專利名稱：抑制凝血酶的二酮哌嗪衍生物的制作方法
發(fā)明的背景a.發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及抑制血凝固的化合物，特別是特異性地抑制凝血酶的二酮哌嗪衍生物，在藥學(xué)上可接受的鹽類及其成份。
b.現(xiàn)有技術(shù)的描述血栓病的特征在于形成阻礙血管血液流動(dòng)的血栓，導(dǎo)致動(dòng)脈或靜脈血栓形成或血栓栓塞。凝血酶由血纖維蛋白、血小板、白細(xì)胞和紅細(xì)胞組成。血栓形成涉及一些遺傳和環(huán)境因素。基因不配對(duì)的抗凝血?jiǎng)C(jī)制包括抗活化的C蛋白的因子V、高半胱氨基酸血過多、C蛋白缺乏、S蛋白缺乏、抗凝血酶缺乏和缺陷性血纖維蛋白溶解作用，而血栓刺激包括外科、懷孕、使用口服避孕藥和抗磷脂抗體。急、慢性血栓并發(fā)癥包括靜脈和動(dòng)脈血栓、心房纖維顫動(dòng)、中風(fēng)、心肌梗塞和肺栓塞是全球死亡的主要原因。
抗血栓治療包括溶解血栓藥物治療除去血栓，使用抗血小板藥物和抗凝血?jiǎng)┮种颇?。進(jìn)一步的治療根據(jù)參與的靜脈或動(dòng)脈循環(huán)系統(tǒng)和血管的大小和位置而變化。
目前采用的抗凝血?jiǎng)┯幸恍┤秉c(diǎn)(Exp.Opin.Inves.Drugs 1997，61591-1622；Current pHarmaceutical Design 1995，1441-468；Circulation 1994，901522-1536)。例如，肝素是在需要急性抗凝血時(shí)腸胃外給藥的首選藥物。肝素由一種動(dòng)物來源的粘多糖組成。標(biāo)準(zhǔn)的或高分子量的肝素(HMWHs)由許多大小不同的分子組成，而降解的或低分子量肝素(LMWHs)的分子量為4000-6000D。
使用肝素有一些缺點(diǎn)，即(1)肝素是一種需要靜脈或皮下給藥的腸胃外藥物；(2)肝素的抗凝血?jiǎng)﹦┝糠磻?yīng)曲線是非線性的，體外凝血參數(shù)(APTT)必須跟蹤監(jiān)測(cè)抗凝血的程度；(3)肝素對(duì)抑制凝塊結(jié)合的凝血酶無效；(4)有報(bào)導(dǎo)在停止肝素治療之后，又出現(xiàn)不穩(wěn)定的心絞痛的“反跳”，而且肝素與血小板減少有關(guān)，需要監(jiān)測(cè)血小板計(jì)數(shù)。肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥(HIT)是一種免疫球蛋白介導(dǎo)的藥物副反應(yīng)，其特征是血小板活化、血小板減少和正接受或最近接受肝素治療的患者中有高危血栓并發(fā)癥。
在靜脈血栓形成或肺栓塞病例中，腸胃外肝素給藥7-10天療程通常是繼之以長(zhǎng)時(shí)間給予目前通用的口服抗凝血藥物華法令(Warfarin)；以延長(zhǎng)對(duì)血栓并發(fā)癥的治療。在停止肝素治療之前，肝素一般與華法令共同給藥數(shù)天。
華法令有一些缺點(diǎn)(The Annals of pHarmacotherapy 1995，291274-1282；Clin.pHarmacokinet.1996，30416-444)，即(1)它有出血的危險(xiǎn)；(2)有不良的藥物和飲食之間的相互作用；(3)需要經(jīng)常性監(jiān)測(cè)。
肝素和華法令均系間接抗凝血?jiǎng)?，它們的功能分別取決于抗凝血酶和維生素K的存在。因此，在停止華法令治療后，需等待依賴維生素K的凝血因子通過肝臟重新合成，以恢復(fù)止血平衡。這些缺點(diǎn)阻礙了醫(yī)生接受和使用華法令來治療血栓病。
在過去的二十余年中，常規(guī)的抗凝血?jiǎng)┲委煹牟焕麠l件促使人們開發(fā)新的抗凝血?jiǎng)?976年發(fā)現(xiàn)低分子量肝素具有與肝素相似的效果。由于它們良好的藥物動(dòng)力學(xué)分布和危險(xiǎn)/比率，自1992年起歐洲廣泛使用，最近獲準(zhǔn)在美國(guó)使用。
新的抗凝血?jiǎng)┓椒ɑ谠谀A段直接抑制關(guān)鍵酶。作為凝血階段中的最終酶，凝血酶已是廣泛測(cè)試的對(duì)象。血栓過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑凝血酶是胰蛋白樣的絲氨酸蛋白酶。凝血酶有多種多樣的生物功能，但其主要作用是催化血纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為血纖維蛋白，不論凝血酶溶于血漿還是與血纖維蛋白結(jié)合。通過激活的血因子XIII的作用，然后血纖維蛋白聚合和交聯(lián)形成不溶解的血塊。凝血酶還激活血因子V和VIII，再經(jīng)反饋機(jī)制加速血液凝固。作為一種強(qiáng)的血小板激活劑，在動(dòng)脈循環(huán)中，凝血酶還在激發(fā)富集血小板的血栓的生長(zhǎng)中起重要作用。當(dāng)凝血酶被抑制時(shí)可中斷血纖維蛋白沉積和血小板聚集。然而凝血酶與在人體中，尤其是血液中存在的許多絲氨酸蛋白酶(如纖溶酶)相似。因此，需要一種對(duì)凝血酶具有特異性的凝血酶抑制劑。
凝血酶抑制劑可通過與凝血酶活性部位和/或血纖維蛋白原藉此轉(zhuǎn)化為血纖維蛋白的血纖維蛋白原識(shí)別外部位(FRE)結(jié)合直接使凝血酶失活，。例如，水蛭素是一種天然存在的63-氨基酸抗凝血?jiǎng)?，它是在吸血水?Hirudomedicinalis)的唾液腺中產(chǎn)生的。水蛭素通過直接與凝血酶活性部位和FRE結(jié)合來抑制凝血酶，其對(duì)凝血酶的抑制常數(shù)(Ki)值為2.0×10-15M(Biochemistry 1986，254622-4628)。Hirugen是一個(gè)從水蛭素的陰離子羧基端衍生的肽，只與凝血酶的FRE結(jié)合，其Ki值為1.44×10-7M(J.Biol.Chem.1989，2648692-8698)。Hirulogs或Bivalirudin是一種合成肽，由一種與FRE結(jié)合的Hirugen樣的序列經(jīng)一個(gè)甘氨酸-間隔區(qū)連接底物樣活性部位結(jié)合部分，D-苯丙氨酸-脯氨酰-精氨酸，連接組成，其Ki值為2.3×10-9M。
除了在出血并發(fā)癥方面有稍好的安全性外，上述直接的凝血酶抑制劑沒有顯示比肝素有較好，甚至更差的特點(diǎn)，即(1)半衰期相對(duì)短；(2)腸胃外給藥；(3)無成本效益。
美國(guó)專利4,258,192和4,201,863披露了一種合成的小分子凝血酶抑制劑，對(duì)人凝血酶的Ki值為1.9×10-10M，其商品名為Argatroban(Novastan，Mitsubishi Chemical Corp Cardiovasc.Drug Rev.1991，9247-263)。對(duì)抗凝血酶III(ATIII)缺乏的患者和有HIT危險(xiǎn)的患者作為肝素的替代物，Argatroban用于治療慢性動(dòng)脈阻塞、急性局部缺血性中風(fēng)和血液透析。但由于以下問題Argatroban仍不是一種理想的小分子凝血酶抑制劑(1)無口服生物藥效；(2)對(duì)靜脈血栓形成的作用比對(duì)動(dòng)脈血栓形成的作用差；(3)可能有劑量依賴性；(4)凝血酶再結(jié)合作用；(5)對(duì)治療不穩(wěn)定的心絞痛、冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)和急性心肌梗塞不比肝素更有效。
