專利名稱：鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻闹谱鞣椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯?、編碼該多肽的核酸以及利用他們的技術(shù)。更詳細地講，本發(fā)明涉及到作為用于解析鞘脂結(jié)構(gòu)和功能的鞘脂工程用試劑有用的具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅陌被嵝蛄械亩嚯模痪哂芯幋a該多肽的堿基序列的核酸；具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶活性的多肽的基因工程制造方法；該多肽的檢測方法及其試劑盒，和編碼該多肽的基因的檢測方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
近年來，作為真核生物的細胞膜脂質(zhì)的構(gòu)成成分，甘油脂以及鞘脂具有的各種各樣的生理功能受到人們的注目。作用于該鞘脂，生成脂肪酸和溶血鞘脂的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；?SCDase)不僅在闡明鞘脂的生理作用上有用，而且在稱之為鞘脂衍生物的制作和標記的鞘脂工程領(lǐng)域中是非常重要的酶。
以前作為作用于神經(jīng)酰胺水解鞘氨醇堿基和脂肪酸之間酰胺鍵的酶已知有神經(jīng)酰胺酶(CeramidaseEC3.5.1.23)[Journal ofBiological Chemistry、第241卷、第3731-3737頁(1966)、Biochemistry、第8卷、第1692-1698頁(1969)、BiochimicaetBiophysica Acta、第176卷、第339頁-347頁(1969)、Science、第178卷、第1100-1102頁(1972)]。但是這樣的酶不能水解鞘糖脂或鞘磷脂中神經(jīng)酰胺部分的鞘氨醇堿基和脂肪酸之間的酰胺鍵。
而由屬于諾卡氏菌(Nocardia)屬、紅球菌(Rhodococcus)屬、鏈霉菌(Streptomyces)屬微生物生產(chǎn)的酶[Journal ofBiochemistry、第103卷、第1-4頁(1988)、特開平6-78782號公報、特開平7-107988號公報]作用于鞘糖脂可以水解鞘氨醇堿基和脂肪酸之間的酰胺鍵，生成溶血鞘糖脂(lysosphingoglycolipid)和脂肪酸。但無論哪一種酶都具有底物特異性窄，不能作用于所有鞘脂的性質(zhì)。
就是說，由屬于諾卡氏菌屬的微生物生產(chǎn)的酶雖然可作用于GD1a、GM1、GM2、GM3等所謂的酸性糖脂，但卻幾乎完全不能作用于中性糖脂。相反，由屬于紅球菌屬微生物生產(chǎn)的酶可作用于中性糖脂，但卻不能作用于酸性糖脂。而由屬于鏈霉菌屬微生物生產(chǎn)的酶不能作用于GM3和作為中性糖脂的乳糖苷神經(jīng)酰胺、腦苷脂類等。另外無論上述的哪一種酶都不能作用于鞘磷脂。
與上述酶不同，來自嗜糖假單胞菌TK-4(Pseudomonassp.TK-4)菌株的SCDase[Journal of Biological Chemistry、第270卷、第24370-24374頁(1995)、特開平8-84587號公報]對包括酸性糖脂、中性糖脂以及鞘磷脂在內(nèi)的所有鞘脂具有廣泛的底物特異性。而該SCDase不僅催化鞘脂生成對應(yīng)的溶血鞘脂和脂肪酸的水解反應(yīng)，而且也催化由溶血鞘脂和脂肪酸合成鞘脂的縮合反應(yīng)，還催化將鞘脂的脂肪酸部分換成其他脂肪酸的交換反應(yīng)(國際公開第98/03529號小冊子)。因此該酶是鞘脂工程領(lǐng)域中的非常重要的工具，產(chǎn)業(yè)上利用價值高。然而，想要在工業(yè)上由微生物有利地制造上述的SCDase時，為了誘導(dǎo)天然存在的該酶的生成，在培養(yǎng)時必須要向培養(yǎng)基中添加神經(jīng)節(jié)苷脂混合物。由于在培養(yǎng)液中有時生成游離的脂肪酸和溶血鞘糖脂，以及鞘磷脂酶等目的以外的酶也同時生成，要將這些脂和混雜的酶與目的SCDase進行分離純化是困難的。
于是為了通過基因工程方法制造嗜糖假單胞菌TK-4生產(chǎn)的SCDase，克隆了該SCDase基因，制作了導(dǎo)入了該基因的轉(zhuǎn)化體(特開平11-276177號公報)。但是轉(zhuǎn)化體中生產(chǎn)的SCDase或者是活性低，或者是不能檢測的水平，所以通過基因工程方法制造SCDase是困難的。
本發(fā)明的目的在于提供在鞘脂工程領(lǐng)域有用的具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶活性的多肽、編碼該多肽的核酸；容易且可大量制造該多肽的基因工程制造方法；能與該核酸特異雜交的寡核苷酸探針或引物、使用該寡核苷酸探針或引物的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻臋z測方法、以及檢測用的試劑盒、能與本發(fā)明的多肽特異結(jié)合的抗體或其片段、使用該抗體或其片段的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅臋z測方法及使用其的試劑盒。
附圖的簡單說明

圖1為質(zhì)粒pSCD1插入DNA片段的限制酶酶切圖譜。
發(fā)明公開本發(fā)明人為了分離編碼具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯牡幕蜻M行了銳意研究，結(jié)果在具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯牡幕虻姆蛛x和其堿基序列的解析中獲得了成功，而且在此基礎(chǔ)上確立了容易且可大量制造高純度的鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶的方法，具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶活性的多肽的檢測方法以及該基因的檢測方法，直至本發(fā)明的完成。
即，本發(fā)明的要點如下[1]從下述(a)～(c)選擇出的多肽，而且是具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯?a)具有序列20所示氨基酸序列或其一部分序列的多肽；(b)由具有在序列20所示氨基酸序列中至少缺失、附加、插入或置換一個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的多肽；以及(c)與序列20所示氨基酸序列至少有25％序列同一性的多肽；[2]從下述(A)～(H)中選擇出的核酸，而且是編碼具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯牡暮怂幔?A)編碼具有序列20所示氨基酸序列或其一部分序列的多肽的核酸；(B)編碼由具有在序列20所示氨基酸序列中至少缺失、附加、插入或置換一個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的多肽的核酸；(C)編碼與序列20所示氨基酸序列至少有25％序列同一性的多肽的核酸；(D)具有序列19所示堿基序列或其一部分序列的核酸；(E)具有在序列19所示堿基序列中至少缺失、附加、插入或置換一個堿基的堿基序列的核酸；(F)在能與上述(A)～(F)任一項記載的核酸或其互補鏈雜交的核酸；(G)具有由于密碼子簡并而與上述(A)～(F)任一項記載的核酸不同的堿基序列的核酸；以及(H)具有與上述(A)～(G)任一項記載的核酸的堿基序列至少有17％序列同一性的堿基序列的核酸；[3]含有上述[2]記載的核酸的重組DNA，[4]帶有上述[2]記載的核酸或上述[3]記載的重組DNA的轉(zhuǎn)化體，[5]具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯牡闹圃旆椒?，其特征是在適于鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；副磉_的條件下對上述[4]的轉(zhuǎn)化體進行培養(yǎng)，然后從得到的培養(yǎng)物中提取具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯?，[6]可在嚴格條件下能與上述[2]記載的核酸雜交的寡核苷酸探針或引物，[7]至少由連續(xù)15個核苷酸構(gòu)成的上述[6]記載的寡核苷酸探針或引物，[8]編碼具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯牡暮怂岬臋z測方法，其特征是使含有核酸的被檢測樣品與上述[6]或[7]記載的寡核苷酸探針接觸，然后對核酸與寡核苷酸探針的雜化體進行檢測。
編碼具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯牡暮怂岬臋z測方法，其特征是以含有核酸的被檢測樣品作為模板樣品，使用上述[6]或[7]記載的引物進行核酸擴增。
包含上述[6]或[7]記載的寡核苷酸探針和/或引物在內(nèi)的用于檢測編碼具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶活性的多肽的核酸的試劑盒，[11]可以特異地與上述[1]記載的多肽結(jié)合的抗體或其片段，[12]具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯牡臋z測方法，其特征是使含有多肽的被檢測樣品與上述[11]記載的抗體或其片段接觸，對多肽與抗體或其片段的復(fù)合物進行檢測，以及[13]包含上述[11]記載的抗體或其片段、用于檢測具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶活性的多肽的試劑盒。
在本發(fā)明說明書中，所謂“鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；浮本拖裆鲜瞿菢邮蔷哂凶饔糜谇手蛊渌鉃榍拾贝碱悏A和脂肪酸的活性，但對神經(jīng)酰胺幾乎或完全沒有作用的酶。
另外在本說明書中，有時將“具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯摹庇涊d為“鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；浮?。
本發(fā)明的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；赣捎诰哂泻軐挼牡孜锾禺愋?，可用于對細胞工程中糖脂的生物功能進行解析的方法、有用的鞘脂的大量生產(chǎn)、鞘脂的功能變換、鞘脂的探針的制作、新的鞘脂的創(chuàng)制等鞘脂工程中。另外可以應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病(例如神經(jīng)變性疾病等)、白血病、創(chuàng)傷等疾病的治療中。
鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚砸部梢园凑罩T如Journal ofBiological Chemistry、第270卷、第24370-24374頁(1995)記載的方法進行測定。具體來說，如向含有0.1％的TritonX-100和10nmol的GM1的50mM醋酸緩沖液(pH6.0)10μl中加入10μl酶液，將得到的反應(yīng)液于37℃下溫育一定時間。然后于100℃下煮沸5分鐘，終止反應(yīng)，使用真空離心蒸發(fā)濃縮器使反應(yīng)液完全干燥。加入15μl的氯仿/甲醇＝2∶1(v/v)，通過超聲處理使反應(yīng)生產(chǎn)物溶解。將得到的溶解物點到硅膠TLC板(商品名Silica Gel60 TLC plate、メルク公司生產(chǎn))上。然后用氯仿/甲醇/0.2％CaCl2(5/4/1、v/v)展開后，噴苔黑酚硫酸。將噴霧后的TLC板用110℃的電熱板加熱后，通過反應(yīng)使游離的溶血GM1和未反應(yīng)的GM1顯色。
使用色譜掃描儀[島津CS-9300，島津制作所生產(chǎn)]于波長540nm對相應(yīng)于游離的溶血GM1和未反應(yīng)的GM1的點進行定量，以得到的值為基礎(chǔ)通過「分解率(％)＝[游離的溶血GM1的面積×100]/[游離的溶血GM1的面積和未反應(yīng)的GM1的面積]」公式可以求分解率。
鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘?個單位(unit)定義為1分鐘內(nèi)分解1μmol的GM1的酶量。
在本發(fā)明中鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅膩碓礇]有特別限定，例如可來源于細菌類、放線菌類、酵母類、線狀菌類、子囊菌類、擔(dān)子菌類等微生物、或植物、動物、昆蟲等生物。這樣來源的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；敢舶ㄔ诒景l(fā)明的范圍內(nèi)。具體來說，例如從海水中分離到的海洋性細菌海藻希瓦氏菌(Shewanella alga)G8菌株就很適合作為獲得本發(fā)明鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅牟牧稀?br> 而上述海藻希瓦氏菌G8可以象下述那樣獲得。
將從各地收集的樣品(海水、河水、或生活在海水、河水的生物的體表或消化道等)懸浮于滅菌的生理鹽水中。將得到的懸浮液10μl接種到在Eppendorf管中加有0.01％神經(jīng)酰胺、0.05％NH4Cl、0.05％K2HPO4、0.1％酵母提取物、2.0％NaCl、0.01％TDC(?；敲撗跄懰徕c)、pH7.0的液體培養(yǎng)基400μl中，于25℃下振蕩培養(yǎng)4天。然后用上述方法測定酶活性，選擇具有活性的培養(yǎng)液。用滅菌的生理鹽水將選擇的培養(yǎng)液稀釋后，將得到的稀釋物涂布在平板培養(yǎng)基上。將涂布后的平板培養(yǎng)基于25℃培養(yǎng)2天，使其形成菌落。上述操作反復(fù)進行直至形成單一菌落。通過這樣操作可以從樣品中分離生產(chǎn)鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅暮Ｔ逑Ｍ呤暇鶪8。
上述海藻希瓦氏菌G8保存在九州大學(xué)大學(xué)院農(nóng)學(xué)研究科生物功能科學(xué)部門伊東研究室，如需要可以提供。
作為本發(fā)明的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；溉缇哂行蛄斜碇行蛄?所示氨基酸序列或具有其一部分序列的多肽，最好是具有缺失該序列1的C末端區(qū)的氨基酸序列(氨基酸序列1～677)或具有其一部分的多肽等。具體來說如具有序列20所示氨基酸序列或具有其一部分序列的多肽。其中由上述序列20所示氨基酸序列構(gòu)成的多肽是由上述序列1所示氨基酸序列構(gòu)成的多肽的C末端缺失體多肽，表現(xiàn)出鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶活性。
即，作為本發(fā)明的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；溉缇哂?a)序列1或20所示氨基酸序列(具有缺失了天然型鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅腃末端區(qū)的氨基酸序列的多肽)或其一部分序列的多肽。
其中“具有序列1或20所示氨基酸序列的一部分的多肽(也稱之為部分多肽)”可以通過用上述活性測定方法測定活性，如果確認與具有序列1或20所示氨基酸序列的多肽具有同樣的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚约纯伞?br> 具體來說，上述部分多肽可以通過常用的基因工程手法使含有序列1或20所示氨基酸序列中的任意部分的多肽表達，然后利用上述活性測定方法對該多肽進行鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚詼y定，根據(jù)測定結(jié)果通過選擇表現(xiàn)該活性的多肽可以獲得。作為使這樣的部分肽表達的手法如將終止密碼子導(dǎo)入編碼序列1或20所示氨基酸序列的核酸(例如，序列2或19)的任意位置，使其表達的手法；利用限制酶等將對應(yīng)所希望的部分肽的區(qū)域切出，導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)谋磉_載體之后，使其表達的手法。
另外通過利用上述活性測定方法測定活性，只要是確認有與具有序列1或20所示氨基酸序列的多肽有同樣的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚裕?b)由具有序列1或20所示氨基酸序列中至少缺失、附加、插入或置換1個氨基酸殘基的氨基酸序列構(gòu)成的多肽也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
上述“變異”如果是得到的多肽具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚阅菢拥淖儺?，即使有2個以上的變異也可以。這里的“具有變異的氨基酸序列”意思為含有來自天然的變異以及人為導(dǎo)入變異的氨基酸序列。而“至少一個”意思包括一個或多個，或更多。
上述“變異”是使用下面敘述的本發(fā)明的核酸，具體來說使用編碼序列1或20所示氨基酸序列的核酸，通過下面敘述的隨機變異導(dǎo)入方法、部位特異的變異導(dǎo)入方法等生成的。
另外通過用上述活性測定方法測定活性，只要是確認與具有序列20所示氨基酸序列的多肽有同樣的鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶活性，(c)至少具有與序列20所示氨基酸序列有25％，比較好的有30％以上，更好的有35％以上序列同一性的多肽也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
另外上述(c)多肽與序列1所示氨基酸序列比較時，至少有25％，比較好的有30％以上，更好的有35％以上序列同一性。
而在本發(fā)明說明書中，所謂的“序列同一性”指的是兩個聚合性分子，具體來說，兩個聚核苷酸之間或兩個多肽之間的殘基的序列類似性。上述“序列同一性”通過在比較對象的氨基酸序列或堿基序列的區(qū)域內(nèi)，比較在最適狀態(tài)下排列的兩個氨基酸序列或堿基序列決定的。這里，比較對象聚核苷酸或多肽與用于兩個序列的最適排列的參考序列(例如公有序列等)比較，即使含有附加或缺失(例如帽子、突出端)也可以。
序列同一性的數(shù)值(百分數(shù))可以通過決定存在于兩方序列中相同的核酸序列之后，決定符合位置數(shù)，然后用比較對象的序列區(qū)域內(nèi)的堿基的總數(shù)除上述的符合位置數(shù)，得到的數(shù)值乘以100算出。作為為獲得最適排列以及同源性的算法如Smith等人的局部同源性算法[Add.APL.Math.，第2卷、第482頁(1981)]、Pearson等人的同源性檢索法[Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe USA、第85卷、第2444頁(1988)]等。更具體來說如dynamicprognamming method法、gap penalty method法、BLAST算法、FASTA算法等。
多肽間的序列同一性可以使用序列解析軟件，具體來說如BLASTP、FASTA等測定。而核酸間的序列同一性可以使用序列解析軟件，具體來說如BLASTN、FASTA等測定。上述的BLASTP和BLASTN在主頁網(wǎng)址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/、FASTA在主頁網(wǎng)址http//www.ddbj.nig.ac.jp中一般都可以利用。
