專利名稱：定制的微陣列構建體及其在靶分子檢測中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及檢測，鑒定和/或定量可能同時存在于一種樣品中的多種靶分子的方法及試劑盒。
背景技術：
及現(xiàn)有技術 可以根據(jù)遺傳物質(zhì)中存在的特定序列鑒定生物體或微生物的多種表達基因。表達基因的鑒定及定量通常是在mRNA反轉(zhuǎn)錄為相應cDNA之后進行，所述cDNA的檢測是通過存在或附著于微陣列上的特定捕獲分子進行。特定生物體的檢測可通過擴增其基因組DNA的特定序列然后檢測和/或鑒定這種擴增序列容易地進行。定量與特定捕獲分子結合的靶序列可以測定存在于初始樣品中靶分子的數(shù)量。優(yōu)選包括適當?shù)恼{(diào)控方法，鑒于不同步驟的效率所做的校正，例如靶序列的復制或擴增及在微陣列上通過雜交而被捕獲的步驟。
帶有核苷酸序列陣列的微陣列目前主要按照兩種方法制備。第一個方法，在美國專利US 5,510,270及5,700,637中描述，是基于固體支持物上捕獲分子或序列的光刻(photolithographic)的原位合成。光刻DNA合成利用快速固相亞磷酰胺化學作用。通過結合5′光保護的亞磷酰胺和一組遮蔽屏(mask)可以實現(xiàn)位置及順序的調(diào)控，其中所述5′光保護的亞磷酰胺可通過光照射活化，而所述遮蔽屏在適當?shù)奈恢蒙蠋в卸矗饪梢酝ㄟ^這些洞。激發(fā)后，去除存在于部分寡核苷酸序列上的光保護基團(該基團是該過程中初期合成的)，加入相應的單體之后通過另一個核苷酸延長該寡聚物。當前的連結效率將這些芯片的實際大小限制在約25個堿基。如超過該極限值，會累積不完全產(chǎn)物。
光刻方法可以在支持物上產(chǎn)生短寡核苷酸。利用該方法，可以通過一系列同樣物種的捕獲序列(而不是單一序列)鑒定基因或基因序列。為調(diào)控特定靶序列的特定雜交，必須對各序列提供一個對照，該對照序列與初始序列一致，只有一個堿基差異。該方法的主要優(yōu)點是可以使如此獲得的陣列或芯片微型化，形成帶有數(shù)千捕獲序列的高密度陣列。
第二種方法基于在陣列基質(zhì)已知的特定位置上發(fā)生機械沉積(deposition)之前捕獲序列的化學或酶促合成。利用該方法，待點樣、沉積或附著的序列大小沒有限制。與原位合成方法相比，沉積技術的一個主要優(yōu)點是其顯著的多變性。該方法可以產(chǎn)生幾乎任何目的分子的微陣列或芯片，包括但不限于任何長度的核酸序列，抗體，脂肪，碳水化合物，小化合物等等。此外，可以最優(yōu)化序列的合成過程，純化序列，在使用之前檢驗其質(zhì)量，和/或在連結到固體表面之前調(diào)整其濃度。但是，該方法的一個缺點是較為耗時，因為點樣到微陣列或芯片之前必須單獨地處理各序列從而限制了陣列的大小。
與寡核苷酸雜交的微陣列的化學作用明顯地不同于用長的DNA捕獲序列或分子構建的陣列。已觀察到長的特定捕獲序列可比相應的短片段更好地與存在于溶液或樣品中的互補靶序列結合。實際上長的多核苷酸捕獲序列被用于直接結合長的多核苷酸靶分子或序列。在常規(guī)基因表達實驗中，與cDNA結合的捕獲序列包含50個或更多堿基，例如70個堿基，甚至可以包含600個堿基或核苷酸。
當僅使用15-20個堿基的短寡核苷酸作為捕獲序列(參見如US 5,510,270)時，長cDNAs的充分檢測，鑒定和/或定量可以改進該檢測方案。首先利用帶有T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄起始位點的引物將RNA逆轉(zhuǎn)錄為相應cDNA。然后在體外將cDNA再轉(zhuǎn)錄為幾個RNA拷貝，再將該拷貝切割成小片段。隨后用這些小RNA片段在帶有一系列捕獲序列的陣列上雜交，所述捕獲序列分別對應這些RNA片段。必須片段化序列以確保靶RNA序列能夠充分接近極短的捕獲序列。要求有特定的算法使這些不同捕獲分子與靶DNA或mRNA原始序列的雜交圖譜適當?shù)年P聯(lián)起來。
