專利名稱：PCR高通量構(gòu)建siRNA全位點分子庫制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種siRNA分子庫制備方法。
背景技術(shù)：
siRNA (small interfering RNA:小片段干擾核糖核酸)是雙鏈短 小核酸堿基片斷，一般功能長度為19-23bp。其作用是與特定靶基因mRNA 結(jié)合引起同源mRNA特異性降解失去功能。這種雙鏈介導(dǎo)的高效轉(zhuǎn)錄的 基因沉默現(xiàn)象稱之為RNAi (RNAinterference:核糖核酸干擾)，是自然存 在于細(xì)胞的防御能力雙鏈RNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)被體內(nèi)Dicer酶切割成 21-23個核酸堿基片斷的siRNA，先與細(xì)胞內(nèi)的其他成分結(jié)合成一個核 酸復(fù)合體而形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA induced silencing complex, RISC)。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA上并切割而導(dǎo)致 mRNA降解，從而清除細(xì)胞內(nèi)特定的基因表達(dá)而發(fā)揮作用。siRNA不僅 廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究，而且在治療多種疾病如病毒感染、腫瘤、血 管神經(jīng)系統(tǒng)疾病等具有廣闊的前景。它是繼單克隆抗體之后的一種劃時 代的能用于治療多種疾病的生物藥分子類型，是當(dāng)今靶向性基因藥物開 發(fā)的熱點。RNAi耙向性基因藥物開發(fā)的第一步就是在靶基因的眾多的siRNA 分子中篩選siRNA的最佳結(jié)合位點-g卩耙點(通常指該基因的沉默效率最 高，結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定的且與別的基因不同源的siRNA)。篩選樣本中的siRNA 分子的代表性和多樣性至關(guān)重要。靶基因的siRNA是否能多，快，好，
省的合成直接影響到R嵐i靶向性基因藥物開發(fā)的進(jìn)展?？v觀SiRNA合成方法可分兩大類即化學(xué)合成和生物合成。siRNA化學(xué)合成是用核酸合成儀直接合成核酸堿基片斷。可以直接 合成RNA堿基小片段(siRNA)或先合成DNA堿基小片段，再克隆到siRNA 表達(dá)載體，利用載體的RNA聚合酶III啟動子(U6或/和HI)在細(xì)胞 內(nèi)將DNA片段轉(zhuǎn)錄成siRNA。直接合成RNA堿基片段費用昂貴而且RNA 片段不能直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，必需外加其它的化學(xué)修飾才能跨膜 傳輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)。先合成DNA堿基小片段再克隆到siRNA表達(dá)載體細(xì)胞內(nèi) 表達(dá)，因涉及分子克隆過程，在眾多siRNA分子合成時量化極其困難。 除此之外，在選擇哪段序列進(jìn)行合成上一直存在盲點。siRNA的最佳靶 點是很難被電腦程序"猜"到的。siRNA生物合成是利用生物酶以全長雙鏈cDNA或雙鏈RNA為底物 的一系列催化反應(yīng)而實現(xiàn)的。而合成的siRNA是分子庫的形式出現(xiàn)，理 論上具有全部siRNA分子，是靶點篩選的良好工具。以雙鏈RNA (dsRNA)為底物是憑借T7RNA聚合酶以DNA為摸板 在體外轉(zhuǎn)錄制備長雙鏈RNA片斷，然后用Dicer酶直接將其切割成短 小RNA片斷。Dicer酶是核糖核酸酶III(Ribonuclease III,RNase III)家族的成員，廣泛存在于蠕蟲真菌物及哺乳動物細(xì)胞內(nèi)。體外重組Dice酶 利用Dicer酶直接將其切割成21-23bp短小RNA片斷，模仿體內(nèi)自然的 RNA干擾起始階段，該酶在市場上已有銷售(Ambion，USA) 。 Dicer酶得 到一群siRNA分子，這種siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，方法和單 一的siRNA轉(zhuǎn)染一樣。由于siRNA "群"有許多不同的位點的si飄s，
通常能夠保證目的基因被有效地抑制。這種方法有兩個缺點1 )短小RNA 片斷不可能再逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，無法加以克隆，導(dǎo)致無法分離siRNA"群" 中的RNAi分子，無法進(jìn)行siRNA藥物耙點的篩選。2) siRNA分子群體 一并投入,容易引發(fā)非特異的基因沉默。以DNA模板(耙基因cDNA;總體cDNA或基因組DNA)構(gòu)建siRNA 分子庫可以將siRNA分子各種位點一并加以克隆，克服上述雙鏈RNA為 底物的瓶頸，不但可以用于高通量的siRNA介導(dǎo)的功能基因組研究，更重要的是便于實行RNAi基因治療最佳靶點的篩選。但Dicer酶無法作用于cDNA模板，目前報道的以DNA模板構(gòu)建siRNA分子庫方法都通過II型限制性內(nèi)切酶Mmel實現(xiàn)的。