專利名稱：控制擬南芥莖粗的特異性基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種控制擬南芥莖粗性狀的基因。
新中國(guó)成立以來(lái)，小麥品種大體經(jīng)歷了5次更換。許多研究表明，品種更換的過(guò)程同時(shí)也是品種莖加粗的過(guò)程。尤其60年代以來(lái)，矮稈、半矮稈小麥品種的選育和利用，明顯增強(qiáng)了品種的產(chǎn)量潛力?？梢杂酶鞣N物理或化學(xué)(烯效唑、甲基磺酸乙酯(EMS)、多效唑等)的方法處理植株，使植株莖粗。如適當(dāng)濃度的烯效唑能促進(jìn)發(fā)芽，使植株的莖變粗，增加生物量，提高可溶性糖、淀粉、葉綠素的含量，降低可溶性蛋白和游離氨基酸的含量。但是單純依靠育種，速度比較慢。
近幾年，開展了一些關(guān)于莖粗相關(guān)功能基因的研究。如蘋果屬顯性莖粗主基因Dw的RAPD分子標(biāo)記(張開春等，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，1999年第7卷第2期Vol.7 No.2 1999)；半矮稈春小麥莖粗基因Rht1和Rht2的相關(guān)研究，小麥Rht8莖粗基因的遺傳(向平，國(guó)外作物育種1996)等。從這些背景資料可以看出，植株莖粗相關(guān)功能基因在作物生產(chǎn)中的重要性顯而易見，具有控制這一性狀的功能基因在生產(chǎn)上的用途是廣闊的。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下擬南芥中沒有內(nèi)源的標(biāo)簽因子，T-DNA整合成為主要的插入誘變方法。擬南芥已經(jīng)通過(guò)T-DNA標(biāo)簽得到了成千上萬(wàn)的突變體。經(jīng)過(guò)TAIL-PCR(ThermalAsymmetric Interlaced PCR，Yaoguang Liu et al，1998，Plant Molecular BiologyReporter 16175-181，熱不對(duì)稱交錯(cuò)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)擴(kuò)增并測(cè)定標(biāo)簽插入位點(diǎn)的兩端序列，用Blast2.0軟件將測(cè)定序列和擬南芥的全基因組序列比較，找出突變位點(diǎn)，種植突變體，通過(guò)表型分析以及各種不同的環(huán)境條件的篩選，在大量突變體當(dāng)中篩選到了該突變體為控制擬南芥莖粗性狀的基因。T-DNA插入了擬南芥第四染色體的第5502902堿基處，插入了基因AT4g31670的尾端。AT4g31670基因的cDNA序列見序列表1(SEQ ID No.1)，AT4g31670基因編碼的蛋白質(zhì)序列見序列表2(SEQ ID No.2)。
一、材料擬南芥生態(tài)型(Columbia)；質(zhì)粒pSKI015(Weigel，D.，et al 2000)；各種常用抗生素；根癌土壤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)為GV3101。
二、方法1.植物生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化擬南芥在溫室中22℃生長(zhǎng)，每天光照16小時(shí)，黑暗8小時(shí)。含有pSKI015的農(nóng)桿菌GV3101，先用PCR反應(yīng)鑒定質(zhì)粒中的四個(gè)CaMV35S增強(qiáng)子完整存在(Weigel，D.，et al 2000)。
我們采用的Ti質(zhì)粒是pSKI015，質(zhì)粒中的T-DNA區(qū)域含有BAR基因，賦予除草劑抗性。還含有在原核系統(tǒng)中用來(lái)篩選的Amp抗性基因，在T-DNA右邊緣附近有串聯(lián)的4個(gè)35S增強(qiáng)子，有可能在插入擬南芥基因組后增強(qiáng)側(cè)翼或附近某個(gè)基因的表達(dá)，從而獲得某種功能，做為插入基因失活的一個(gè)額外的補(bǔ)充。
轉(zhuǎn)化擬南芥的方法主要采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法。十多年前科學(xué)家發(fā)明了種子浸染轉(zhuǎn)化法，后來(lái)采用農(nóng)桿菌培養(yǎng)侵染植物莖尖成整株植物進(jìn)行真空抽濾，這些方法都代替了以前組織培養(yǎng)和植物再生方法，縮短了組織培養(yǎng)的步驟。我們實(shí)驗(yàn)使用的轉(zhuǎn)化方法是花浸法(flaral dip)，比真空抽濾更為簡(jiǎn)便，轉(zhuǎn)化效率也不會(huì)降低，野生的擬南芥(Columbia)長(zhǎng)到一定階段，有一些未成熟的花苞，將已開的花剪掉，做為待轉(zhuǎn)化植物。帶有pSKI015的農(nóng)桿菌經(jīng)鑒定后28℃搖到穩(wěn)定期(0.06≈2.0)離心后重新懸浮在浸染培養(yǎng)基中。浸染培養(yǎng)基中必不可少的提高轉(zhuǎn)化效率的是蔗糖和Surfactant兩種物質(zhì)。將含有大量未開花苞的擬南芥倒置在農(nóng)桿菌的浸染培養(yǎng)基的浸泡液中十五分鐘，然后暗培養(yǎng)一定時(shí)間后繼續(xù)開花，結(jié)籽，將種子收集，其中就有轉(zhuǎn)基因株系。