另外在本發(fā)明中也包括與序列20所示氨基酸序列之間具有至少25％、比較好的30％以上，更好的35％以上序列同源性的多肽。
另外，在本發(fā)明中也包括與序列1所示氨基酸序列之間具有至少25％、比較好的30％以上，更好的35％以上序列同源性的多肽。
具有上述序列同源性的多肽在鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅陌被嵝蛄兄屑词咕哂斜Ｊ刂脫Q的多肽也可以。上述“保守置換”包括與具有類似的性質(zhì)(即在疏水性、電荷、pK、立體構(gòu)造上的特征)的氨基酸置換；與只要是維持原有多肽生理活性的程度，沒有使該多肽的立體結(jié)構(gòu)、折疊構(gòu)造變化的氨基酸置換。作為保守置換如在①甘氨酸、丙氨酸；②纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；③天冬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺；④絲氨酸、蘇氨酸；⑤賴氨酸、精氨酸；⑥苯丙氨酸、酪氨酸的組內(nèi)的置換。
上述的“序列同源性”可以通過序列解析軟件，例如BLAST[Journal of Molecular Biology、第215卷、第403-410頁(1990)]、FASTA[Proceedings of the National Academy ofSciences of the USA、第85卷、第2444-2448頁(1988)]等決定。
本發(fā)明的核酸是編碼具有上述鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯牡暮怂幔Q之為具有編碼具有上述鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯牡膲A基序列的核酸。例如編碼來自海藻希瓦氏菌G8的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅暮怂幔唧w來說如(A)編碼具有序列1或20所示氨基酸序列或其一部分序列的多肽的核酸；(B)編碼由在序列1或20所示氨基酸序列中至少缺失、附加、插入或置換一個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的多肽的核酸；(C)編碼與序列1或20所示氨基酸序列相比至少具有25％序列同一性的多肽的核酸；(D)具有序列2或19所示堿基序列或其一部分序列的核酸。
編碼具有上述序列20所示氨基酸序列的多肽的核酸以及具有序列19所示堿基序列的核酸，如對應(yīng)于具有序列2所示堿基序列的核酸中的堿基號1～2031堿基序列。
而具有上述序列2所示堿基序列的核酸可以從帶有該核酸的質(zhì)粒pSCD44轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109[Escherichia coli JM109/pSE5]獲得。這樣的“用攜帶有上述序列2所示堿基序列核酸的質(zhì)粒pSCD44轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109”被命名為Escherichia coli JM109/pSE5，以FERM BP-7717于2001年8月24日[2000年9月22日(原保藏日)]按照布達佩斯條約寄托于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許微生物寄托中心[郵政編碼305-8566日本國茨城縣筑波市東一丁目1番地1中央第6]。
在本發(fā)明中通過用上述活性測定方法測定活性只要是確認具有與具有序列1或20所示氨基酸序列的多肽同樣的鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶活性，(E)具有在序列1或19所示堿基序列中至少缺失、附加、插入或置換一個堿基的堿基序列的核酸也包括在本發(fā)明的核酸中。上述(E)的核酸希望是在序列2或19所示堿基序列中，作為可被翻譯成氨基酸序列的形式中具有至少缺失、附加、插入或置換一個堿基的堿基序列的核酸。
這里所謂的“具有置換、缺失、附加或插入的堿基序列”包括導(dǎo)入來自天然的變異以及人為變異的堿基序列。而“至少一個”意思包括一個或多個，或更多。上述“變異”可以通過下面敘述的隨機變異導(dǎo)入方法、部位特異的變異導(dǎo)入方法等生成的。
而所謂的“翻譯成氨基酸序列形式”指的是通過缺失、附加或插入，原來的開放閱讀框不錯位，或者維持原來具有的鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶活性程度的讀框移位。
通過用上述活性測定方法測定活性只要是確認與具有序列1或20所示氨基酸序列的多肽有同樣的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚?，(F)在嚴格條件下可與上述(A)～(E)中任一項記載的核酸或其互補鏈雜交的核酸也包括在本發(fā)明的核酸中。
在上述雜交中作為探針可以使用上述(A)～(E)中任一項記載的核酸或其互補鏈的全部一部分。這里的“上述(A)～(E)中任一項記載的核酸或其互補鏈的一部分”只要是具有對本發(fā)明的核酸特異的序列的都可以。而作為探針也可以使用可以特異結(jié)合上述(A)～(E)中任一項記載的核酸的寡核苷酸探針。
所謂的“在嚴格條件下進行雜交”指的是在1989年Cold SpringHarbor Laboratory發(fā)行T.Maniatis等人編輯的MolecularCloningA Laboratory Manual 2nd ed.等記載的條件下可進行雜交的條件。具體來說，如指的是在以下條件可進行雜交。即，將固定有核酸的膜于含有0.5％ SDS、0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％ Ficol 400、0.01％變性的鮭魚精子DNA的6×SSC(1×SSC表示0.15M NaCl、0.015M檸檬酸鈉、pH7.0)中，于50℃下與探針一起溫育12～20小時。溫育結(jié)束后于含有0.5％ SDS的2×SSC中，于37℃下開始洗，SSC濃度在0.1倍濃度之內(nèi)范圍，而溫度在50℃以下范圍內(nèi)變化，直至達到來自固定的核酸的信號可以與背景區(qū)別的程度之后，洗凈膜，進行探針的檢測。
經(jīng)雜交得到的新的核酸通過利用上述活性測定方法對該核酸編碼的多肽具有的活性進行測定，可以確認得到的核酸是否是目的核酸。
而使用寡核苷酸探針時，作為上述“嚴格條件”沒有特別限定，如于含有6×SSC、0.5％ SDS、5×Denhardt、0.01％變性的鮭魚精子DNA的溶液中，在[Tm-25℃]溫度下保溫過夜的條件。
寡核苷酸探針的Tm在探針為18個核苷酸以上的鏈長時，例如可以通過下式(I)求出Tm＝81.5-16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)(I)(式中，N為寡核苷酸探針的鏈長，％G+C是寡核苷酸探針引物中的鳥嘌呤和胞嘧啶殘基的含量)。
當(dāng)寡核苷酸探針的鏈長比18個核苷酸短時，Tm可以通過A+T(腺嘌呤+胸腺嘧啶)殘基的含量與2℃的乘積，和G+C殘基的含量與4℃的乘積的和[(A+T)×2+(G+C)×4]推定。
而在本發(fā)明中通過用上述活性測定方法測定活性，只要是確認與序列20所示的氨基酸序列的多肽有同樣的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚?，(G)具有由于簡并而與上述(A)～(F)中任一項記載的核酸不同的堿基序列的核酸也包括在本發(fā)明中。
基因上確定氨基酸的密碼子(3個堿基的組合)對于每一種氨基酸可能存在1～6種，這已為人們所知。所以編碼某一個氨基酸序列的核酸由于其氨基酸序列的不同可能存在多個。核酸并不是在自然界以穩(wěn)定形式存在的，其堿基序列發(fā)生變異也不稀少。有時也存在核酸上發(fā)生變異不會引起其編碼的氨基酸序列的變化的時候(也稱為沉默變異)，此時可以認為是生成了編碼同一氨基酸序列的不同核酸。因此即使分離到編碼某一特定氨基酸序列的核酸，含有該核酸的生物在傳代的過程中生成編碼同一氨基酸序列的多種核酸的可能性也不能否定。另外使用各種基因工程手法人為制作編碼同一氨基酸序列的核酸并不困難。
而通過用上述活性測定方法測定活性，只要是確認與具有序列20所示氨基酸序列的多肽有同樣的鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶活性，(H)至少與上述(A)～(G)中任一項記載的核酸的堿基序列有17％，比較好的20％以上，更好的23％以上序列同一性的堿基序列的核酸也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
序列同一性通過上述手法可以求出。
利用本發(fā)明的核酸可以大量獲得鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；浮＠缭诨蚬こ痰牡鞍踪|(zhì)生產(chǎn)中，編碼目的蛋白質(zhì)的原來的核酸上使用的密碼子在宿主中使用頻率低的時候，有時蛋白質(zhì)的表達量低。這樣的情況下不要改變被編碼的氨基酸序列，而要通過人為地將密碼子變換為宿主頻繁使用的密碼子，就可以進行目的蛋白質(zhì)的高表達(例如，特公平7-102146號公報)。不用說人為地制作這樣的編碼特定氨基酸序列的多種核酸是可能的，即使在自然界中也可以生成。
本發(fā)明通過闡明鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅囊患壗Y(jié)構(gòu)和基因結(jié)構(gòu)，向本發(fā)明的基因?qū)腚S機的變異或部位特異的變異，獲得編碼具有編碼在天然的鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶的氨基酸序列中缺失、附加、插入或置換一個以上氨基酸殘基的多肽的基因是有可能的。通過這樣操作獲得編碼具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚裕钸m溫度、穩(wěn)定溫度、最適pH、穩(wěn)定pH等性質(zhì)變化少的鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶的基因是有可能的，通過基因工程手段制造這些鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶已成為可能。
作為隨機變異導(dǎo)入方法，例如可以使用通過用亞硫酸氫鈉進行化學(xué)處理，引起胞嘧啶堿基置換為尿嘧啶堿基的置換變異的方法[Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA、第79卷、第1408-1412頁(1982)]、在含有錳的反應(yīng)液中進行PCR，使DNA合成時的核苷酸整合正確性降低的方法[AnalyticalBiochemistry、第224卷、第347-353頁(1995)]等。
作為部位特異的變異導(dǎo)入方法例如可以使用利用琥珀變異的方法[gapped duplex法、Nucleic Acids Research、第12卷、第9441-9456頁(1984)]、利用缺失dut(dUTPase)和ung(尿嘧啶-DNA糖基化酶)基因的宿主的方法[Kunkel法，Proceedings of theNational Academy of Sciences of the USA、第82卷、第488-492頁(1985)]、通過利用琥珀變異的PCR的方法(國際公開第98/02535號冊)等。利用這些方法將部位特異的變異導(dǎo)入目的基因的各種試劑盒都有商品銷售，通過利用這樣試劑盒可以容易地獲得導(dǎo)入所期望變異的基因。
以下就利用雜交法獲得來自微生物的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻姆椒ㄟM行說明。
首先作為制作用于克隆鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻奶结樀男畔?，調(diào)查鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶的部分氨基酸序列。將純化的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；冈獠粍拥靥峁┙o按照常規(guī)方法使用Edman降解法[Journal of Biological Biochemstry、第256卷、第7990-7997頁(1981)]進行的氨基酸序列分析，或者是使賴氨酰內(nèi)肽酶或N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲酮(TPCK)-胰蛋白酶等底物特異性高的蛋白水解酶作用，進行有限水解，對得到的肽混合物中分離純化出的純化肽片段進行氨基酸序列分析。
以闡明的部分氨基酸序列信息作為基礎(chǔ)設(shè)計出作為雜交用探針使用的寡核苷酸，進行化學(xué)合成。
制備生產(chǎn)鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅奈⑸锏幕蚪MDNA，用適當(dāng)?shù)南拗泼高M行完全消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離之后，按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)移印跡在尼龍膜上。該尼龍膜上的DNA片段與上述合成的寡核苷酸探針的雜交在一般的條件下進行。例如在含有鮭魚精子DNA的預(yù)雜交溶液中將尼龍膜封閉之后，與32P標記的合成寡核苷酸探針一起保溫過夜。將該尼龍膜洗凈后，作成放射自顯影照片，檢測與合成寡核苷酸探針雜交的DNA片段。
將對應(yīng)于放射自顯影照片上信息的DNA片段從瓊脂糖凝膠中提取、純化。將這樣獲得的DNA片段通過常用的方法整合到載體、例如質(zhì)粒載體中，制作重組DNA分子。載體可以使用市場上的各種載體。然后將該重組DNA分子導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗?、例如大腸桿菌，得到轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化的方法可以從通常使用的方法、例如從上述Molecular CloningALaboratory Manual第二版等記載的方法中選擇對應(yīng)于使用的載體的方法。
接下來，選擇具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富蚱蔚霓D(zhuǎn)化體。選擇的方法根據(jù)載體的種類可以使用菌落雜交、噬斑雜交等。另外也可以使用以菌落或噬斑作為起始材料的PCR法或以鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚员磉_作為指標的方法。
從含有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富蚱蔚霓D(zhuǎn)化體制備整合了該片段的重組DNA分子，對該片段的堿基序列進行解析。堿基序列的解析可以使用通常的方法、例如雙脫氧法決定。通過將決定的堿基序列與先前得到的鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶的部分氨基酸序列和鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅姆肿恿康冗M行比較，確定得到的DNA片段是目的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻娜?，還是其一部分。
當(dāng)?shù)玫降腄NA不含有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻娜L時，可以用該片段的一部分作為探針，在用其他限制酶對基因組DNA消化后同樣進行雜交等，利用得到的缺失的部分可以獲得目的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富蛉L。從這樣獲得的含有鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶基因的DNA片斷就可以確定鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻慕Y(jié)構(gòu)以及鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶的總氨基酸序列。
除了上述那樣的雜交法之外，通過PCR法也可以得到本發(fā)明的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富?。例如通過使用根據(jù)鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅腘末端氨基酸序列和內(nèi)部部分氨基酸序列設(shè)計的引物的PCR法，和使用這些引物以及盒式DNA和盒式引物的PCR法可以獲得鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富颉?br> 另外具有序列2所示堿基序列的核酸可以通過以序列2所示堿基序列為基礎(chǔ)的化學(xué)合成法制作。
在通過化學(xué)合成制作由序列2所示堿基序列構(gòu)成的核酸時，例如可以通過常用的亞磷酰胺法(phosphoramidite)等、通過酶學(xué)方法使化學(xué)合成的寡核苷酸連接合成上述核酸。具體來說，例如可以通過如下工序制作由序列2所示堿基序列構(gòu)成的核酸。
(1)通過常用的化學(xué)合成法分別合成可包含序列2所示堿基序列的數(shù)十種寡核苷酸An(n為正整數(shù))和與該An序列的3’端或5’端錯開數(shù)個堿基的堿基序列互補的序列構(gòu)成的與該An相同鏈長的寡核苷酸，通過與該寡核苷酸An退火，生成具有5’突出端或3’突出端的雙鏈DNA的互補鏈寡核苷酸an(n為正整數(shù))的工序；[例如，上述An是分別由序列2的堿基序列1～20(A1)、21～40(A2)、41～60(A3)、61～80(A4)、81～100(A5)、101～120(A6)、121～140(A7)、141～160(A8)····2841～2862(A143)構(gòu)成的核酸，而上述an是分別由序列2的堿基序列1～23(a1)、24～43(a2)、44～63(a3)、64～83(a4)、84～103(a5)、104～123(a6)、124～143(a7)、144～163(a8)····2843～2862(a143)構(gòu)成的寡核苷酸等的互補鏈](2)使用ATP和常用的T4聚核苷酸激酶對上述工序(1)中得到的各個寡核苷酸An和對應(yīng)的互補鏈寡核苷酸an的各個5’末端進行磷酸化的工序；(3)使上述工序(2)中得到的各個寡核苷酸An和對應(yīng)的互補鏈寡核苷酸an退火，得到數(shù)十種“具有5’突出末端或3’突出末端的雙鏈DNA(Anan)”的工序；(4)將上述工序(3)得到的雙鏈DNA(Anan)，依照n增加的順序與序列2所示的堿基序列對應(yīng)，分為數(shù)區(qū)段，對應(yīng)于各個區(qū)段將上述工序(3)得到的雙鏈DNA(Anan)收到一個試管中的工序；[例如，設(shè)定寡核苷酸A1～A4和互補鏈a1～a4的試管，寡核苷酸A5～A8和互補鏈a5～a8的試管，寡核苷酸A9～A11和互補鏈a9～a11的試管，寡核苷酸A140～A143和互補鏈a140～a143的試管](5)對應(yīng)于上述(4)工序的各個區(qū)段的每個試管，對雙鏈DNA進行連接，由此可以得到對應(yīng)于各個區(qū)段的雙鏈DNA的工序；(6)將上述工序(5)得到的雙鏈DNA進行凝膠電泳，從凝膠中提取具有對應(yīng)于各個區(qū)段的目的鏈長的雙鏈DNA帶的工序；(7)將具有對應(yīng)于上述工序(6)得到的各個區(qū)段的目的鏈長的雙鏈DNA歸于一處進行連接的工序；(8)對上述工序(7)得到的DNA通過凝膠電泳檢查鏈長，和/或進行堿基序列解析，確認是由序列2所示堿基序列構(gòu)成的DNA的工序。
