獲得了更有效力的疫苗。將脂質(zhì)體包封的抗原配制成疏水性物質(zhì)還可以牽涉到使用乳化劑來促進脂質(zhì)體在疏水性物質(zhì)中的更均勻的分布。典型的乳化劑在本領(lǐng)域中是公知的，且包括二縮甘露醇油酸酯(ArlacelA)、卵磷脂、Tween80、Spans20、80、83和85。所述乳化劑以有效促進脂質(zhì)體的均勻分布的量使用。通常，疏水性物質(zhì)與乳化劑的體積比(v/v)是在約5:1到約15:1的范圍內(nèi)。微顆粒和納米顆粒使用小的可生物降解的球體，它用作疫苗遞送的貯庫。聚合物微球具有的超過其它貯庫效應(yīng)的佐劑的主要優(yōu)點是，它們是極其安全的，且已經(jīng)被美國食品和藥品管理局批準作為適合的縫合線用于人類醫(yī)藥以及用作可生物降解的藥物遞送系統(tǒng)(LangerR.Science(科學(xué)).1990;249(4976):1527-33)。共聚物水解的速率被很好表征，進而允許制造在延長時間內(nèi)具有持續(xù)抗原釋放的微顆粒(0'Hagen等人，Vaccine(疫苗).1993;11(9):965-9)。微顆粒的胃腸外施用引起了持久的免疫，特別是如果它們引入了延長的釋放特性。能夠通過將在不同時間內(nèi)水解的聚合物的混合物和它們的相對分子量來調(diào)節(jié)釋放速率。不希望受理論約束，不同粒度的顆粒(lym至200iim)的配制還可以有助于持久的免疫應(yīng)答，因為在可供用于巨噬細胞攝取之前，大的顆粒必須被破碎為更小的顆粒。以這種方式，單注射疫苗能夠通過結(jié)合各種粒度來開發(fā)，從而延長抗原呈遞和很大地有益于畜牧業(yè)生產(chǎn)者。在一些應(yīng)用中，佐劑或賦形劑可以包括在疫苗制劑中。MontanideTM(不完全弗氏佐劑)和明礬例如是優(yōu)選用于人用途的佐劑。所述佐劑的選擇將部分通過疫苗的施用方式來決定。例如，非注射接種將導(dǎo)致更好的總體順從性和更低的總體成本。優(yōu)選的施用方式是肌內(nèi)施用。另一優(yōu)選的施用方式是鼻內(nèi)施用。鼻內(nèi)佐劑的非限制性例子包括脫乙酰殼多糖粉劑、PLA和PLG微球、QS-21、磷酸f丐納米顆粒(CAP)和mCTA/LTB(具有熱不穩(wěn)定的腸毒素的五聚體B亞基的突變霍亂毒素E112K)。使用的佐劑還可以理論上是已知用于基于肽或蛋白的疫苗的任何佐劑。例如凝膠形式的無機佐劑(氫氧化鋁/磷酸鋁，Warren等人，1986;磷酸鈣，Relyvelt，1986);細菌佐齊U，例如單磷酰脂質(zhì)A(Ribi，1984;Baker等人，1988)和胞壁酰肽(Ellouz等人，1974;Allison和Byars，1991;Waters等人，1986);顆粒佐劑例如所謂的ISCOMS("immunosti咖latorycomplexes(免疫剌激復(fù)合物)"，Mowat禾口Donachie，1991;Takahashi等人，1990;Thapar等人，1991)，脂質(zhì)體(Mbawuike等人，1990;Abraham，1992;Phillips和Emili，1992;Gregoriadis，1990)和可生物降解的微球(Marx等人，1993);基于油乳劑和乳化劑如IFA的佐劑("不完全弗氏佐劑"(Stuart-Harris，1969;Warren等人，1986)，SAF(Allison和Byars，1991)，皂苷類(例如QS-21;Newman等人，1992，角鱉烯/角鱉烷(Allison和Byars，1991);合成佐劑如非離子嵌段共聚物(Hunter等人，1991)，胞壁酰肽類似物(A薩a，1992)，合成脂質(zhì)A(Warren等人，1986;Azuma，1992)，合成多聚核苷酸(Harrington等人，1978)和聚陽離子佐劑(W097/30721)。與本發(fā)明的免疫原一起使用的佐劑包括鋁或鈣鹽(例如氫氧化物或磷酸鹽)。特別優(yōu)選在這里使用的佐劑是氫氧化鋁凝膠例如AlhydrogelTM。磷酸鈣納米顆粒(CAP)是由Biosante，Inc.(Lincolnshire,111.)開發(fā)的佐劑。感興趣的免疫原可以涂布到顆粒的外部，或者在內(nèi)部包封[He等人(2000年11月)Clin.Diagn.Lab.Immunol.，7(6):899-903]。與本發(fā)明的免疫原一起使用的另一佐劑是乳劑。涉及的乳劑可以是水包油乳劑或油包水乳劑。除了免疫原性嵌合蛋白顆粒以外，這種乳劑包括角鯊烯、角鯊?fù)?、花生油或本領(lǐng)域公知的類似物的油相和分散劑。非離子分散劑是優(yōu)選的，且這種材料包括脫水山梨醇單-c12-c24-脂肪酸酯、脫水山梨醇二-c12-c24-脂肪酸酯、二縮甘露醇單-c12-c24-脂肪酸酯和二縮甘露醇二-c12-c24-脂肪酸酯，例如脫水山梨醇單硬脂酸酯、脫水山梨醇單油酸酯和二縮甘露醇單油酸酯。這種乳劑例如是包括角鯊烯、甘油和表面活性劑例如二縮甘露醇單油酸酯(ArlacelA)的，任選地具有角鯊?fù)榈挠桶閯?，用在水相中的嵌合蛋白顆粒乳化。油相的可選擇的組分包括a-生育酚、混合鏈甘油二酯和三酯和脫水山梨醇酯。這種乳劑的公知例子包括MontanideTMISA-720和MontanideISA703(S印pic，法國卡斯特爾)。其它水包油乳劑佐劑包括在WO95/17210和EP0399843中公開的那些佐劑。小分子佐劑的使用也在這里被考慮。可在這里使用的一類小分子佐劑是美國專利第4，539，205號、美國專利第4，643,992號、美國專利第5，011，828號和美國專利第5，093，318號中所述的7-取代-8-氧代-鳥苷衍生物或者8-磺基-鳥苷衍生物。7-烯丙基_8-氧代鳥苷(洛索立賓)已經(jīng)顯示在誘導(dǎo)抗原_(免疫原_)特異性應(yīng)答中特別有效。有用的佐劑包括單磷酰脂質(zhì)A(MPL)、3-去乙酰單磷酰脂質(zhì)A(3D-MPL)，一種公知的由西雅圖的CorixaCorp.，以前的Ribilmmunochem，Hamilton,Mont.制造的佐劑。該佐劑含有從細菌中提取的三種組分在2X角鯊烯/TweenTM80乳劑中的單磷酰脂質(zhì)(MPL)A、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和細胞壁骨架(CWS)(MPL+TDM+CWS)。