因此，提供一種口服有效的凝血酶抑制劑是極為理想的。人們對(duì)口服生物藥效的凝血酶抑制劑的興趣甚高(Am.J.Cardiol.1995，7527B-33B)。如上所述，一種有選擇性并可逆地抑制凝血酶的小分子凝血酶活性部位抑制劑在副作用和監(jiān)測(cè)方面明顯優(yōu)于華法令。與華法令相比，凝血酶抑制劑的選擇性使其在治療動(dòng)脈和靜脈血栓中有相對(duì)的安全性。小分子凝血酶抑制劑的另一明顯優(yōu)點(diǎn)或許對(duì)抑制血塊結(jié)合的凝血酶及流動(dòng)相凝血酶具有潛在重要的能力。
根據(jù)本發(fā)明提供具有下列結(jié)構(gòu)式I的化合物 或藥學(xué)上可接受的鹽或其立體異構(gòu)體，其中R1、R2和R4代表氫、烷基或芳基部分，R3由烷基或芳基部分組成，R5代表氫、烷基、芳基、氫芳基、雜芳基、氫雜芳基、磺酰烷基、磺酰芳基、磺酰氫芳基、磺酰雜芳基或磺酰氫雜芳基部分，R6代表氫、烷基、芳基、氫芳基、雜芳基或氫雜芳基部分。這種化合物抑制凝血酶或血凝固，還可用作一種抗血栓劑或抗凝血?jiǎng)?br> 例如，R5代表烷基、芳基、氫芳基、雜芳基或氫雜芳基部分。尤其是R1、R2和R4代表氫部分，R3可由甲基部分組成，R5代表1，2，3，4-四氫-3-甲基-8-喹啉磺酰基，R6代表3-胍丙基。這種化合物具有高的抑制常數(shù)(Ki為5.3×10-15M)。
根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)一步提供一種藥物成分包括一種象活性組分那樣的化合物，與一種藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合。藥物成分適合口服給藥?；钚越M分可用于，如片劑、膠囊、溶液或懸浮液成分中(約含5-500mg/結(jié)構(gòu)式I的化合物或混合物的劑量單位)?；衔锟梢猿Ｒ?guī)方法與生理上可接受的賦形劑或載體結(jié)合，包括合適的應(yīng)急藥物、結(jié)合劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、香料等，如在制藥實(shí)踐中接受的那樣。
根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)一步提供一種方法基本上阻止哺乳動(dòng)物或人或其組織中的凝血酶活性。該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物、人或組織給與有效劑量的這種化合物或藥物成分。
根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)一步提供一種治療哺乳動(dòng)物或人或其組織中的凝血障礙的方法。該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物、人或組織給與有效劑量的化合物或藥物成分。凝血障礙的例子包括血栓形成或肝素誘導(dǎo)的血小板減少(HIT)。
本發(fā)明的化合物可對(duì)已知血栓障礙的各種哺乳動(dòng)物，如人、貓、狗、猴、鼠以及類似物口服給藥，有效劑量范圍為0.1-100mg/kg，約0.2-50mg/kg較好，約0.5-25mg/kg最好，以單劑量或日劑量分為2-4次方法。
雖然本發(fā)明的結(jié)構(gòu)式I的化合物抑制凝血酶，且可用作抗凝血?jiǎng)?，但還可與其他抗血栓或抗凝血藥物結(jié)合使用。
本發(fā)明的化合物包括對(duì)一種二酮哌啶結(jié)構(gòu)附加環(huán)和取代，且與已知的二酮哌啶衍生物相比更堅(jiān)固。
與抗凝血?jiǎng)┧幬锶绺嗡亍⑷A法令、水蛭素、Hirugen、Hirulogs和Argatroban相比，本發(fā)明的化合物通過與凝血酶特異結(jié)合來抑制血凝固。與肝素相反，本發(fā)明的化合物具有口服生物藥效，半衰期增加，對(duì)靜脈血栓形成有效，對(duì)凝血酶有限制或沒有“反跳”作用。本發(fā)明的化合物還降低了HIT的危險(xiǎn)。
對(duì)本發(fā)明目的，下列術(shù)語解釋如下術(shù)語“烷基”是指在18碳范圍以內(nèi)的直鏈或支鏈基團(tuán)或環(huán)狀環(huán)，最好是1-8碳，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基及其各種支鏈異構(gòu)體，和/或1或2個(gè)以下取代基芳基取代基(例如，形成芐基或苯乙基)，環(huán)烷基取代基，烷環(huán)烷基取代基，鏈烯基取代基，炔基取代基、羥基、烷氧基、鹵基、氨基、烷氨基、二烷氨基、胍基或羧基取代基。
術(shù)語“芳基”意指環(huán)部分中含6-14碳的單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)芳基，例如苯基、萘基或蒽基。芳基部分可包括取代的芳基，其可有1或2個(gè)取代基，例如烷基、氰基、氨基、烷氨基、二烷氨基、硝基、羧基、羰烷氧基、三氟甲基、鹵基、烷氧基、芳烷氧基或羥基。
術(shù)語“氫芳基”意指10-14元芳基環(huán)，例如四氫萘基、四氫蒽基和類似物。氫芳基可包括取代的氫芳基，其可有1或2個(gè)取代基，例如烷基、氰基、氨基、烷氨基、二烷氨基、硝基、羧基、羰烷氧基、三氟甲基、鹵基、烷氧基、芳烷氧基或羥基。
術(shù)語“雜芳基”意指包括1，2或3個(gè)雜原子(如氮、氧或硫)的5-14元芳基環(huán)，例如 和類似物。雜芳基環(huán)可任意與如以前所說明的芳基環(huán)稠合。雜芳基環(huán)可包括1個(gè)取代的雜芳基，其可有1或2個(gè)取代基，例如烷基、氰基、氨基、烷氨基、二烷氨基、硝基、羧基、羰烷氧基、三氟甲基、鹵基、烷氧基、芳烷氧基或羥基。
術(shù)語“氫雜芳基”意指上述雜芳基環(huán)的還原形式，例如 和類似物。氫雜芳基環(huán)可任意與如以前所說明的芳基環(huán)稠合。氫雜芳基環(huán)可包括取代的氫雜芳基，其可有1或2個(gè)取代基，例如烷基、氰基、氨基、烷氨基、二烷氧基、硝基、羧基、羰烷氧基、三氟甲基、鹵基、烷氧基、芳烷氧基或羥基。
術(shù)語“磺酰烷基”意指一個(gè)磺?；?SO2)，連上一個(gè)如以前所說明的烷基。
術(shù)語“磺酰烷基”意指一個(gè)磺?；?SO2)，連上一個(gè)如以前所說明的芳基。
術(shù)語“磺酰氫芳基”意指一個(gè)磺?；?SO2)，連上一個(gè)如以前所說明的氫芳基。
術(shù)語“磺酰雜芳基”意指一個(gè)磺酰基(SO2)，連上一個(gè)如以前所說明的雜芳基。
術(shù)語“磺酰氫雜芳基”意指一個(gè)磺?；?SO2)，連上一個(gè)如以前所說明的氫雜芳基。
通過游離堿基與酸(例如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、硫酸、磷酸、乙酸、檸檬酸、馬來酸、琥珀酸、乳酸、酒石酸、葡糖酸、苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、P-甲苯磺酸或類似物)反應(yīng)，從本發(fā)明的結(jié)構(gòu)式I的化合物可得到一種藥學(xué)上可接受的酸鹽。
圖2表示用化合物Cycloargatroban(結(jié)構(gòu)式I，R1、R2和R4是氫，R3是甲基，R5是1，2，3，4-四氫-3-甲基-8-喹啉磺酰基和R6是3-胍丙基)，在底物濃度([s])為10μm時(shí)體內(nèi)測(cè)定凝血酶抑制作用的累進(jìn)曲線。
圖3表示用化合物Cycloargatroban(結(jié)構(gòu)式I，R1、R2和R4是氫，R3是甲基，R5是1，2，3，4-四氫-3-甲基-8-喹啉磺?；蚏6是3-胍丙基)，在底物濃度([s])為22μm時(shí)體內(nèi)測(cè)定胰蛋白酶抑制作用的累進(jìn)曲線。
圖4表示用化合物Cycloargatroban(結(jié)構(gòu)式I，R1、R2和R4是氫，R3是甲基，R5是1，2，3，4-四氫-3-甲基-8-喹啉磺?；蚏6是3-胍丙基)，運(yùn)用體內(nèi)動(dòng)力學(xué)測(cè)定法測(cè)定凝血酶抑制常數(shù)(Ki)。