2.轉(zhuǎn)基因植物的篩選和PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化植物的子代用抗生素等標(biāo)記篩選出來(lái)。我們使用的是除草劑PPT，采用一定濃度的PPT(100mg/ml)加入培養(yǎng)基中，使不含有T-DNA插入的種子不萌發(fā)或不生長(zhǎng)，而含有T-DNA插入的種子因?yàn)楹型暾腂AR基因而正常生長(zhǎng)起來(lái)。在這些植物中，T-DNA插入一般為單倍體，是隱性突變，所以表型一般不易發(fā)現(xiàn)。
用CATB法提取植物葉片的總DNA，利用pSKI015載體上BAR基因的引物進(jìn)行PCR檢測(cè)5’引物5’-TCGACTCTAGCGAATTCCTC-3’，3’引物5’-ATAGGCGTCTCGCATATCTC-3’；并用擬南芥中COP1的引物同時(shí)進(jìn)行PCR作為正對(duì)照5’引物5’-TGACTATGCTCTGTTTCAGCT-3’，3’引物5’-TTAGTAAACCAAGGAAACACCA-3’反應(yīng)條件為94℃ 50s，60℃ 60s，72℃ 90s，35個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。
3.T-DNA插入側(cè)翼序列的擴(kuò)增和測(cè)序我們采用TAIL-PCR方法，即熱不對(duì)稱性交錯(cuò)PCR(Thermal Asymmetry InterlacePCR)，TAIL-PCR包含三輪連續(xù)的半嵌套式插入序列特異引物和一個(gè)小的可退火在附近側(cè)翼序列上的隨機(jī)引物，很容易擴(kuò)增出插入位點(diǎn)側(cè)翼序列，這種方法不需要在PCR之前進(jìn)行很多復(fù)雜的操作，而且產(chǎn)生高純度的特異產(chǎn)物，可以直接用作雜交探針和測(cè)序模板，即具有高效、靈敏、簡(jiǎn)便、特異的優(yōu)點(diǎn)。
將確定含有BAR基因的植株用TAIL-PCR擴(kuò)增T-DNA插入側(cè)翼序列(Liu，1995)，所用的三個(gè)特異引物是根據(jù)T-DNA的左邊緣附近的序列設(shè)計(jì)的，分別為DL15’-GACAACATGTCGAGGCTCAGCAGG-3’；DL25’-TGGACGTGAATGTAGACACGTCGA-3’；DL35’-GCTTTCGCCTATAAATACGACGG-3’。
所用的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物有兩個(gè)AD25’-NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3’；AD2-25’-NGTGCA(G/C)(A/T)GTNT(A/T)GAA-3’。
大量擴(kuò)增第三輪PCR產(chǎn)物，用低熔點(diǎn)瓊脂糖將每條條帶進(jìn)行回收，加兩倍體積的水在65℃溫浴使膠塊熔化，用酚、氯仿各抽提一遍。再用2-2.5倍體積乙醇和1/10體積醋酸鈉(NaAC)沉淀。12,000轉(zhuǎn)，離心20分鐘后沉淀，用70％、100％乙醇各洗一遍，抽干。溶于水中，定量后可用來(lái)測(cè)序。
還可將第三輪PCR產(chǎn)物直接與pBS產(chǎn)生的T-vector用T4-DNA連接酶連接，篩選出有插入的陽(yáng)性克隆。提質(zhì)粒測(cè)序。
4.序列的比對(duì)和分析得到大量的插入位點(diǎn)側(cè)翼序列，就需要進(jìn)行序列分析，首先用BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，到EMBL或Gene bank中比對(duì)出匹配的序列，從而確定T-DNA插入位點(diǎn)究竟在哪條染色體的什么部位，附近的開放讀碼框架ORF，已經(jīng)翻譯出蛋白質(zhì)的可能功能，與已知蛋白的同源比較等等，由此得到我們尋找的控制擬南芥莖粗性狀的基因AT4g31670突變的突變體。
5.表型分析種植突變體，同時(shí)種植野生型擬南芥為對(duì)照。如附