該佐劑可以通過GB2122204B中教導(dǎo)的方法來制備。其它化合物與稱為氨基烷基葡萄糖酰胺磷酸酯(AGP)的MPL⑧佐劑是結(jié)構(gòu)相關(guān)的，所述佐劑例如從CorixaCorp獲得的名稱為RC-529TM佐劑{2_[(R)-3-十四?；趸孽；被鵠-乙基-2-脫氧-4-0-膦?；?3-0-[(R)-3-十四?；趸孽；鵠-2-[(R)-3-十四?；趸孽；鵢氨基]-p-D-吡喃葡萄糖苷三乙銨鹽}。RC-529佐劑可在作為RC-529SE銷售的角鯊烯乳劑以及作為RC-529AF的水性制劑中從CorixaCorp.獲得(參見美國專利第6，355，257號和美國專利第6，303，347號；美國專利第6，113，918號；以及美國公開第03-0092643號)。其它被考慮的佐劑包括含有一次或多次CpG核苷酸基序(附加側(cè)翼序列)的合成寡核苷酸佐劑，其可從ColeyPharmaceuticalGroup獲得?？蓮腁quilaBiopharmaceuticals,Inc.獲得的命名為QS21的佐劑，是具有佐劑活性的免疫活性皂苷部分，其衍生自南美州樹木QuillajaS即onariaMolina的樹皮(例如QuilA)，并且它的生產(chǎn)方法在美國專利第5，057，540號中被公開。QuilA的衍生物，例如QS21(QuilA的HPLC純化部分衍生物，也叫做QA21)和其它部分例如QA17也被公開。QuillajaS即onariaMolina皂苷的半合成和合成衍生物也是有用的，例如在美國專利第5，977，081號和美國專利第6，080，725號中描述的那些。可從ChironCorp.獲得的命名為MF59的佐劑描述在美國專利第5，709，879號和美國專利第6，086，901號。胞壁酰二肽佐劑也被考慮，且包括N-乙?；鵢胞壁酰基-L-蘇氨?；?D-異谷酰胺(thur-MDP)、N-乙?；?去甲-胞壁?；?L-丙氨?；鵢D_異谷酰胺[CGP11637，稱之為nor-MDP]和N-乙?；邗；?L-丙氨?；?D-異谷酰胺基-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕櫚酰基-s-n-甘油-3-羥基磷酰氧基)乙胺[(CGP)1983A，稱之為MTP-PE]。所謂的胞壁酰二肽類似物描述在美國專利第4，767，842號中。其它佐劑混合物包括3D-MPL和QS21的組合(EP0671948Bl)、含有3D-MPL和QS21的水包油乳劑(WO95/17210，PCT/EP98/05714)、用其它載體配制的3D-MPL(EP0689454B1)、在含有膽固醇的脂質(zhì)體中配制的QS21(W096/33739)或者免疫剌激性寡核苷酸(WO96/02555)。購自SKB(現(xiàn)在為Glaxo-SmithKline)的佐劑SBAS2(現(xiàn)在AS02)含有在水包油乳劑中的QS21和MPL，也是有用的?？蛇x擇的佐劑包括在WO99/52549中所述的那些以及聚氧乙烯醚的非顆粒狀懸浮劑(英國專利申請第9807805.8號)。使用單獨的含有一種或多種Toll樣受體-4(TLR-4)的激動劑的佐劑如MPL⑧佐劑或結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物例如RC-529⑧'佐劑或脂質(zhì)A模擬物或與TLR-9的激動劑如含非甲基化寡脫氧核苷酸的CpG基序一起也是任選的。另一類佐劑混合物包括如在美國專利第6，113，918中所述的進一步含有氨基烷基葡萄糖胺磷酸酯的穩(wěn)定油包水乳劑。在氨基烷基葡萄糖胺磷酸酯中，稱為RC-529的分子{(2-[(R)-3-十四?；趸孽；被鵠_乙基_2-脫氧-4-0-膦酰基-3-0-[(R)-3-十四?；趸孽；鵠-2-[(R)_3-十四?；趸孽；被鵠-p-D-吡喃葡萄糖苷三乙銨鹽)}是最優(yōu)選的。優(yōu)選的油包水乳劑在W09956776中被描述。佐劑以輔佐量使用，該量能夠隨佐劑、宿主動物和免疫原而改變。典型的量可以從每免疫大約lmcg到大約lmg改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，適當?shù)臐舛然蛄靠梢匀菀状_定。包括基于水包油乳劑的佐劑的疫苗組合物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。油包水乳劑可以包括例如在美國7，323，182中所述的可代謝的油和皂苷。所述油和皂苷例如以在1:1和200:l之間的比率存在。根據(jù)幾個實施方案，根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物可以含有一種或多種佐劑，特征在于它作為基本上無無機鹽離子的溶液或乳劑存在，其中所述溶液或乳劑含有一種或多種水溶性或水可乳化的物質(zhì)，所述物質(zhì)能夠使疫苗等滲或低滲。所述水溶性或水可乳化的物質(zhì)例如可以選自由麥芽糖、果糖、半乳糖、蔗糖、糖醇、脂質(zhì)和它們的組合組成的組。本發(fā)明的制劑可任選地包括粘膜遞送增強劑諸如例如US2004/007540中所述的通過調(diào)節(jié)上皮連接結(jié)構(gòu)和/或生理學(xué)來可逆地增強粘膜上皮細胞旁轉(zhuǎn)運的滲透肽。根據(jù)本發(fā)明的幾個具體實施方案，本發(fā)明的多亞基多表位多肽包括蛋白體佐劑。蛋白體佐劑包括腦膜炎球菌的外膜蛋白的純化制劑和來自其它細菌的類似制劑。這些蛋白是高度疏水的，反映了它們作為跨膜蛋白和膜孔蛋白的作用。由于它們的疏水性蛋白_蛋白相互作用，當適當分離時，所述蛋白形成了由約60-100nm直徑整體或碎片膜囊泡組成的多分子結(jié)構(gòu)。所述脂質(zhì)體樣物理狀態(tài)允許所述蛋白體佐劑作為蛋白載體起作用以及作為佐劑起作用。蛋白體佐劑的使用已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中有描述，并且由LowellGH在"NewGenerationVaccines(新一代疫苗)"，第二版，MarcelDekkerInc，紐約，巴塞爾，香港(1997)第193-206頁中綜述。