抗磷脂酶A2受體抗體IgG試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種定量檢測(cè)人血清、血漿中抗磷脂酶A2受 體抗體IgG的酶聯(lián)免疫分析試劑盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 膜性腎病按發(fā)病原因可分為特發(fā)性和繼發(fā)性膜性腎病，其診斷上要依靠臨床表 現(xiàn)，腎臟穿刺術(shù)的組織學(xué)檢查或腎組織電鏡檢查。腎臟穿刺術(shù)是一種侵入式的診斷方法，對(duì) 病人有一定的傷害;腎組織電鏡檢測(cè)對(duì)設(shè)備要求很高，難以普及使用。2009年國(guó)外首次報(bào)道 了特發(fā)性膜性腎病的自身免疫基質(zhì)，其實(shí)質(zhì)是自身抗體與磷脂酶A2受體反應(yīng)的結(jié)果。磷脂 酶A2受體是在人腎小球足細(xì)胞表面表達(dá)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞中磷脂酶的結(jié)合過(guò)程。目前已經(jīng)確 認(rèn)了磷脂酶A2受體是自身抗體的主要靶抗原，研究發(fā)現(xiàn)約75%的特發(fā)性膜性腎病患者可以 通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)檢出抗PLA2R抗體，國(guó)內(nèi)也有文獻(xiàn)顯示在國(guó)人中檢測(cè)陽(yáng)性率更高，達(dá)到 82%，而繼發(fā)性膜性腎病及其他類型腎小球疾病患者的檢出率很低，健康人群均為陰性。血 清學(xué)PLA2R抗體的定量檢測(cè)可以為特發(fā)性膜性腎病的初篩和病情監(jiān)測(cè)提供輔助作用。因此， 開(kāi)發(fā)非創(chuàng)傷、低風(fēng)險(xiǎn)、安全、廉價(jià)、精確和快速的PLA2R定量測(cè)定試劑盒有極其重要的意義。
[0003] 目前報(bào)道的抗磷脂酶A2受體抗體檢測(cè)技術(shù)主要有免疫印跡法、間接免疫熒光法和 時(shí)間分辨熒光法。免疫印跡法還在實(shí)驗(yàn)室研究階段，主要在進(jìn)行與組織病理學(xué)檢測(cè)方法的 對(duì)比試驗(yàn)研究，方法的靈敏度、特異性相對(duì)較低；間接免疫熒光法，其采用轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為 基質(zhì)檢測(cè)抗磷脂酶A2受體抗體，陽(yáng)性樣本的結(jié)果有熒光出現(xiàn)，陰性則無(wú)，屬于定性檢測(cè)方 法，不能精確的進(jìn)行不同階段的抗體滴度定量比較;時(shí)間分辨熒光法相對(duì)較復(fù)雜，需要時(shí)間 分辨熒光的專門(mén)檢測(cè)儀器，試劑成本高，正處于研究階段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，為了提高磷脂酶A2受體抗體檢測(cè)的靈敏度、特異性，能夠定量檢測(cè)且試 劑成本低，簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便的方法，本發(fā)明提供一種抗磷脂酶A2受體抗體IgG試劑盒及檢測(cè) 方法。
[0005] 本發(fā)明是基于免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)，能夠檢測(cè)人血清、血漿樣本中的磷脂酶A2受 體抗體IgG的含量，其測(cè)定原理是利用重組的磷脂酶A2受體抗原包被微孔板，用含0.5-5% 的BSA封閉液封閉，干燥，然后分別加入校準(zhǔn)品和樣品，其中抗磷脂酶A2受體抗體IgG與包被 在微孔板的抗原特異性結(jié)合，未結(jié)合的成分跟過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗人IgG抗體，進(jìn) 行第二次結(jié)合反應(yīng)，結(jié)果洗滌去除過(guò)量的HRP標(biāo)記的抗人IgG抗體，加入3，3'，5，5'-四甲基 聯(lián)苯胺(TMB)，在HRP的催化下顯色，最后加入終止劑，顯色的深淺與樣品中的待測(cè)物含量成 比例，在酶標(biāo)儀上進(jìn)行450/630nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)。按照校準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的0D值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可由 標(biāo)準(zhǔn)曲線算出各樣本中抗磷脂酶A2受體抗體I gG的濃度值。