對雙鏈DNA(dsDNA)的檢測進行類似的改進，可以優(yōu)先在溶液中再結合，而不是與存在或附著于固體基質(zhì)上的捕獲序列雜交。通過利用帶有T3或T7序列的引物進行的雙擴增過程及隨后的利用RNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄過程，將擴增子再一次再轉(zhuǎn)錄為RNA。在通過陣列檢測之前將這些RNA切割成約40個堿基的片段(參見如國際專利申請WO97/29212的實施例1)。本文利用小于30核苷酸的捕獲核苷酸序列，應用上述技術鑒定結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)rpoB基因。由于不能直接檢測來自遺傳擴增反應(例如PCR)的擴增子，因此從這一點說，所述的方法較為復雜，還需要另一個反應及復制靶序列的循環(huán)，這會在所述靶序列的定量中引入額外的偏離值。
盡管存在一些缺點，通過化學合成及寡核苷酸或短多核苷酸序列的沉積構建微陣列還是有益的，因為這是一個快速且廉價的過程。除此之外，可根據(jù)待分析或鑒別序列的需要容易地改造捕獲分子或序列的設計。
捕獲分子不一定必須由核苷酸序列構成。靶分子還可以是通過與其相應的配對物(counterparts)(抗體，抗原，配體，受體等)結合而被檢測或捕獲的抗體，抗原，受體或配體。上述實例名單并非是窮舉。
用戶并不總是使用標準的微陣列，即使其可以檢測大量不同靶分子。他可能想要檢測非常規(guī)的靶分子，或者想要提高靈敏度水平。因此用戶越來越希望獲得能夠按照他的的愿望加入一些額外檢測分子的定制(customized)或半定制微陣列。可能被進一步定制的基本或標準微陣列已經(jīng)包含了多種不同的捕獲分子，能夠檢測已被充分測定的基因。
可以構建標準微陣列并交給眾多用戶，然后這些用戶可以使用該陣列檢測一些定義清楚的靶基因和其它靶基因，每次應用或每個用戶的靶基因都可能不相同。
發(fā)明目的 本發(fā)明旨在提供用標準微陣列進行新的檢測，鑒定及定量方法和試劑盒，所述微陣列可被輕易地改變以滿足一個或多個特定用戶檢測多種靶分子的特定需求。
本發(fā)明的另一目的是允許用戶在一個特定實驗中除了檢測一組靶分子(該靶分子與已經(jīng)同微陣列固體支持物表面結合的捕獲分子相匹配)外還可以檢測一組新的靶分子，所述新的靶分子可以根據(jù)試驗而改變，對于這兩組靶分子的所述檢測是定量的，并與其在樣品中的存在相關。
發(fā)明概述 本發(fā)明涉及檢測或定量不同組靶分子(第一組和第二組靶分子)的方法，所述不同組靶分子可能同時存在于一個生物樣品中；所述方法包括使這些不同組靶分子與固體支持物表面上存在的(微)陣列相接觸的步驟；所述(微)陣列包含第一和第二組捕獲分子，這些捕獲分子存在于固體支持物表面的不同位置。
在本發(fā)明方法中，第一組捕獲分子包含至少3種對第一組靶分子特異的捕獲分子，其通過特定分子識別(優(yōu)選通過雜交)作用直接固定第一組靶分子，第二組捕獲分子包含至少3種與第二組靶分子(和第一組靶分子)無關且沒有直接親合性的捕獲分子；第二組捕獲分子能夠通過一個銜接分子固定第二組靶分子，所述銜接分子能夠在捕獲分子和靶分子之間實現(xiàn)互補結合。
此外，在本發(fā)明方法中，通過一個校正系數(shù)可以方便地獲得一組靶分子相對于另一組靶分子的相對定量，該系數(shù)是利用在兩個捕獲分子組中同時定量的至少一個額外相同的靶分子(能結合第一組捕獲分子并能通過銜接分子結合第二組)計算得到。
本發(fā)明方法所用的校正系數(shù)可由本領域技術人員通過利用未知濃度的能夠固定兩組捕獲分子的靶分子獲得，或通過利用具有已知濃度的內(nèi)標物獲得，所述內(nèi)標物被加到樣品中并接受與待檢測和/或定量的靶分子相同的預處理(純化，擴增，復制)步驟以及接觸步驟。所述已知濃度的內(nèi)標物還能夠與兩組捕獲分子結合。