蛋白體佐劑囊泡被描述為在尺寸上比得上疏水且對于人類使24用安全的某些病毒。該綜述描述了當使用完全透析技術(shù)可選擇地除去溶解的洗滌劑時形成的包括在各種抗原和蛋白體佐劑囊泡之間的非共價復(fù)合物的組合物的配制。本發(fā)明的多肽任選地通過疏水部分復(fù)合到蛋白體抗原囊泡上。例如將抗原軛合于脂質(zhì)部分如脂肪?；鶊F。這種疏水部分可以直接連接于多亞基多肽，或者可選擇地例如一個、兩個、三個或四個、多達六個或十個氨基酸的短間隔子可以用于將多亞基多肽連接于脂肪基團。這種疏水錨狀物與蛋白體佐劑囊泡的疏水膜相互作用，同時提供了一般親水性的抗原肽。尤其，疏水性錨狀物可以包括連接于多亞基多肽的氨基端或者羧基端附近的脂肪?；鶊F。一個例子是十二碳鏈月桂?；?CH"CH、。CO)，雖然包括但不限于八碳、十碳、十四碳、十六碳、十八碳或二十碳鏈長度的?；鶊F的任何類似作用的脂肪酰基基團也能夠用作疏水錨狀物。所述錨狀物可以使用免疫增強間隔子連接于肽抗原。這種連接體可以由i-io個氨基酸組成，它們可以有助于保持肽的構(gòu)象結(jié)構(gòu)?？梢酝ㄟ^混合在選擇的洗滌劑的溶液中組分，然后通過滲濾/超濾方法除去洗滌劑來配制該兩種組分，即多亞基多肽和蛋白體佐劑。一般，該組合物中含有的蛋白體佐劑與多亞基多肽的比率優(yōu)選大于(按重量計)i:i，并且例如可以是i:2、i:3、i:4高達i:5、i:io或i:20。所述兩種組分的基于洗滌劑的溶液可以含有相同的洗滌劑或不同的洗滌劑，且一種以上的洗滌劑可以存在于經(jīng)歷超濾/滲濾的混合物中。適合的洗滌劑包括Triton、Empigen和Mega-lO。還能夠使用其它適合的洗滌劑。所述洗滌劑用于將所述組分溶解，以用來制備所述組合物?？梢酝ㄟ^將許多不同的抗原肽與蛋白體佐劑混合來生產(chǎn)包括不同多亞基多肽的疫苗?？蛇x擇地，可以生產(chǎn)兩種或多種蛋白體佐劑/抗原肽組合物，隨后混合。雖然在雞蛋中生產(chǎn)的商業(yè)流感疫苗在對雞蛋敏感的個體中誘導(dǎo)了過敏反應(yīng)，但多亞基疫苗不會引起這種應(yīng)答，如由免疫之前和免疫之后的IgE滴度所表現(xiàn)的?？乖孔罴训赝ㄟ^它引起的生物效果來界定。自然，應(yīng)該提供足夠的抗原來引起可測定量的保護性抗體的產(chǎn)生。用于病毒的生物活性的便利試驗涉及到進行試驗的抗原材料耗盡已知的它的保護性抗體的陽性抗血清的能力。對于用毒力生物體處理的小鼠，該結(jié)果以LDs。的負對數(shù)(致死劑量，50%)被報道，所述毒力生物體用已知抗血清預(yù)處理，所述已知抗血清本身用各種稀釋度的評價的抗原材料預(yù)處理。高值因此反映了高含量的已經(jīng)縛牢已知抗血清中的抗體的抗原材料，因此減少或消除了抗血清對毒力生物體的效果，使得小劑量致死。優(yōu)選地，與由用未處理的抗血清處理的毒力生物體獲得的結(jié)果相比，存在于最終制劑中的抗原材料是在足以將LD5。的負對數(shù)增加至少1的，優(yōu)選1.4的水平。對于抗血清對照和適合的疫苗材料獲得的絕對值當然依賴于選擇的毒力生物體和抗血清標準。還可以使用以下方法來獲得理想的疫苗制劑從預(yù)期引起希望的免疫應(yīng)答的規(guī)定的抗原起始，在第一步中，發(fā)現(xiàn)與抗原配合的佐劑，如在專門文獻，尤其WO97/30721中所描述的。在第二步中，所述疫苗通過以下步驟優(yōu)化以等滲或稍微低滲的濃度將本發(fā)明中定義的各種實現(xiàn)等滲的物質(zhì)，優(yōu)選糖和/或糖醇，添加抗原和佐劑的混合物中，使得所述組合物在其他方面相同，并且調(diào)節(jié)該溶液到pH4.0-10.0范圍內(nèi)的，尤其7.4的生理pH。然后，在第一步中確定與通常的鹽水緩沖的溶液相比將改善抗原/佐劑組合物的溶解性的物質(zhì)或其濃度。通過候選物質(zhì)的溶解度特性的改善是該物質(zhì)能夠?qū)е乱呙绲拿庖咴曰钚缘脑黾拥牡谝恢甘?。因為細胞免疫?yīng)答增加的可能前提條件之一是抗原與APC(抗原呈遞細胞)的增加的結(jié)合，在第二步中可以研究來發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)是否導(dǎo)致這種的增加。使用的方法可以類似于在佐劑的定義中描述的方法，例如用熒光標記的肽或蛋白、佐劑和實現(xiàn)等滲的物質(zhì)孵育APC。能夠通過使用通流細胞術(shù)(throughflowcytometry)與已經(jīng)與單獨的肽和佐劑混合的或者與存在于普通鹽水緩沖溶液的肽/佐劑組合物混合的細胞比較來確定由所述物質(zhì)帶來的增加的肽攝取或與APC的結(jié)合。在第二步中，可以體外研究候選物質(zhì)以發(fā)現(xiàn)它們的存在是否能夠增加肽至APC的呈遞和它們存在的什么程度能夠增加肽至APC的呈遞；細胞上的MHC濃度可以使用W097/30721中所述的用于試驗肽的方法來測定。試驗制劑的效率的另一可能方式是通過使用體外模型系統(tǒng)。在該方式中，APC與佐劑、肽和候選物質(zhì)一起孵育，并測定特異性識別使用的肽的T細胞克隆的相對活化(Coligan等人，1991;Lopez等人，1993)。制劑的效率還可任選地通過檢測免疫動物中的"遲發(fā)型超敏"(DTH)反應(yīng)由細胞免疫應(yīng)答來證實。最后，該制劑的免疫調(diào)節(jié)活性在動物試驗中測定?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的用于合成肽、肽多聚體和多肽的方法來化學(xué)合成本發(fā)明的多亞基肽和多肽。這些方法一般依賴已知的肽合成原理；最便利地，該方法可以根據(jù)已知的固相肽合成原理來進行。這里所使用的"肽"表示由肽鍵連接的氨基酸的序列。根據(jù)本發(fā)明的肽包括4-24個氨基酸殘基的序列。多亞基多肽包括肽表位的至少二個重復(fù)和最多50個重復(fù)。肽類似物和肽模擬物(p印tidomimetic)也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，以及本發(fā)明的肽的鹽和酯也被包括。根據(jù)本發(fā)明的肽類似物可任選地包括至少一個非天然氨基酸和/或在C端或N端的至少一個封閉基團。