圖1和附圖2所示，圖1為擬南芥突變體植株在開花期和結(jié)莢期的形態(tài)照片；圖2為野生擬南芥在開花期和結(jié)莢期的形態(tài)照片。由圖中可以看出，突變體植株在開花期和結(jié)莢期與野生型比較，表現(xiàn)出明顯的莖桿變粗側(cè)枝單邊的表型特征。
受基因AT4g31670的功能啟示，我們得到一種控制植株莖粗的方法，包括將AT4g31670基因在轉(zhuǎn)基因植物中過(guò)量表達(dá)。
本發(fā)明采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將農(nóng)桿菌的T-DNA插入到擬南芥的基因組DNA當(dāng)中，從而產(chǎn)生插入突變體。轉(zhuǎn)化植物的種子在含有PPT(100mg/ml)的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。用CATB法提取植物葉片的總DNA，利用pSKI015載體上BAR基因的引物進(jìn)行PCR。將確定含有BAR基因的植株用TAIL-PCR擴(kuò)增T-DNA插入側(cè)翼序列。大量擴(kuò)增第三輪PCR產(chǎn)物用低熔點(diǎn)瓊脂糖將每條條帶進(jìn)行回收。測(cè)序后進(jìn)行BLAST的比對(duì)與分析，由此找到T-DNA的插入位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)該T-DNA的插入點(diǎn)恰好是在莖粗基因的DNA序列上，位于擬南芥第四染色體的長(zhǎng)臂上。它的功能與植物細(xì)胞的發(fā)育、分化與程序性細(xì)胞死亡以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞周期調(diào)控等均有著密切的關(guān)系。
序列表1(SEQ ID No.1)1 ATGCATGAGG TTGGTTTTCC GTTGGATCTC TCTGTCTTCA CTCGCCTTAT AGCGACTCTA61 TTTTTCCTCG CCGTTGGTGT TTTTTACTTT CTCAAAAACA CCGCCGCTAA GTACTTCGAC121 ATCGGAGCCG CCGCCGCCGG AGGTTTCGAC AGGGACTTCA TGGCGGTTGA TGCTGAGGAT181 TGCTCTGTCT GTGGGAATTT TTCCACCAAG AAATGCTCCC GCTGCAAATC CGTTCGATAC241 TGCTCAGCAG AGTGCCAAAG GTCAGATTGG AGTTCGGGTC ATCAAAGAAA CTGCAGGGAT301 TATGGGATTA CTACATTAAC ACCATCTGCA AAGAATGGCT TAAGGTTCAG AGCTTCTCCA361 TTCGGGGATA GTTCTGCGTC TAGTATTGCA CTGATTTCCG AACGGGGCCA AAACAAGAGT421 AGTCTCAAGC CAAGAGAAGT TCTTTTTCCA TATGAAGAAT TTGTTGAATA TTTTAACTGG481 GACAATCCAG AATTGGCTCC CTGTGGGCTC ATGAATTGTG GAAATAGTTG TTTCGCCAAT541 GTGATTCTAC AATGCCTTTC CTGGACACGT CCTCTTGTTG CATATCTGCT GGAGAAAGGC601 CACAAGAGAG AATGTATGCG CAACGATTGG TGCTTCCTCT GTGAATTTCA AACCCATGTT661 GAGAGAGCGA GTCAAAGTCG GTTCCCTTTT TCACCAATGA ACATTATTTC ACGGTTAACT721 AATATTGGTG GAACTCTTGG ATATGGAAGA CAGGAGGATG CTCATGAGTT CATGAGGTAT781 GCGATTGATA TGATGCAGTC TGTTTGCCTT GATGAATTCG GTGGAGAAAA AATAGTGCCT841 CCTCGTTCAC AAGAAACAAC ACTTATTCAG TATATATTTG GAGGTCTCCT TCAATCACAG901 GTTCAATGTA CTGTTTGCAA TCATGTTTCT GACCAATATG AAAATATGAT GGATCTAATC961 GTTGAGATGC ATGGGGATGC GGGGTCTTTG GAGGAATGTC TTGATCAATT TACAGCCGAA1021 GAGTGGCTTC ATGGAGATAA TATGTACAAA TGTGATAGGT GTAGTGACTA TGTAAAAGCA1081 TGTAAGCGTC TTACGATTCG ACGCGCTCCA AATATTCTTA CTATTGCCTT AAAAAGATAT1141 CAGGGAGGAA GATACGGAAA ATTGAACAAA