Mmel能識別和限定切割其相鄰任意1 8 — 20個核苷酸序列，是II型限制性內(nèi)切酶的最長識別位點，無法模仿體內(nèi)Dicer酶自然形成的21-23bP siRNA片斷，在實行RNAi基因治療 最佳靶點的篩選上存在盲點與瓶頸。最近lll型限制性內(nèi)切酶EcoP151已問世(New England Biolabs;USA)，能識別和限定切割其相鄰任意的25 — 27個核苷酸序列(是目前切割跨度最長的限制性內(nèi)切酶)。在一個DNA底物分子中必須有兩個對立而置EcoP151的識別序列才能被切割 -----〉5'CAGCA(N)25-------------------------......................27(N)GTGCTG3'3 ，GTCGT(N)27—……----------------------........-—-25(N)C ACGAC5 ，〈---------基于上述限定的條件，目前尚未見有用于siRNA分子庫的構(gòu)建的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種III型限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的PCR高通量 構(gòu)建SiRNA全位點分子庫制備方法。本方法克服了目前其它II型型限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的siRNA分子庫構(gòu)建方法存在的盲點和瓶頸，產(chǎn)生的 siRNA片斷能任意控制在16-23bp之間，不但可完全模仿體內(nèi)自然的 siRNA 21-23bp長度，而且可以囊括目前II型型限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的siRNA分子構(gòu)建長度(18-20bp)，適用于RNAJ基因治療最佳靶點的篩 選。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是1、 一種PCR高通量構(gòu)建siRNA全位點分子庫的制備方法，其特征是為依次包括下列步驟和結(jié)構(gòu)(1 )將起始DNA在Mn^的緩沖體系中用DNAse I行不完全消化， 消化后的DNA和產(chǎn)生16-23bp的siRNA環(huán)狀磷酸接頭-l進(jìn)行平端連接；結(jié)構(gòu)上，各環(huán)狀磷酸接頭-i都包含一個ni型限制性酶切位點，該位點的近端即近接頭平端，與多聚A/T序列相接續(xù)，遠(yuǎn)端即近發(fā)夾環(huán)部， 與一個II型限制性酶切位點相接續(xù)，通過加減多聚A/T堿基對的數(shù)目， 可以控制各環(huán)狀磷酸接頭-1中的III型限制性酶切長度，使siRNA長度呈 可控性分布，遠(yuǎn)端II型限制性酶切位點能介導(dǎo)多聚A/T的克隆方式，一 旦克隆能產(chǎn)生U6和HI啟動子多聚A和多聚T的轉(zhuǎn)錄起始和終止信號， 去除啟動子和siRNA之間多余的克隆位點序列；所述的環(huán)狀磷酸接頭-1的通式為 5'pC(n)TTTTN(n) III型內(nèi)切酶N(n) II型內(nèi)切酶-PCR錨序列-環(huán)3， G(n)AAAAN(n) III型內(nèi)切酶N(n) II型內(nèi)切酶-PCR錨序列-環(huán)上述P:磷酸鍵；N: G，C,T，A任意堿基；n:堿基數(shù)(0-20)，可計算 上述兩種限制性內(nèi)切酶的距離相應(yīng)調(diào)整；(2)以上述平端連接反應(yīng)后的產(chǎn)物為模板，用環(huán)狀磷酸接頭-1的 反義鏈序列為引物進(jìn)行"單引物"PCR擴增，選擇性擴增兩個對立而置的ni型限制性酶切位點分子，使之能被ni型限制性酶消化；(3 )PCR產(chǎn)物用III型限制性內(nèi)切酶消化，酶切后的DNA呈粘性末端；(4) 上述DNA酶切后的粘端用DNA聚合酶在dNTPs存在下補平， 然后與磷酸接頭-2進(jìn)行平端連接。該接頭包含一個II型限制性內(nèi)切酶消 化位點(與磷酸接頭-l產(chǎn)生相同的粘端)，為進(jìn)行克隆所用；(5) 將經(jīng)步驟(4)平端連接后的產(chǎn)物用5'(磷酸接頭-l)和3' 磷酸接頭-2)引物進(jìn)行PCR擴增；(6) 純化PCR產(chǎn)物后進(jìn)行n型限制性內(nèi)切酶消化，兩側(cè)產(chǎn)生AAAA粘端；(7) 分離目的片段后，克隆到帶有Ts/Ai粘端的表達(dá)載體構(gòu)建siRNA分子庫或miRNA (microRNA，即:微小RNA)分子庫；前者帶有U6和Hl 雙啟動子，表達(dá)雙鏈的siRNA;后者為U6或Hl單一啟動子，表達(dá)單鏈 的mi腿。一經(jīng)克隆能產(chǎn)生U6或/和Hl啟動子多聚A和多聚T的轉(zhuǎn)錄起始和終止 信號。在環(huán)狀磷酸接頭-1的轉(zhuǎn)錄起始信號多聚A后加一個增強轉(zhuǎn)錄效率 的"G"堿基。上述步驟可用以下產(chǎn)生19-23bp的siRNA分子庫為例來表示 1.)各環(huán)狀資酸^^1連接DNA: (DNA為DNase l不全消化產(chǎn)物)(EE2.)單引物PCR擴增:3.) EcoP15 I消化(19-23bp) 19-23bp) 4.)粘端補平，與環(huán)狀資酸接頭-2連接Fok15'PCTTTTT……CATC3'GAMAA……GTAGi(19-23bp) 5.)