本發(fā)明的肽的鹽是生理學(xué)上可接受的有機鹽和無機鹽。適當?shù)?類似物"的設(shè)計可以用計算機輔助。術(shù)語"肽模擬物"是指根據(jù)本發(fā)明的肽以包括至少一個非肽鍵例如脲鍵、氨基甲酸酯鍵、磺酰胺鍵、肼鍵或任何其它共價鍵的這種方式來修飾。適當?shù)?肽模擬物"的設(shè)計可以用計算機來輔助。本發(fā)明的肽的鹽和酯包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的肽的鹽是生理學(xué)上可接受的有機鹽和無機鹽。本發(fā)明的肽的功能衍生物包括可以通過本領(lǐng)域已知的方式由作為殘基上的側(cè)鏈或N或C端基團存在的官能團制備的衍生物，并且包括在本發(fā)明中，只要它們保持藥學(xué)上可接受，即它們不破壞肽的活性且不賦予含有它的組合物以毒性。這些衍生物例如包括羧基的脂肪族的酯、通過與氨或伯胺或仲胺反應(yīng)所產(chǎn)生的羧基的酰胺、通過與?；糠?例如烷?；蛱辑h(huán)芳?；?反應(yīng)形成的氨基酸殘基的游離氨基的N-?；苌锘蛲ㄟ^與?；糠址磻?yīng)形成的游離羥基(例如絲氨?；蛱K氨?；鶜埢?的o-?；苌?。術(shù)語"氨基酸"是指化合物，其具有氨基基團和羧酸基團，優(yōu)選是在碳骨架上的1，2_取代、1，3-取代或1，4-取代模式。a_氨基酸是最優(yōu)選的，且包括在蛋白中發(fā)現(xiàn)的20種天然氨基酸(它們是L-氨基酸，除了甘氨酸)，相應(yīng)的D-氨基酸、相應(yīng)的N-甲基氨基酸、側(cè)鏈修飾的氨基酸、沒有在蛋白中發(fā)現(xiàn)的生物合成獲得的氨基酸(例如4-羥基-脯氨酸、5_羥基_賴氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸、刀豆氨酸、黎豆氨酸、13_氰基丙氨酸，以及合成衍生的a-氨基酸，例如氨基異丁酸、正亮氨酸、正纈氨酸、同型半胱氨酸和同型絲氨酸。e-丙氨酸和Y-氨基丁酸分別是1，3-氨基酸和1，4-氨基酸的例子，且許多其它氨基酸在本領(lǐng)域是公知的。抑胃酶氨酸樣等構(gòu)物(包括兩個氨基酸的二肽，其中CONH鍵被CHOH置換)、羥基亞乙基等構(gòu)物(包括兩個氨基酸的二肽，其中CONH鍵被CHOHCH2置換)、還原的酰胺等構(gòu)物(包括兩個氨基酸的二肽，其中CONH鍵被CH2NH鍵置換)和硫代酰胺等構(gòu)物(包括兩個氨基酸的二肽，其中CONH鍵被CSNH鍵置換)也是本發(fā)明有用的殘基。用于本發(fā)明的氨基酸是可商業(yè)獲得或者可通過常規(guī)合成方法獲得的氨基酸。某些殘基可以需要特殊方法來引入到肽中，肽序列的順序、發(fā)散或匯集合成方法可用于本發(fā)明。自然編碼的氨基酸及其衍生物根據(jù)IUPAC協(xié)議用三字母代碼來表示。當沒有指示時，使用L異構(gòu)體。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的氨基酸的保守替代是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。保守氨基酸替代包括一個氨基酸用另一個具有相同類型官能團或側(cè)鏈例如脂肪族、芳族、帶正電、帶負電的氨基酸替換。這些替代可以增強口服生物利用度、滲透到中樞神經(jīng)系統(tǒng)、耙向特異性細胞群體等。技術(shù)人員會認識到，在編碼序列中改變、增加或刪除單個氨基酸或小百分率的氨基酸的對肽、多肽或蛋白序列的個別替代、刪除或增加是"保守修飾變體"，其中改變導(dǎo)致了氨基酸用化學(xué)類似的氨基酸替代。提供功能上類似的氨基酸的保守替代表格在本領(lǐng)域中是公知的。以下六組各自含有用于彼此保守替代的氨基酸1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷胺酰胺(Q);4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(1)、亮氨酸(U、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V);以及6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。提供以下實施例，以便更充分說明本發(fā)明的一些實施方案。然而，這些實施例決不被認為限制本發(fā)明的寬范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在不偏離本發(fā)明范圍的情況下容易設(shè)計此處公開的原理的許多變化和修飾。實施例材料和方法多亞某多表位多肽:提供包括表1中列舉的流感病毒肽表位El-E9的若干重復(fù)的多亞基多表位多肽的例子。所述多肽包括氨基酸和作為間隔子的短肽。所述多肽以交替的順序聚合物結(jié)構(gòu)或嵌段共聚物結(jié)構(gòu)排列。通過由包括多個限制性位點以便進一步控制多肽的多聚核苷酸構(gòu)建體在表達載體中表達來制備所述多肽。所述多聚核苷酸構(gòu)建體由商業(yè)來源供應(yīng)。皿在實施例1-3中提供的由多亞基多表位多肽制備的疫苗用于各種小鼠株的免疫研究。生產(chǎn)和試驗的特定疫苗的例子是多亞基#11由多亞基多肽制備，所述多亞基多肽包括在實施例1中提供的以交替順序聚合物結(jié)構(gòu)[E1E2E3E4E5E6E7E8E9]5排列的九種流感肽表位的五個重復(fù)。多亞基#12由多亞基多肽制備，所述多亞基多肽包括在實施例3中提供的以交替順序聚合物結(jié)構(gòu)[E1E2E3E4E5E6E7E8E9]3排列的九種流感肽表位的三個重復(fù)。多亞基#14由多亞基多肽制備，所述多亞基多肽包括在實施例2中提供的以嵌段共聚物結(jié)構(gòu)[E1]3_[E2]3-[E3]3-[E4]3-[E5]3-[E6]3-[E7]3-[E8]3-[E9]3排列的九種流感肽表位的三個重復(fù)。免疫研究:三種品系的小鼠遠交品系(ICR)、近交品系(BALB/c)和人HLAA*0201分子轉(zhuǎn)基因品系(HLAA*0201)用于免疫研究以及在一些實驗中使用兔子。