/1111(肋/1111中的肋為1^16衍￥6 1]11行即 相對單位）。在制備每一批校準(zhǔn)品時(shí)候，分別用校準(zhǔn)品稀釋液按照1:10-500倍稀釋即可。 [0033]三、陽性對照與陰性對照的制備方法：
[0034]取臨床上的陽性標(biāo)本，經(jīng)鑒定未檢測出傳染源的樣本，多支混合，滅活、過濾、分 裝，-40°C以下深冷保存。根據(jù)GB/T 21415-2008國家標(biāo)準(zhǔn)(體外診斷醫(yī)療器械生物樣品中量 的測量校準(zhǔn)品和控制物質(zhì)賦值的計(jì)量學(xué)溯源性)確定陽性對照的靶值范圍，在每一批制備 時(shí)，直接用陽性對照稀釋液按照1:10-500倍稀釋即可。
[0035]取健康人的標(biāo)本，經(jīng)鑒定未檢測出傳染源的樣本，多支混合，滅活、過濾、分裝，-40 °C以下深冷保存，確定為陰性對照。在每一批制備時(shí)，直接用陽性對照稀釋液按照1:10-500 倍稀釋即可。
[0036]四、酶標(biāo)液與終止液的制備方法：
[0037]將商品化的HRP標(biāo)記的抗人IgG抗體按照經(jīng)過滴配試驗(yàn)確定了工作濃度的比例，用 酶標(biāo)稀釋液稀釋后，分裝即可。終止液為〇. 25-5m〇 1/L硫酸配制而成，分裝即可。
[0038]五、校準(zhǔn)曲線的繪制方法：
[0039] 按照以校準(zhǔn)品的濃度值為橫坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo)），以各濃度校準(zhǔn)品的0D值為縱坐標(biāo)， 繪制半對數(shù)校準(zhǔn)曲線，經(jīng)典的校準(zhǔn)曲線如圖1所示。
[0040] 所述陽性對照和陰性對照是對校準(zhǔn)品的校準(zhǔn)曲線質(zhì)控的作用，如果從校準(zhǔn)曲線中 求出的陽性對照的值在陽性對照的靶值范圍內(nèi)，求出的陰性對照的值也在陰性對照的靶值 范圍內(nèi)，則校準(zhǔn)曲線可以用于定量檢測;若陽性對照或陰性對照有一個計(jì)算結(jié)果不在相應(yīng) 的靶值范圍內(nèi)，則本次試驗(yàn)無效，需要重新試驗(yàn)，建立校準(zhǔn)曲線。
[0041] 六、抗磷脂酶A2受體抗體IgG酶聯(lián)免疫分析試劑盒的檢測步驟：
[0042]①樣本孵育:在預(yù)包被人磷脂酶A2受體抗原的微孔板的微孔內(nèi)分別加入2RU/ml、 20RU/ml、80RU/ml、400RU/ml、1600RU/ml校準(zhǔn)品，陽性對照與陰性對照各100μΙ，以及稀釋后 的待測樣本各1〇〇μ1，室溫孵育30分鐘；
[0043]②一次洗滌:甩掉反應(yīng)液，每孔用300μ1洗滌液洗3次，拍干；
[0044]⑧酶結(jié)合物孵育:在預(yù)包被人磷脂酶Α2受體抗原的微孔板的每個微孔內(nèi)加入酶標(biāo) 液100μΙ，室溫孵育30分鐘；
[0045]④二次洗滌:甩掉反應(yīng)液，再每孔用300μ1磷酸鹽漂洗液洗3次，拍干；
[0046]⑤底物孵育：在預(yù)包被人磷脂酶Α2受體抗原的微孔板的每個微孔內(nèi)加入底物液 100μ1，室溫孵育10分鐘；
[0047]⑥終止:在預(yù)包被人磷脂酶Α2受體抗原的微孔板的每個微孔內(nèi)加入終止液100ul， 混勻；
[0048]⑦讀值:加入終止液30分鐘內(nèi)將微孔板至于酶標(biāo)儀上，用450/630nm雙波長檢測得 到各樣本的0D值;按照校準(zhǔn)品對應(yīng)的0D值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣本的0D值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算 得到樣本中抗磷脂酶A2受體抗體IgG的濃度值。
[0049] 七、試劑盒性能指標(biāo)測定
[0050] 1、檢獅艮
[0051] 用5%牛血清白蛋白溶液作為空白樣本，在一次運(yùn)行中將空白樣本重復(fù)測定20次。 20次平均值為0.27RU/ml，標(biāo)準(zhǔn)差為0.04RU/ml。以空白均值加兩倍標(biāo)準(zhǔn)差報(bào)告方法的檢測 限，本試劑盒的檢測限為0.35RU/ml。