下面以來自海藻希瓦氏菌G8的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅那闆r為例進行具體地說明。
首先對海藻希瓦氏菌G8生產(chǎn)的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；高M行純化。將海藻希瓦氏菌G8用通常使用的液體培養(yǎng)基[PY培養(yǎng)基(組成0.5％多胨、0.1％酵母提取物、0.5％氯化鈉、pH7.2)]于25℃下進行培養(yǎng)，將得到的培養(yǎng)上清進行濃縮，經(jīng)通常使用的柱層析對鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；高M行純化。
然后確定鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅牟糠职被嵝蛄?。上述鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅腘末端氨基酸序列其對應(yīng)的密碼子種類很多，引物序列的組合變得很大。使用上述引物進行PCR時，由于生成很多非特異性的擴增產(chǎn)物，從這些產(chǎn)物中鑒定來自目的基因的產(chǎn)物是困難的。
本發(fā)明人為了獲得相應(yīng)的密碼子簡并少的序列，作為用于引物設(shè)計的氨基酸序列，使用以蛋白質(zhì)水解酶或溴化氰為代表的蛋白質(zhì)有限分解用試劑進行肽譜分析，然后嘗試引物的設(shè)計。于是本發(fā)明人以得到的氨基酸序列作為基礎(chǔ)合成寡核苷酸引物，即分別合成根據(jù)鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅腘末端氨基酸序列C603(序列7)設(shè)計的寡核苷酸引物SS2a(序列9)、根據(jù)部分氨基酸序列C606(序列3)設(shè)計的寡核苷酸引物SA3(序列13)。以海藻希瓦氏菌G8的基因組DNA為模板，通過使用上述兩種引物進行PCR，可以得到特異擴增的DNA片段。研究該片段的堿基序列，通過對該序列與得到的有關(guān)鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅纳鲜鲆酝獾牟糠职被嵝蛄羞M行比較，可知該片段包含編碼鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅幕虻囊徊糠?。
通過以該擴增的DNA片段作為探針進行雜交等可以克隆編碼鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；溉L的基因。
序列15給出了通過以上操作得到的編碼來自海藻希瓦氏菌G8的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻娜繅A基序列。而序列14給出了通過該堿基序列推定的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅陌被嵝蛄?。另外，通過與來自海藻希瓦氏菌G8的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅腘末端氨基酸序列進行比較，可知該菌株生產(chǎn)的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；甘怯煞g后除去N末端38個氨基酸構(gòu)成的多肽后轉(zhuǎn)換的成熟型酶。序列1為該成熟型的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅陌被嵝蛄?，而序列2給出了上述的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻膲A基序列中，編碼成熟型鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅牟糠謮A基序列。而來自海藻希瓦氏菌G8的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅陌被嵝蛄幸约熬幋a該序列的堿基序列，由于沒有觀察到與眾所周知的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅陌被嵝蛄幸约皦A基序列有顯著的同源性，表明上述來自海藻希瓦氏菌G8的酶是屬于新家族的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；?。
另外從上述序列1給出的氨基酸序列使C末端的277個氨基酸缺失的多肽(C末端缺失體多肽)也具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚?。序列20給出了上述C末端缺失體多肽的氨基酸序列，而序列19給出了堿基序列。
這樣一來，在本發(fā)明中，由于編碼鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅暮怂岬目倝A基序列被確定，使用該鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻娜炕蚱湟徊糠肿鳛殡s交用探針，可以從由海藻希瓦氏菌G8菌株以外的生物體得到的基因組DNA或cDNA文庫中選擇出與鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富蛲葱愿叩腄NA。雜交可以在一般常用的條件下進行。例如使用海藻希瓦氏菌G8菌株以外的生物體得到的基因組DNA或cDNA文庫在上述嚴格條件下使其雜交，可以得到表現(xiàn)出各種各樣同源性的基因。
另外，可以由本發(fā)明的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻膲A基序列設(shè)計PCR用的引物。通過使用該引物進行PCR可以檢測出與本發(fā)明的基因同源性高的基因片段，也可以得到該基因全部，另外對生產(chǎn)鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅纳镞M行檢測也是有可能的。
為了確認通過上述雜交、或者PCR得到的基因是否是編碼具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯牡幕颍梢酝ㄟ^將得到的基因的堿基序列與本發(fā)明的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻膲A基序列或氨基酸序列進行比較進行推定。而利用下述記載的方法，制作得到的基因編碼的多肽，通過測定鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚钥梢源_認是否是目的基因。
將編碼本發(fā)明的多肽的核酸，例如具有序列2或序列19所示堿基序列的核酸與適當(dāng)?shù)妮d體進行連接，可以制作重組DNA。這樣的重組DNA也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
作為在上述重組DNA的制作中使用的載體如質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒載體等，可以根據(jù)重組DNA的使用目的進行適當(dāng)?shù)倪x擇。
例如當(dāng)作為導(dǎo)入上述重組DNA的對象的宿主為大腸桿菌時，作為載體可以使用pUC118、pUC119、pBR322、pCR3、pCMVSPORT等質(zhì)粒載體；λZAPII、λgtII等噬菌體載體。宿主為酵母時，作為載體可以使用pYES2、pYEUra3等。宿主為昆蟲時可以使用pAcSGHisNT-A等。宿主為動物時可以使用pKCR、pEFBOS、cDM8、pCEV4等。在這樣的載體中即使含有適當(dāng)?shù)目烧T導(dǎo)的啟動子、選擇標記、終止子等因子也可以。
從容易、而且可大量制造本發(fā)明的多肽的觀點出發(fā)，可以使用能夠使外源基因誘導(dǎo)表達的載體；能夠使作為與報告基因產(chǎn)物等的融合蛋白表達的載體等。
使作為融合蛋白表達的可能的載體如具有在宿主內(nèi)發(fā)揮作用的合適的啟動子(lac啟動子、tac啟動子、trc啟動子、trp啟動子、CMV啟動子、SV40初期啟動子等)的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白載體(pGEX4T等)；具有上述適當(dāng)啟動子的標記(His標記等)序列的載體等。
另外通過本發(fā)明的核酸或者本發(fā)明的重組DNA也提供攜帶該核酸或重組DNA的細胞導(dǎo)入用載體。這樣的細胞導(dǎo)入用載體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的細胞導(dǎo)入用載體具體來說可以由攜帶本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的重組DNA的載體構(gòu)成。作為上述載體如脂質(zhì)體、HVJ-微脂粒、葡聚糖、磷酸鈣、金粒子等。
另外將本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的重組DNA，或者本發(fā)明的細胞導(dǎo)入用載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骱罂梢灾谱鬓D(zhuǎn)化體。上述轉(zhuǎn)化體是攜帶本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的重組DNA的轉(zhuǎn)化體，包括在本發(fā)明中。
作為使用的宿主如細菌(例如大腸桿菌K-12系統(tǒng)的HB101菌株、C600菌株、JM109菌株等)、酵母(釀酒酵母等)、線狀菌等微生物以外，也可以使用哺乳動物的培養(yǎng)細胞(L、3T3、FM3A、CHO、COS、Vero、Hela等)、植物的培養(yǎng)細胞、昆蟲的培養(yǎng)細胞(sf9等)等。
而作為向宿主導(dǎo)入重組DNA的導(dǎo)入方法可以使用眾所周知的導(dǎo)入方法，例如磷酸鈣法、DEAE-葡聚糖法、電脈沖法等。
通過上述轉(zhuǎn)化體可以提供具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯牡闹圃旆椒?。這樣的具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯牡闹圃旆椒ㄒ舶ㄔ诒景l(fā)明中。
具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚远嚯牡闹圃旆椒ǖ囊淮筇卣靼?，在適合鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；副磉_的條件下對上述轉(zhuǎn)化體進行培養(yǎng)，從得到的培養(yǎng)物中提取具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯牡墓ば颉Ｓ绕涫怯捎谑褂昧吮景l(fā)明的轉(zhuǎn)化體可以高效而且大量地獲得具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯摹６捎谑褂帽磉_載體，在異源宿主中可使SCDase特異表達，例如與假單胞菌屬TK-4[特開平8-84547號公報，J.Biol.chem..、270(41)、24370-24374(1995)]情況相比，在SCDase的表達中可以發(fā)揮不需要誘導(dǎo)SCDase產(chǎn)生的物質(zhì)(唾液酸基GM1等神經(jīng)節(jié)苷脂)，不同時生產(chǎn)鞘磷脂酶等的SCDase以外的蛋白質(zhì)，不生產(chǎn)來自培養(yǎng)基的脂肪酸或來自誘導(dǎo)物質(zhì)的脂肪酸，且純化容易的優(yōu)良效果。
在本發(fā)明的制造方法中當(dāng)該轉(zhuǎn)化體是微生物或培養(yǎng)細胞時，通過確定有關(guān)培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)基的pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間以及誘導(dǎo)劑的使用量、使用時間等鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶表達的最適條件，可以有效地生產(chǎn)具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶活性的多肽。
在從轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)物純化具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯倪^程中使用了通常的方法。當(dāng)具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯男罘e在象大腸桿菌那樣的轉(zhuǎn)化體細胞內(nèi)時，可以在培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心分離收集轉(zhuǎn)化體細胞，得到的細胞經(jīng)超聲處理破碎后，通過離心分離得到無細胞提取液。以該提取液為起始材料，可以通過鹽析法以及離子交換、凝膠過濾、疏水、親和等各種層析等一般的蛋白質(zhì)純化法進行純化。有時通過使用的轉(zhuǎn)化體可以將表達產(chǎn)物分泌到細胞外。這種情況下，從培養(yǎng)上清中同樣可以進行純化。
在轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)的具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯闹?，雖然在該多肽在細胞內(nèi)生產(chǎn)的時候同時還存在著很多酶、蛋白質(zhì)，但這些酶和蛋白質(zhì)的量與表達的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅牧肯啾仁呛芪⒘康?，所以具有純化非常容易的優(yōu)點。另外作為載體使用菌體外分泌型的載體時，鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶被分泌到菌體外，在含有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅募壏种羞€同時存在著培養(yǎng)基成分。但這些成分通常幾乎不含有妨礙鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶純化那樣的蛋白質(zhì)成分，所以具有諸如不需要由海藻希瓦氏菌G8菌株的培養(yǎng)物純化鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶所必需的繁瑣的分離純化操作的優(yōu)點。
另外，例如宿主為大腸桿菌時，有時表達產(chǎn)物形成不溶性的包涵體(inclusion body)。此時，可以在培養(yǎng)結(jié)束后通過離心分離收集菌體，然后菌體經(jīng)超聲處理破碎后，通過離心分離收集含有包涵體的不溶性級分。接下來將包涵體洗凈后，用通常使用的蛋白質(zhì)增溶溶解劑，例如尿素和鹽酸胍鹽等進行增溶溶解，根據(jù)需要可將溶解的樣品通過離子交換、凝膠過濾、疏水、親和等各種層析進行純化，然后通過使用透析法或稀釋法等重折疊操作，可以得到含有保持鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶活性的多肽的標準樣品。根據(jù)需要如果通過各種層析對標準樣品再進一步純化的話，可以得到高純度的具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯摹?br> 鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；副磉_的確認可以通過測定鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶活性來進行?；钚詼y定，例如可以以轉(zhuǎn)化體的細胞提取液作為樣品，使用Journal of Biological Chemistry、第270卷、第24370-24374頁(1995)記載的方法進行。另外也可以使用抗鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶抗體，但當(dāng)使鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；敢耘c其他多肽形成的融合體表達時，可以使用抗該多肽部分的抗體。在使用抗體時，例如可以將轉(zhuǎn)化體的細胞提取液進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，可以于該膜上使用抗體進行檢測。
另外通過本發(fā)明的核酸可以提供可以特異檢測鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶基因的寡核苷酸探針或引物。上述寡核苷酸探針或引物在嚴格的條件下可以與本發(fā)明的核酸或與該核酸互補的核酸雜交。這里的嚴格條件只要是上述的“使用寡核苷酸探針時的嚴格條件”就可以。
而適于上述寡核苷酸探針或引物的序列可以在使用眾所周知的軟件、例如Oligo Primer Analysis Software(寶酒造公司制造)等，考慮二級結(jié)構(gòu)的形成、Tm值、對本發(fā)明的核酸的特異性等之后可以得到。
上述寡核苷酸探針可以以本發(fā)明的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻膲A基序列作為基礎(chǔ)進行設(shè)計，例如利用常規(guī)方法通過化學(xué)方法合成制作。
上述寡核苷酸探針的鏈長沒有特別限定，從防止非特異性的雜交的觀點出發(fā)，鏈長最好是至少連續(xù)15個核苷酸、即連續(xù)15個核苷酸以上的鏈，鏈長在18個核苷酸以上更好。
而在本發(fā)明的引物中也可以是具有與上述寡核苷酸探針同樣的堿基序列的核酸。例如，可以通過以本發(fā)明的基因的堿基序列作為基礎(chǔ)進行設(shè)計、化學(xué)合成等制作。對于引物的鏈長沒有特別限定，例如可以使用至少連續(xù)15個核苷酸的鏈，具體來說可以使用15～40個核苷酸堿基的鏈長的引物，特別是17～30個核苷酸鏈長的引物更合適。上述引物可以用于PCR法為首的其他各種基因擴增法中，具有通過該引物可以特異檢測鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻膬?yōu)越性質(zhì)。
而作為上述寡核苷酸探針或引物也可以使用對編碼來自天然的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅暮怂嵬ㄟ^進行限制酶、外切核酸酶等酶處理、超聲處理等物理處理切斷，得到的片段經(jīng)以瓊脂糖凝膠等為代表的各種核酸分離法分離純化后得到的核酸。象上述那樣得到的核酸最好是來自具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；柑赜行蛄械膮^(qū)域。
上述寡核苷酸探針或引物按照眾所周知的方法實施適當(dāng)?shù)臉擞洠梢杂糜诒景l(fā)明的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻臋z測。標記沒有特別限定，可以使用放射性同位素以及熒光物質(zhì)、生物素或異羥基洋地黃毒那樣的配基等。