AGAATAAGTT TTCCCGAGAC ATTGGATCTT1201 AATCCTTACA TGAGTGAAGG CGGAGATGGA TCAGATGTAT ATAAACTCTA TGCAGTGATT1261 GTCCATTTAG ATATGCTGAA TGCATCATTC TTCGGCCATT ACATATGCTA CATTAAGGAT1321 TTTTGCGGAA ACTGGTATAG AATAGATGAT TCCGAGATAG AAAGTGTTGA ATTAGAAGAT1381 GTCCTTTCTC AAAGAGCTTA TATGCTCCTC TACAGCAGGA TTCAAGCTCG GTCGTCATCT1441 TCATGTCTTA GATCAGAAGT TAAAGACGAG AAGAAAACAG ACACATTGGA CACAGAATCT1501 TGCGTAAAAG AGTTAGTTGA GAGTTCAATG GTAGGAGCTA TTGAAAGCAG AAGCAGCACC1561 CATGCGACCA TTGAAGACCC TGTATGCGAG CAATCACCAT CACCATCGCC ATCACCATCA1621 CCATCACCAT CGCCATCACC ATCACCATCA GTATTGGCCT CTGAATGTTG TAGTGAGGTT1681 GAAAGGATTG ATACATTGGA TTCCGAGTCC AACTCTTCGA TTGATGACTC TGCAACAGAT1741 CATCAAGAGG ATGTAGCAAA TGGGAACAAA GATCCAGAGG TAAAATATCA GGCTGCCGAT1801 TCTTGGTCAG ACCCTACAAC TTCAACTCCA TTGGTCTGTA CAAAATCCAA ACCTCCGGTG1861 AGAGATATGG ACACCAAGAT GATCGACGCT CAGTGA序列表2(SEQ ID No.2)MHEVGFPLDL SVFTRLIATL FFLAVGVFYF LKNTAAKYFD IGAAAAGGFD RDFMAVDAEDCSVCGNFSTK KCSRCKSVRY CSAECQRSDW SSGHQRNCRD YGITTLTPSA KNGLRFRASPFGDSSASSIA LISERGQNKS SLKPREVLFP YEEFVEYFNW DNPELAPCGL MNCGNSCFANVILQCLSWTR PLVAYLLEKG HKRECMRNDW CFLCEFQTHV ERASQSRFPF SPMNIISRLTNIGGTLGYGR QEDAHEFMRY AIDMMQSVCL DEFGGEKIVP PRSQETTLIQ YIFGGLLQSQVQCTVCNHVS DQYENMMDLI VEMHGDAGSL EECLDQFTAE EWLHGDNMYK CDRCSDYVKACKRLTIRRAP NILTIALKRY QGGRYGKLNK RISFPETLDL NPYMSEGGDG SDVYKLYAVIVHLDMLNASF FGHYICYIKD FCGNWYRIDD SEIESVELED VLSQRAYMLL YSRIQARSSSSCLRSEVKDE KKTDTLDTES CVKELVESSM VGAIESRSST HATIEDPVCE QSPSPSPSPSPSPSPSPSPS VLASECCSEV ERIDTLDSES NSSIDDSATD HQEDVANGNK DPEVKYQAADSWSDPTTSTP LVCTKSKPPV RDMDTKMIDA Q*
權(quán)利要求
1.一種多核苷酸，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一種蛋白質(zhì)，具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1所示的多核苷酸，其為控制擬南芥莖粗性狀的基因。
4.一種控制植株莖粗的方法，包括將權(quán)利要求1所述的多核苷酸在轉(zhuǎn)基因植物中過(guò)量表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種控制擬南芥莖粗性狀的特異性基因AT4g31670的cDNA序列;基因AT4g31670編碼的蛋白質(zhì)序列;控制植株莖粗的方法,包括將基因AT4g31670在轉(zhuǎn)基因植株中過(guò)量表達(dá)。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1369502SQ0210015
公開日2002年9月18日 申請(qǐng)日期2002年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月16日
發(fā)明者瞿禮嘉, 康定明, 劉鐵, 董一宇, 秦跟基, 申云平, 鄧興旺, 顧紅雅, 陳章良 申請(qǐng)人:北京大學(xué)