[0052] 2、參考范圍
[0053]該抗體過高有病理意義，過低無病理意義，參考值為正常值上限，故本試劑盒的正 常值范圍采用單側(cè)范圍。檢測了 208例健康體檢者血清，平均值為3.8RU/ml，標(biāo)準(zhǔn)差為 3. IRU/ml。由于樣本檢測數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，本試劑盒采用正態(tài)分布法，推算參考范圍。即 以平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差為檢測含量的正常參考范圍上限，故確定正常參考值為0-13. IRU/ml。
[0054] 3、特異性
[0055] 選取類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人的血清、甲狀腺炎病人血清、干燥綜合癥病人血清各4份， 結(jié)果均在正常參考范圍內(nèi)。
[0056] 4、精密度
[0057]批內(nèi)變異系數(shù)(CV，單位為％ ):選取高、中、低值3份質(zhì)控血清，在同次試驗(yàn)內(nèi)每份 重復(fù)測定10次，計(jì)算得批內(nèi)CV分別為9.7 %、7.4 %和7.1 % ;
[0058]批內(nèi)變異系數(shù):選取高、中、低值3份質(zhì)控血清，每天測定1次，連續(xù)測定10天，計(jì)算 批間(^分別為11.3%、8.0%和6.6%;
[0059] 5、準(zhǔn)確性：
[0060] 選擇抗體濃度為100RU/ml的血清3份，分別加入38RU/ml、100RU/ml和500RU/ml后， 混合均勻，用試劑盒檢測濃度分別為134.64RU/ml、203.4RU/ml、619. IRU/ml，計(jì)算回收率分 別為 97.6%、101.7%、103.2%，平均回收率在 100.8%。
[0061 ] 6、與金標(biāo)準(zhǔn)對比：
[0062]選取通過組織病理學(xué)檢驗(yàn)確診為特發(fā)性膜性腎病患者血清89份，非特發(fā)性膜性腎 病患者血清34份，以組織病理學(xué)檢驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，用四格表統(tǒng)計(jì)如下：
[0063] 特異性=真陰性/陰性總數(shù)X 100%
[0064] 敏感性=真陽性/陽性總數(shù)X 100%
[0065]表1.四格表統(tǒng)計(jì)結(jié)果
[0066]
[0067]
[0068]因此本試劑盒的特異性為100%，敏感性為74.2%。
[0069]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗磷脂酶A2受體抗體IgG試劑盒，其特征在于:所述試劑盒內(nèi)設(shè)置有預(yù)包被人磷 脂酶A2受體抗原的微孔板，以及瓶裝的以下試劑:一組抗磷脂酶A2受體抗體IgG校準(zhǔn)品，陽 性對照，陰性對照，濃縮洗滌液，樣本稀釋液，酶標(biāo)液，底物液和終止液。2. 如權(quán)利要求1所述抗磷脂酶A2受體抗體IgG試劑盒，其特征在于:所述微孔板預(yù)包被 的人磷脂酶A2受體抗原是由導(dǎo)入了含有人磷脂酶A2受體基因的重組載體的大腸桿菌、酵母 細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生的；該人磷脂酶A2受體抗原的包被是用濃度0.05mol/L， pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋到一定濃度后包被的。3. 如權(quán)利要求1所述抗磷脂酶A2受體抗體IgG試劑盒，其特征在于:所述抗磷脂酶A2受 體抗體IgG校準(zhǔn)品是由校準(zhǔn)品稀釋液與抗磷脂酶A2受體抗體IgG陽性血清配制而成，該組抗 磷脂酶A2受體抗體IgG校準(zhǔn)品濃度分別為2RU/ml、20RU/ml、80RU/ml、400RU/ml、1600RU/ml; 所述陽性對照是由質(zhì)控品稀釋液與抗磷脂酶A2受體抗體IgG陽性血清配制而成;所述 陰性對照是由質(zhì)控品稀釋液與抗磷脂酶A2受體抗體IgG陰性血清配制而成。