雙引物PCR擴'l増6.)Fokl消化7.>克隆到siRNA表達(dá)載體(19-23bp)3 aaaU6 siRNA(19-23bp)H1環(huán)狀璘酸接頭-1結(jié)構(gòu)5'P(C(^)(t4—7)ECOp151 d)Fok1 3'(GM)(A4.7)Ecop15l( N0<J)Fok1PCR錨(N27)CTGCTG (N13)CATCC (N25)GACGAC (N 9>GTAGG分解19bp siRNA接頭Ecop15 Fokl5'pct'I h I I ICTGCTG CATCC— 3'GAAAAAAAGACGAC GTAGG-—20bpsiRNA接頭5' PCTTTTTTC丁GCTGNCATCC---:〕,'GAAAAAAGA,CGACNC，丁AGC，匿匿.21 bp siRNA接頭5' pc丁ttttc丁gctgN Ncatcc-3'gaaaaagacgacMNgtagg-22 bp siRNA接頭5' pcttttc丁gctgN N Ncatcc—:TGAAAAGACGACN關(guān)GTAGG--23 bp siRNA接頭5' P丁TTTCTGCTGN N NCATCC:---3'AAAAGACGACNNNGTAGG---具體可以解釋為 1.)環(huán)狀磷酸接頭-1的結(jié)構(gòu)和連;DNA在錳離子存在下經(jīng)DNase I不完全消隨機消化的片段為平端， 可以直接和環(huán)狀磷酸接頭-1進(jìn)行平端連接。為了構(gòu)建各種功能長度的 siRNA的分子以供耙點的篩選，本發(fā)明首先采用III型限制性內(nèi)切酶構(gòu) 建siRNA分子庫的方法。III型限制性內(nèi)切酶Ec叩15I是目前切割跨度最長的限制性內(nèi)切酶，可以限定切割其相鄰任意的25 — 27個核苷酸序 列。為了分別產(chǎn)生固定的19bp; 20bp; 21bp; 22bp和23bp siRNA的長 度，本發(fā)明設(shè)計了各種相應(yīng)的環(huán)狀磷酸接頭-1。圖中所示的19-23bp的 環(huán)狀磷酸接頭-1僅為示范，如需要可以繼續(xù)向下設(shè)計到16-18bp。
本發(fā)明的環(huán)狀磷酸接頭-1有三大特點I) 起siRNA分子各種功能長度控制作用siRNA分子功能長度一般 為19-23bp，目前只能依賴核酸儀一一化學(xué)合成。以全長基因為原料的 生物合成是一系列的酶促反應(yīng)，目前還沒有任何生物合成的方法能指定 合成這一長度分布。在圖示的環(huán)狀磷酸接頭-1的結(jié)構(gòu)中，本發(fā)明的技術(shù) 方案特點之一是在Ecopl5I位點的近端(近接頭平端)與多聚A/T序列 相接續(xù)，通過加減多聚A/T堿基對的數(shù)目，可以控制各環(huán)狀磷酸接頭-l 中Ecopl51的酶切指定長度，使siRNA長度呈可控性分布于19-23bp， 也可根據(jù)需要固定在其某一長度。這樣不但可以模仿體內(nèi)DICER酶所 產(chǎn)生的自然長度(21-23bp)，也可以囊括目前其它siRNA分子庫構(gòu)建方法所用的II型限制性酶Mmel實現(xiàn)的極限長度(19-20bp)，并能擴展到其它長度(如16-18bp等)?；贓copl51是目前切割長度最長的III 型限制性內(nèi)切酶，隨著具有更長切割長度的III型限制性內(nèi)切酶出現(xiàn)， 視需要可根據(jù)本發(fā)明技術(shù)路線將siRNA長度向上延伸(如24-29bp)。但 目前公認(rèn)，siRNA長度過長(〉30 bp)或過短(〈16 bp)都會引起核酸 干擾反應(yīng)失敗。前者引起細(xì)胞凋亡，后者則反應(yīng)無效。本發(fā)明的所列舉 的19-23bp的長度是目前公認(rèn)的siRNA定義長度。II) 多聚A/T序列起克隆位點的和RNA聚合酶III啟動和終止信號 的作用RNA聚合酶III啟動子(U6和Hl)的起始信號為AAAAA，終止信 號為TTTTT。環(huán)狀磷酸接頭-1中Ec叩151的遠(yuǎn)端(近發(fā)夾環(huán)部)所設(shè)置的II型限制性酶Fokl酶能識別和限定切割其相鄰任意9一 1 3個核苷酸序列，通過和Ecopl5I之間"N"堿基數(shù)的調(diào)節(jié)，切點能產(chǎn)生A4 (4 個"AAAA"堿基)的粘性末端和表達(dá)載體的T 5 / A i粘性末端連接。當(dāng)siRNA分子克隆到表達(dá)載體后，即產(chǎn)生啟動子的AAAAA起始信號和 TTTTT終止信號。運用本發(fā)明的技術(shù)方案，RNA聚合酶III(U6和H1) 在啟動子的AAAAA起始信號和siRNA之間去除與siRNA無關(guān)的多余克 隆位點的序列，降低siRNA在靶點篩選中的脫靶現(xiàn)象。除此之外，在 U6和Hl的起始信號AAAAA之后加堿基"G"可以增強siRNA轉(zhuǎn)錄效 率。本發(fā)明在產(chǎn)生22bp以下的siRNA環(huán)狀磷酸接頭-1結(jié)構(gòu)的多聚A前 都含有堿基"G"。克隆后堿基"G"位于AAAAA之后。而產(chǎn)生23bp 的siRNA環(huán)狀磷酸接頭-l的結(jié)構(gòu)中，為了Ec叩15I保證產(chǎn)生足夠的長度， 堿基"G"被省略，而被視為特列。如特殊需要，此時堿基"G"可以 加在表達(dá)載體上。