[0006] 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，其原理是酶分子與抗體或抗抗體共價(jià)結(jié)合，酶標(biāo)記抗 體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。加入底物液后，底物可在酶作用 下使其所含的供氫體由無(wú)色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過(guò)底物 的顏色反應(yīng)來(lái)判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈 正比。此種顯色反應(yīng)可通過(guò)ELISA檢測(cè)儀進(jìn)行定量測(cè)定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗 原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來(lái)，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測(cè)方法。ELISA法 對(duì)試劑的要求低，成本低，且能夠定量檢測(cè)，作為一種靈敏度高，可定量，能夠替代價(jià)格昂貴 的進(jìn)口試劑和其他復(fù)雜的檢測(cè)系統(tǒng)而言，是一種臨床實(shí)驗(yàn)室理想的檢測(cè)方法。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題，所采用的技術(shù)方案是提供一種抗磷脂酶A2受體抗體IgG 試劑盒及檢測(cè)方法，所述抗磷脂酶A2受體抗體IgG試劑盒內(nèi)設(shè)置有預(yù)包被重組人磷脂酶A2 受體抗原的微孔板，以及瓶裝的以下試劑:一組抗磷脂酶A2受體抗體IgG校準(zhǔn)品，陽(yáng)性對(duì)照， 陰性對(duì)照，濃縮洗滌液，樣本稀釋液，酶標(biāo)液，底物液和終止液。
[0008] 試劑盒各組分制備方法如下：
[0009] 預(yù)包被抗原微孔板的制備：將重組的人磷脂酶A2受體全分子或其片段，用濃度 0.05mol/L，pH9.6的碳酸鹽緩沖液按1:50-1:1000稀釋，所述碳酸鹽緩沖液含0.159g Na2C03,0.293g NaHC03和1000ml H20,按照每孔100μΙ包被，在4°C過(guò)夜包被。之后棄去包被 液，洗滌3次，每孔再加入150μ1的穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑是磷酸鹽緩沖液或Tris緩沖液基質(zhì)， 其中含0.5-5 %的BSA或酪蛋白，0.1-5 %的蔗糖或海藻糖，0.01-0.5 %的Procl in300，室溫 孵育15min-4h，棄去穩(wěn)定劑，干燥，放入鋁箱袋封口后4°C保存。
[0010]所述抗磷脂酶A2受體抗體IgG校準(zhǔn)品是由校準(zhǔn)品稀釋液與抗磷脂酶A2受體抗體 IgG陽(yáng)性血清配制而成，各校準(zhǔn)品濃度分別為2RU/ml、20RU/ml、80RU/ml、400RU/ml、1600RU/ ml，每瓶中分裝lml。
[0011] 所述陽(yáng)性對(duì)照是由質(zhì)控品稀釋液與抗磷脂酶A2受體抗體IgG陽(yáng)性血清配制而成； 陰性對(duì)照是由質(zhì)控品稀釋液與抗磷脂酶A2受體抗體IgG陰性血清配制而成。
[0012] 所述濃縮洗滌液的配制：按每升水中，12.11g三羥甲基氨基甲烷(Tris)，5ml的吐 溫20,調(diào)pH 7.8,定容1L，即濃縮洗滌液。
[0013] 所述樣本稀釋液的配制：按每升水中，1.21g三羥甲基氨基甲烷(Tris)，0.02-2g的 牛血清白蛋白（BSA)，0.5ml的吐溫20，調(diào)pH 7.8，定容1L，即樣本稀釋液。
[0014]所述酶標(biāo)液是由酶標(biāo)記的抗人IgG抗體與酶標(biāo)稀釋液按合適濃度配制而成。所述 的酶為辣根過(guò)氧化物酶(HRP);根據(jù)所選用的酶標(biāo)類型，底物為3,3' 四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)顯色底物。終止液為0.25-2mol/L的硫酸或氫氧化鈉。我們優(yōu)選的終止液為lmol/L的 硫酉支。
[0015] -種抗磷脂酶A2受體抗體IgG的檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0016] ①樣本孵育:在預(yù)包被人磷脂酶A2受體抗原的微孔板的微孔內(nèi)分別加入一組校準(zhǔn) 品，陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照，以及稀釋后的待測(cè)樣本各100μΙ，室溫孵育30分鐘；
[0017] ②一次洗滌:甩掉反應(yīng)液，每孔用300μ1稀釋10倍的濃縮洗滌液洗3次，拍干；
[0018] ⑧酶結(jié)合物孵育:在預(yù)包被人磷脂酶Α2受體抗原的微孔板的每個(gè)微孔內(nèi)加入酶標(biāo) 液100μΙ，室溫孵育30分鐘；
[0019] ④二次洗滌:甩掉反應(yīng)液，每孔用300μ1稀釋10倍的濃縮洗滌液洗3次，拍干；
[0020] ⑤底物孵育：在預(yù)包被人磷脂酶Α2受體抗原的微孔板的每個(gè)微孔內(nèi)加入底物液 100μΙ，室溫孵育10分鐘；