因此，為準確定量存在于兩組靶分子之一中的靶物質(zhì)，本領域技術人員可以鑒定由于兩組中的兩種捕獲分子結合而產(chǎn)生的兩種信號之間的比率，獲得所述信號的目的是為了給本領域技術人員提供一個校正系數(shù)，用于定量另一待檢測和待定量的靶分子。
本發(fā)明另一方面涉及一種檢測及定量試劑盒，其包含-一個(微)陣列組固體支持物表面，其包含存在于支持物表面不同位置的第一和第二組捕獲分子，其中第一組捕獲分子包含至少3種對樣品中待檢測和定量的靶分子特異的不同捕獲分子，所述第一組捕獲分子能夠直接固定第一組靶分子；-并且其中，在所述固體支持物表面的不同位置上，所述(微)陣列固體支持物表面進一步包含第二組捕獲分子，所述第二組捕獲分子包含至少3種捕獲分子，該捕獲分子同可能與第一組靶分子同時存在于樣品中的待檢測和定量的第二組靶分子(以及第一組靶分子)無關且沒有直接結合親合性；-能夠?qū)⒌诙M靶分子特異性結合到第二組捕獲分子上的一種或多種銜接分子，以及；-一組靶分子的校正系數(shù)，其能夠比較樣品中第一和第二組靶分子的數(shù)量。
在本發(fā)明方法和試劑盒中優(yōu)選第二組捕獲分子是全能性捕獲分子(“通用微陣列”部分)。因此，它們與自己的互補靶分子不相關，沒有直接的結合親合性，所述結合僅通過銜接分子進行。
根據(jù)本發(fā)明的第一實施方案，檢測和定量是在(微)陣列上進行，該陣列被分成至少兩個不同的陣列，存在于固體支持物的同一表面上。各陣列包含第一和第二組捕獲分子，其存在于支持物表面的不同位置。所述至少兩個不同的陣列包含用于檢測同樣靶分子的第一組捕獲分子和互不相同的用于檢測其它靶分子的不同的第二組捕獲分子的陣列，各陣列是互不相同的。這就是說，有可能在靶分子的第一個位置上獲得特定的類似檢測，而在其它類型靶分子通過特定銜接分子與不同陣列的捕獲分子結合后，獲得所述靶分子的不同檢測模式。各陣列的所述銜接分子是不相同的。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，通過第二組捕獲分子固定靶分子是由用戶向固體支持物加入銜接分子而完成。這是指本發(fā)明的陣列是“半定制(semi-customised)”的陣列，可根據(jù)用戶要求用于獲得特定結合，用于在微陣列表面特定位點特異性地鑒定靶分子。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，所述靶分子、捕獲分子和銜接分子是核苷酸序列或包含核苷酸序列。在所述實施方案中，通過第二組捕獲分子固定靶分子的過程是如下獲得在捕獲分子和靶分子之間通過銜接分子實現(xiàn)夾心雜交(sandwich hybridization)，所述銜接分子是互補核苷酸序列或包含互補核苷酸序列。
所述夾心雜交優(yōu)選通過銜接分子獲得，該分子包含第一部分和第二部分，所述第一部分能通過互補堿基對與捕獲分子的一個特定末端部分雜交，所述第二部分對一種或多種靶分子的至少一部分具有特異性。
如果捕獲分子是核苷酸序列，那么它的特定末端部分是指不能與固體支持物表面結合的5′或3′末端部分。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，靶分子和捕獲分子是蛋白質(zhì)，銜接分子是嵌合的蛋白質(zhì)或雜合抗體，能夠在捕獲和靶分子之間實現(xiàn)特異的間接結合。根據(jù)優(yōu)選實施例，靶分子和捕獲分子分別是-抗原和抗體(或者所述抗體的高變的部分)，-或抗體(或其部分)和抗原。
本發(fā)明還提供測定(至定量)在初始樣品中檢測到的兩組靶分子的數(shù)量的方法。不同靶分子的數(shù)量可以是相互之間的相對量，或校正為絕對值(p摩爾)。通過一個系數(shù)校正定量檢測，該系數(shù)使得可以類似地且同時地檢測所有被固定的靶分子(被固定到其捕獲分子上)。本發(fā)明方法中更優(yōu)選通過檢測至少一個被加到所述(生物)樣品中并接受與靶分子相同的檢測步驟的標準序列來校正定量的檢測結果。所述標準分子是在捕獲分子的兩個組上進行檢測，所述捕獲分子的兩個組存在于固體支持物表面兩個位置上。