圖5表示用化合物Cycloargatroban(結(jié)構(gòu)式I，R1、R2和R4是氫，R3是甲基，R5是1，2，3，4-四氫-3-甲基-8-喹啉磺酰基和R6是3-胍丙基)和具有結(jié)構(gòu)XIII所示化學(xué)成分的對(duì)照化合物argatroban的體外凝血測(cè)定。
發(fā)明的詳細(xì)描述根據(jù)本發(fā)明，提供的化合物可在哺乳動(dòng)物體外和體內(nèi)用作強(qiáng)效和特異性的凝血酶和血凝固抑制劑。
本發(fā)明包括結(jié)構(gòu)式I的二酮哌嗪衍生物的制備 可按照下列反應(yīng)步驟I制備本發(fā)明的結(jié)構(gòu)式I的化合物 氨基酸II用叔-丁氧羰基(BOC)保護(hù)，采用在含10％三乙胺(TEA)的甲醇中與二-叔-丁基碳酸酯反應(yīng)，或用芐氧羰基(Cbz)保護(hù)，采用在有機(jī)溶劑(如二噁烷、四氫呋喃或乙醚)中與芐基氯甲酸酯和氫氧化鈉水溶液反應(yīng)。在二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、二異丙基碳二亞胺(DIC)或2-(1H-苯三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽(TBTU)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)或N-羥基苯三唑(HOBT)存在下，在惰性有機(jī)溶劑，如二甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯二酮(NMP)、二氯甲烷(DCM)或四氫呋喃(THF)中，在-20℃～-5℃溫度范圍內(nèi)，被保護(hù)的氨基酸III被酯化，通過偶聯(lián)反應(yīng)與乙醇生成酯IV。
在干燥惰性溶劑，如DCM、THF、乙酸乙酯或氯仿中，用三氟乙酸或鹽酸處理對(duì)酯IV去保護(hù)(BOC)，或在室溫下，在醇溶劑中用鈀炭進(jìn)行氫化去保護(hù)(Cbz)。
或者，在0℃-20℃溫度范圍內(nèi)，在氨基酸II的醇溶液中加氯化亞砜，然后用堿(如碳酸氫鈉或碳酸鉀和類似物)中和，可制備酯V。在偶合劑(如DCC、DIC或TBTU，和DMAP或HOBT)，和叔胺有機(jī)堿(如TEA或二異丙基乙胺)存在下。
在惰性有機(jī)溶劑(如DMF、NMP、THF或DCM)中，在0℃-20℃范圍內(nèi)，酯V與被保護(hù)的氨基酸衍生物VI進(jìn)行偶合反應(yīng)生成肽VII。在哌啶或二乙胺存在下，在惰性有機(jī)溶劑(如DMF、NMP、DCM或THF)中，室溫下，肽VII被去保護(hù)并環(huán)化(FMOC)。或在干燥惰性溶劑，如DCM、THF、乙酸乙酯或氯仿中，用TFA或鹽酸處理進(jìn)行去保護(hù)(BOC)，或在室溫下，在醇溶劑中用鈀炭進(jìn)行氫化去保護(hù)(Cbz)，然后加堿環(huán)化。在0℃干燥的THF溶劑中，用氨化有機(jī)堿，如二(三甲硅烷基)氨化鋰(LHMDs)或二異丙基氨化基(LDA)處理二酮哌嗪VIII，再在0℃-20℃添加烷化劑IX得到二酮哌嗪I。
按照下列反應(yīng)步驟II也可制備本發(fā)明的結(jié)構(gòu)式I的化合物 室溫條件下，在干燥惰性溶劑(如DCM、THF、乙酸乙酯或氯仿)中，用TFA或HCl處理對(duì)肽VII(其中PG是BOC或Cbz)進(jìn)行去保護(hù)(BOC)，或在醇溶劑用鈀炭進(jìn)行氫化(Cbz)。在叔胺有機(jī)堿(如吡啶、TEA或DIPEA)存在下，在干燥惰性溶劑(如DCM、THF或氯仿)中，室溫下肽X與烷化劑IX進(jìn)行反應(yīng)生成肽XI。在醇溶劑(如甲醇或乙醇)中，用堿金屬堿(如氫氧化鈉或氫氧化鋰)處理將肽XI的酯進(jìn)行水解。反應(yīng)混合物用鹽酸或硫酸酸化，生成酸XII。
在TBTU、HOBT、DIPEA存在下，在惰性有機(jī)溶劑(如DMF、NMP、THF或DCM)中，室溫下酸XII進(jìn)行分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)，生成二酮哌嗪I。
本發(fā)明的結(jié)構(gòu)式I的化合物，其中R6是 Y是烷基、芳基、氫芳基、雜芳基或氫雜芳基部分，可按照下列反應(yīng)步驟III制備 二酮哌嗪I是按照下列反應(yīng)步驟I或II制備的，其中R6是 在干燥惰性溶劑如DCM、THF、乙酸乙酯或氯仿中，用TFA或鹽酸處理去保護(hù)(BOC、三苯甲基和類似物)，或室溫下在醇溶劑中用鈀炭進(jìn)行氫化(Cbz)。在胍化劑XIV(如N，N′-雙-(叔-丁氧羰基)-N″-三氟甲烷磺酰胍，1-[N，N′-雙(叔-丁氧羰基)酰胺]吡唑或N，N′-雙-(叔-丁氧羰基)-S-甲基異硫脲和叔胺有機(jī)堿(如TEA或DIPEA)存在下，在惰性有機(jī)溶劑(如DMF、NMP、THF或DCM)中，室溫下，對(duì)二酮哌嗪XIII進(jìn)行胍化，生成一種被保護(hù)的、胍化的二酮哌嗪XV。
在干燥惰性溶劑(如DCM、THF、乙酸乙酯或氯仿)中，室溫下用TFA或鹽酸對(duì)二酮哌嗪XV去保護(hù)，生成二酮哌嗪I，其中R6是
本發(fā)明的結(jié)構(gòu)式I的化合物(其中R5是氫雜芳基)，可按照下列反應(yīng)步驟IV制備。 按照反應(yīng)步驟II制備酸XII，其中R5是芳基部分，且在一種含金屬(如鈀炭、鉑、銠或鎳)的催化劑存在下進(jìn)行還原反應(yīng)，在溫度20℃-100℃內(nèi)，壓力1-100大氣壓形成酸XII，其中R5是氫雜芳基部分。酸XII(其中R5是氫雜芳基)在惰性有機(jī)溶劑(如DMF、NMP、THF或DCM)中，在偶聯(lián)劑TBTU、HOBT和DIPEA存在下，室溫中進(jìn)行分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)，生成二酮哌嗪I，其中R5是氫雜芳基。
通過下列實(shí)施例更易理解本發(fā)明，這些例子是說明本發(fā)明，而不是限制其范圍。
實(shí)施例1 N-(叔-丁氧羰基)-D-2-哌啶羧酸，烯丙酯N-(叔-丁氧羰基)-D-2-哌啶羧酸(2.0g，8.7mmol，BACHEM公司)溶解于二氯甲烷(40ml)，冷卻到-20℃，加入烯丙醇(1.0ml，15.0mmol，Aldrich公司)、二環(huán)己基碳二亞胺(1.8g，8.7mmol，Aldrich公司)和4-二甲氨基吡啶(0.11g，0.87mmol，Aldrich公司)，反應(yīng)混合液在-5℃和-10℃之間攪拌4小時(shí)。過濾除去副產(chǎn)物脲后，反應(yīng)混合液減壓濃縮。得到的油用100克硅膠層析，用15∶1己烷/乙酸乙酯洗脫，得到題述的化合物為一種清晰、無色的液體(2.33克，99％)。
實(shí)施例2 (2R，4R)-N-(叔-丁氧羰基)-4-甲基-2-哌啶羧酸，烯丙酯(2R，4R)-4-甲基-2-哌啶羧酸(250mg，1.75mmol)溶解于含10％三乙胺的甲醇30ml中，冷卻到0℃，加入二-叔-丁基碳酸酯鈉(0.48ml，2.10mmol，Aldrich公司)，2小時(shí)后反應(yīng)混合液減壓濃縮，加入磷酸二氫鈉10mg。殘余物溶解于1∶1乙酸乙酯/水(10ml)，用1N鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值至2.0?；旌弦河靡宜嵋阴?4×20ml)提取，合并的有機(jī)提取物用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮。得到的白色固體溶解于二氯甲烷(8ml)中，冷卻到-20℃。加入烯丙醇(0.20ml，2.98mmol，Aldrich公司)、二環(huán)己基碳二亞胺(361mg，1.75mmol，Aldrich公司)和4-二甲基氨基吡啶(22mg，0.18mmol，Aldrich公司)，反應(yīng)混合液在-5℃和-10℃之間攪拌5小時(shí)。過濾除去副產(chǎn)物脲后，反應(yīng)混合液減壓濃縮。得到的油用10克硅膠層析，用9∶1己烷/乙酸乙酯洗脫，得到題述的化合物為一種清晰、無色的液體(457mg，92％)。