通過本發(fā)明的寡核苷酸探針或引物可以提供編碼具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶活性的多肽的核酸的檢測方法。本發(fā)明的檢測方法其一大特征是使用上述的寡核苷酸探針和/或引物，利用探針和引物可以檢測被檢測樣品中的基因。更具體地講，如使含有核酸的被檢測樣品與本發(fā)明的寡核苷酸探針接觸，然后對核酸與寡核苷酸探針的雜化體進行檢測的方法，或?qū)⒑泻怂岬谋粰z測樣品作為模板樣品，利用本發(fā)明的引物進行核酸擴增的方法。
在本發(fā)明的檢測方法中使用上述寡核苷酸探針于嚴格條件下的雜交法等可以進行基因的檢測，或使用上述引物通過PCR法等DNA擴增方法進行基因的檢測。另外即使將兩者組合用也可以。
使用寡核苷酸探針時，作為被檢測樣品可以是諸如微生物的菌落和組織切片那樣的樣品，將這樣的樣品中的DNA或RNA固定于膜上的被檢測樣品，從這些樣品提取出的DNA或RNA等。而從樣品的穩(wěn)定性的觀點看，固定于膜上的DNA或提取的DNA比較好。
使用寡核苷酸探針時，通過在上述的嚴格條件下進行雜交可以進行基因的檢測。
使用引物時，作為被檢測樣品可以是如微生物培養(yǎng)液、微生物菌落、微生物菌體那樣的微生物樣品、皮膚、組織、組織切片那樣的來自生物體的樣品等。
使用上述引物時的被檢測樣品例如可以原封不動地直接使用分離的微生物，也可以實施適當(dāng)處置之后使用。而象組織那樣的固體樣品可以在制備出浸出液或懸浮液之后使用。而這些樣品的上清或這些樣品經(jīng)表面活性劑處理那樣的細胞溶解處理后的樣品或其上清也可以使用。另外在不損傷作為檢測對象的核酸的范圍內(nèi)可以進行除去樣品中其他成分的操作。
當(dāng)使用上述引物通過PCR法進行檢測時，PCR條件可以根據(jù)使用的引物的Tm值、擴增檢測對象的區(qū)域的長度等進行適當(dāng)?shù)剡x擇。
使用上述引物時，可以通過PCR法等DNA擴增方法進行擴增，通過確認PCR擴增產(chǎn)物的有無進行檢測。擴增有無的確認方法沒有特別限定，例如可以通過將核酸擴增反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠用適當(dāng)?shù)暮怂崛旧?，例如溴化乙錠、SYBER Green I等染色，通過檢測照射紫外線后有無帶生成確認。帶的檢測可以用肉眼觀察，也可以使用熒光影像分析儀等進行檢測。
在本發(fā)明的檢測方法中，為了提高檢測靈敏度，可以并用上述探針和引物。例如使用上述引物，利用PCR法對樣品中存在的微量的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富蜻M行擴增，然后使用探針與該基因進行雜交可以高靈敏度而且正確地進行檢測。
通過本發(fā)明的檢測方法對鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶基因進行檢測，進一步確定該基因表達量時，可以通過對在嚴格條件下來自雜交的探針的信號強度、對來自使用引物擴增的產(chǎn)物的帶的熒光強度等定量來進行。
用于本發(fā)明的核酸檢測方法的試劑盒其特征之一是含有上述寡核苷酸探針和/或引物。
在本發(fā)明的試劑盒中可以含有用于固定核酸的膜或雜交緩沖液等為代表的雜交用各種試劑、耐熱性DNA聚合酶、dNTP混合液、PCR用緩沖液等為代表的PCR用試劑、探針和用于檢測擴增DNA的試劑或微生物增殖用的培養(yǎng)基，用于從樣品中提取核酸的試劑等。
另外通過本發(fā)明的多肽、或使本發(fā)明的核酸表達得到的多肽可以提供與該多肽特異結(jié)合的抗體或其片段。這樣的抗體或其片段也包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明的抗體或其片段只要是具有特異結(jié)合多肽能力即可，沒有特別限定，無論是多克隆抗體、還是單克隆抗體都可以。另外也可以使用利用眾所周知技術(shù)修飾的抗體或抗體的衍生物，例如人源化抗體、Fab片段、單鏈抗體等。本發(fā)明的抗體可以使用例如1992年JohnWeily & Sons，Inc.發(fā)行的、John E.Coliga編輯、Current Protocolsin Immunology記載的方法，用本發(fā)明的多肽的全部或其一部分對兔或鼠進行免疫很容易制作。也可以通過基因工程技術(shù)制作抗體。另外也包括可以與多肽的某一部分片段特異結(jié)合的抗體或其片段。
進一步將得到的抗體純化后，經(jīng)肽酶處理可以得到抗體的片段。至于得到的抗體或其片段的用途，可以考慮用于鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶生產(chǎn)菌的檢測、親和層析、各種文庫(基因組DNA或cDNA)的篩選、藥物、診斷藥、研究用藥等方面的應(yīng)用。
另外本發(fā)明的抗體或其片段為了使其通過酶免疫測定法、熒光免疫測定法、發(fā)光免疫測定法容易檢測，可以進行各種修飾。
本發(fā)明的多肽的檢測方法其特征是使用上述抗體或其片段，通過他們可以對具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯倪M行檢測。具體來說，使含有多肽的被檢測樣品與上述抗體或其片段接觸，對多肽與抗體或其片段的復(fù)合體進行檢測。
在本發(fā)明中，作為被檢測樣品可以使用諸如微生物的細胞破碎物、皮膚等組織的提取液或洗凈液、固定了來自組織或微生物的蛋白質(zhì)的膜等蛋白質(zhì)樣品。
抗體或其片段與上述多肽的特異結(jié)合的檢測可以利用眾所周知的方法，如酶免疫測定法、熒光免疫測定法、發(fā)光免疫測定法。
用于本發(fā)明的多肽的檢測方法的試劑盒其特征之一是含有上述抗體或其片段。由于本發(fā)明的試劑盒含有上述抗體或其片段，所以對具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯倪M行特異、而且簡便的檢測成為可能。
在本發(fā)明的試劑盒中可以進一步含有反應(yīng)用緩沖液、標記二次抗體、顯色試劑等。
另外本發(fā)明的核酸有可能應(yīng)用于與鞘脂代謝有關(guān)系的疾病，例如神經(jīng)系統(tǒng)疾病(例如神經(jīng)變性疾病等)、白血病、創(chuàng)傷等疾病的治療。就是說，可以提供含有本發(fā)明核酸作為有效成分的用于與鞘脂代謝有關(guān)系的疾病，例如神經(jīng)系統(tǒng)疾病(例如神經(jīng)變性疾病等)、白血病、創(chuàng)傷等疾病的治療劑，以及在與鞘脂代謝有關(guān)系的疾病，具體來說如神經(jīng)系統(tǒng)疾病(例如神經(jīng)變性疾病等)、白血病、創(chuàng)傷等疾病的治療方面應(yīng)用本發(fā)明的核酸。
上述治療劑可以是使該有效成分裝載到可穩(wěn)定維持上述有效成分的載體后得到的制劑，例如，上述細胞導(dǎo)入用載體等。具體來說，如可以將有效成分裝載到可容易向作為投藥對象的個體、器官、局部部位、組織等生物體導(dǎo)入的藥學(xué)上容許的載體上。另外在治療劑中根據(jù)該治療劑投藥必需的狀態(tài)、疾病[例如神經(jīng)系統(tǒng)疾病(例如，神經(jīng)變性疾病等)、白血病、創(chuàng)傷等]；以及相應(yīng)于作為投藥對象的個體、器官、局部部位、組織還可以包含其他的助劑。具體來說，含有在直到到達使有效成分效果表達的對象部位之前的時間內(nèi)，藥學(xué)上容許的表現(xiàn)出抑制該核酸分解的性質(zhì)的助劑、賦形劑、結(jié)合劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、溶解輔助劑、等滲劑等。有效成分的含量根據(jù)投藥必需的狀態(tài)、疾??；作為投藥對象的個體、器官、局部部位、組織；作為投藥對象的個體的年齡等可進行適當(dāng)選擇。
作為上述治療劑的投藥方式可以是局部投藥、皮下注射、肌肉內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射等。
當(dāng)將本發(fā)明的核酸用于與鞘脂代謝有關(guān)系的疾病，例如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、白血病、創(chuàng)傷等疾病的治療時，可以使用將該核酸裝載到例如病毒載體、脂質(zhì)體等適于導(dǎo)入細胞的載體上得到的治療劑，然后將這樣的治療劑直接導(dǎo)入體內(nèi)的方法，對于取自動物，例如哺乳動物的某種細胞可以使用于體外導(dǎo)入治療劑，然后將得到的細胞返回體內(nèi)的方法。
以下舉些實施例對本發(fā)明進行具體說明，但本發(fā)明的范圍并不限定于這些實施例。
實施例1生產(chǎn)鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅奈⑸锏臋z索將從各地收集的樣品(海水、河水、或生活在海水、河水的生物的體表或消化道等)懸浮于滅菌的生理鹽水中。將得到的懸浮液10μl接種到在Eppendorf管中加有0.01％神經(jīng)酰胺、0.05％NH4Cl、0.05％K2HPO4、0.1％酵母提取液、2.0％NaCl、0.01％TDC、pH7.0的液體培養(yǎng)基400μl中，于25℃下振蕩培養(yǎng)4天。然后測定鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶活性(也稱之為SCDase)，選擇具有活性的培養(yǎng)液。
用NBD-GM1作為底物測定上述培養(yǎng)液中SCDase活性。NBD-GM1是用NBD(7-硝基苯-2-氧雜-1，3-二唑-4-基)對神經(jīng)酰胺的脂肪酸部分進行標記的GM1，按照Journal of Biochemistry、第126卷、第604-611頁(1999)記載的方法進行制備。
而活性測定象下述那樣進行。即，向含有0.1％的TritonX-100和NBD-GM1 100pmol的50mM醋酸緩沖液(pH6.0)10μl中加入酶液10μl，于37℃溫育一定時間。然后于100℃下煮沸5分鐘，終止反應(yīng)，使用真空離心蒸發(fā)濃縮器使反應(yīng)液完全干燥。加入15μl的氯仿/甲醇＝2∶1(v/v)，通過超聲處理使反應(yīng)生成物溶解。將得到的溶解物點到硅膠TLC板上。然后用氯仿/甲醇/0.2％CaCl2(5/4/1、v/v)展開后，使用島津色譜掃描儀CS-9300測定(吸光度475nm)分解率。再通過「分解率(％)＝[游離的溶血GM1的面積×100]/[游離的溶血GM1的面積+未反應(yīng)的GM1的面積]」公式求分解率。1個單位(U)定義為1分鐘內(nèi)分解1μmol的NBD-GM1的酶量。
上述那樣選擇的培養(yǎng)液用滅菌的生理鹽水稀釋后，將得到的稀釋物涂布在平板培養(yǎng)基上。將涂布后的平板培養(yǎng)基于25℃培養(yǎng)2天，使其形成菌落。上述操作反復(fù)進行直至形成單一菌落，結(jié)果從長崎縣小長井町的海砂采取的樣品中分離出生產(chǎn)鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅暮Ｔ逑Ｍ呤暇鶪8菌株。
實施例2鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶結(jié)構(gòu)基因的克隆(1)基因組DNA的提取純化將鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅纳a(chǎn)菌海藻希瓦氏菌G8菌株接種到200ml的PY培養(yǎng)基(0.5％多胨、0.1％酵母提取物、0.5％氯化鈉、pH7.2)中，于25℃下培養(yǎng)22小時。培養(yǎng)結(jié)束后，經(jīng)離心分離收集菌體，懸浮于10ml的TE緩沖液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.0)。向得到的懸浮液中再加入50mg/ml的卵白溶菌酶溶液0.2ml，于30℃下反應(yīng)15分鐘。然后向反應(yīng)結(jié)束后得到的溶液中加入2ml的10％SDS，平穩(wěn)攪拌，在溶液具有粘性后立即加入10ml的TE緩沖液飽和酚和1.5ml的5M NaCl，于室溫下緩慢攪拌1小時。攪拌后得到的溶液于2500rpm離心10分鐘后，回收上層。向得到的上層中加入等量的氯仿后攪拌10分鐘，然后于1500rpm離心10分鐘后，回收上層，再向回收上層加入等量的氯仿攪拌后，離心分離后回收上層(以下將這一系列操作記載為酚-氯仿處理)。向回收的溶液慢慢地加入等量的異丙醇，用巴氏移液管吸取界面上析出的DNA，溶解于10ml的TE緩沖液中。向得到的溶液加入20μl的RNase A(使RNase A于10mMTris-HCl、pH7.5、15mM NaCl溶液中溶解，濃度為10mg/ml，于100℃下進行加熱處理15分鐘的溶液)，于50℃下保溫1小時。通過向保溫后得到的溶液加入10μl的20mg/ml蛋白酶K溶液、200μl的5MNaCl、400μl的10％SDS之后，于37℃下保溫1小時，使其反應(yīng)。將反應(yīng)后得到的溶液恢復(fù)到室溫，進行酚-氯仿處理。反復(fù)進行2次，向得到的水層中加入等量的異丙醇和1/10容量的3M醋酸鈉，于-20℃下冷卻1小時后，于10000rpm下離心分離，將得到的沉淀用70％的乙醇沖洗之后，溶解于TE緩沖液，作為基因組DNA溶液。通過這樣的操作可以得到1.1mg的基因組DNA。
(2)鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅牟糠职被嵝蛄械拇_定對海藻希瓦氏菌G8菌株生產(chǎn)的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；高M行純化。海藻希瓦氏菌G8菌株于含有0.5％多胨、0.1％酵母提取物、2％氯化鈉、0.1％牛腦丙酮粉末的培養(yǎng)基在25℃下培養(yǎng)22小時。培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)液于8,300rpm下離心分離30分鐘后，得到培養(yǎng)上清4.6升。該培養(yǎng)上清中的SCDase活性是55.5單位(U)。而SCDase的1個單位(unit)定義為1分鐘內(nèi)分解1μmol GM1的酶量。
使用Minitan-ultratiltration system(Millipore公司生產(chǎn))的去除分子量10,000的超濾膜將上述得到的培養(yǎng)上清濃縮到1升，供于Butyl-Toyopeal 650M的柱層析((柱)床體積80ml)。首先向預(yù)先用含有2M氯化鈉的20mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)平衡的柱子加濃縮后的培養(yǎng)上清樣品。然后用20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)將柱子洗凈，然后用含有2％Lubrol PX(ナカライテスク公司生產(chǎn))的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)將吸附的SCDase洗脫出來。
收集活性級分，得到17.7U的SCDase。
然后將該活性級分加到預(yù)先用含有2％Lubrol PX的20mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)平衡的DEAE-Sepharose(Amersham PharmaciaBiotech公司生產(chǎn))柱子(30ml)上。用上述平衡緩沖液將柱子充分洗凈后，用含有1M NaCl和0.1％Lubrol PX的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)將吸附的酶脫下來。
收集活性級分，得到13.5U的SCDase。
該級分經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，在相當(dāng)于分子量75,000的位置處檢測出SCDase的帶。
利用上述的純化方法最終可以得到收率為24％的純化了1600倍的13.5U的SCDase。
將得到的SCDase進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。然后利用電印跡法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF(Immobilon-P、Millipore公司生產(chǎn))膜上。將對應(yīng)于該膜的SCDase帶的部分(約50pmol)切出，通過在含有0.2mg的賴氨酰[基]內(nèi)肽酶(リジルエンドペプチダ-ゼ) (0.9U)、8％乙腈的20mM Tris-HCl緩沖液100μl中振蕩的同時，于37℃下保溫16小時，進行酶消化。
將該酶消化液進行反相層析，進行肽段的純化。將得到的肽段通過使用477型氣相肽序列分析儀(Applied Biosystems公司生產(chǎn))的Edman降解法進行分析，確定SCDase的內(nèi)部部分氨基酸序列C-606(序列3)、C-599(序列4)、C-614(序列5)、C-616(序列6)。
另外與上述作法不同，對上述的PVDF膜不進行賴氨酰[基]內(nèi)肽酶處理，供肽序列分析儀分析，確定了N末端氨基酸序列C-603(序列7)。
(3)對含有鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶基因的DNA片段利用PCR法進行擴增根據(jù)實施例2-(2)中確定的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅腘末端氨基酸序列以及內(nèi)部部分氨基酸序列設(shè)計引物，用DNA合成儀進行合成。
即分別合成相對應(yīng)于序列7所示C-603合成有義混合引物SS1(序列8)、有義混合引物SS2a(序列9)以及有義混合引物SS2b(序列10)，對應(yīng)于序列3所示C-606合成反義混合引物SA1a(序列11)、反義混合引物SA1b(序列12)以及反義混合引物SA3(序列13)。
用這些引物進行PCR。在PCR中使用AmpliTaq Gold(ピ-イ-バイオシステムズ公司生產(chǎn))按照附帶的程序進行PCR的35循環(huán)反應(yīng)，每一循環(huán)為95℃ 0.3分鐘、52℃ 0.5分鐘、72℃ 1.5分鐘。
用實施例2-(1)中得到的海藻希瓦氏菌G8菌株基因組DNA作為模板，使用引物SS2a與引物SA3；SS1與SA1a；SS1與SA1b；SS1與SA3；SS2a與SA1a；SS2a與SA1b；SS2b與SA1a；SS2b與SA1b；SS2b與SA3的組合進行PCR。結(jié)果檢測出相當(dāng)于對應(yīng)于大約1,000bp的特異的帶的擴增。
從瓊脂糖凝膠電泳后的凝膠中回收上述的大約1,000bp的擴增DNA片段。將得到的DNA片段與pGEM-T easy載體(Promega公司生產(chǎn))連接，制作重組質(zhì)粒。以該質(zhì)粒作為模板，通過雙脫氧法確定上述的擴增DNA片段的堿基序列。
結(jié)果在得到的堿基序列中發(fā)現(xiàn)分別編碼鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶的N末端氨基酸序列C-603、部分氨基酸序列C-606以及C-599的堿基序列，很清楚該擴增DNA片段是編碼目的鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶的基因的一部分。
(4)含有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻腄NA片段的檢測用實施例2-(3)中得到的PCR擴增DNA片段作為探針，進行含有SCDase基因的基因組DNA片段的篩選。