隨著具有更長切割長度的III型限制性內(nèi)切酶出現(xiàn)， 產(chǎn)生23bp以上的siRNA環(huán)狀磷酸接頭-l的結(jié)構(gòu)也可列入上述通列中。III)環(huán)狀磷酸接頭的結(jié)構(gòu)在siRNA構(gòu)建過程中起保護(hù)作用 環(huán)狀磷酸接頭由于是一端呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)(發(fā)夾環(huán)狀)的二級結(jié)構(gòu)，可 防磷酸接頭充當(dāng)PCR引物在在后續(xù)的PCR擴增中起非特異性擴增的副 作用。除此之外，環(huán)狀結(jié)構(gòu)與DNA片段連接的過程中可以防止形成多 個磷酸接頭的自身連接。這種自連現(xiàn)象極易發(fā)生在雙平端磷酸接頭而形 成磷酸接頭的多聚體。磷酸接頭多聚體一旦形成，因長度和正常連接的 DNA分子相仿，不易被分離而造成siRNA分子庫的污染，使有效克隆 數(shù)嚴(yán)重降低。2.)單引物PCR擴增 III型限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的消化反應(yīng)的必需條件是在底物(DNA)同一分子內(nèi)存在兩個酶切位點，而且這兩個位點必需對立而置。 以EcoP15I為例 (A)EcoP15I-…〉-——CAGCA(N)25(多聚a)陽----......................(多聚t)27(N)GTGCTG-———■GTCGT(N)27(多聚t)---------—---------------------(多聚a)25(N)CACGAC—-〈…-EcoP151然而，由于環(huán)狀磷酸接頭-1和DNA的平端連接，除上述可消化分子 (A)夕卜，還可以出現(xiàn)其它兩種不可消化分子(B和C):(B)-—GTCGT(N)27(多聚t)-------—-曙--................--(多聚t)27(N)GTGCTG—-—曙CAGCA(N)2s(多聚a).........................-—--(多聚a)2s(N)CACGAC—-(C)CAGCA(N)25(多聚a).......-墨一一------------------(多聚a)25(N)CACGAC—扁-—GTCGT(N)27(多聚t)——.........-.................(多聚t)27(N)GTGCTG-—本發(fā)明用單一引物PCR選擇性擴增III型限制性內(nèi)切酶可消化的(A)分子單一引物 5，——〉3，—CAGCA(N)25(多聚a)-----------.........--------(多聚t)27(N)GTGCTG—--—GTCGT(N)27(多聚t)-----------------------------(多聚a)25(N)CACGAC—-3，〈——5，單一引物
由于此單一引物為環(huán)狀磷酸接頭-1的反義鏈(指環(huán)狀磷酸接頭-l的無磷酸鍵的鏈)，只對已獲得對立而置的m型限制性內(nèi)切酶位點(上述A)分子進(jìn)行特異性的擴增。PCR產(chǎn)物可被III型限制性內(nèi)切酶EcoP151 消化。上述(B) 、 (C)分子在PCR過程中被淘汰。3. ) EcoP151消化對PCR產(chǎn)物進(jìn)行III型限制性內(nèi)切酶(如EcoP151)消化，限定切割其相鄰任意的25 — 27個核苷酸序列。5種混合環(huán)狀磷酸接頭-1，由于調(diào)節(jié)了 Ec叩5I相鄰的多聚A/T堿基數(shù)，切割的DNA (除去磷酸接 頭序列)呈現(xiàn)19-23bp可控性多樣分布。4. )粘性補平，與環(huán)狀磷酸接頭-2連接EcoP151消化后的DNA為粘性末端，用DNA聚合酶在dNTPs存 在下將其補平。分離目的片段后與環(huán)狀磷酸接頭-2進(jìn)行平端連接。環(huán)狀 磷酸接頭-2起PCR錨和克隆作用。環(huán)狀磷酸接頭-2的平端連接可隨機 產(chǎn)生如下兩種分子<formula>formula see original document page 13</formula><formula>formula see original document page 14</formula>Fok I為II型限制性內(nèi)切酶，限定切割其相鄰任意的9一1 3個核 苷酸序列。切割位點設(shè)計在磷酸接頭多聚A/T序列處，但唯有在正義 鏈和反義鏈的5'端產(chǎn)生AAAA才能在本系統(tǒng)中進(jìn)行克隆<formula>formula see original document page 14</formula>以上(B)的接序結(jié)構(gòu)可以滿足這種要求。用5'(磷酸接頭-l)和3' (磷酸接頭-2)引物以選擇性擴增(B)分子。<formula>formula see original document page 14</formula>(5-7.)雙引物PCR擴增，F(xiàn)okl消化，克隆到表達(dá)載體 用5，(磷酸接頭-1)和3'(磷酸接頭-2)引物行PCR擴增。純化PCR產(chǎn) 物后進(jìn)行FokI酶消化，分離目的片段，克隆到siRNA表達(dá)載體(具有 U6和H1雙啟動子，表達(dá)雙鏈的siRNA)，完成siRNA分子庫的構(gòu)建。 也可克隆到miRNA (micro RNA)表達(dá)載體(具有U6或HI單一啟動子； 表達(dá)單鏈的miRNA)構(gòu)建miRNA分子庫。本發(fā)明解決了以III型限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的PCR高通量構(gòu)建siRNA