使用的病毒包括以下A/得克薩斯/1/77、A/威斯康星/67/05(WISC)、A/WSN/33(WSN)、B/馬來西亞/2506/04(MAL)、A/加利福尼亞/07-2007、A/新喀里多尼亞20/99(NC)以及其它。所有研究用肌內(nèi)施用在100微升中的150mcg多亞基多表位多肽來進行，同樣地施用于兩個后肢。棚列1:11柳，糊幅雜,歹謹,亓息樹縫這是包含以交替順序聚合物結(jié)構(gòu)[E1E2E3E4E5E6E7E8E9]5排列的九種流感肽表位的五個重復(fù)的多亞基多肽的實施例。估計的分子量是80kD。該多亞基多肽的氨基酸序列，包括組氨酸標簽，在圖1B中顯示。用于制備該多亞基肽的多聚核苷酸構(gòu)建體的DNA序列在圖1A中顯示。棚列2:JI都乂鵬錢雄細,力,禾中砌表橘fe—麵H樹飾《縫在本實施例中，用于制備包括以嵌段共聚物結(jié)構(gòu)[E1]3-[E2]3-[E3]3-[E4]3_[E5]f[E6]f[E7]f[E8]f[E9]3排列的九種流感肽表位的三個重復(fù)的多亞基肽的多聚核苷酸構(gòu)建體的DNA序列在圖2A中顯示，且相應(yīng)的氨基酸序列在圖2B中顯示。估計的分子量是48kD。實施例3:具有包含以交替順序結(jié)構(gòu)排列的九種表位的單元的三個重復(fù)的多亞基鍾這是包括以交替順序聚合物結(jié)構(gòu)[E1E2E3E4E5E6E7E8E9]3排列的九種流感肽表位的三個重復(fù)的多亞基多肽的實施例。估計的分子量為48kD。該多亞基多肽的氨基酸序列在圖3B中顯示。用于制備該多亞基肽的多聚核苷酸構(gòu)建體的DNA序列在圖3A中顯示。實施例4:細胞免疫應(yīng)答評價對兩種不同濃度的A/得克薩斯/1/77、A/WisxWisc/67/05、A/加利福尼亞/07-2007和B/馬來西亞/2506/04株的剌激流感病毒的細胞免疫應(yīng)答。轉(zhuǎn)基因小鼠(對于HLAA*0201的轉(zhuǎn)基因)用在IFA(不完全弗氏佐劑)內(nèi)乳化的兩種多亞基疫苗#11和#14接種一次。在免疫后7-10天，取下它們的脾和淋巴結(jié)(LN)，進一步用上述病毒孵育。增殖通過胸腺嘧啶攝取來測定，并于圖4中以用剌激病毒孵育的淋巴細胞的增殖指數(shù)顯示。該增殖與在300-1300pg/ml的范圍內(nèi)的IFN-y分泌關(guān)聯(lián)。該應(yīng)答指示對該疫苗的Thl細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，所述疫苗能夠提供對攻擊病毒感染的更牢固的免疫。實施例5:免疫抗原和病毒被免疫血清識別用懸浮于在PBS中的50%甘油中的或懸浮于作為佐劑的IFA中的包括以交替的順序聚合物結(jié)構(gòu)[E1E2E3E4E5E6E7E8E9]5排列的九種表位的五個重復(fù)的多亞基多表位多肽(多亞基#11)、或者包括以嵌段共聚物結(jié)構(gòu)[E1]3-[E2]3-[E3]3-[E4]3-[E5]3-[E6]3-[E7]3-[F8]f[E9]3排列的九種表位的三個重復(fù)的多亞基多表位多肽(多亞基#14)、或者用作為載體對照的在PBS中的50X甘油來免疫ICR小鼠。已知保護性流感表位HA91-108和M22-12以及幾種流感疫苗(WISC、WSN、NC和MAL)被用抗原多肽免疫的小鼠血清(分別為#11和#14)識別，通過ELISA測定，結(jié)果在表4a和4b中總結(jié)。有意義的識別被定義為在免疫前血清和在2-3周間隔三次IM免疫之后的血清中的滴度有至少4倍升高。:免疫前血清和用PBS中的50X甘油中的多亞基多表位多肽三次免疫之后的血清的對各種抗原的滴度的升高倍數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>:免疫前血清和用作為佐劑的IFA中的多亞基多表位多肽三次免疫后血清的對各種抗原的滴度的升高倍數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>兩個組顯示免疫抗原的高度識別，肽HA91-108和M22_18僅僅被用#14免疫的小鼠的血清識別，但不被用#11免疫的小鼠的血清識別。正常人血清能夠識別多亞基疫苗候選物，指示在用該疫苗免疫人受試者之后引起的潛在記憶應(yīng)答。對#11和#14的四個人血清的平均滴度分別為6000和6400。實施例6.杭對用H3N2A/得克薩斯/1/77的高致死攻擊的保護按3周間隔用多亞基#14疫苗或PBS肌內(nèi)三次免疫八只轉(zhuǎn)基因小鼠的組。在最后一次剌激之后三周給予用高致死劑量(300LD5。)的H3N2A/得克薩斯/1/77的攻擊感染。感染后5天處死小鼠。如圖5中所述，發(fā)現(xiàn)了小鼠肺中的病毒滴度的顯著減少，盡管使用了大量的病毒用于感染。實施例7:體內(nèi)效力研究體內(nèi)評價兩種疫苗型懸浮于PBS中的50%甘油中或懸浮于不完全弗氏佐劑中的多亞基多肽。在幾個小鼠模型中使用純化疫苗來確立其效力、作用機制和重復(fù)劑量毒理學(xué)之前的初步毒理學(xué)數(shù)據(jù)。在幾個品系的小鼠中進行體液應(yīng)答以及藥效動力學(xué)研究。用于評價疫苗的一個動物模型是HLAA*0201的轉(zhuǎn)基因小鼠。該模型用于確定最佳劑量以及免疫應(yīng)答的細胞參數(shù)，以揭示其作用機制。實施例8:使用ICR和轉(zhuǎn)基因(HLAA*0201)小鼠在兩個初步研究中證明疫苗的效力。按三周間隔用具有和不具有佐劑(IFA)的150mcg/小鼠的劑量的疫苗ftll、ftl2和ftl4肌內(nèi)三次接種小鼠。在最后一次免疫之前3-4周，用300LD50的小鼠適應(yīng)的流感病毒H3N2株(A/得克薩斯/1/77)感染小鼠。感染后5天，監(jiān)視存活率。用具有和不具有IFA的PBS中50X甘油免疫的處理組和對照組進行比較。在ICR小鼠中在300LD50感染之后的存活率(圖6A)是100%，而在對照組(PBS中50%甘油)中存活率證明為20%。圖6B中僅僅詳細給出了對于疫苗#11和#14的其肺中的病毒載量。其中發(fā)現(xiàn)了100%存活率的組中的病毒載量明顯低于對照組中的病毒載量(p<0.05)。