首先對實施例2-(1)制備的基因組DNA5μg用限制酶ApaI、KpnI、Sa1I、EcoRV、BamHI、XbaI和SacI各100單位于37℃下消化22小時。將得到的限制酶消化的DNA進行1％瓊脂糖凝膠電泳。電泳后通過Southern blot法將DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜[Hybond-N+、Amersham公司生產(chǎn)]上。作為雜交的探針使用DNA標記試劑盒[ReadyToGo、Amersham Pharmacia Biotech公司生產(chǎn)]按照附帶的程序?qū)嵤├?-(3)得到的PCR擴增DNA片段0.1μg用32P標記后的產(chǎn)物。
將上述尼龍膜于含有0.5M Church法磷酸緩沖液[Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the USA、第81卷、第1991-1995頁(1984)]pH7.0、7％SDS、1mM EDTA的雜交溶液中，在65℃下進行1小時以上的預(yù)雜交。然后加入上述的標記探針，終濃度為6fmol/ml，于65℃下雜交過夜。
然后于65℃加溫的洗凈液(1％SDS、40mM磷酸鈉緩沖液)中，65℃下反復(fù)洗3次，每次15分鐘。將尼龍膜上殘留的水分除去后，將膜與富士膠片公司生產(chǎn)的像紙(富士膠片公司生產(chǎn))接觸20分鐘，使其曝光。將感光后的像紙用BAS1000圖象分析儀(富士膠片公司生產(chǎn))進行分析，對尼龍膜上的探針進行檢測。結(jié)果可以確認來自與ApaI、KpnI、Sa1I、EcoRV、BamHI、XbaI和SacI各消化物中的分別為約10kb、約5kb、約2.3kb、約4.4kb、約10kb、約10kb、約4kb的位置雜交的探針的信號。
(5)鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶基因的克隆根據(jù)實施例2-(4)的結(jié)果對約4.4kb的EcoRV片段進行克隆。通過1％瓊脂糖凝膠電泳對EcoRV消化的基因組DNA 10mg進行分離，切出對應(yīng)于約4.4kb大小的物質(zhì)的瓊脂糖凝膠。使用Sephaglas BandPrep試劑盒(Amersham pharmacia biotech公司生產(chǎn))從凝膠中提取純化DNA片段，將該DNA片段插入到pBluescript II SK(東洋紡公司生產(chǎn))的EcoRV部位，制作重組質(zhì)粒。用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。然后于含有氨芐青霉素100μg/ml的L瓊脂(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取液、1％NaCl、pH7.2、1％瓊脂)板上培養(yǎng)過夜，從出現(xiàn)的菌落中選擇300菌落，接種到置于同樣培養(yǎng)基板上的尼龍膜[Hybond-N)、Amersham pharmacia biotech公司生產(chǎn)]上。于37℃下培養(yǎng)16小時后，將該尼龍膜放置在浸入了堿性變性溶液(0.5M NaOH、1.5MNaCl)的濾紙上進行5分鐘(變性)處理，再于浸入了中和溶液(0.5MTris-HCl(pH7.5)、3M NaCl)的濾紙上進行5分鐘(中和)處理后，用2×SSC(1×SSC組成0.15M NaCl、0.015M檸檬酸鈉、pH7.0)進行沖洗。
該尼龍膜用實施例2-(3)得到的PCR擴增DNA片段作為探針，在與上述同樣的條件下進行雜交，得到了對應(yīng)于2個菌落的信號。從其中一個菌落制備的質(zhì)粒被命名為pSCD1，對該質(zhì)粒中插入DNA片段的堿基序列進行確定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了分別對應(yīng)于實施例2-(2)得到的氨基酸序列C-606、C-599、C-614、C-616、N末端氨基酸序列C-603的序列以及在與這些序列同一框內(nèi)的終止密碼子。即表明該質(zhì)粒含有由2976bp的開放讀碼框構(gòu)成的SCDase基因全長。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109被命名為大腸桿菌JM109/pSE5，由以FERM BP-7717于2001年8月24日[原保藏日]原保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所、特許微生物寄托中心[郵政編碼305-8566日本國茨城縣筑波市東一丁目1番地1中央第6]轉(zhuǎn)至按照布達佩斯條件的保藏。
圖1給出了質(zhì)粒pSCD1插入DNA片段的限制酶圖譜。由該質(zhì)粒的堿基序列的解析結(jié)果確定了鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻娜繅A基序列和鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅陌被嵝蛄?。序列14給出了編碼海藻希瓦氏菌G8菌株生產(chǎn)的SCDase的開放讀碼框(ORF)的堿基序列，而序列15給出了該ORF編碼的氨基酸序列。
另外序列2給出了編碼由實施例2-(2)得到的鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶的N末端氨基酸序列C-603(序列7)所表明的成熟型SCDase的堿基序列，序列1給出了該堿基序列編碼的成熟型SCDase的氨基酸序列。
實施例3表達鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；付嚯牡馁|(zhì)粒的構(gòu)建按照以下操作構(gòu)建表達鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅馁|(zhì)粒。
以鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶的N末端和C末端的各堿基序列為基礎(chǔ)分別合成附加了NheI位點的引物UN1(序列16)和附加了XhoI位點的引物L(fēng)C1(序列17)。使用這些引物進行以上述實施例2記載的質(zhì)粒pSCD1作為模板的PCR。在PCR中，使用Pyrobest DNA聚合酶按照附帶的程序，進行25循環(huán)的RCR，每一循環(huán)為98℃ 10秒、68℃ 3.5分鐘。上述條件下的PCR結(jié)果可檢測出大約3kb的特異的帶。
從瓊脂糖凝膠電泳后的凝膠中回收該大約3kb的擴增DNA片段，用限制酶NheI和XhoI消化，將得到的片段與pET23a載體(ノバジエン公司生產(chǎn))連接，制作重組質(zhì)粒pSCD2。
實施例4鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶在轉(zhuǎn)化體大腸桿菌中的表達。
用實施例3得到的質(zhì)粒pSCD2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21pLys S(ノバジエン公司生產(chǎn))，得到大腸桿菌BL21/pSCD2。將該轉(zhuǎn)化體接種到含有氨芐青霉素100μg/ml的3ml的LB培養(yǎng)基之后，于37℃下振蕩培養(yǎng)過夜。然后將得到的培養(yǎng)液0.5ml接種到50ml的同樣培養(yǎng)基中。于37℃下培養(yǎng)，在度(600nm的吸光度)大約達到0.5的階段，加入終濃度0.1的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，再于37℃下振蕩培養(yǎng)30分鐘。培養(yǎng)結(jié)束后，對培養(yǎng)液離心分離，收集菌體，懸浮于含有5ml的0.1％TritonX-100和0.8M NaCl的50mM醋酸緩沖液(pH6.0)。然后進行超聲處理，破碎菌體。得到的破碎液進行離心分離，提取上清，該上清作為粗酶液。
與上述實施例1一樣，用NBD-GM1作為底物測定該粗酶液的SCDase活性。結(jié)果表明含有本發(fā)明的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻拇竽c桿菌BL21/pSCD2每1升培養(yǎng)液生產(chǎn)大約1U的鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶。
實施例5用于編碼具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶活性的核酸檢測的試劑盒的構(gòu)建以序列2所示的堿基序列為基礎(chǔ)制作寡核苷酸探針和引物，構(gòu)建如下所示的用于編碼具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘暮怂釞z測的試劑盒。
在該試劑盒中包含可以對鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；柑禺悈^(qū)域進行擴增的引物組、DNA聚合酶、PCR用緩沖液、dNTP混合物。
另外，用于進行擴增后雜交的對擴增區(qū)域特異的探針根據(jù)需要包括在試劑盒中。
例如，制作如下的試劑盒。
試劑盒的組成(PCR100次)SS1(20pmol/μl)110μlSS2a(20pmol/μl) 110μlSS2b(20pmol/μl) 110μlSA1a(20pmol/μl) 110μlSA1b(20pmol/μl) 110μlSA3(20pmol/μl)110μl10×PCR緩沖液 1mlTakaRa(5U/μl) 50μldNTP混合物(各2.5mM)1.28μl實施例6用于具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶活性的多肽檢測的試劑盒的構(gòu)建通過以具有序列1所示氨基酸序列的多肽作為抗原，對山羊、兔、大鼠、小鼠等進行免疫，制作抗鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；缚贵w，構(gòu)建如下所示的用于具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶活性的多肽檢測的試劑盒。
該試劑盒是含有包被抗SCDase單克隆抗體的96孔板、過氧化物酶標記的抗SCDase單克隆抗體、標準品、稀釋液、底物溶液(TMBZ3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺)以及反應(yīng)終止液(1N硫酸)的夾心EIA用試劑盒。
例如作成如下那樣的試劑盒試劑盒的構(gòu)成(96次)抗SCDase單克隆抗體板96孔(8孔×12列) 1塊過氧化物酶標記的抗SCDase單克隆抗體(冷凍干燥品) 11ml用×1份標準品(冷凍干燥品)1ml×1份稀釋液11ml×1份底物溶液(TMBZ)12ml×1份反應(yīng)終止液(1N硫酸)12ml×1份實施例7表達C末端缺失的鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶多肽的質(zhì)粒的構(gòu)建按照以下操作構(gòu)建表達C末端缺失的鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶多肽的質(zhì)粒。
以由通過純化酶推定的肽序列所給出的從N末端75kDa部分、即對應(yīng)于C末端一側(cè)(ERAEAH)的部分堿基序列為基礎(chǔ)合成引物L(fēng)SCD2125(序列18)。使用得到的引物L(fēng)SCD2125和實施例3中合成的引物UN1(序列16)，以上述實施例2記載的質(zhì)粒pSCD1為模板進行PCR。在PCR中，使用PyroBest DNA聚合酶(寶酒造公司生產(chǎn))按照附帶的程序進行30循環(huán)的RCR，每一循環(huán)為96℃ 10秒、68℃ 2.5分鐘。上述條件下的PCR結(jié)果可檢測出大約2kb的特異的帶。
從瓊脂糖凝膠電泳后的凝膠中回收大約2kb的該擴增DNA片段，用限制酶NheI和XhoI消化，得到編碼缺失了C末端區(qū)的SCDase的片段。將得到的片段與用限制酶NheI和XhoI消化的pET23b載體(ノバジエン公司生產(chǎn))連接，制作重組質(zhì)粒pETSCD-del。
序列19給出了編碼缺失了C末端區(qū)的SCDase的DNA的堿基序列，序列20給出了該堿基序列編碼的氨基酸序列。
實施例8鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；窩末端缺失體在轉(zhuǎn)化大腸桿菌中的表達用實施例7中得到的質(zhì)粒pETSCD-del轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysE(ノバジエン公司生產(chǎn))，得到轉(zhuǎn)化體大腸桿菌BL21(DE3)pLysE/pETSCD-del。將該轉(zhuǎn)化體接種到含有100μg/ml氨芐青霉素和35μg/ml氯霉素的5ml的LB培養(yǎng)基之后，于25℃下振蕩培養(yǎng)過夜。然后將得到的培養(yǎng)液振蕩接種到加入2升容量帶有風(fēng)口的燒瓶的1升同樣培養(yǎng)液中。然后對得到的培養(yǎng)液于25℃下振蕩培養(yǎng)18小時，然后加入終濃度為0.1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，再于25℃下振蕩培養(yǎng)1小時。培養(yǎng)結(jié)束后，對培養(yǎng)液離心分離，回收菌體，懸浮于含有0.1％TritonX-100和150mM NaCl、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、5μg/ml胃蛋白酶抑制劑、5μg/ml抑糜蛋白酶素以及5μg/ml亮抑蛋白酶肽的10mM Tris-HCl緩沖液50ml中(pH7.5)。然后將得到的懸浮物于-80℃下冷凍后、再使其融解來破壞菌體。再進行超聲，破碎菌體。得到的破碎液進行離心分離，提取上清，得到粗酶液。
得到的粗酶液的SCDase活性測定按照以下的方法進行。即，向10μl底物[10nmol GM1a、5mM MgCl2、5mM MnCl2、5mM CaCl2、0.2％TritonX-100、200mM NaCl、50mM醋酸緩沖液(pH5.5)]中加入粗酶液10μl，于37℃溫育30分鐘，使粗酶液與底物反應(yīng)。然后于100℃下煮沸5分鐘，終止反應(yīng)，使用離心濃縮機將得到的反應(yīng)液濃縮干燥。向得到的產(chǎn)物中加入10μl的氯仿/甲醇(2＝1、v/v)，對得到的化合物進行超聲處理，使反應(yīng)生成物溶解。將得到的溶解物點到硅膠TLC板上。然后用氯仿/甲醇/0.2％CaCl2(5/4/1、v/v/v)展開后，通過苔黑酚硫酸法使硅膠TLC板顯色。使用TCL色譜掃描儀(島津制作所生產(chǎn))測定顯色后的硅膠TLC板的吸光度(波長540nm)，通過以下公式求分解率。
分解率(％)＝([游離的溶血GM1a的面積]/[游離的溶血GM1a的面積+未反應(yīng)的GM1a的面積]×100)其中SCDase的1個單位(U)定義為1分鐘內(nèi)分解1μmol的GM1a的酶量。
利用上述方法測定活性時，表明攜帶編碼本發(fā)明的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；窩末端缺失體的基因的大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)pLysE/pETSCD-del每1升培養(yǎng)液生產(chǎn)872U的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；窩末端缺失體。
通過以下的方法可以得到SCDase純化標準品。
即，將上述粗酶液加到預(yù)先用含有0.1％TritonX-100和150mMNaCl的10mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)平衡的HiTrap Chelating柱(Amersham pharmacia biotech公司生產(chǎn))。然后用含有20mM咪唑的10mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)將樣品夾雜的蛋白質(zhì)洗出。然后用含有50mM咪唑的10mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)將SCDase洗脫出來，回收活性級分(1)。
將回收的活性級分(1)對含有0.1％TritonX-100的10M的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)透析。然后將上述透析液加到用含有0.1％TritonX-100的10mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)平衡的HiTrapQ柱(Amersham Pharmacia Biotech公司生產(chǎn))。接下來用含有0.1％TritonX-100和1M NaCl的10mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)將SCDase洗脫出來，回收活性級分(2)。
將上述活性級分(2)加到用含有0.1％TritonX-100和150mM NaCl的10mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)平衡的HiLoad Superdex 200pg柱(Amersham pharmacia biotech公司生產(chǎn))?；厥罩記]有吸附的穿過的活性級分(3)。
將上述活性級分(3)加到用含有0.1％TritonX-100的10mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)平衡的HiTrapQ柱(Amersham PharmaciaBiotech公司生產(chǎn))。然后用含有0.1％TritonX-100和1M NaCl的10mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)將SCDase洗脫出來，回收活性級分(4)?；厥盏幕钚约壏?4)作為酶純化標準品。
得到的酶純化標準品在SDS-PAGE上表現(xiàn)為單一帶?？偟鞍琢繛?9.3mg，總活力為5258U。
序列表目錄序列8所示序列為用于擴增鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶基因的引物序列。
序列9所示序列為用于擴增鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻囊镄蛄?。
序列10所示序列為用于擴增鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻囊镄蛄小?br> 序列11所示序列為用于擴增鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻囊镄蛄?。
序列12所示序列為用于擴增鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻囊镄蛄小?br> 序列13所示序列為用于擴增鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻囊镄蛄?。
序列16所示序列為用于擴增鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶基因的引物序列。
序列17所示序列為用于擴增鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻囊镄蛄?。
序列18所示序列為用于擴增C末端缺失鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻囊镄蛄?。