全位點分子庫制備方法，由此產(chǎn)生的SiRNA功能片斷可控性分布在19-23bp，這樣可完全模仿體內(nèi)自然的siRNA分子多樣性，適用于RNAi基因治療最佳靶點的篩選，克服了目前其它siRNA分子庫構(gòu)建方法存在 的盲點和瓶頸。


下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。圖1:本實施例的起始DNA: SARS冠狀病毒膜蛋白666bpDNA的1 % Agarose電泳圖。 圖2:經(jīng)DNAse I不完全酶切后1 %Agarose電泳圖。 圖3:單一引物PCR (PCR-1)擴增后的l%Agarose電泳圖。 圖4:跟蹤酚提后D N A回收的l%Agarose膠電泳圖。 圖5:證實Ecopl51消化后66bpDNA片段的20。/。PAGE電泳圖。 圖6:證實PCR-2反應(yīng)產(chǎn)生109bp特異條的20%PAGE電泳圖。 圖7: Fok I酶切產(chǎn)物的20%PAGE電泳圖。 圖8:菌檢PCR產(chǎn)物的l%Agarose膠檢電泳圖。 圖9:菌檢PCR產(chǎn)物Sfi I酶切的l%Agarose膠檢電泳圖。 圖10:菌檢PCR產(chǎn)物陽性克隆接菌擴大培養(yǎng)、抽提質(zhì)粒l%Agarose 膠檢電泳圖。圖ll: siRNA表達(dá)載體示意圖和克隆前后的接續(xù)方式。
具體實施例方式1.1材料、試劑和主要儀器(l)目的DNA: SARS冠狀病毒膜蛋白(NCBI庫號AY536759)全 長cDNA由本公司基因合成組合成，見圖l，其長度為666bp。(2) 試齊ll: lkb plus DNA Ladder (invitrogen); DNase I (Roche); MnCl2 (BBI);磷酸接頭(Sigma-aldrich); ATP (BBI); BSA (NEB); Bmsbl (NEB); T4 DNA Ligase (NEB) ; Tag DNA聚合酶(Biocolor Shanghai); Agarose (BBI); dNTP (上海生工)；酚氯仿抽提試劑(上 海生工)；低分子量DNALadder (NEB); EcoP15I (NEB); T4 DNA聚 合酶(NEB); FokI酶(NEB); Sfil酶(NEB);感受態(tài)細(xì)胞(invitrogen); PU6H1-GFP表達(dá)載體(NT Oimcs， USA)。其他生化試劑均購于 Sigma-aldrich 。(3) 01igao序列Sigma-aldrich公司合成；(P=Phosphat:磷酸鍵) (A)磷酸接頭(以下磷酸接頭在Sigma-aldrich公司合成； (去除P=Phosphat) 磷酸環(huán)狀接頭-l:風(fēng)尸5，PCTTTTTTlfcTGCTGl I CATCClCTGAACTGGGATCCGT丁GGATGTGT'gaaaaaaa|gacgac| L^^2^Gacttgaccctaggcaacctacaca2,: -IT+1G-2T+2G，PCTTTTTCTGCTGGGCATCCCTGAACTGGGATCCGTTGGATGTGT￡coP"I MI<formula>formula see original document page 17</formula>(B) PCR引物(以下PCR引物在invitrogen公司合成)PCR-1引物(單引物擴增)3，BH1: 5'ACACATCCAACGGATCCCAGTTCAG 3' PCR-2引物5'LG: 5, GACTCTGATGGATCGTCTGCAGAG 3, 3，BH1: 5， ACACATCCAACGGATCCCAGTTCAG 3'(C) 質(zhì)檢PCR:5， U6: 5， AAGGTCGGGCAGGAAGAGGGC 3， 3， Hl:5， TATTTGCATGTCGCTATGTGTTCT 3，(4)試劑盒凝膠抽提試劑盒QIAEXII Gel Extration Kit (QIAGEN); 質(zhì)粒純化試劑盒TIANprep Mini Plasmid Kit (TIANGEN)等。(5)主要儀器PCR儀(PE9600);電轉(zhuǎn)儀(BIO-RAD， MicroPulser);長波長紫外燈等。2.1 DNaseI不完全酶切 DNA在Mr^+的緩沖體系中，用DNase I進(jìn)行不完全酶切，得到的 DNA片段均為平端。先將10U的DNaseI用NEB Buffer-2和80%甘油稀釋到O.OIU， -20°C 保存。SARS全長cDNA，在Mn2+的緩沖體系中，用0.01-003U的DNase I在冰上反應(yīng)l分鐘，然后7(TC滅活20分鐘，Agarose電泳檢測，如 圖2所示，DNA不完全酶切后呈霧狀分布，在100 300bp處呈亮區(qū)。2.2磷酸接頭-1連接和pcr-1反應(yīng)DNase I酶切過的DNA通過用平端連接的方法接上磷酸接頭1 。磷酸接頭1為19LP1、 20LP1、 21LP1、 22LP1、 23LP1。退火處理 (95°C 1分鐘，自然降至室溫)。上述各磷酸接頭-1連接反應(yīng)取2.5^經(jīng)過DNase I酶切過的DNA， 在10x連接反應(yīng)Buffer(500mM Tris-HCl (pH7.5,25。