由于每組的小鼠數(shù)量少(5只小鼠)，使用雙側(cè)Fisher's確切檢驗(Two-sidedFisher'sExactTest)進行統(tǒng)計學(xué)分析。5X或更低的P值被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。使用SAS⑧9.l版(北卡羅來納州卡瑞(Cary)的SAS研究所)分析數(shù)據(jù)。關(guān)于用在PBS/50X甘油中的疫苗免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠的存活率(圖7)，使用上述相同的接種和感染方法，相比于對照組的20%，用#11和#14接種的存活率分別是80%和60%。在該小鼠模型中疫苗#12以及測試的佐劑(IFA)疫苗是非保護的。在本動物模型中或者至少在本研究中，看來添加佐劑是不必要的，甚至減低了疫苗的保護性潛力。實施例9:重復(fù)劑暈毒理學(xué)用疫苗#14(懸浮于PBS中的50%甘油或不完全弗氏佐劑中的三個嵌段重復(fù)的多亞基疫苗)，根據(jù)基于http://www3.niaid.nih.gov/daids/vaccine/Science/VRTT/06_SafetyTest.htm的操作規(guī)程來進行重復(fù)劑量毒理學(xué)試驗。在ICR遠交系小鼠中進行初步劑量相關(guān)的毒理學(xué)研究。使用用于每一處死時間點每劑量每性別的三只動物來試驗在肌內(nèi)施用一次、兩次和三次疫苗之后的它們的主要器官的組織病理學(xué)。在包含三個每兩周一次接種的6周重復(fù)劑量中使用預(yù)期用于臨床的最高劑量，該6周重復(fù)劑量很可能足以評價產(chǎn)品的毒性且能夠重復(fù)兩次。研究包括監(jiān)視生存階段，隨后整套的毒理學(xué)參數(shù)，包括在免疫后2天和2周的尸體剖檢和所有主要器官的完全組織病理學(xué)檢查，以便說明在處理期間見到的任何毒理學(xué)效應(yīng)是可逆的。實施例10:l/IIa期臨床試驗本臨床試驗的主要目的是檢查在單次或雙次肌內(nèi)施用之后預(yù)防性抗流感疫苗的安全性。該研究在控制臨床環(huán)境下在年齡18歲到49歲的健康志愿者中進行。第二個目的是估計通過施用多亞基疫苗引起的免疫原性。該I/II期研究評價了最普通的急性不良效應(yīng)并檢查了患者能夠安全施用、沒有副作用高發(fā)生率的劑量大小。輔你l11:膨lk謹錢德，,臟W棘純制勺/l、隨青巾,驢磁HLAA*0201的轉(zhuǎn)基因小鼠用商業(yè)滅活流感疫苗(分裂病毒顆粒)BPVaxignp⑧在0天、第60天、第81天免疫三次，或者用Vaxigrip⑧在o天免疫一次，以及用多亞基疫苗#11、#12和#14免疫另外兩次(在第60天和第81天)。在免疫之前(免疫前)和在最后一次免疫后收集血液。在以下混合血清中測定幾種流感株的抗體H3N2:A/威斯康星/67/05、A/得克薩斯/1/77、A/加利福尼亞/07/2007、A/福建/411/2002、A/莫斯科/10/99和A/巴拿馬/2007/99;H1N1:A/新喀里多尼亞/20/99、A/WSN/33、A/PR8/34B:B/馬來西亞/2506/04、B/Lee/40。在用預(yù)期在人類中單次免疫的Vaxigrip⑧第一次免疫之后，對于所有病毒滴度沒有明顯升高(除了對A/加利福尼亞的滴度升高4倍以外)。結(jié)果在表5A和5B中顯示。用多亞基制劑，與來自其中證明了相似體液應(yīng)答的免疫研究的其它數(shù)據(jù)相比，用Vaxigrip⑧的在前免疫沒有顯著升高對病毒的應(yīng)答。在用多亞基疫苗兩次免疫之后觀察到了免疫后/免疫前的滴度的最高8倍升高。施用PBS的對照組對于所有病毒均為陰性。在不同多亞基變體的比較中，在對病毒的體液應(yīng)答方面，#14是最佳的候選物。表5A.H3N2<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>t=滴度，f=倍數(shù)表5B.H1N1和B型流感<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>t=滴度，f=倍數(shù)實施例12.肽合成使用典型的固相肽合成用以下材料來合成肽和多亞基肽保護的氨基酸、9-芴基甲氧基羰基-N-羥基琥珀酰亞胺(Fmoc-OSu)、溴-三-吡咯烷酮-磷六氟磷酸鹽(PyBrop)、林克酰胺-甲基二苯甲胺(MBHA)聚苯乙烯樹脂，且用于固相肽合成(SPPS)的許多有機物和載體從NovaBiochemicals(瑞士Laufelftngen)購買。雙(三氯甲基)碳酸酯(BTC)從Lancaster(英國Lancashire)購買，用于高效液相色譜法(HPLC)的三氟乙酸(TFA)和溶劑從Bio-Lab(以色列Jerusalem)購買。有機化學(xué)溶劑從Frutarom(以色列的海法)購買。核磁共振(NMR)譜用BrukerAMX-300MHz波譜儀記錄。質(zhì)譜用FinniganLCQDUO離子阱質(zhì)譜儀進行。薄層色譜法(TLC)用MerckF24560硅凝膠板(德國Darmstadt)進行。HPLC分析使用Vydac分析RP柱(C18，4.6X250mm，分類號201TP54)進行，并且用Merck-HitachiL-7100泵和在215nm下操作的Merck-HitachiL-7400可變波長檢測器進行。流動相由梯度系統(tǒng)組成，溶劑A對應(yīng)具有0.1%TFA的水，溶劑B對應(yīng)具有0.1%TFA的乙腈(ACN)。流動相從0-5分鐘用95%A開始，隨后從5-55分鐘是從5%B-95%B的線性梯度。梯度在95%B保持另外5分鐘，然后從60-65分鐘下降至95%A和5%B。梯度在95%A保持另外5分鐘，以獲得柱平衡。流動相的流速是lmL/min。通過逆相HPLC(L-6200A泵，日本Merck-Hitachi)使用Vydac制備RP柱(C8，22x250mm，分類號218TP1022)進行肽純化。使用溶劑A對應(yīng)具有0.1%TFA的水和溶劑B對應(yīng)具有0.1%TFA的ACN的梯度系統(tǒng)進行所有制備HPLC。雖然已經(jīng)具體描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會到可以作出許多改變和修飾。