在本發(fā)明另一方面，定量檢測兩個組中的至少一個共同靶分子，以此校正捕獲分子兩個組上靶分子的固定效率。在一個特定實施方案中，共同靶分子是管家基因。
優(yōu)選在兩個組的捕獲分子上檢測并定量3種標準物或3種靶分子，每一靶分子的濃度均以至少3倍(factor)的差異不同于其它靶分子。
為了使捕獲分子和靶分子之間通過銜接分子特異結合，第二組捕獲分子包含一種或多種能與銜接分子特異性結合的末端反應性化學官能團。優(yōu)選所述末端反應性化學官能團選自醛基、環(huán)氧基、丙烯酸根/酯/鹽基團或其混合物。
優(yōu)選所有的捕獲分子都通過共價鍵或連接方式結合到固體支持物表面，在固體支持物表面形成微陣列。在本發(fā)明的第一實施方案中，表面的第二位置包含捕獲分子，其末端為反應性化學官能團(例如醛基，環(huán)氧基團，或丙烯酸根/酯/鹽基團)，該基團可與銜接分子的NH2基團反應。
為避免空間位阻，捕獲分子是通過一個特定長度的間隔物(或連接物)結合到固體支持物的表面。所述間隔物元件或分子可以是至少10個原子的聚合鏈，可以帶有支鏈，可選自聚-乙二醇，聚氨基酸，聚丙烯酰胺，聚氨基糖，多聚糖，聚酰胺，聚丙烯酸酯，聚碳酸酯，聚環(huán)氧化物，聚酯分子或化學鏈，或其混合物?；蛘撸东@分子的一部分可以作為一個間隔物分子。優(yōu)選間隔物分子至少為6.8nm長。間隔物分子可以是在約15到約1000個堿基之間的核苷酸序列，優(yōu)選在約30到約120堿基之間。
本發(fā)明的方法和試劑盒特別適合于同步檢測，鑒定和/或定量目的生物分子，例如靶多核苷酸或核苷酸序列(可以是同時存在于一個生物樣品或試驗溶液中的同源序列)，其中一個基本的多參數(shù)微陣列是根據(jù)用戶的需求被改造。優(yōu)選在檢測之前利用本領域常規(guī)技術增多(復制)和/或擴增(遺傳學擴增)靶分子，例如靶多核苷酸或核苷酸序列(如基因組DNA或RNA序列或擴增子)?；蛘呖梢岳帽绢I域技術人員公知的技術擴增檢測信號。
在本發(fā)明的上下文中，“核酸”，“寡核苷酸”，“陣列”或“微陣列”，“核苷酸序列”，“靶核酸”或“靶核苷酸序列”，“基本上結合”，“特異性雜交”，“背景”，“定量”等等術語的含義如同在國際專利申請WO97/27317中所述，該申請并入本文作為參考。
“同源序列”的含義如歐洲專利EP 1266034所述，該專利并入本文作為參考。
本文中用于構建微陣列的術語“固體支持物”包括任何類型的固體材料，其可接受物理學處理以完成必要的反應，如與試驗溶液或可能含有靶分子或靶序列拷貝的樣品進行溫育。該固體支持物可以是單一成分或是幾種材料構成的組合物，其中之一是基質(zhì)表面，在該表面上捕獲分子或核苷酸序列可以被固定或與其結合，形成微陣列。本領域所用的基質(zhì)典型實例是聚合物，可以被功能化(functionalized)(包括接受向其表面加入接頭的過程)，以便更好地固定捕獲分子。捕獲分子固定或結合的所述基質(zhì)或支持物表面可以是多孔或無孔的支持物，可以是平滑的或粗糙的，可被置放或安放在另一固體支持物之上，例如由玻璃或塑料構成。
術語“樣品”，“生物樣品”或“試驗溶液”包括任何可能包含靶分子的(生物)樣品或溶液。所述靶分子可以是(微)生物體或獲自(微)生物體或其組分(例如葉綠體，線粒體，基因，基因產(chǎn)物，蛋白質(zhì)，肽，毒素，抗原，脂類，糖等)。
在本發(fā)明的上下文中，特別是(微)生物體或其組分(肉，骨......)特異性的多核苷酸或核苷酸序列是通過第二組捕獲分子進行檢測，其中靶分子是通過一個特定銜接分子被捕獲。試驗溶液可以是含有(微)生物體或其組分PCR產(chǎn)物(復制子)的溶液。
本文中術語“靶分子”可以是核苷酸序列或多核苷酸，也可以是樣品中待檢測的蛋白質(zhì)，脂肪，糖類等等。