C) ， 100mM MgC12， 100mMDTT， 25(ig/(il BSA)的體系中，加入(10mM)磷酸接頭-1，10mM ATP， 0.5|il T4 DNA Ligase和0.5)^1 10xBuffer，在PCR儀上 16'C過夜反應(yīng)。pcr-1:在各連接反應(yīng)體系中取出0.5^1作為模板進(jìn)行50(_U PCR反 應(yīng)0.5^1模板DNA， 2)!l單一引物BHl (20mM)， 1 fil dNTP( 1 OmM)， 0.5^1 Tag酶，用D-H20補足到5(^1，反應(yīng)條件為:95。C 1分鐘預(yù)變性， 95°C 15秒變性，68 。C lmin退火和延伸，28個循環(huán)。1% Agarose膠 電泳檢測，如圖3所示，5種PCR產(chǎn)物:19LP1、 20LP1、 21LP1、 22LP1、 23LP1都顯示陽性結(jié)果，說明5種接頭-1連接成功。將各PCR-1產(chǎn)物進(jìn)行酚提，乙醇沉淀(-20。C， 2小時)離心后，沉淀
物加20(ilD-H2O溶解，-2(TC保存。為了跟蹤沉淀物，在下一步反應(yīng)前 再進(jìn)行1% Agarose膠電泳檢測，如圖4所示，5種PCR產(chǎn)物19LP1、 20LP1、 21LP1、 22LP1、 23LP1酚提后回收正常。2.3 EcoP15I酶切為了合理使用EcoP151酶，將純化后的19LP1、 20LP1、 21LP1、 22LP1、23LP1 PCR-1產(chǎn)物以各5pl混合，加入10^1 ATP( 10mM) ， 10(^1 10X NEBBuffer-3， BSA(100x)(10mg/ml)， 10UEcoP15I酶，用D-H20補 足到IOOiliI ， 37。C水浴，酶切過夜。將EcoP151酶切產(chǎn)物進(jìn)行酚提，乙 醇沉淀(-20。C， 4小時)后，離心后加入11plD-H20溶解沉淀物，-20°C 保存。2.4 T4DNA聚合酶補平DNAEcoP151酶切后的DNA 1 l(il，力q 1.5(il (4.5U)T4 DNA聚合酶；1.5(xl NEB Buffer-2， 2(il dNTP(lmM)，總反應(yīng)體積為15|il，混合均勻，置于 PCR儀37'C孵化15分鐘。2.5 PAGE分離DNA目的條帶在修補成平端的15)il DNA中加入1.5^1的DNA上樣Buffer(30mM EDTA; 36。/。(V/V)丙三醇；0.05X(W/V)溴酚藍(lán)；pH = 7.0)， 6.5^1 X 3 點樣到20% TBE聚丙烯胺凝膠。電泳200V， 90分鐘，分離DNA片段。電泳結(jié)束后，取出凝膠置于含10% EB (溴化乙錠)的TBE染液 中行DNA染色20分鐘。如圖5所示，66bp的EcoP151酶切片段清晰 可見。
在紫外燈下，膠切66bp的DNA片段，置于1.5ml離心管中。加入 150pl溶膠Buffer ( 0.5M NH4Ac ， 10mM Mg(Ac)2 ， lmM EDTA (pH8.0)) ， 55。C烘箱過夜，溶出DNA。用QIAEX II Gel Extration Kit 抽提DNA，加D-H20洗脫。 2.6磷酸接頭-2連接取2.5pl PAGE分離的DNA，加入lpl (20mM)磷酸接頭-2， 0.5(il 10x連接Buffer, 0.5|il ATP(10mM)， 0.5^1 T4 DNA Ligase，用 D-H20補到5(！1，混合均勻，PCR儀16i:過夜反應(yīng)。 2.7 PCR-2反應(yīng)在反應(yīng)體系中用滅菌的D-H20補足到5(Vl，從中取出5)il作為模板， lfil5,LG (10pM); 3'BH1 O0|iM)， 1 pl dNTP (1 OmM)， 0.5(il TagDNA聚合酶，用D-H20補到50|il進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為95°C l分鐘預(yù)變性，95。C15秒變性，68 °C 2min退火和延伸，28個循環(huán)。 PAGE檢測。10|il PCR-2產(chǎn)物PAGE檢測結(jié)果如圖6所示，連接產(chǎn)物 DNA片段大小為109bp片段，顯示磷酸接頭-2連接成功。PCR-2產(chǎn)物進(jìn)行酚提，乙醇沉淀(-2(TC， 2小時)后，離心加入 20plD-H2O， -20。C保存。 2.8 Fokl酶切Fokl酶消化PCR-2產(chǎn)物，切成粘端DNA片段。取20^1 PCR-2 DNA，加入2^Fokl酶，5|il NEBuffer-3，用D-H20 補到50pl，混勻后加lOOpl ， 37。C反應(yīng)100分鐘。lO(il酶切產(chǎn)物PAGE 檢測，如圖7所示，目的片段為29 33bp，如箭頭所示。其它3條帶至 上而下為未消化條帶；不完全消化條帶；消化的兩邊接頭條帶(因重 疊，故信號較強)。PAGE分離目的片段，膠切和回收和上述2.5。 2.9與siRNA表達(dá)載體連接將Fokl酶切后的DNA片段連接到帶有U6和Hl雙啟動子的siRNA表達(dá)載體pU6Hl-GEP,如圖IO所示。反應(yīng)體系為1 u 1載體，2 u 1 Fokl酶切的DNA， 10 ul 1.5X P Buffer(90mMTris ((PH8.5 9.0); 12mMDTT; 6mMMgC12; 40%PEG8000)，0.5 n 1 ATP(10mM), 0.25 y 1 T4 DNA Ligase，用D-H20補足到15 y 1，16"C反應(yīng)30分鐘。