因此，本發(fā)明不應(yīng)被認為受限于具體描述的實施方案，且本發(fā)明的范圍和構(gòu)思將更容易參考以下權(quán)利要求來理解。權(quán)利要求一種合成或重組的流感多表位多肽，其包括以選自交替的順序聚合物結(jié)構(gòu)(X1X2X3...Xm)n和嵌段共聚物結(jié)構(gòu)(X1)n(X2)n(X3)n...(Xm)n的構(gòu)型排列的多個拷貝的多種流感病毒肽表位。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其選自由以下組成的組<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>以及<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中B是1-4個氨基酸殘基的任選的序列；n在每次出現(xiàn)時獨立地是2-50的整數(shù)；m是3-50的整數(shù)；&，X2...Xm的每一個是由4-24個氨基酸殘基組成的流感肽表位；Z在每次出現(xiàn)時是鍵或1-4個氨基酸殘基的間隔子；且其中多肽中的氨基酸殘基的最大數(shù)是約1000。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽，其中n在每次出現(xiàn)時獨立地是2-50的整數(shù)；m是3-15的整數(shù)A-Xm的每一個是選自由4-24個氨基酸殘基組成的B細胞型表位、T輔助細胞(Th)型表位和細胞毒性淋巴細胞(CTL)型表位組成的組的流感肽表位；且所述多肽中的氨基酸殘基的最大數(shù)是約600。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多肽，其中所述流感肽表位選自由血凝素(HA)肽、M1肽、M2肽和核蛋白(NP)肽組成的組。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多肽，其中m是9且n是3-5的整數(shù)。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多肽，其中所述流感肽表位選自由SEQIDNO:l至SEQIDNO:82組成的組。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多肽，其中所述流感肽表位選自由以下組成的組HA354-372(El，SEQIDNO:82)、HA91-108(E2，SEQIDNO:48)、Ml2-12(E3，SEQIDNO:25)、HA150-159(E4，SEQIDNO:52)、HA143-149(E5，SEQIDNO:51)、NP206-229(E6，SEQIDNO:64)、HA307-319(E7，SEQIDNO:59)、NP335-350(E8，SEQIDNO:69)，以及NP380-393(E9，SEQIDNO:70)。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多肽，其中所述流感肽表位由HA354-372(El，SEQIDNO:82)、HA91-108(E2，SEQIDNO:48)、M12-12(E3，SEQIDNO:25)、HA150-159(E4，SEQIDNO:52)、HA143-149(E5，SEQIDNO:51)、NP206-229(E6，SEQIDNO:64)、HA307-319(E7，SEQIDNO:59)、NP335-350(E8，SEQIDNO:69)，以及NP380-393(E9，SEQIDNO:70)組成。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的多肽，其如SEQIDNO:84所示。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的多肽，其如SEQIDNO:86所示。11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的多肽，其如SEQIDNO:88所示。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其包括以下列交替順序聚合物結(jié)構(gòu)[ElE2E3E4E5E6E7E8E9]n排列的九種不同流感病毒肽表位，其中n是3或5;E1是HA354-372(SEQIDNO:82)，E2是HA91-108(SEQIDNO:48)，E3是M12-12(SEQIDNO:25)，E4是HA150-159(SEQIDNO:52)，E5是HA143-149(SEQIDNO:51)，E6是NP206-229(SEQIDNO:64)，E7是HA307-319(SEQIDNO:59)，E8是NP335-350(SEQIDNO:69)，以及E9是NP380-393(SEQIDNO:70)。13.根據(jù)權(quán)利要求l所述的多肽，其包括以下列嵌段共聚物結(jié)構(gòu)[E1E1E1-E2E2E2-E3E3E3-E4E4E4-E5E5E5-E6E6E6-E7E7E7-E8E8E8-E9E9E9]排列的九種不同流感病毒肽表位的三個重復(fù)，其中El是HA354-372(SEQIDN0:82)，E2是HA91-108(SEQIDNO:48)，E3是M12-12(SEQIDNO:25)，E4是HA150-159(SEQIDNO:52)，E5是HA143-149(SEQIDNO:51)，E6是NP206-229(SEQIDNO:64)，E7是HA307-319(SEQIDNO:59)，E8是NP335-350(SEQIDNO:69)，以及E9是NP380-393(SEQIDNO:70)。14.根據(jù)權(quán)利要求l所述的多肽，其包括以下列交替順序聚合物結(jié)構(gòu)[E1E2E3E4E5]6排列的五種不同B細胞型流感病毒肽表位的六個重復(fù)，其中E1是HA354-372(SEQIDNO:82)，E2是HA91-108(SEQIDN0:48)，E3是M12-12(SEQIDN0:25)，E4是HA150-159(SEQIDN0:52)，E5是HA143-149(SEQIDNO:51)。