在本文中，“捕獲分子”可包括核苷酸序列，還可以包括抗體或其高變部分(Fab，F(xiàn)ab2等)，抗原或其表位，受體，受體的配體等，其對靶分子具有特異性和/或?qū)︺暯臃肿泳哂刑禺愋浴?br> 在本文中，術語“銜接子”可指多核苷酸序列或多肽序列(例如抗體，嵌合分子等)，其連接捕獲分子和靶分子。
參照附圖，下面的實施例和特定具體實施方案更詳細地描述了本發(fā)明。所述實施例，具體實施方案和附圖以及所用的參考標記并非是對本發(fā)明要求保護范圍的限制。


圖1代表陣列(7)形式的固體支持物表面(6)，由存在于固體支持物表面不同位置(8，9)的兩組捕獲分子(A，B)構成。第一組(A)由對靶分子(1)特異的捕獲分子(2)組成，而第二組(B)由捕獲分子(4)組成，其與靶分子(3)不相關。在捕獲分子的兩個組(A，B)上同時定量同一種分子(x)。
圖2代表用本發(fā)明的兩個″半定制″陣列(7′，7″)覆蓋的玻璃載片的表面。在第一位置上(8′，8″)，兩個陣列上的第一組捕獲分子(A)是共同的，它們可以檢測第一組靶分子(1)。但是在第二位置上(9′，9″)，兩個陣列上的第二組捕獲分子(B，B′)是不同的，它們可以檢測第二組的不同靶分子。在捕獲分子的兩個組(A，B-B′)上同時定量同一種分子(x)。
圖3代表被存在于固體支持物表面不同位置(8，9)的兩組捕獲分子(2，4)所覆蓋的本發(fā)明固體支持物表面(6)。第一組捕獲分子(2)對于第一組靶分子(1)特異，而第二組捕獲分子與第二組靶分子(3)不相關，但可以通過使用靶(3)特異性銜接子(5)檢測第二組靶分子。
發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及檢測、鑒定和/或定量多種靶分子(1，3)的方法及試劑盒。用互補捕獲分子固定之后可檢測可能同時存在于樣品中的物質(zhì)，所述捕獲分子存在于固體支持物表面(6)陣列(7)上。
所述表面(6)包含至少兩組捕獲分子(2，4)，其存在于固體支持物表面(6)的不同位置(8，9)，其中第一組A包含至少三種對于待檢測、鑒定和/或定量的靶分子(1)特異的不同捕獲分子(2)，所述捕獲分子能夠直接固定靶分子(1)；其中第二組B包含至少三種與待檢測和定量的其它靶分子(3)不相關且不具備不同親合性以固定所述靶分子(3)的捕獲分子(4)，所述第二組捕獲分子(4)通過銜接分子(5)固定靶分子(3)。在捕獲分子的兩個組上同時定量至少一種相同的分子(x)。
圖1和3中描述的本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，捕獲分子以陣列(7，7′，7″)的形式存在于固體支持物表面6。如圖2所述，檢測可通過利用固體支持物表面完成，在所述固體支持物的表面上(6)存在至少兩個不同的微陣列(7′，7″)；所述至少兩個陣列(7′，7″)在第一位置(8′，8″)包含用于檢測同樣靶分子(1)的A組捕獲分子(2)。
此外，各陣列(7′，7″)還包含不同組(B，B′)的捕獲分子(4，4′)，用于檢測陣列(7′)與(7″)彼此不同的靶分子(3，3′)，所述第二組(B，B′)捕獲分子(4，4′)存在于與第一組A位置(8′，8″)不同的位置(9′，9″)。
根據(jù)本發(fā)明，通過向標準支持物表面(6)加入能夠與全能性捕獲分子(4)結合的銜接分子(5)，可以改變所述標準(微)陣列以使其適用于檢測、鑒定和/或定量非常見的(其它)的靶分子(3)，所述支持物表面含有針對至少第一組靶分子(1)的捕獲分子(2))，所述全能性捕獲分子不能直接與可能存在于樣品或試驗溶液中的任何靶分子(3)結合。所述全能性捕獲分子(4)已經(jīng)存在于(結合于)表面(6)，在定制標準微陣列(7)上。優(yōu)選所述(全能性)捕獲分子(4)是核苷酸序列，例如DNA或RNA序列，其骨架可被修飾。
最優(yōu)選第二組(B)捕獲分子(4)到支持物表面(6)的附著(固定)作用沒有導致第一組(A)捕獲分子(2)的完全分離和/或失活。優(yōu)選所述分離和/或失活被保持在盡可能低的程度。