連接后用D-H20補到100ul，進(jìn)行連接產(chǎn)物純化加1.5 U 1 glycogen, 253 ^ 1的預(yù)冷無水乙醇，-7(TC放置30分鐘沉淀后，離心加5 y 1 D-H20溶解DNA沉淀。1.10電轉(zhuǎn)化融化-80。C保存的感受態(tài)細(xì)胞。將40(il的細(xì)胞和5^1純化后的連接 產(chǎn)物在冰上混勻，放置1分鐘，然后加入到預(yù)冷的電擊杯中，進(jìn)行電擊。 加入150^1 SOC培養(yǎng)基(2% (W/V) Tryptone， 0,5% (W/V) Yeast， 0.05% (W/V) NaCl， 2.5mM KC1， 10mM MgCl2， 20mM葡萄糖，pH=7.0)， 37。C搖床，220rpm振搖40 60分鐘。將菌液均勻涂布到含50嗎/ml Kan 的LB瓊脂平板(l。/。(W/V)Tryptone， 0.5%(WZV) Yeast， 1%(W/V) NaCl， 1.5%(W/V)Agar， pH二7.0)上，37。C恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。1.11 PCR菌檢隨機挑取菌斑至400^1 LB(1%(W/V)， Tryptone0.5°/。(W/V)， Yeastl%(W/V)， NaCl， pH=7.0 ) 1.5ml EP管(或48深孔板)中37。C搖 床，220rpm振搖2h。PCR檢測取2(il培養(yǎng)菌液為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR體系 為2fil菌液，0.5jil3，Hl (10pM) ， 0.5|il5，U6 (10pM) ， 0.5jil dNTP (10mM) ， 3ul 10xPCR Buffer, 0、1 Tag DNA polymerase,用D-H20 補到30^1。反應(yīng)體系為95°C 5分鐘預(yù)變性，94°C 30秒變性，62°C 30 秒退火，72。C40秒延伸，72"C7終末延伸，25個循環(huán)。5plPCR產(chǎn)物 Agarose膠檢測，如圖8所示，出現(xiàn)400bp左右條帶的為陽性；沒有PCR 產(chǎn)物的為沒挑到菌斑或接菌培養(yǎng)失敗。在隨機挑取的48個克隆中，44 例陽性，陽性率為91.6%。Sfil酶切證實真陽性400bp左右條帶的陽性條帶中，siRNA只有 19-13bp， siRNA重組體(真陽性克隆)和非重組體(假陽性空載體克隆) 的PCR產(chǎn)物長度鑒定極為困難。為了進(jìn)一步鑒定真陽克隆，本發(fā)明利 用空載體多克隆位點含有Sfil酶切位點的特點，將菌液PCR產(chǎn)物進(jìn)行 Sfil酶切，PCR產(chǎn)物不能被消化者為真陽性克隆。取4^1菌液PCR產(chǎn)物，加入0.25(il Sfil酶，0.75^1 NEBuffer-2， 混勻后PCR儀，5(TC，反應(yīng)1.5小時。5^1酶切產(chǎn)物Agarose膠檢測， 如圖9所示，4 3例檢測中，只有l(wèi)例被Sfil消化，重組率為9 7. 6 %。1.12接菌擴大培養(yǎng)，質(zhì)粒抽提100^1 2小時培養(yǎng)的菌液接種到4ml Ka+ LB液體培養(yǎng)基試管中， 37'C搖床，220rpm過夜搖菌。次日取800pl菌液保種為20%的甘油菌， -20。C保存；用TIANprep Mini Plasmid Kit抽提質(zhì)粒，50^1 D-H20洗脫 DNA， -20。C保存。lpl質(zhì)粒Agarose膠電泳檢測，如圖10所示，質(zhì)粒 大小為5.5kb，與。 1.13測序鑒定從抽提的質(zhì)粒中取出20^1，送測序(上海英駿生物技術(shù)有限公司)。 所得序列用alignment program軟件和SARS全長基因進(jìn)行序列比對。 2.結(jié)果分析從SARSsiRNA分子庫中，隨機抽樣30例進(jìn)行測序，所得結(jié)果統(tǒng) 計見下表編 號克隆號siRNA分子序列siRNA長度位點所在1S061218-lTACAATTTGCCTATTCTAATC21101~1212S061218-11GGCTCTTGTGGCCAGTAACA20161 1813S061220-10GGAAAACAAGCTTTATTATG20529~5104S061220-19TACGGTAGCGGTTGTATGC1987~695S070115-21TATTCTAATCGGAACAGGTT20112~1316S070115-26GAGCAAACAGCCTGAAGGAAGC22378~3577S070115-46GTACCCGCTCAATGTGGTCA20311~3308S070119-27GTACATAATAAAGCTTGTTTTCC23135~1579S070119-28AGAATGTTTGTTTCTGGGT19332~31210S070119-30CATTGGTGCTGTGATCATTC20414~43311S070119-31GAGAATGTTTGTTTCTGGGT20332~31412S070119-32CTTTATTATGTACAAAAACC20539~520*13S070119-34GATTAGAATAGGCAAATTGT20565~54614S070122-7GGAAGCAACGAAGTAGCTAAGCC23395 