實(shí)施例3 (3S，6R)-二環(huán)[4.4.0]-1，4-二氮-3-[(4-硝苯基)甲基]-4-N-(4-叔-丁苯磺?；?-2，5-癸二酮，三氟乙酸鹽3A)1-[Nα-(9-芴甲氧羰氧基)-L-4-硝基苯丙氨酰]-D-2-哌啶羧酸，烯丙酯實(shí)施例1的2-哌啶酯(259mg，0.96mmol)溶解于1∶1三氟乙酸/二氯甲烷(5ml)，攪拌3小時(shí)。反應(yīng)混合液減壓濃縮，置于真空泵過夜。得到的油溶解于二甲基甲酰胺(5ml)，冷卻到0℃，加入二異丙基乙胺(0.50ml，2.88mmol，Aldrich公司)。攪拌5分鐘后，加入Nα-(9-芴甲氧羰氧基)-L-4-硝基苯丙氨酸(500mg，1.16mmol，Novabiochem公司)，N-羥基苯并三唑(205mg，1.34mmol，Nobaviochem公司)和2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽(430mg，1.34mmol，Novabiochem公司)。反應(yīng)混合液攪拌72小時(shí)，傾入乙酸乙酯(125ml)中，用10％鹽酸(2×25ml)、飽和的碳酸氫鈉溶液(2×25ml)和鹽水(25ml)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮。得到的油用50克硅膠層析，用7∶3己烷/乙酸乙酯洗脫，得到題述的化合物為一種白色固體(457mg，82％)。
3B)(3S，6R)-二環(huán)[4.4.0]-1，4二氮-3[(4-硝苯基)甲基]-2，5-癸二酮將哌啶(1.68ml，17.0mmol，Aldrich公司)加入到含3A部分的酯(200mg，0.34mmol)的二氯甲烷(68ml)溶液中，反應(yīng)混合液攪拌1小時(shí)。反應(yīng)混合液減壓濃縮。得到的油用20g硅膠層析，用19∶1二氯甲烷/甲醇洗脫，得到題述的化合物為一種淡黃色固體(69mg，67％)。
3C)(3S，6R-二環(huán)[4.4.0]-1，4-二氮-3[(4-硝苯基)甲基]-4-N-(4-叔-丁苯磺?；?-2，5-癸二酮，三氟乙酸鹽在0℃，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將1.0M二(三甲硅烷基)氨化鋰溶于四氫呋喃，(0.090ml，0.090mmol，Aldrich公司)加入到含3B部分的二酮哌嗪(20mg，0.066mmol)的無水四氫呋喃(1ml，Aldrich公司)溶液中，反應(yīng)混合液攪拌1小時(shí)。一次性加入4-叔-丁基苯磺酰氯(23mg，0.10mmol)，混合液于室溫?cái)嚢?小時(shí)。加入鹽水(5ml)，反應(yīng)混合液用乙酸乙酯(3×10ml)提取。合并的有機(jī)提取物用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮。得到的油用25克硅膠層析，先用9∶1己烷/乙酸乙酯，然后用7∶3己烷/乙酸乙酯洗脫，得到題述的化合物為一種白色固體(23mg，70％)質(zhì)譜(EI)(M+)于499。
實(shí)施例4 (3S，6R)-二環(huán)[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-胍丙基)-4-N-(4-叔-丁苯磺?；?-2，5-癸二酮，三氟乙酸鹽4A)1-[Nγ-(4-三苯甲基)-Nα-(9-芴甲氧羰氧基)-L-鳥氨酰]-D-2-哌啶羧酸，烯丙酯實(shí)施例1的2-哌啶酯(500mg，1.86mmol)溶解于1∶1三氟乙酸/二氯甲烷(8ml)，攪拌3小時(shí)。反應(yīng)混合液減壓濃縮，置真空泵過夜。得到的油溶解于二甲基甲酰胺(8ml)，冷卻到0℃，加入二異丙基乙胺(0.97ml，5.58mmol，Aldrich公司)。攪拌5分鐘后，加入Nγ-(4-三苯甲基)-Nα-(9-芴甲氧羰氧基)-L-鳥氨酸(1.36g，2.23mmol，Novabiochem公司)，N-羥基苯并三唑(398mg，2.60mmol，Novabiochem公司)和2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽(835mg，2.60mmol，Novabiochem公司)。反應(yīng)混合液攪拌96小時(shí)，傾入乙酸乙酯(125ml)中，用10％鹽酸(2×25ml)、飽和的碳酸氫鈉(2×25ml)和鹽水(25ml)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮。得到的油用75克硅膠層析，用3∶1己烷/乙酸乙酯洗脫，得到題述的化合物為一種白色固體(1.22g，86％)。
4B)(3S-6R)-二環(huán)[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-N-(4-三苯甲基)胺丙基)-2，5-癸二酮將哌啶(3.26ml，33.0mmol，Aldrich公司)加入到含4A部分的酯(500mg，0.66mmol)的二氯甲烷(132ml)溶液中，反應(yīng)混合液攪拌3小時(shí)。反應(yīng)混合液減壓濃縮。得到的油用40克硅膠層析，用1∶1己烷/乙酸乙酯洗脫，得到題述的化合物為一種白色固體(288mg，91％)。
4C)(3S，6R)-二環(huán)[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-N-(4-三苯甲基)胺丙基)-4-N-(4-叔-丁苯磺酰基)-2，5-癸二酮在0℃，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將1.0M二(三甲硅烷基)氨化鋰溶于四氫呋喃(0.42ml，0.42mmol，Aldrich公司)，加入到含4B部分的二酮哌嗪(150mg，0.30mmol)的無水四氫呋喃(5ml，Aldrich公司)溶液中，反應(yīng)混合液攪拌1小時(shí)。一次性加入4-叔-丁基苯磺酰氯(109mg，0.47mmol)，混合液于室溫?cái)嚢?小時(shí)。加入鹽水(10ml)，反應(yīng)混合液用乙酸乙酯(3×20ml)提取。合并的有機(jī)提取物用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮。得到的油用25克硅膠層析，先用9∶1己烷/乙酸乙酯，然后用7∶3己烷/乙酸乙酯洗脫，得到題述的化合物為一種白色固體(135mg，64％)。
4D)(3S，6R)-二環(huán)[4.4.0]-1，4-二氮-3(3-N，N′-(二-叔-丁氧羰基)胍丙基)-4-N-(4-叔-丁苯磺酰基)-2，5-癸二酮4C部分的二酮哌嗪(296mg，0.44mmol)溶解于含1％三氟乙酸的二氯甲烷(30ml)中，攪拌30分鐘。反應(yīng)混合液減壓濃縮，得到的油用25克硅膠層析，先用1∶1己烷/乙酸乙酯，然后用4∶1二氯甲烷/甲醇洗脫，冷凍干燥得到的(3S，6R)-二環(huán)[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-氨丙基)-4-N-(4-叔-丁苯磺?；?-2，5-癸二酮，三氟乙酸鹽為一種白色固體。