序列19所示序列為編碼C末端缺失鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富虻膲A基序列。上述序列對應(yīng)于序列2中堿基1～2031的序列。
序列20所示序列為C末端缺失鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅陌被嵝蛄?。上述序列對應(yīng)于序列1中氨基酸1～677的序列。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明首次提供鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶的氨基酸序列以及編碼該序列的堿基序列。由此提供使用編碼具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚远嚯牡暮怂嶂圃炀哂星手窠?jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯牡幕蚬こ讨圃旆椒?，以及該鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅臋z測方法。本發(fā)明的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；钢圃旆椒梢园l(fā)揮出不需要向培養(yǎng)基中添加用于誘導(dǎo)鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；副磉_的鞘脂，沒有混雜同時被誘導(dǎo)的鞘磷脂酶等酶和加到培養(yǎng)基的鞘脂或其他分解物，具有容易純化目的鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；傅膬?yōu)良效果。另外可以提供與編碼具有本發(fā)明的鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶活性的多肽的核酸特異雜交的探針和引物，與具有本發(fā)明的鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶活性的多肽特異結(jié)合的抗體或其片段。利用這些探針、引物和抗體或其片段可以簡便、而且高靈敏度地檢測鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚浴?br> 序列表序列表<110>寶生物株式會社<120>鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富?amp;lt;130>01-060-PCT<150>JP 2000-293181<151>2000-09-26<160>20<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>954<212>PRT<213>海藻希瓦氏菌<400>1Thr Thr Gln Ala Val Asp Ser Leu Ala Gln Gln Cys Phe Ile Ile Gln1 5 10 15Ser Pro Thr Asn Gly Gln Tyr Leu His Arg Phe His Gln Gly Gly Thr20 25 30Val Asp Asp Gly Leu Ser Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Ser Gln Ala Glu35 40 45Ala Ser Ala Phe Tyr Phe Lys Pro Ser Arg Arg Gly His Phe Met Met50 55 60Thr Asp Ala Asp Gly Arg Phe Phe Ala Ser His Leu Pro Ala Glu Val65 70 75 80Ser Ala Gly Arg Tyr Pro Gly Glu Phe Ala Glu Trp Arg Val Asp Ala85 90 95Glu Thr Ala Pro Ser Gly Glu Phe Ser Tyr Arg Phe His Ala Val Gly100 105 110Leu Asn Leu Gly Leu Arg His Asn Tyr Ser Gly Gly Gly Leu Tyr Phe115 120 125Phe Asp Leu Leu Asn Pro Gly Asn Asn Thr Ser Glu Ala Ser Phe Lys130 135 140Leu Val Ala Ser Asp Ala Cys Ser Ala Phe Pro Glu Val Glu Val Asn145 150 155 160Ala Ser Gly Asp Phe Ser Ala Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu Pro Val165 170 175Arg Gly Leu Val Asp Ala His Thr His Ile Thr Ser Tyr Glu Phe Met
180 185 190Gly Gly Lys Met Met His Gly Lys Pro Phe His Arg Trp Gly Val Thr195 200 205Gln Ala Leu Asn Asp Ser Ala Val Ile His Gly Pro Asn Gly Ser Leu210 215 220Asp Leu Ile Gly Asn Leu Tyr Ser Phe Asn Asp Ala Asn Phe Arg Tyr225 230 235 240Asp Thr Arg Gly Trp Pro Asp Phe Pro Trp Trp Pro Asn His Glu Gln245 250 255Met Thr His Ser Gly Tyr Tyr Tyr Lys Trp Ile Glu Arg Ala Trp Leu260 265 270Gly Gly Leu Arg Leu Met Val Thr His Leu Val Glu Asn Glu Val Leu275 280 285Cys Asn Ala Gln Lys Thr Ile Asn Pro Ala Ser Trp Val Asn Pro Asn290 295 300Asp Cys Asn Thr Met Asn Ser Ile Gln Leu Gln Ile Asn Arg Leu Lys305 310 315 320Gln Met Gln Glu Tyr Ile Asp Val Gln Ser Gly Gly Pro Gly Lys Gly325 330 335Phe Phe Arg Leu Val Ser Ser Pro Gln Glu Ala Arg Glu Val Ile Ala340 345 350Asp Gly Lys Leu Ala Val Leu Met Gly Ile Glu Ala Ser Glu Leu Phe355 360 365Asn Cys Gly Ile Lys Asp Asp Cys Asn Arg Arg Gln Ile Glu Glu Gln370 375 380Leu Gln Gln Val Tyr Ala Lys Gly Val Arg Ile Leu Phe Pro Thr His385 390 395 400Lys Phe Asp Asn Gln Leu Gly Gly Ser Val Val Glu Asp Gly Phe Ile405 410 415Asn Ile Gly Glu Val Leu Ala Thr Gly His Phe Phe Glu Thr Gln Ala420 425 430Cys Asp Ala Asp Thr Gln Gly Arg Pro Phe Lys Ser Gly Phe Pro Ile435 440 445Leu Gly Glu Ile Pro Val Leu Lys Asp Ile Leu Asn Ala Val Gly Leu450 455 460Asn Pro Gln Tyr Asp Glu Asn Met Leu His Cys Asn Lys His Gly Leu465 470 475 480Ser Glu Lys Gly Val Tyr Leu Val Asn Arg Met Ile Asp Met Gly Met485 490 495Leu Ile Glu Leu Asp His Met Ser Ala Gln Thr Ala Thr Ser Val Met500 505 510Asp Ile Val Glu Gln Arg Gln Tyr Gly Gly Val Ile Thr Ser His Ser515 520 525Trp Met Thr Asp Gly Thr Gln Gly Arg Leu His Pro Asn Thr Leu Arg
530 535 540Leu Ala Lys Val Gly Gly Phe Met Ala Pro Tyr Asn Ser Asn Ala Asn545 550 555 560His Leu Gly Gly Ser Ile Asp Arg Tyr Leu Gln Leu Ile Ala Asp Thr565 570 575Pro Phe Leu Pro Gly Val Gly Leu Gly Thr Asp Met Ser Gly Leu Gly580 585 590Ala Gln Ala Gly Pro Arg Asp Asp Ala Ala Thr Asn Pro Leu His Tyr595 600 605Pro Phe Val Ser Glu Phe Gly Ile Gln Phe Glu Arg Gln Val Ser Gly610 615 620Asn Arg Val Phe Asp Phe Asn Gln Asp Gly Met Ala His Tyr Gly Met625 630 635 640Leu Ala Asp His Leu Gln Asp Val Arg Glu Gln Leu Gly Gly Ser Thr645 650 655Tyr Glu Ala Leu Met Asn Ser Ala Glu Ala Tyr Leu Gln Met Trp Glu660 665 670Arg Ala Glu Ala His Arg Asp Glu Ala Tyr Ile Asn Pro Leu Pro Thr675 680 685Tyr Val Arg Ile Val Asn Arg Ala Ser Asp Lys Cys Met Asp Ile Pro690 695 700Gly Asn Gly Ser Asp Met Val Asn Gly Thr Asp Val Ile Leu Tyr Asp705 710 715 720Cys Glu Arg Asp Ala Trp Asp Gln Arg Trp Ser Phe Asp Ala Asp Lys725 730 735Arg Met Phe Ser Asn Lys Ala Asn Pro Ser Leu Cys Leu Asp Asn Arg740 745 750Gly Gln Ala Tyr Asn Glu Gly Glu Ile Val Val Trp Glu Cys Val Asp755 760 765Ser Asp Asn Leu Arg Trp Asp Tyr Asp Gly Arg Phe Ile Arg Ser Ala770 775 780His Asp Ala Asn Ile Val Ala Asp Ala Tyr Gly Arg Gly Asn Asp Ala785 790 795 800Gln Val Gly Gln Trp Gln Phe His Gly Gly Ala Asn Gln Gln Trp Leu805 810 815Leu Arg Pro Glu Met Thr Ile His Arg Trp Val Ser Leu Arg Asp Lys820 825 830Arg Ala Gly Leu Cys Ile Ser Ala Pro Glu Gln Ala Gln Ser Gly Ser835 840 845Leu Val Asn Leu Asp Asn Cys Ser Asn Arg Gln Gly Gln Lys Trp Tyr850 855 860Phe Asp Pro Ile Lys Gly Ser Ile Lys Leu Ala Gly Asp Ala Gly Leu865 870 875 880Cys Leu His Ile Pro Gly Gly Asn Thr Gln Asp His Ser Gln Leu Ala
885 890 895Leu Ala Pro Cys Asp Ala Ser Asn Pro Ala Gln Ala Phe Asp Lys Asp900 905 910Gly Ser Val Phe Ser Ser Arg Met Ala Pro Asn Gln Val Leu Asp Ala915 920 925Ser Gly Glu Gln Ala Gly Ala Ala Leu Ile Leu Tyr His His His Gly930 935 940Asp Ser Asn Gln Lys Trp Lys Ser Ser Leu945 950<210>2<211>2862<212>DNA<213>海藻希瓦氏菌<400>2accacccagg cggtcgacag cctggcgcag caatgtttta ttattcaatc gccaaccaat 60ggccagtatc tgcatcgctt ccatcaggga ggcactgtgg atgatggtct gagttatcgt 120ttcgataata tcagccaggc cgaggccagt gcgttttact tcaaacccag tcgccgcggt 180cattttatga tgacagacgc agatggccgc ttctttgcca gccatctgcc ggccgaagtc 240agcgccggtc gttacccggg ggaatttgcc gagtggcggg ttgacgccga aacagcacca 300tccggtgaat tcagttatcg ctttcacgcc gtgggcctca atctgggact caggcacaac 360tacagcggcg gaggcttgta tttcttcgat ctgctcaacc ctggaaacaa cacttcagag 420gcaagcttca agctggttgc cagtgacgcc tgcagcgcgt ttcccgaggt tgaagtcaat 480gccagtggtg atttctccgc cctgaaaggc gatgcttcac tgccggtgcg gggtctggtc 540gatgcccaca cccatatcac ctcgtatgag tttatgggcg gcaagatgat gcatggcaag 600ccgttccacc gctggggggt gacccaggcg ttgaacgaca gtgcggtgat ccatgggccg 660aatggctcac tggatctcat cggcaatctc tactccttca acgacgccaa cttccgctat 720gacacccgag gctggccgga cttcccctgg tggcccaatc acgagcagat gacccactca 780ggttactact acaagtggat tgagcgcgcc tggctaggcg gtttgcgcct gatggtcacc 840catctggtgg aaaacgaggt gttgtgcaac gcccagaaaa ccatcaatcc cgccagttgg 900gtcaacccca acgactgtaa caccatgaac agcattcagt tgcagattaa ccgtctcaag 960caaatgcagg agtatattga tgtgcagtcc ggcggccccg gcaaaggctt cttccgcctg 1020gtgtcctcgc ctcaagaggc tcgcgaggtc attgccgacg gcaagctggc ggtgctgatg 1080ggcatagagg cctcagagct gttcaactgc ggtatcaagg atgattgcaa ccgccgccag 1140attgaagagc aactgcagca agtttatgcc aagggggtga gaatcctgtt cccgacccac 1200aagttcgata accaactggg cggctcagtg gtggaagacg gctttatcaa tatcggtgaa 1260gtcttggcga cgggccattt ctttgaaacc caggcctgcg acgccgacac ccagggcaga 1320ccattcaagt ccggtttccc cattttgggc gaaatcccag tgctcaagga tattctcaat 1380gccgtgggtc tcaatcccca gtacgacgag aacatgctgc actgcaacaa gcatggcttg 1440tccgaaaaag gcgtctacct ggttaaccgc atgatagata tgggaatgtt gatagaattg 1500gatcatatgt cggcacaaac cgccaccagt gtgatggata ttgtcgagca gcgccaatat 1560ggcggggtga tcaccagcca cagctggatg actgatggca cccaaggcag actgcacccc 1620aacaccctgc gcctggccaa ggtcggcggt tttatggcgc cctacaacag taacgccaac 1680
catcttggag gcagtattga tagatacctg cagttgatag ccgatactcc ttttctgccg 1740ggtgtcggcc tgggaaccga tatgagtggc ctcggcgctc aggccggtcc cagagacgat 1800gcggccacta atccactgca ctaccccttc gtcagtgagt tcggtatcca gtttgagcgt 1860caggtatcgg ggaatcgtgt atttgacttc aatcaggatg gcatggccca ttacggtatg 1920ctggctgatc atctgcagga tgtgcgcgag cagcttggcg gcagtaccta tgaagccttg 1980atgaactcgg ccgaagccta tctgcagatg tgggagcgcg cagaagccca cagggatgaa 2040gcctatatca atccactgcc gacctatgtg cggatagtca accgcgcctc ggacaagtgt 2100atggatattc cgggtaatgg cagcgatatg gtcaatggca cagatgtgat cctctatgat 2160tgtgaacgcg acgcctggga tcaacgctgg agctttgatg ccgacaaacg catgttcagc 2220aacaaagcca atccatcctt gtgtttggac aatcgcggtc aggcctacaa tgaaggcgaa 2280atcgtggtat gggagtgtgt cgacagcgac aatctgcgtt gggattatga cggccgcttt 2340attcgcagtg cccatgacgc caatatagtg gccgacgcct atggccgtgg caacgatgcc 2400caagtgggtc aatggcaatt tcatggcggc gccaaccagc aatggttgct caggcctgag 2460atgactattc accgctgggt cagtttgcgg gataaacgtg ccgggctatg tatcagcgct 2520cccgaacagg cccaaagcgg cagcctggtg aacctggaca actgcagcaa ccgtcagggg 2580caaaaatggt acttcgatcc gataaaaggc agtatcaaac tggctggtga cgcgggactg 2640tgcctgcaca ttccgggtgg caatacccag gatcatagcc agttggcact ggcgccctgc 2700gatgcttcca atccggctca ggcattcgat aaagacggca gcgtgttctc aagccgaatg 2760gcacccaatc aggtgcttga tgcctcggga gaacaagccg gcgcggctct gatcctctac 2820caccaccatg gcgacagtaa tcagaagtgg aagtccagcc tc2862<210>3<211>16<212>PRT<213>海藻希瓦氏菌<400>3Gln Met Gln Glu Tyr Ile Asp Val Gln Ser Gly Gly Pro Gly Lys Gly1 5 10 15<210>4<211>12<212>PRT<213>海藻希瓦氏菌<400>4Arg Leu Met Val Thr His Leu Val Glu Asn Glu Val1 5 10<210>5<211>7<212>PRT<213>海藻希瓦氏菌