4. 如權(quán)利要求1所述抗磷脂酶A2受體抗體IgG試劑盒，其特征在于:所述濃縮洗滌液按 以下方法配制，按每升水中，加入12. llg三羥甲基氨基甲烷和5ml的吐溫20,調(diào)pH 7.8,定容 1L，即得濃縮洗滌液； 所述樣本稀釋液按以下方法配制，按每升水中，加入1.21g三羥甲基氨基甲烷，7.5g的 牛血清白蛋白，0.5ml的吐溫20，調(diào)pH 7.8，定容1L，即得樣本稀釋液。5. 如權(quán)利要求1所述抗磷脂酶A2受體抗體IgG試劑盒，其特征在于:所述酶標(biāo)液是由酶 標(biāo)記的兔抗人IgG抗體與酶標(biāo)稀釋液按一定濃度配制而成;所述的酶為過氧化物酶類，所述 終止液為0.25-5mol/L的硫酸。6. 如權(quán)利要求5所述抗磷脂酶A2受體抗體IgG試劑盒，其特征在于:所述的酶為辣根過 氧化物酶，所述底物液為3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺溶液。7. 如權(quán)利要求2所述抗磷脂酶A2受體抗體IgG試劑盒，其特征在于:所述碳酸鹽緩沖液 含按以下方法配制，按l〇〇〇ml水中加入0.159g Na2C03和0.293g NaHC03制得。8. 如權(quán)利要求3所述抗磷脂酶A2受體抗體IgG試劑盒，其特征在于:所述校準(zhǔn)品稀釋液 的配制方法為按l〇〇ml水中加入1.21g三羥甲基氨基甲烷，10g牛血清白蛋白，0.5ml吐溫20， 0.5ml Proclin300，PH調(diào)至7.4制得，所述質(zhì)控品稀釋液的配制方法與校準(zhǔn)品稀釋液的配制 方法相同。9. 一種抗磷脂酶A2受體抗體IgG的檢測方法，其特征在于:包括以下步驟： ① 樣本孵育：在預(yù)包被人磷脂酶A2受體抗原的微孔板的微孔內(nèi)分別加入一組校準(zhǔn)品， 陽性對照與陰性對照，以及稀釋后的待測樣本各1〇〇μ1，室溫孵育30分鐘； ② 一次洗滌:甩掉反應(yīng)液之后，每孔用300μ1稀釋10倍的濃縮洗滌液洗3次，拍干； ⑧酶結(jié)合物孵育：在預(yù)包被人磷脂酶Α2受體抗原的微孔板的每個微孔內(nèi)加入酶標(biāo)液 100μΙ，室溫孵育30分鐘； ④ 二次洗滌:甩掉反應(yīng)液，之后，每孔用300μ1稀釋10倍的濃縮洗滌液洗3次，拍干； ⑤ 底物孵育:在預(yù)包被人磷脂酶Α2受體抗原的微孔板的每個微孔內(nèi)加入底物液100μ1， 室溫孵育10分鐘； ⑥ 終止:在預(yù)包被人磷脂酶Α2受體抗原的微孔板的每個微孔內(nèi)加入終止液100ul，混 勻；
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抗磷脂酶A2受體抗體IgG試劑盒及檢測方法。該試劑盒內(nèi)有預(yù)包被人磷脂酶A2受體抗原的微孔板，以及瓶裝的以下試劑：抗磷脂酶A2受體抗體IgG校準(zhǔn)品，陽性對照，陰性對照，濃縮洗滌液，樣本稀釋液，酶標(biāo)液，底物液和終止液。本發(fā)明檢測可非創(chuàng)傷、低風(fēng)險(xiǎn)、安全、廉價(jià)、精確的定量檢測血清、血漿的抗磷脂酶A2受體抗體IgG的含量，對特發(fā)性膜性腎病患者陽性檢出率高，測定結(jié)果精確、客觀、方法簡便，易于推廣應(yīng)用。對特發(fā)性膜性腎病的診斷、指導(dǎo)治療及療效評價(jià)有重要意義，對治療方案的制定、方法的選擇有重要的臨床參考價(jià)值。
【IPC分類】G01N33/543, G01N33/535, G01N33/531, G01N21/78
【公開號】CN105510575
【申請?zhí)枴緾N201510888173
【發(fā)明人】熊祖應(yīng), 張永頂, 張大準(zhǔn), 馬偉民
【申請人】深圳市伯勞特生物制品有限公司
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年12月4日