在上述含胺的二氯甲烷(10ml)溶液中加入三乙胺(0.061ml，0.44mmol，Aldrich公司)和N，N′-二-叔-丁氧基-N″-三氟甲烷磺?；?157mg，0.40mmol，Journal of Organic Chemistry 63(12)3804-3805(1998))。攪拌12小時(shí)后，反應(yīng)混合液傾入二氯甲烷(50ml)中，用1M硫酸氫鈉溶液(10ml)，5％碳酸氫鈉溶液(10ml)和水(10ml)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮。得到的油用20克硅膠層析，先用9∶1己烷/乙酸乙酯，然后用1∶1己烷/乙酸乙酯洗脫，得到題述的合物為一種白色固體(239mg，93％)。
4E)(3S，6R)-二環(huán)[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-胍丙基)-4-N-(4-叔-丁苯磺酰基)-2，5-癸二酮，三氟乙酸鹽4D部分的二酮哌嗪(100mg，0.16mmol)溶液溶解于1∶1三氟乙酸/二氯甲烷(2ml)中，攪拌1小時(shí)，反應(yīng)混合液減壓濃縮。得到的油用5克硅膠層析，先用19∶1二氯甲烷/甲醇，然后用9∶1二氯甲烷/甲醇洗脫，冷凍干燥得到題述的化合物為一種白色固體(88mg，96％)。電噴霧質(zhì)譜(M+H+)于464.5。
實(shí)施例5 (3S，6R)-二環(huán)[4.4.0]-1，4-二氮-3-(4-胍丁基)-4-N-(4-叔-丁苯磺?；?-2，5-癸二酮，三氟乙酸鹽5A)1-[Nε-(4-三苯甲基)-Nα-(9-芴甲氧羰氧基)-L-賴氨酰]-D-2-哌啶羧酸，烯丙酯將實(shí)施例1的2-哌啶酯(253g，0.94mmol)溶解于1∶1三氟乙酸/二氯甲烷(5ml)中，攪拌2小時(shí)。反應(yīng)混合液減壓濃縮，置真空泵過夜。得到的油溶解于二甲基甲酰胺(5ml)中，冷卻到0℃，加入二異丙基乙胺(0.49ml，2.82mmol，Aldrich公司)。攪拌5分鐘后，加入Nε-(4-三苯甲基)-Nα-(9-芴甲氧羰氧基)-L-賴氨酸(706mg，1.13mmol，Novabiochem公司)、N-羥基苯并三唑(202mg，1.32mmol，Novabiochem公司)和2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽(424mg，1.32mmol，Novabiochem公司)。反應(yīng)混合液攪拌72小時(shí)，傾入乙酸乙酯(125ml)中，用10％鹽酸(2×25ml)，飽和的碳酸氫鈉溶液(2×25ml)和鹽水(25ml)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮。得到的的油用50克硅膠層析，用3∶1己烷/乙酸乙酯洗脫，得到題述的化合物為一種白色固體(605mg，83％)。
5B)(3S，6R)-二環(huán)[4.4.0]-1，4-二氮-3-(4-N-(4-三苯甲基)丁基)-2，5-癸二酮將哌啶(1.58ml，16.0mmol，Aldrich公司)加入到含5A部分酯(250mg，0.32mmol)的二氯甲烷(64ml)溶液中，反應(yīng)混合液攪拌2小時(shí)。反應(yīng)混合液減壓濃縮。得到的油用25克硅膠層析，用乙酸乙酯洗脫，得到題述的化合物為一種白色固體(149mg，94％)。
5C)(3S，6R)-二環(huán)[4.4.0]-1，4-二氮-3-(4-N-(4-三苯甲基)丁基)-4-N-(4-叔-丁苯磺?；?-2，5-癸二酮在0℃，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將1.0M二(三甲硅烷基)氨化鋰溶于四氫呋喃(0.14ml，0.14mmol，Aldrich公司)，加入到含5B部分的二酮哌嗪(50mg，0.10mmol)的無水四氫呋喃(1.5ml，Aldrich公司)溶液中，反應(yīng)混合液攪拌1小時(shí)。一次性加入4-叔-丁基苯磺酰氯(35mg，0.15mmol)，混合液于室溫?cái)嚢?小時(shí)。加入鹽水(5ml)，反應(yīng)混合液用乙酸乙酯(3×10ml)提取。合并的有機(jī)提取物用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮。得到的油用10克硅膠層析，先用9∶1己烷/乙酸乙酯，然后用7∶3己烷/乙酸乙酯洗脫，得到題述的化合物為一種白色固體(47mg，68％)。
5D)(3S，6R)-二環(huán)[4.4.0]-1，4-二氮-3-(4-氨丁基)-4-N-(4-叔-丁苯磺?；?-2，5-癸二酮，三氟乙酸鹽5C部分的二酮哌嗪(57mg，0.082mmol)溶解于含1％三氟乙酸的二氯甲烷(2ml)中，攪拌15分鐘。反應(yīng)混合液減壓濃縮，得到的油用2克硅膠層析，先用1∶1己烷/乙酸乙酯，然后用甲醇洗脫，冷凍干燥得到題述的化合物為一種白色固體(40mg，89％)。
5E)(3S，6R)-二環(huán)[4.4.0]-1，4-二氮-3-(4-N，N′-(二-叔-丁氧羰基)胍丁基)-4-N-(4-叔-丁苯磺?；?-2，5-癸二酮在含5D部分的胺(40mg，0.073mmol)的二氯甲烷(5ml)溶液中加入三乙胺(0.011ml，0.082mmol，Aldrich公司)和N，N′-二-叔-丁氧基-N″-三氟甲烷磺酰基胍(29mg，0.074mmol，Journal of Organic Chemistry 63(12)3804-3805(1998))。攪拌12小時(shí)后，反應(yīng)混合液傾入二氯甲烷(25ml)中，用1M硫酸氫鈉溶液(5ml)、5％碳酸氫鈉(5ml)和水(5ml)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮。得到的油用5克硅膠層析，先用9∶1己烷/乙酸乙酯，然后用1∶1己烷/乙酸乙酯洗脫，得到題述的化合物為一種白色固體(35mg，71％)。
5F)(3S，6R)-二環(huán)-[4.4.0]-1，4-二氮-3(4-胍丁基)-4-N-(4-叔-丁苯磺?；?-2，5-癸二酮，三氟乙酸鹽5E部分的二酮哌嗪(35mg，0.052mmol)的溶液溶解于1∶1三氟乙酸/二氯甲烷(1ml)中，攪拌1小時(shí)，反應(yīng)混合液減壓濃縮。得到的油用4克硅膠層析，先用19∶1二氯甲烷/甲醇，然后用9∶1二氯甲烷/甲醇洗脫，得到題述的化合物為一種白色固體(28mg，90％)。電噴霧質(zhì)譜(M+H+)@478.0。
實(shí)施例6 (3S，6R)-二環(huán)-[4.4.0]-1，4-二氮-3(3-胍丙基)-4-N-(3-甲基-8-喹啉磺?；?-2，5-癸二酮，鹽酸鹽6A)(3S，6R)-二環(huán)-[4.4.0]-1，4-二氮-3(3-N-(4-三苯甲基)胺丙基)-4-N-(3-甲基-8-喹啉磺?；?-2，5-癸二酮在0℃，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將1.0M二(三甲硅烷基)氨化鋰溶于四氫呋喃(0.88ml，0.88mmol，Aldrich公司)，加入到含實(shí)施例4B部分的二酮哌嗪(350mg，0.73mmol)的無水四氫呋喃(12ml，Aldrich公司)溶液中，反應(yīng)混合液攪拌1小時(shí)。一次性加入3-甲基-8-喹啉磺酰氯(168mg，0.69mmol)，混合液于室溫?cái)嚢?小時(shí)，加入鹽水(15ml)，反應(yīng)混合液用乙酸乙酯(3×25ml)提取。合并有機(jī)提取物用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮。得到的油用35克硅膠層析，用1∶1己烷/乙酸乙酯洗脫，得到題述的化合物為一種白色固體(304mg，64％)。
6B)(3S，6R)-二環(huán)-[4.4.0]-1，4-二氮-3(3-胺丙基)-4-N-(3-甲基-8-喹啉磺?；?-2，5-癸二酮，三氟乙酸鹽6A部分的二酮哌嗪(304mg，0.44mmol)溶解于含1％三氟乙酸的二氯甲烷(30ml)中，攪拌30分鐘。反應(yīng)混合液減壓濃縮，得到的油用25克硅膠層析，先用1∶1己烷/乙酸乙酯，然后用4∶1二氯甲烷/甲醇洗脫，冷凍干燥得到題述的化合物為一種白色固體(240mg，100％)。