<400>5Gln Leu Gln Gln Val Tyr Ala1 5<210>6<211>7<212>PRT<213>海藻希瓦氏菌<400>6Gly Val Arg Ile Leu Phe Pro1 5<210>7<211>18<212>PRT<213>海藻希瓦氏菌<400>7Thr Thr Gln Ala Val Asp Ser Leu Ala Gln Gln Cys Phe Ile Ile Gln1 5 10 15Ser Pro<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明用于擴增SCDase基因的引物<400>8carcartgyt tyathathca 20<210>9<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明用于擴增SCDase基因的引物<400>9ttngcncarc artgytt 17
<210>10<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明用于擴增SCDase基因的引物<400>10ctngcncarc artgytt17<210>11<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明用于擴增SCDase基因的引物<400>11ccnstytgna crtcdat17<210>12<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明用于擴增SCDase基因的引物<400>12ccnsaytgna crtcdat17<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明用于擴增SCDase基因的引物<400>13acrtcdatrt aytcytgcat20
<210>14<211>992<212>PRT<213>海藻希瓦氏菌<400>14Met Lys Lys Leu Ile Gly His Gly Asp Trp Pro Ser Ala Lys Ser Leu1 5 10 15Phe Ser Ala Leu Ile Pro Gly Leu Phe Thr Leu Gly Thr Leu Pro Leu20 25 30Ala Ala Ala Glu Thr Gln Thr Thr Gln Ala Val Asp Ser Leu Ala Gln35 40 45Gln Cys Phe Ile Ile Gln Ser Pro Thr Asn Gly Gln Tyr Leu His Arg50 55 60Phe His Gln Gly Gly Thr Val Asp Asp Gly Leu Ser Tyr Arg Phe Asp65 70 75 80Asn Ile Ser Gln Ala Glu Ala Ser Ala Phe Tyr Phe Lys Pro Ser Arg85 90 95Arg Gly His Phe Met Met Thr Asp Ala Asp Gly Arg Phe Phe Ala Serl00 105 110His Leu Pro Ala Glu Val Ser Ala Gly Arg Tyr Pro Gly Glu Phe Ala115 120 125Glu Trp Arg Val Asp Ala Glu Thr Ala Pro Ser Gly Glu Phe Ser Tyr130 135 140Arg Phc His Ala Val Gly Leu Asn Leu Gly Leu Arg His Asn Tyr Ser145 150 155 160Gly Gly Gly Leu Tyr Phe Phe Asp Leu Leu Asn Pro Gly Asn Asn Thr165 170 175Ser Glu Ala Ser Phe Lys Leu Val Ala Ser Asp Ala Cys Ser Ala Phe180 185 190Pro Glu Val Glu Val Asn Ala Ser Gly Asp Phe Ser Ala Leu Lys Gly195 200 205Asp Ala Ser Leu Pro Val Arg Gly Leu Val Asp Ala His Thr His Ile210 215 220Thr Ser Tyr Glu Phe Met Gly Gly Lys Met Met His Gly Lys Pro Phe225 230 235 240His Arg Trp Gly Val Thr Gln Ala Leu Asn Asp Ser Ala Val Ile His245 250 255Gly Pro Asn Gly Ser Leu Asp Leu Ile Gly Asn Leu Tyr Ser Phe Asn260 265 270Asp Ala Asn Phe Arg Tyr Asp Thr Arg Gly Trp Pro Asp Phe Pro Trp275 280 285Trp Pro Asn His Glu Gln Met Thr His Ser Gly Tyr Tyr Tyr Lys Trp
290 295 300Ile Glu Arg Ala Trp Leu Gly Gly Leu Arg Leu Met Val Thr His Leu305 310 315 320Val Glu Asn Glu Val Leu Cys Asn Ala Gln Lys Thr Ile Asn Pro Ala325 330 335Ser Trp Val Asn Pro Asn Asp Cys Asn Thr Met Asn Ser Ile Gln Leu340 345 350Gln Ile Asn Arg Leu Lys Gln Met Gln Glu Tyr Ile Asp Val Gln Ser355 360 365Gly Gly Pro Gly Lys Gly Phe Phe Arg Leu Val Ser Ser Pro Gln Glu370 375 380Ala Arg Glu Val Ile Ala Asp Gly Lys Leu Ala Val Leu Met Gly Ile385 390 395 400Glu Ala Ser Glu Leu Phe Asn Cys Gly Ile Lys Asp Asp Cys Asn Arg405 410 415Arg Gln Ile Glu Glu Gln Leu Gln Gln Val Tyr Ala Lys Gly Val Arg420 425 430Ile Leu Phe Pro Thr His Lys Phe Asp Asn Gln Leu Gly Gly Ser Val435 440 445Val Glu Asp Gly Phe Ile Asn Ile Gly Glu Val Leu Ala Thr Gly His450 455 460Phe Phe Glu Thr Gln Ala Cys Asp Ala Asp Thr Gln Gly Arg Pro Phe465 470 475 480Lys Ser Gly Phe Pro Ile Leu Gly Glu Ile Pro Val Leu Lys Asp Ile485 490 495Leu Asn Ala Val Gly Leu Asn Pro Gln Tyr Asp Glu Asn Met Leu His500 505 510Cys Asn Lys His Gly Leu Ser Glu Lys Gly Val Tyr Leu Val Asn Arg515 520 525Met Ile Asp Met Gly Met Leu Ile Glu Leu Asp His Met Ser Ala Gln530 535 540Thr Ala Thr Ser Val Met Asp Ile Val Glu Gln Arg Gln Tyr Gly Gly545 550 555 560Val Ile Thr Ser His Ser Trp Met Thr Asp Gly Thr Gln Gly Arg Leu565 570 575His Pro Asn Thr Leu Arg Leu Ala Lys Val Gly Gly Phe Met Ala Pro580 585 590Tyr Asn Ser Asn Ala Asn His Leu Gly Gly Ser Ile Asp Arg Tyr Leu595 600 605Gln Leu Ile Ala Asp Thr Pro Phe Leu Pro Gly Val Gly Leu Gly Thr610 615 620Asp Met Ser Gly Leu Gly Ala Gln Ala Gly Pro Arg Asp Asp Ala Ala625 630 635 640Thr Asn Pro Leu His Tyr Pro Phe Val Ser Glu Phe Gly Ile Gln Phe
645 650 655Glu Arg Gln Val Ser Gly Asn Arg Val Phe Asp Phe Asn Gln Asp Gly660 665 670Met Ala His Tyr Gly Met Leu Ala Asp His Leu Gln Asp Val Arg Glu675 680 685Gln Leu Gly Gly Ser Thr Tyr Glu Ala Leu Met Asn Ser Ala Glu Ala690 695 700Tyr Leu Gln Met Trp Glu Arg Ala Glu Ala His Arg Asp Glu Ala Tyr705 710 715 720Ile Asn Pro Leu Pro Thr Tyr Val Arg Ile Val Asn Arg Ala Ser Asp725 730 735Lys Cys Met Asp Ile Pro Gly Asn Gly Ser Asp Met Val Asn Gly Thr740 745 750Asp Val Ile Leu Tyr Asp Cys Glu Arg Asp Ala Trp Asp Gln Arg Trp755 760 765Ser Phe Asp Ala Asp Lys Arg Met Phe Ser Asn Lys Ala Asn Pro Ser770 775 780Leu Cys Leu Asp Asn Arg Gly Gln Ala Tyr Asn Glu Gly Glu Ile Val785 790 795 800Val Trp Glu Cys Val Asp Ser Asp Asn Leu Arg Trp Asp Tyr Asp Gly805 810 815Arg Phe Ile Arg Ser Ala His Asp Ala Asn Ile Val Ala Asp Ala Tyr820 825 830Gly Arg Gly Asn Asp Ala Gln Val Gly Gln Trp Gln Phe His Gly Gly835 840 845Ala Asn Gln Gln Trp Leu Leu Arg Pro Glu Met Thr Ile His Arg Trp850 855 860Val Ser Leu Arg Asp Lys Arg Ala Gly Leu Cys Ile Ser Ala Pro Glu865 870 875 880Gln Ala Gln Ser Gly Ser Leu Val Asn Leu Asp Asn Cys Ser Asn Arg885 890 895Gln Gly Gln Lys Trp Tyr Phe Asp Pro Ile Lys Gly Ser Ile Lys Leu900 905 910Ala Gly Asp Ala Gly Leu Cys Leu His Ile Pro Gly Gly Asn Thr Gln915 920 925Asp His Ser Gln Leu Ala Leu Ala Pro Cys Asp Ala Ser Asn Pro Ala930 935 940Gln Ala Phe Asp Lys Asp Gly Ser Val Phe Ser Ser Arg Met Ala Pro945 950 955 960Asn Gln Val Leu Asp Ala Ser Gly Glu Gln Ala Gly Ala Ala Leu Ile965 970 975Leu Tyr His His His Gly Asp Ser Asn Gln Lys Trp Lys Ser Ser Leu980 985 990
<210>15<211>2976<212>DNA<213>海藻希瓦氏菌<400>15atgaaaaagc taatcggaca tggagattgg cccagtgcca aaagtctgtt ctctgccctg 60atccccggcc tgtttacgct gggaacccta cccctagctg cagctgaaac gcaaaccacc 120caggcggtcg acagcctggc gcagcaatgt tttattattc aatcgccaac caatggccag 180tatctgcatc gcttccatca gggaggcact gtggatgatg gtctgagtta tcgtttcgat 240aatatcagcc aggccgaggc cagtgcgttt tacttcaaac ccagtcgccg cggtcatttt 300atgatgacag acgcagatgg ccgcttcttt gccagccatc tgccggccga agtcagcgcc 360ggtcgttacc cgggggaatt tgccgagtgg cgggttgacg ccgaaacagc accatccggt 420gaattcagtt atcgctttca cgccgtgggc ctcaatctgg gactcaggca caactacagc 480ggcggaggct tgtatttctt cgatctgctc aaccctggaa acaacacttc agaggcaagc 540ttcaagctgg ttgccagtga cgcctgcagc gcgtttcccg aggttgaagt caatgccagt 600ggtgatttct ccgccctgaa aggcgatgct tcactgccgg tgcggggtct ggtcgatgcc 660cacacccata tcacctcgta tgagtttatg ggcggcaaga tgatgcatgg caagccgttc 720caccgctggg gggtgaccca ggcgttgaac gacagtgcgg tgatccatgg gccgaatggc 780tcactggatc tcatcggcaa tctctactcc ttcaacgacg ccaacttccg ctatgacacc 840cgaggctggc cggacttccc ctggtggccc aatcacgagc agatgaccca ctcaggttac 900tactacaagt ggattgagcg cgcctggcta ggcggtttgc gcctgatggt cacccatctg 960gtggaaaacg aggtgttgtg caacgcccag aaaaccatca atcccgccag ttgggtcaac 1020cccaacgact gtaacaccat gaacagcatt cagttgcaga ttaaccgtct caagcaaatg 1080caggagtata ttgatgtgca gtccggcggc cccggcaaag gcttcttccg cctggtgtcc 1140tcgcctcaag aggctcgcga ggtcattgcc gacggcaagc tggcggtgct gatgggcata 1200gaggcctcag agctgttcaa ctgcggtatc aaggatgatt gcaaccgccg ccagattgaa 1260gagcaactgc agcaagttta tgccaagggg gtgagaatcc tgttcccgac ccacaagttc 1320gataaccaac tgggcggctc agtggtggaa gacggcttta tcaatatcgg tgaagtcttg 1380gcgacgggcc atttctttga aacccaggcc tgcgacgccg acacccaggg cagaccattc 1440aagtccggtt tccccatttt gggcgaaatc ccagtgctca aggatattct caatgccgtg 1500ggtctcaatc cccagtacga cgagaacatg ctgcactgca acaagcatgg cttgtccgaa 1560aaaggcgtct acctggttaa ccgcatgata gatatgggaa tgttgataga attggatcat 1620atgtcggcac aaaccgccac cagtgtgatg gatattgtcg agcagcgcca atatggcggg 1680gtgatcacca gccacagctg gatgactgat ggcacccaag gcagactgca ccccaacacc 1740ctgcgcctgg ccaaggtcgg cggttttatg gcgccctaca acagtaacgc caaccatctt 1800ggaggcagta ttgatagata cctgcagttg atagccgata ctccttttct gccgggtgtc 1860ggcctgggaa ccgatatgag tggcctcggc gctcaggccg gtcccagaga cgatgcggcc 1920actaatccac tgcactaccc cttcgtcagt gagttcggta tccagtttga gcgtcaggta 1980tcggggaatc gtgtatttga cttcaatcag gatggcatgg cccattacgg tatgctggct 2040gatcatctgc aggatgtgcg cgagcagctt ggcggcagta cctatgaagc cttgatgaac 2100tcggccgaag cctatctgca gatgtgggag cgcgcagaag cccacaggga tgaagcctat 2160atcaatccac tgccgaccta tgtgcggata gtcaaccgcg cctcggacaa gtgtatggat 2220attccgggta atggcagcga tatggtcaat ggcacagatg tgatcctcta tgattgtgaa 2280