37315S070122-12GAGCGGGTACGAGCAAACAGCC22368-34716S070122-14TCTCCGGGGGACAATTGTGAC21366~386*17S070122-19TGTTACTACAATTTGCCTATTC2295~11618S070122-22GCTTTATTATGTACAAAAACC21539~519*19S070122-30GAATGACCACATTGAGCGGGT21354~33420S070122-32GTGATGTAGCCACAGTGATC20169~15021S070122-48TCAACCCAGAAACAAACATTC21332~35222S070307-4GTATTGTAGGCTTGATGTGGCT22254~275*23S070307-45CTACAATTTGCCTATTCTAATC22100~12124S070307-48TACAATACAAGCCATTGCAATC22427~楊25S070316-11CATCAAGCCTACAATACAAGCC22418~397*30例中，5例為序列重復(fù)克隆(*)， 25例為不同位點隨機分布。長 度可控性分布在19 23bp之間，顯示出位點及長度的多樣性。
權(quán)利要求
1、一種PCR高通量構(gòu)建siRNA全位點分子庫的制備方法，其特征是為依次包括下列步驟和結(jié)構(gòu)(1)將起始DNA在Mn2+的緩沖體系中用DNAse I行不完全消化，消化后的DNA和產(chǎn)生16-23bp的siRNA環(huán)狀磷酸接頭-1進(jìn)行平端連接；結(jié)構(gòu)上，各環(huán)狀磷酸接頭-1都包含一個III型限制性酶切位點，該位點的近端即近接頭平端，與多聚A/T序列相接續(xù)，遠(yuǎn)端即近發(fā)夾環(huán)部，與一個II型限制性酶切位點相接續(xù)，通過加減多聚A/T堿基對的數(shù)目，可以控制各環(huán)狀磷酸接頭-1中的III型限制性酶切長度，使siRNA長度呈可控性分布，遠(yuǎn)端II型限制性酶切位點能介導(dǎo)多聚A/T的克隆方式，一旦克隆能產(chǎn)生U6和H1啟動子多聚A和多聚T的轉(zhuǎn)錄起始和終止信號，去除啟動子和siRNA之間多余的克隆位點序列；所述的環(huán)狀磷酸接頭-1的通式為5’pC(n)TTTTN(n)III型內(nèi)切酶N(n)II型內(nèi)切酶-PCR錨序列-環(huán)3’G(n)AAAAN(n)III型內(nèi)切酶N(n)II型內(nèi)切酶-PCR錨序列-環(huán)上述P磷酸鍵；NG，C，T，A任意堿基；n堿基數(shù)(0-20)，可計算上述兩種限制性內(nèi)切酶的距離相應(yīng)調(diào)整；(2)以上述平端連接反應(yīng)后的產(chǎn)物為模板，用環(huán)狀磷酸接頭-1的反義鏈序列為引物進(jìn)行“單引物”PCR擴增，選擇性擴增兩個對立而置的III型限制性酶切位點分子，使之能被III型限制性酶消化；(3)PCR產(chǎn)物用III型限制性內(nèi)切酶消化，酶切后的DNA呈粘性末端；(4)上述DNA酶切后的粘端用DNA聚合酶在dNTPs存在下補平，然后與磷酸接頭-2進(jìn)行平端連接。該接頭包含一個II型限制性內(nèi)切酶消化位點(與磷酸接頭-1產(chǎn)生相同的粘端)，為進(jìn)行克隆所用；(5)將經(jīng)步驟(4)平端連接后的產(chǎn)物用5’(磷酸接頭-1)和3’磷酸接頭-2)引物進(jìn)行PCR擴增；(6)純化PCR產(chǎn)物后進(jìn)行II型限制性內(nèi)切酶消化，兩側(cè)產(chǎn)生AAAA粘端；(7)分離目的片段后，克隆到帶有T5/A1粘端的表達(dá)載體構(gòu)建siRNA分子庫或miRNA(microRNA)分子庫；前者帶有U6和H1雙啟動子，表達(dá)雙鏈的siRNA；后者為U6或H1單一啟動子，表達(dá)單鏈的miRNA。一經(jīng)克隆能產(chǎn)生U6或/和H1啟動子多聚A和多聚T的轉(zhuǎn)錄起始和終止信號。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR高通量構(gòu)建siRNA全位點分子 庫的制備方法，其特征是在環(huán)狀磷酸接頭-1的轉(zhuǎn)錄起始信號多聚A 后加一個增強轉(zhuǎn)錄效率的"G"堿基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種PCR高通量構(gòu)建siRNA全位點分子庫制備方法，包括環(huán)狀磷酸接頭-1連接、單引物PCR擴增、III型限制性內(nèi)切酶消化、粘性補平、與環(huán)狀磷酸接頭-2連接、雙引物PCR擴增、FokI消化、克隆到表達(dá)載體等步驟。本發(fā)明解決了以III型限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的PCR高通量構(gòu)建siRNA全位點分子庫制備方法，由此產(chǎn)生的siRNA功能片斷可控性的分布在19-23bp，這樣可完全模仿體內(nèi)自然的siRNA分子長度多樣性，適用于RNAi基因治療最佳靶點的篩選，克服了目前其它siRNA分子庫構(gòu)建方法存在的瓶頸和盲點。
文檔編號C40B40/04GK101126176SQ20071002421
公開日2008年2月20日 申請日期2007年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月23日
發(fā)明者朱遠(yuǎn)源 申請人:百奧生物技術(shù)(南通)有限公司