6C)(3S，6R)-二環(huán)-[4.4.0]-1，4-二氮-3(3-N，N′-(二-叔-丁氧羰基)胍丙基)-4-N-(3-甲基-8-喹啉磺?；?-2，5-癸二酮在含6B部分的胺(240mg，0.44mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中加入三乙胺(0.12ml，0.8mmol，Aldrich公司)和N，N′-二-叔-丁氧基-N″-三氟甲烷磺?；?164mg，0.42mmol，Journal of Organci Chemistry 63(12)3804-3805(1998))。攪拌12小時(shí)后，反應(yīng)混合液傾入二氯甲烷(50ml)中，用1M硫酸氫鈉溶液(10ml)、5％碳酸氫鈉溶液(10ml)和水(10ml)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮。得到的油用25克硅膠層析，用1∶1己烷/乙酸乙酯洗脫得到題述的化合物為一種白色固體(216mg，73％)。
6D)(3S，6R)-二環(huán)[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-胍丙基)-4-N-(3-甲基-8-喹啉磺酰基)-2，5-癸二酮，鹽酸鹽6C部分的二酮哌嗪(10mg，0.015mmol)溶液溶解于含3N鹽酸的乙酸乙酯(0.27ml)中，攪拌1小時(shí)，反應(yīng)混合液減壓濃縮，冷凍干燥得到題述的化合物為一種白色固體(7mg，88％)。電噴霧質(zhì)譜(M+M+)@473.5。
實(shí)施例7 (3S，6R、8R)-二環(huán)[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-胍丙基)-4-N-(3-甲基-8-喹啉磺酰基)-8-甲基2，5-癸二酮，鹽酸鹽7A)(2R，4R)-1-[Nγ-(4-三苯甲基)-Nα-(9-芴甲氧羰氧基)-L-鳥氨酰]-4-甲基-2-哌啶羧酸，烯丙酯將實(shí)施例2的哌啶酯(406mg，1.43mmol)溶解于1∶1三氟乙酸/二氯甲烷(7ml)中，攪拌2小時(shí)。反應(yīng)混合液減壓濃縮，置真空泵過夜。得到的油溶解于二甲基甲酰胺(7ml)中，冷卻到0℃，加入二異丙基乙胺(0.75ml，4.29mmol，Aldrich公司)。攪拌5分鐘后，加入Nγ-(4-三苯甲基)-Nα-(9-芴甲氧羰氧基)-L-鳥氨酸](1.05g，1.72mmol，Novabiochem公司)，N-羥基苯并三唑(306mg，2.00mmol，Novabiochem公司)和2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽(642mg，2.00mmol，Novabiochem公司)。反應(yīng)混合液攪拌72小時(shí)，傾入乙酸乙酯(125ml)中，用10％鹽酸(2×25ml)，飽和的碳酸氫鈉溶液(2×25ml)和鹽水(25ml)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮。得到的油用75克硅膠層析，用3∶1己烷/乙酸乙酯洗脫，得到題述的化合物為一種白色固體(1.05g，95％)。
7B)(3S，6R、8R)-二環(huán)[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-N-(4-三苯甲基)胺丙基)-8-甲基-2，5-癸二酮在含7A部分的酯(958mg，1.23mmol)的二氯甲烷(246ml)溶液中加入哌啶(6.1ml，61.7mmol，Aldrich公司)，反應(yīng)混合液攪拌4小時(shí)。反應(yīng)混合液減壓濃縮，得到的油用65克硅膠層析，先用4∶1己烷/乙酸乙酯，然后用1∶1己烷/乙酸乙酯洗脫，得到題述的化合物為一種白色固體(520mg，96％)。
7C)(3S，6R、8R)-二環(huán)[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-N-(4-三苯甲基)胺丙基)-4-N-(3-甲基-8-喹啉磺?；?-8-甲基-2，5-癸二酮在0℃，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將1.0M二(三甲硅烷基)氨化鋰溶于四氫呋喃(0.50ml，0.50mmol，Aldrich公司)，加入到含7B部分的二酮派嗪(250mg，0.50mmol)的無水四氫呋喃(7ml，Aldrich公司)溶液中，反應(yīng)混合液攪拌1小時(shí)。一次性加入3-甲基-8-喹啉磺酰氯(97mg，0.40mmol)，混合物用于室溫?cái)嚢?小時(shí)。加入鹽水(7ml)，反應(yīng)混合液用乙酸乙酯(3×20ml)提取。合并的有機(jī)提取物用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮。得到的油用25克硅膠層析，先用3∶1己烷/乙酸乙酯，然后用3∶2己烷/乙酸乙酯洗脫，得到題述的化合物為一種白色固體(177mg，63％)。
7D)(3S，6R、8R)-二環(huán)[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-胺丙基)-4-N-(3-甲基-8-喹啉磺?；?-8-甲基-2，5-癸二酮，三氟乙酸鹽7C部分的二酮哌嗪(264mg，0.38mmol)溶解于含1％三氟乙酸的二氯甲烷(26ml)中，攪拌30分鐘。反應(yīng)混合液減壓濃縮，得到油用20克硅膠層析，先用1∶1己烷/乙酸乙酯，然后用19∶1二氯甲烷/甲醇洗脫，冷凍干燥得到題述的化合物為一種白色固體(206mg，100％)。
7E)(3S，6R、8R)-二環(huán)[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-N，N′-(二-叔-丁氧羰基)胍丙基)-4-N-(3-甲基-8-喹啉磺?；?-8-甲基-2，5-癸二酮在7D部分的胺(206mg，0.38mmol)的二氯甲烷(8ml)溶液中加入三乙胺(0.053ml，0.38mmol，Aldrich公司)和N，N′-二-叔-丁氧基-N″-三氟甲烷磺酰基胍(82mg，0.34mmol，Journal of Organic Chemistry 63(12)3804-3805(1998))。攪拌12小時(shí)后，反應(yīng)混合液傾入二氯甲烷(50ml)中，用1M硫酸氫鈉溶液(10ml)、5％碳酸氫鈉溶液(10ml)和水(10ml)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮。得到的油用15克硅膠層析，用1∶1己烷/乙酸乙酯洗脫，得到題述的化合物為一種白色固體(140mg，60％)。
7F)(3S，6R，8R)-二環(huán)[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-胍丙基)-4-N-(3-甲基-8-喹啉磺?；?-8-甲基-2，5-癸二酮，鹽酸鹽7E部分的二酮哌嗪(10mg，0.15mmol)溶液溶解于含3N鹽酸的乙酸乙酯(0.27ml)中，攪拌1小時(shí)，反應(yīng)混合液減壓濃縮，冷凍干燥得到題述的化合物為一種白色固體(7.5mg，94％)。電噴霧質(zhì)譜(M+H+)于487.5。