[0021]⑥終止:在預(yù)包被人磷脂酶A2受體抗原的微孔板的每個(gè)微孔內(nèi)加入終止液lOOul， 混勻；
[0022]⑦讀值:加入終止液30分鐘內(nèi)將微孔板至于酶標(biāo)儀上，用450/630nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)得 到各樣本的0D值;按照校準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的0D值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣本的0D值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算 得到樣本中抗磷脂酶A2受體抗體IgG的濃度值。
[0023]有益效果:本發(fā)明是對(duì)抗磷脂酶A2受體抗體IgG進(jìn)行定量檢測(cè)，量值更易于臨床上 的應(yīng)用，便于比較治療前后，病程周期病情的變化，定量?jī)?yōu)于定性的方法。另外，幾乎所有類 型的醫(yī)院都有ELI SA試劑配套使用的酶標(biāo)儀，容易推廣使用，能夠解決目前臨床的迫切需 求;另外相比其他復(fù)雜的檢測(cè)系統(tǒng)而言，操作便利，是一種臨床實(shí)驗(yàn)室理想的檢測(cè)方法。同 時(shí)，ELISA法對(duì)試劑的要求低，成本低，能夠替代價(jià)格昂貴的進(jìn)口試劑，降低檢測(cè)成本。該試 劑盒非創(chuàng)傷、低風(fēng)險(xiǎn)、安全、廉價(jià)、精確和快速的定量檢測(cè)血清、血漿和全血中的PLA2R抗體 含量，可以為特發(fā)性膜性腎病的初篩和病情監(jiān)測(cè)提供輔助作用。
[0024]以下將結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行較為詳細(xì)的說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1為本發(fā)明經(jīng)典的校準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 本發(fā)明公開(kāi)了 一種定量檢測(cè)人血清、血漿中抗磷脂酶A2受體抗體IgG的酶聯(lián)免疫 分析試劑盒及檢測(cè)方法，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特 別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都 被視為包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已通過(guò)較佳實(shí)例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯 能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組 合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0027] 本發(fā)明提供抗磷脂酶A2受體抗體IgG酶聯(lián)免疫分析試劑盒及檢測(cè)方法中所用的生 物材料及試劑均可由市場(chǎng)購(gòu)得。
[0028] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0029] 一、包被微孔板的制備方法：
[0030]利用重組的人磷脂酶A2受體全分子或其片段，用濃度0.05mol/L，pH9.6的碳酸鹽 緩沖液按1: 50-1:1000稀釋，其中，碳酸鹽緩沖液由0.159g Na2C03，0.293g NaHC03和 1000ml H20配置而成，每孔加入100μΙ稀釋后的重組的人磷脂酶A2受體全分子或其片段進(jìn) 行包被，在4°C過(guò)夜包被。之后棄去包被液，洗滌3次，之后每孔再加入150μ1的穩(wěn)定劑，所述 穩(wěn)定劑是磷酸鹽緩沖液或Tris緩沖液基質(zhì)，其中含0.5-5 %的BSA或酪蛋白，0.1-5 %的蔗糖 或海藻糖，〇. 01-0.5 %的Procl in300，室溫孵育15min-4h，棄去穩(wěn)定劑，干燥，放入鋁箱袋封 口后4°C保存。
[0031] 二、抗磷脂酶A2受體抗體IgG校準(zhǔn)品制備方法：
[0032] 取臨床上的陽(yáng)性標(biāo)本，經(jīng)鑒定未檢測(cè)出傳染源的樣本，多支混合，滅活、過(guò)濾、分 裝，-40°C以下深冷保存。根據(jù)GB/T 21415-2008國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(體外診斷醫(yī)療器械生物樣品中量 的測(cè)量校準(zhǔn)品和控制物質(zhì)賦值的計(jì)量學(xué)溯源性)并結(jié)合臨床實(shí)踐確定了校準(zhǔn)曲線的濃度點(diǎn) 分別為2冊(cè)/1111、20肋/1111、80肋/1111、400肋/1111、16001?1]