cgcgacgcct gggatcaacg ctggagcttt gatgccgaca aacgcatgtt cagcaacaaa 2340gccaatccat ccttgtgttt ggacaatcgc ggtcaggcct acaatgaagg cgaaatcgtg 2400gtatgggagt gtgtcgacag cgacaatctg cgttgggatt atgacggccg ctttattcgc 2460agtgcccatg acgccaatat agtggccgac gcctatggcc gtggcaacga tgcccaagtg 2520ggtcaatggc aatttcatgg cggcgccaac cagcaatggt tgctcaggcc tgagatgact 2580attcaccgct gggtcagttt gcgggataaa cgtgccgggc tatgtatcag cgctcccgaa 2640caggcccaaa gcggcagcct ggtgaacctg gacaactgca gcaaccgtca ggggcaaaaa 2700tggtacttcg atccgataaa aggcagtatc aaactggctg gtgacgcggg actgtgcctg 2760cacattccgg gtggcaatac ccaggatcat agccagttgg cactggcgcc ctgcgatgct 2820tccaatccgg ctcaggcatt cgataaagac ggcagcgtgt tctcaagccg aatggcaccc 2880aatcaggtgc ttgatgcctc gggagaacaa gccggcgcgg ctctgatcct ctaccaccac 2940catggcgaca gtaatcagaa gtggaagtcc agcctc 2976<210>16<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明用于擴增SCDase基因的引物<400>16gacgctagca tgaaaaagct aatcggacat 30<210>17<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明用于擴增SCDase基因的引物<400>17cttctcgaga ggaggctgga cttccacttc tg32<210>18<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明用于擴增SCDase基因的引物<400>18
gtgctcgagg tgggcttctg cgcgctccca 30<210>19<211>2031<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明3′末端截斷的SCDase基因<220>
<223>相應(yīng)于序列2中的1-2031號堿基的序列<400>19accacccagg cggtcgacag cctggcgcag caatgtttta ttattcaatc gccaaccaat 60ggccagtatc tgcatcgctt ccatcaggga ggcactgtgg atgatggtct gagttatcgt 120ttcgataata tcagccaggc cgaggccagt gcgttttact tcaaacccag tcgccgcggt 180cattttatga tgacagacgc agatggccgc ttctttgcca gccatctgcc ggccgaagtc 240agcgccggtc gttacccggg ggaatttgcc gagtggcggg ttgacgccga aacagcacca 300tccggtgaat tcagttatcg ctttcacgcc gtgggcctca atctgggact caggcacaac 360tacagcggcg gaggcttgta tttcttcgat ctgctcaacc ctggaaacaa cacttcagag 420gcaagcttca agctggttgc cagtgacgcc tgcagcgcgt ttcccgaggt tgaagtcaat 480gccagtggtg atttctccgc cctgaaaggc gatgcttcac tgccggtgcg gggtctggtc 540gatgcccaca cccatatcac ctcgtatgag tttatgggcg gcaagatgat gcatggcaag 600ccgttccacc gctggggggt gacccaggcg ttgaacgaca gtgcggtgat ccatgggccg 660aatggctcac tggatctcat cggcaatctc tactccttca acgacgccaa cttccgctat 720gacacccgag gctggccgga cttcccctgg tggcccaatc acgagcagat gacccactca 780ggttactact acaagtggat tgagcgcgcc tggctaggcg gtttgcgcct gatggtcacc 840catctggtgg aaaacgaggt gttgtgcaac gcccagaaaa ccatcaatcc cgccagttgg 900gtcaacccca acgactgtaa caccatgaac agcattcagt tgcagattaa ccgtctcaag 960caaatgcagg agtatattga tgtgcagtcc ggcggccccg gcaaaggctt cttccgcctg 1020gtgtcctcgc ctcaagaggc tcgcgaggtc attgccgacg gcaagctggc ggtgctgatg 1080ggcatagagg cctcagagct gttcaactgc ggtatcaagg atgattgcaa ccgccgccag 1140attgaagagc aactgcagca agtttatgcc aagggggtga gaatcctgtt cccgacccac 1200aagttcgata accaactggg cggctcagtg gtggaagacg gctttatcaa tatcggtgaa 1260gtcttggcga cgggccattt ctttgaaacc caggcctgcg acgccgacac ccagggcaga 1320ccattcaagt ccggtttccc cattttgggc gaaatcccag tgctcaagga tattctcaat 1380gccgtgggtc tcaatcccca gtacgacgag aacatgctgc actgcaacaa gcatggcttg 1440tccgaaaaag gcgtctacct ggttaaccgc atgatagata tgggaatgtt gatagaattg 1500gatcatatgt cggcacaaac cgccaccagt gtgatggata ttgtcgagca gcgccaatat 1560ggcggggtga tcaccagcca cagctggatg actgatggca cccaaggcag actgcacccc 1620aacaccctgc gcctggccaa ggtcggcggt tttatggcgc cctacaacag taacgccaac 1680catcttggag gcagtattga tagatacctg cagttgatag ccgatactcc ttttctgccg 1740ggtgtcggcc tgggaaccga tatgagtggc ctcggcgctc aggccggtcc cagagacgat 1800
gcggccacta atccactgca ctaccccttc gtcagtgagt tcggtatcca gtttgagcgt 1860caggtatcgg ggaatcgtgt atttgacttc aatcaggatg gcatggccca ttacggtatg 1920ctggctgatc atctgcagga tgtgcgcgag cagcttggcg gcagtaccta tgaagccttg 1980atgaactcgg ccgaagccta tctgcagatg tgggagcgcg cagaagccca c 2031<210>20<211>677<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明C-末端截斷的SCDase<220>
<223>相應(yīng)于序列1中第1-667號堿基的序列<400>20Thr Thr Gln Ala Val Asp Ser Leu Ala Gln Gln Cys Phe Ile Ile Gln1 5 10 15Ser Pro Thr Asn Gly Gln Tyr Leu His Arg Phe His Gln Gly Gly Thr20 25 30Val Asp Asp Gly Leu Ser Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Ser Gln Ala Glu35 40 45Ala Ser Ala Phe Tyr Phe Lys Pro Ser Arg Arg Gly His Phe Met Met50 55 60Thr Asp Ala Asp Gly Arg Phe Phe Ala Ser His Leu Pro Ala Glu Val65 70 75 80Ser Ala Gly Arg Tyr Pro Gly Glu Phe Ala Glu Trp Arg Val Asp Ala85 90 95Glu Thr Ala Pro Ser Gly Glu Phe Ser Tyr Arg Phe His Ala Val Gly100 105 110Leu Asn Leu Gly Leu Arg His Asn Tyr Ser Gly Gly Gly Leu Tyr Phe115 120 125Phe Asp Leu Leu Asn Pro Gly Asn Asn Thr Ser Glu Ala Ser Phe Lys130 135 140Leu Val Ala Ser Asp Ala Cys Ser Ala Phe Pro Glu Val Glu Val Asn145 150 155 160Ala Ser Gly Asp Phe Ser Ala Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu Pro Val165 170 175Arg Gly Leu Val Asp Ala His Thr His Ile Thr Ser Tyr Glu Phe Met180 185 190Gly Gly Lys Met Met His Gly Lys Pro Phe His Arg Trp Gly Val Thr195 200 205Gln Ala Leu Asn Asp Ser Ala Val Ile His Gly Pro Asn Gly Ser Leu
210 2l5 220Asp Leu Ile Gly Asn Leu Tyr Ser Phe Asn Asp Ala Asn Phe Arg Tyr225 230 235 240Asp Thr Arg Gly Trp Pro Asp Phe Pro Trp Trp Pro Asn His Glu Gln245 250 255Met Thr His Ser Gly Tyr Tyr Tyr Lys Trp Ile Glu Arg Ala Trp Leu260 265 270Gly Gly Leu Arg Leu Met Val Thr His Leu Val Glu Asn Glu Val Leu275 280 285Cys Asn Ala Gln Lys Thr Ile Asn Pro Ala Ser Trp Val Asn Pro Asn290 295 300Asp Cys Asn Thr Met Asn Ser Ile Gln Leu Gln Ile Asn Arg Leu Lys305 310 315 320Gln Met Gln Glu Tyr Ile Asp Val Gln Ser Gly Gly Pro Gly Lys Gly325 330 335Phe Phe Arg Leu Val Ser Ser Pro Gln Glu Ala Arg Glu Val Ile Ala340 345 350Asp Gly Lys Leu Ala Val Leu Met Gly Ile Glu Ala Ser Glu Leu Phe355 360 365Asn Cys Gly Ile Lys Asp Asp Cys Asn Arg Arg Gln Ile Glu Glu Gln370 375 380Leu Gln Gln Val Tyr Ala Lys Gly Val Arg Ile Leu Phe Pro Thr His385 390 395 400Lys Phe Asp Asn Gln Leu Gly Gly Ser Val Val Glu Asp Gly Phe Ile405 410 415Asn Ile Gly Glu Val Leu Ala Thr Gly His Phe Phe Glu Thr Gln Ala420 425 430Cys Asp Ala Asp Thr Gln Gly Arg Pro Phe Lys Ser Gly Phe Pro Ile435 440 445Leu Gly Glu Ile Pro Val Leu Lys Asp Ile Leu Asn Ala Val Gly Leu450 455 460Asn Pro Gln Tyr Asp Glu Asn Met Leu His Cys Asn Lys His Gly Leu465 470 475 480Ser Glu Lys Gly Val Tyr Leu Val Asn Arg Met Ile Asp Met Gly Met485 490 495Leu Ile Glu Leu Asp His Met Ser Ala Gln Thr Ala Thr Ser Val Met500 505 510Asp Ile Val Glu Gln Arg Gln Tyr Gly Gly Val Ile Thr Ser His Ser515 520 525Trp Met Thr Asp Gly Thr Gln Gly Arg Leu His Pro Asn Thr Leu Arg530 535 540Leu Ala Lys Val Gly Gly Phe Met Ala Pro Tyr Asn Ser Asn Ala Asn545 550 555 560His Leu Gly Gly Ser Ile Asp Arg Tyr Leu Gln Leu Ile Ala Asp Thr
565 570 575Pro Phe Leu Pro Gly Val Gly Leu Gly Thr Asp Met Ser Gly Leu Gly580 585 590Ala Gln Ala Gly Pro Arg Asp Asp Ala Ala Thr Asn Pro Leu His Tyr595 600 605Pro Phe Val Ser Glu Phe Gly Ile Gln Phe Glu Arg Gln Val Ser Gly610 615 620Asn Arg Val Phe Asp Phe Asn Gln Asp Gly Met Ala His Tyr Gly Met625 630 635 640Leu Ala Asp His Leu Gln Asp Val Arg Glu Gln Leu Gly Gly Ser Thr645 650 655Tyr Glu Ala Leu Met Asn Ser Ala Glu Ala Tyr Leu Gln Met Trp Glu660 665 670Arg Ala Glu Ala His67權(quán)利要求
1.從下述(a)～(c)選擇出的多肽，而且是具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶活性的多肽(a)具有序列20所示氨基酸序列或其一部分序列的多肽；(b)由具有在序列20所示氨基酸序列中至少缺失、附加、插入或轉(zhuǎn)換一個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的多肽；以及(c)與序列20所示氨基酸序列至少有25％序列同一性的多肽。
2.從下述(A)～(H)中選擇出的核酸，而且是編碼具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯牡暮怂?；(A)編碼具有序列20所示氨基酸序列或其一部分序列的多肽的核酸；(B)編碼由具有在序列20表示的氨基酸序列中至少缺失、附加、插入或轉(zhuǎn)換一個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的多肽的核酸；(C)編碼與序列20所示氨基酸序列至少有25％序列同一性的多肽的核酸；(D)具有序列19所示堿基序列或其一部分序列的核酸；(E)具有在序列19所示堿基序列中至少缺失、附加、插入或轉(zhuǎn)換一個堿基的堿基序列的核酸；(F)在嚴格條件下能與上述(A)～(F)任一項記載的核酸或其互補鏈雜交的核酸；(G)具有由于簡并而與上述(A)～(F)任一項記載的核酸不同的堿基序列的核酸；以及(H)具有與上述(A)～(G)任一項記載的核酸的堿基序列至少有17％序列同一性的堿基序列的核酸；
3.含有權(quán)利要求2記載的核酸的重組DNA。
4.攜帶權(quán)利要求2記載的核酸或權(quán)利要求3記載的重組DNA的轉(zhuǎn)化體。
5.具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶活性的多肽的制造方法，其特征是在適于鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；副磉_的條件下對權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)化體進行培養(yǎng)，然后從得到培養(yǎng)物中提取具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯?。
6.可在嚴格條件下能與權(quán)利要求2記載的核酸雜交的寡核苷酸探針或引物，
7.由至少連續(xù)15個核苷酸構(gòu)成的權(quán)利要求6記載的寡核苷酸探針或引物。
8.編碼具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯牡暮怂岬臋z測方法，其特征是使含有核酸的被檢測樣品與權(quán)利要求6或7記載的寡核苷酸探針接觸，然后對核酸與寡核苷酸探針的雜化體進行檢測。
9.編碼具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯牡暮怂岬臋z測方法，其特征是以含有核酸的被檢測樣品作為模板樣品，使用權(quán)利要求6或7記載的引物進行核酸擴增。
10.包含權(quán)利要求6或7記載的寡核苷酸探針和/或引物在內(nèi)的，用于檢測編碼具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯牡暮怂岬脑噭┖?。
11.可以特異地與權(quán)利要求1記載的多肽結(jié)合的抗體或其片段，
12.具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯牡臋z測方法，其特征是使含有多肽的被檢測樣品與權(quán)利要求11記載的抗體或其片段接觸，對多肽與抗體或其片段的復(fù)合物進行檢測。
13.包含權(quán)利要求11記載的抗體或其片段的，用于檢測具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰基酶活性的多肽的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及到具有鞘脂神經(jīng)酰胺脫?；富钚缘亩嚯?、編碼該多肽的核酸、含有該核酸的重組DNA、帶有該核酸或該重組DNA的導(dǎo)入細胞用載體、帶有該核酸或該重組DNA的轉(zhuǎn)化體的該多肽的制造方法，針對該核酸的寡核苷酸探針或引物、使用該探針或引物的該核酸的檢測方法及其試劑盒、針對該多肽的抗體或其片段、使用該抗體或其片段的該多肽的檢測方法及其試劑盒。本發(fā)明可用于鞘脂工程、神經(jīng)系統(tǒng)疾病(例如神經(jīng)變性疾病)、白血病、創(chuàng)傷等疾病的治療。
文檔編號C07K16/40GK1527878SQ0181946
公開日2004年9月8日 申請日期2001年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月26日
發(fā)明者伊東信, 古里正子, 末吉紀行, 子, 行 申請人:寶生物工程株式會社