實(shí)施例8 (3S，6R，8R)-二環(huán)[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-胍丙基)-4-N-(1，2，3，4-四氫-3-甲基-8-喹啉磺?；?-8-甲基-2，5-癸二酮，鹽酸鹽8A)(2R，4R)-1-[Nγ(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺?；?-Nα-(叔-丁氧羰基)-L-精氨酰]-4-甲基-2-哌啶羧酸將實(shí)施例2的哌啶酯(375mg，1.32mmol)溶解于1∶1三氟乙酸/二氯甲烷(8ml)中，攪拌2小時(shí)。反應(yīng)混合液減壓濃縮，置真空泵過夜。得到的油溶解于二甲基甲酰胺(8ml)中，冷卻到0℃，加入二異丙基乙胺(1.15ml，6.6mmol，Aldrich公司)。攪拌5分鐘后，加入Nγ-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺?；?-Nα-(叔-丁氧羰基)-L-精氨酸(769mg，1.58mmol，Novabiochem公司)、N-羥基苯并三唑(283mg，1.85mmol，Novabiochem公司)和2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲(594mg，1.85mmol，Novabiochem公司)。反應(yīng)混合液攪拌18小時(shí)，傾入乙酸乙酯(75ml)中，用10％檸檬酸(2×10ml)、飽和的碳酸氫鈉溶液(2×10ml)和鹽水(10ml)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得到(2R，4R)-1-[Nγ-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺?；?-Nα-(叔-丁氧羰基)-L-精氨酰]-4-甲基-2-哌啶羧酸、烯丙酯為一種白色泡沫樣固體。
從上得到的肽溶解于1∶1三氟乙酸/二氯甲烷(8ml)中，攪拌5分鐘。反應(yīng)混合液減壓濃縮，置真空泵5分鐘。得到的油溶解于二氯甲烷(20ml)中，加入三乙胺(1.8ml，13.2mmol，Aldrich公司)和3-甲基-8-喹啉磺酰氯(319mg，1.32mmol)。攪拌1小時(shí)后，反應(yīng)混合液傾入二氯甲烷(50ml)中，用水(15ml)和鹽水(15ml)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，得到(2R，4R)-1-[Nγ-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基)-Nα-(3-甲基-8-喹啉磺?；?-L-精氨酰]-4-甲基-2-哌啶羧酸、烯丙酯為一種淡黃色泡沫樣固體。
從上得到的肽溶解于無水乙醇(14ml)和1N氫氧化鈉溶液(3.6ml)中。攪拌21小時(shí)后，反應(yīng)混合液用1N鹽酸調(diào)節(jié)至pH7，減壓濃縮。得到的殘余物溶解于1∶1乙酸乙酯/水(20ml)中，溶液用1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH11，用乙酸乙酯(2×30ml)提取。水層用1N鹽酸調(diào)節(jié)至pH2，用氯仿(3×50ml)提取。合并的氯仿提取液用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，得到題述的化合物為一種白色泡沫樣固體(3步總收率88％，829mg)。
8B)(2R，4R)-1-[Nγ(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基)-Nα-(1，2，3，4-四氫-3-甲基-8-喹啉磺?；?-L-精氨酰]-4-甲基-2-哌啶羧酸8A部分的酸(100mg，0.14mmol)和含10％鈀炭(28mg，Aldrich公司)的95％乙醇(2ml)的懸浮液和1N鹽酸(0.12ml)置15ml密封管內(nèi)在75℃-80℃，氫氣條件下加熱65小時(shí)?；旌弦豪鋮s到室溫，過濾、減壓濃縮.。得到的油用15克硅膠層析，先用乙酸乙酯，然后用4∶1二氯甲烷/甲醇洗脫，得到題述的化合物為一種白色固體(58mg，58％)。
8C)(3S，6R，8R)-二環(huán)[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-(Nγ-4-甲氧基-2，3，6-三甲苯磺?；?胍丙基)-4-N-(3-甲基-1，2，3，4-四氫-8-喹啉磺酰基)-8-甲基-2，5-癸二酮在含8B部分的酸(58mg，0.080mmol)的二氯甲烷(16ml)溶液中加入N-羥基苯并三唑(12mg，0.080mmol，Novabiochem公司)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽(26mg，0.080mmol，Novabiochem公司)、和二異丙基乙胺(0.014ml，0.080mmol，Aldrich公司)。反應(yīng)混合液攪拌3小時(shí)，傾入乙酸乙酯(30ml)中，用飽和的碳酸氫鈉溶液(10ml)和鹽水(10ml)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮。得到的油用6克硅膠層析，用1∶4己烷/乙酸乙酯洗脫，冷凍干燥得到題述的化合物為一種白色固體(51mg，91％)。
8D)(3S，6R，8R)-二環(huán)[4.4.0]-1，4-二氮-3-(3-胍丙基)-4-N-(1，2，3，4-四氫-3-甲基-8-喹啉磺酰基)-8-甲基-2，5-癸二酮，鹽酸鹽8C部分的二酮哌嗪(36mg，0.051mmol)溶解于1∶1三氟乙酸/二氯甲烷(4ml)中，攪拌20小時(shí)，減壓濃縮。得到的油溶解于含3N鹽酸的乙酸乙酯(4ml)中，攪拌1小時(shí)，減壓濃縮。得到的油用2克硅膠層析，先用乙酸乙酯洗脫，然后用甲醇洗脫，冷凍干燥得到題述的化合物為一種白色固體(20mg，74％)。電噴霧質(zhì)譜(M+H+)于491.5。
實(shí)施例9 Cycloargatroban(分子式I)的生物學(xué)測(cè)定，其中R1、R2和R4是氫，R3是甲基，R5是1，2，3，4-四氫-3-甲基-8-喹啉磺酸基和R6是3-胍丙基本發(fā)明的活性和選擇性可通過測(cè)定絲氨酸蛋白酶，如凝血酶、胰蛋白酶和溶解血纖維蛋白的酶，如尿激酶、纖溶酶和組織纖溶酶原激活物(tPA)的抑制常數(shù)(Ki)來鑒定。所有的酶購(gòu)自Sigma公司。一般測(cè)定條件如下熒光的底物溶解于DMSO中，用含50mM Tris-HCl(pH7.8，25℃)、0.1M NaCl和0.1％聚乙二醇8000的測(cè)定緩沖液稀釋。對(duì)凝血酶，熒光的底物為Tos-Gly-Pro-Arg-AMC(Sigma公司，Km＝4.0μM，25℃，pH7.8)(Yudu Cheng etal.，Biochemistry，1996，3513021-13029)；對(duì)胰蛋白酶為Bz-Arg-AMC·HCl(Bachem公司，Km＝59±2μM，25℃，pH8.0)；對(duì)尿激酶為N-Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC(Sigma公司，Km＝400μM，24℃，pH7.5)；對(duì)纖溶酶為為D-Ala-Leu-Lys-AMC(Sigma公司，Km＝620μM，25℃，pH8.0)；對(duì)tPA為Boc-L-(p-F)FPR-ANSNH-C2H5(血液技術(shù)公司，Km＝71μM，25℃，pH7.4)。采用日立F2500分光光度計(jì)在常溫下進(jìn)行測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為383nm和455nm。酶測(cè)定的典型累進(jìn)數(shù)據(jù)如

圖1-3所示，抑制常數(shù)(Ki)的測(cè)定如圖4所示。與目前臨床使用且具有化學(xué)結(jié)構(gòu)XIII的一種抗凝劑argatroban比較的測(cè)定結(jié)果列于表1。