15.根據(jù)權(quán)利要求l所述的多肽，其包括以下列交替順序聚合物結(jié)構(gòu)[E7E8E9E6]e排列的四種不同T細胞型流感病毒肽表位的六個重復(fù)，其中E6是NP206-229(SEQIDNO:64)，E7是HA307-319(SEQIDN0:59)，E8是NP335-350(SEQIDNO:69)，以及E9是NP380-393(SEQIDNO:70)。16.根據(jù)權(quán)利要求l所述的多肽，其包括以下列交替順序聚合物結(jié)構(gòu)[E7E8E9E6]n排列的四種不同T細胞型流感病毒肽表位的四個重復(fù)，其中n是6，且其中E6是NP206-229(SEQIDNO:64)，E7是HA307-319(SEQIDNO:59)，E8是NP335-350(SEQIDNO:69)，以及E9是NP380-393(SEQIDNO:70)，且其中所述多亞基多肽與載體蛋白融合。17.根據(jù)權(quán)利要求l所述的多肽，其包括以下列嵌段共聚物結(jié)構(gòu)[E2E2E2E2E2E2-E1E1E1E1E1E1-E3E3E3E3E3E3-E4E4E4E4E4E4-E5E5E5E5E5E5-E6E6EE6E6E66-E7E7E7E7E7E7-E8E8E8E8E8E8-E9E9E9E9E9E9]排列的九種不同流感病毒肽表位的六個重復(fù)，其中El是HA354-372(SEQIDN0:82)，E2是HA91-108(SEQIDNO:48)，E3是M12-12(SEQIDN0:25)，E4是HA150-159(SEQIDN0:52)，E5是HA143-149(SEQIDNO:51)，E6是NP206-229(SEQIDNO:64)，E7是HA307-319(SEQIDNO:59)，E8是NP335-350(SEQIDNO:69)，以及E9是NP380-393(SEQIDNO:70)。18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其還包括載體序列。19.根據(jù)權(quán)利要求24所述的多肽，其中所述肽表位插入在載體多肽的序列內(nèi)。20.分離的多聚核苷酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1-19的任一項所述的流感多表位多肽。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的分離的多聚核苷酸，其編碼選自以下組成的組中的多肽序列:SEQIDNO:84、SEQIDNO:86和SEQIDNO:88。22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的分離的多聚核苷酸，其包括選自以下組成的組中的序列SEQIDNO:83、SEQIDNO:85和SEQIDNO:87。23.—種用于免疫受試者抗流感的疫苗，其包括至少一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的疫苗，其中第一多肽包括多種B細胞型流感病毒肽表位，且第二多肽包括多種T細胞型流感病毒肽表位。25.根據(jù)權(quán)利要求37所述的疫苗，其中所述第一多肽是根據(jù)權(quán)利要求17所述的多肽，且所述第二多肽是根據(jù)權(quán)利要求18所述的多肽。26.根據(jù)權(quán)利要求37所述的疫苗，其中所述第一多肽是根據(jù)權(quán)利要求17所述的多肽，且所述第二多肽是根據(jù)權(quán)利要求19所述的多肽。27.根據(jù)權(quán)利要求23-30所述的疫苗，其還包括佐劑。28.根據(jù)權(quán)利要求24所述的疫苗，其中所述佐劑選自由油包水乳劑、脂質(zhì)乳劑和脂質(zhì)體組成的組。29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的疫苗，其中所述佐劑選自由以下組成的組Montanide、明礬、胞壁酰二肽、061\^*、甲殼質(zhì)微顆粒、脫乙酰殼多糖、霍亂毒素亞基8、111^^14@和Lipofimdin。30.根據(jù)權(quán)利要求26所述的疫苗，其中所述佐劑是Montanide。31.—種在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和提供抗流感保護的方法，其中所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求23-30的任一項所述的疫苗施用于受試者。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述疫苗的施用途經(jīng)選自肌內(nèi)、鼻內(nèi)、口服、腹膜內(nèi)、皮下、局部、皮內(nèi)和透皮遞送。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述疫苗鼻內(nèi)施用。34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述疫苗肌內(nèi)施用。35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述疫苗皮內(nèi)施用。36.用于免疫抗流感的根據(jù)權(quán)利要求1-19的任一項所述的多肽。37.根據(jù)權(quán)利要求1-19的任一項所述的多肽在制備用于免疫抗流感的疫苗組合物中的用途。38.根據(jù)權(quán)利要求20-22的任一項所述的分離的多聚核苷酸在生產(chǎn)多肽中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及基于多亞基多表位肽的疫苗。特別是，本發(fā)明涉及引起對流感的保護性免疫的基于多亞基多表位肽的疫苗的用途。文檔編號A61K39/145GK101795709SQ200880101581公開日2010年8月4日申請日期2008年8月3日優(yōu)先權(quán)日2007年8月2日發(fā)明者塔瑪·本-葉迪狄亞,尤西·辛格申請人:彼昂德瓦克斯醫(yī)藥有限公司