結(jié)果表明由argatroban的主鏈環(huán)化衍生得到的Cycloargatroban，有以下特征(1)保持高的凝血酶抑制活性(比argatroban低2.1倍)；(2)對(duì)凝血酶的選擇性高于胰蛋白酶(比argatroban高12倍)；(3)對(duì)溶解血纖維蛋白的酶無明顯的抑制作用(類似于argatroban)；(4)在側(cè)鏈上保持多樣性(類似于argatroban)。
表1Argatroban(化學(xué)結(jié)構(gòu)XIII見下面)和Cycloargatroban(結(jié)構(gòu)式I，其中R1、R2和R4是氫，R3是甲基，R5是1，2，3，4-四氫-3-甲基-8-喹啉磺酸基和R6是3-胍丙基)的測(cè)定結(jié)果比較
*Cycloargatroban[Ki(酶)/Ki(凝血酶)]與Argatroban[Ki(酶)/Ki(凝血酶)]比較
實(shí)施例10體外凝血測(cè)定與目前臨床使用且具有下列化學(xué)結(jié)構(gòu)的對(duì)照抗凝劑argatroban比較 采用采集的正常人血漿，通過在廣濃度范圍內(nèi)分別加入凝血酶抑制劑來測(cè)定活化的部分促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)的延長(zhǎng)來測(cè)定NPI 999的體外抗凝血作用。從Sigma公司得到凍干收集的人血漿。采用ELECTRATM800自動(dòng)血凝固計(jì)(醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化公司)和自動(dòng)的APTT試劑(Sigma公司)作為血凝固的起始物，按照制造商的說明書測(cè)定APTT。在迅速融化的血漿中配制一系列對(duì)照化合物和測(cè)試化合物的稀釋液(化合物∶血漿＝0.1ml∶0.9ml)，然后向測(cè)試流程的孔中添加混合的溶液進(jìn)行測(cè)定。在整個(gè)測(cè)定中采用三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液(pH7.8，25℃)。
圖5表示NPI999(空心圓)和argatroban(空心方格)對(duì)正常用檸檬酸鹽處理的人血漿的活化部分促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)的作用。如圖5所示，兩種化合物對(duì)延長(zhǎng)了APTT有劑量依賴性。這表明凝血酶在血漿中失活。需指出的是，APTT測(cè)定了化合物對(duì)凝血的酶，如凝血酶、血漿、尿激酶、組織纖溶酶原激活酶(tPA)和絲氨酸蛋白酶，如胰蛋白酶、凝血因子X等的總的抗凝血作用。因此，Cycloargatroban(結(jié)構(gòu)式I)對(duì)APTT的作用強(qiáng)度稍差于argatroban可歸咎于cycloargatroban(結(jié)構(gòu)式I)對(duì)凝血和絲氨酸蛋白酶的選擇性略高于argatroban。
雖然已描述的發(fā)明與特定的最佳實(shí)施例有關(guān)，但可以認(rèn)為發(fā)明可進(jìn)一步改進(jìn)，本發(fā)明意圖是用來覆蓋發(fā)明的任何進(jìn)一步的改變、用途或適應(yīng)性?？傊?，遵照發(fā)明的原理，且包括目前的披露偏離與本發(fā)明有關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)和已知或習(xí)慣的范圍，可適用于上文中陳述的基本特征。所附的權(quán)利要求范圍如下。
權(quán)利要求
1.一種具有下列結(jié)構(gòu)I的化合物 或一種藥學(xué)上可接受的鹽和立體異構(gòu)體，其中R1、R2和R4代表氫、烷基或芳基部分，R3代表烷基或芳基部分，R5代表氫、烷基、芳基、氫芳基、雜芳基、氫雜芳基、磺酰烷基、磺酰芳基、磺酰氫芳基、磺酰雜芳基或磺酰氫雜芳基部分，R6代表氫、烷基、芳基、氫芳基、雜芳基或氫雜芳基部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種化合物，其中R1、R2和R4代表氫、烷基或芳基部分，R3代表烷基或芳基部分，R5代表烷基、芳基、氫芳基、雜芳基或氫雜芳基部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種化合物，其中R3代表甲基部分，R5代表1，2，3，4-四氫-3-甲基-8-喹啉磺?；?，R6代表3-胍丙基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種藥物成分，包括一種化合物作為與藥學(xué)上可接受的載體相結(jié)合的活性組份。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種藥物成分，包括與藥學(xué)上可接受的載體相結(jié)合的一種化合物，所述的藥物成分適合于口服。
6.一種明顯阻止哺乳動(dòng)物或人或組織中的凝血酶活性的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物、人或組織給與根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種有效量的化合物。
7.一種治療哺乳動(dòng)物或人或組織中的凝血障礙的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物、人或組織給與根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種有效量的化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，障礙包括血栓形成或肝素誘導(dǎo)血小板減少癥。
9.一種明顯阻止哺乳動(dòng)物或人或組織中的凝血酶活性的方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物、人或組織給與根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種有效量的藥物成分。
10.一種明顯阻止哺乳動(dòng)物或人或組織中的溶解血纖維蛋白的酶活性的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物、人或組織給與根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種有效量的藥物成份。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的一種方法，溶解血纖維蛋白的酶是從一組尿激酶、血漿和組織纖溶酶原激活物(tPA)中挑選出的。
12.一種治療哺乳動(dòng)物或人或組織中的凝血障礙的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物、人或組織給與根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種有效量的藥物成分。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的一種方法，障礙包括血栓形成或肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑制血凝固的化合物，尤其是特異性地抑制凝血酶新的二酮派嗪衍生物；藥學(xué)上可接受的鹽類及其成分?；衔锞哂腥缦峦ㄊ狡渲蠷
文檔編號(hào)C07D471/04GK1402725SQ00816317
公開日2003年3月12日 申請(qǐng)日期2000年11月29日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月30日
發(fā)明者程毓渡, 杰弗里·曼韋爾 申請(qǐng)人:四川達(dá)鑫生物科技有限公司