本發(fā)明的標準微陣列或陣列(7)在定制之前就含有兩個類型的捕獲分子(2，4)。第一類型的捕獲分子(2)對第一組靶分子(1)特異，而第二類型捕獲分子(4)對靶序列(1或3)非特異。它們是全能性的，但可通過與靶-特異性銜接分子(5)結合而具備特異性。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中全能性捕獲分子(4)、銜接分子(5)和靶分子(3)是核苷酸序列。有利地，銜接分子(5)特異于靶多核苷酸(3)或其拷貝的至少一部分，使得通過間接地被捕獲分子(4)固定，可以進行特異性雜交、檢測、鑒定和/或定量。
待定制的預制標準分析物也被稱為標準產(chǎn)品(如一般芯片，用于檢測癌癥的微陣列，小鼠微陣列等等)，是帶有用于檢測指定數(shù)目很好定義的靶分子的捕獲分子的微陣列。與固體支持物表面特定位點結合的捕獲核苷酸序列的密度高于約10f摩爾，優(yōu)選約100f摩爾/厘米2固體支持物表面。標準產(chǎn)品可以是低密度或高密度陣列。低密度陣列利用帶有有限數(shù)目捕獲分子的標準產(chǎn)品，該有限數(shù)目針對于有限的和選定的靶分子數(shù)目。本發(fā)明的微陣列和標準產(chǎn)品每cm2含有至少5，10，50，100，1000或10000個捕獲分子的點樣。
除通過第一組捕獲分子檢測靶分子之外，本發(fā)明微陣列能夠應用戶的要求適應性地檢測額外靶分子。因此本發(fā)明相同的陣列能夠用于檢測大量不同靶分子，可能的待檢測靶分子數(shù)目可以比存在的捕獲分子數(shù)目大至少10，20，50，100乃至500倍。
本發(fā)明進一步提供定制該標準產(chǎn)品必需的及隨后的檢測、鑒定和/或定量必需的工具和試劑。例如本發(fā)明還可涉及用于安全地識別及特異性結合靶分子(3)(可能存在于生物樣品或試驗溶液中)的上述銜接分子(5)，還涉及第二組(B)捕獲分子(4)，其不能直接結合存在于樣品中的所述靶分子(3)。
第二組(B)捕獲分子(4)不具有互補于待檢測靶分子(3)的核苷酸序列或其互補序列的核苷酸序列。
在正常工作條件下，如果存在的是優(yōu)選小于10個連續(xù)的互補堿基或通常小于15個互補堿基，這些多核苷酸或核苷酸序列靶分子(3)不會與捕獲分子(4)結合。在靶分子和全能性捕獲分子之間優(yōu)選小于5，更優(yōu)選小于3個互補堿基對。最優(yōu)選在靶多核苷酸或核苷酸序列和該全能性捕獲分子之間根本沒有互補堿基對。本領域技術人員公知雜交是通過兩個序列的同源性或相似性百分比定義的，進一步通過所用的雜交條件(如嚴格，較少嚴格或非嚴格條件)定義，該條件主要依賴于溫度和鹽濃度。
本發(fā)明的一個實施方案涉及可定制的微陣列及其構建，從同一個標準產(chǎn)品開始，一方面用于檢測相同且確定的靶分子，另一方面用于檢測非確定且可變的靶分子。
在本發(fā)明的一個實施方案中，上述銜接分子(5)含有與待鑒定靶分子(3)或其互補序列互補的至少30個連續(xù)核苷酸序列(10)，也稱為銜接分子的靶特異性部分，還含有對全能性捕獲分子(4)特異的至少30個連續(xù)核苷酸的序列(11)，所述全能性捕獲分子將要檢測和/或間接定量靶分子，該序列也稱為銜接分子的靶非特異性或靶不相關部分。
在另一實施方案中，銜接分子的靶特異性部分(10)由50或70個以上的堿基構成，甚至100或150個以上的堿基構成。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，捕獲分子(4)被銜接分子(5)識別的部分存在于捕獲分子(4)的末端(未與固體支持物表面(6)結合的那一端)或至少靠近該端。優(yōu)選不過于靠近捕獲分子(4)的另一部分或末端，通過該部分或末端捕獲分子(4)附著于固體支持物表面(6)。
在本發(fā)明的另一實施方案中，全能性捕獲分子(4)含有被銜接分子(5)識別的一個序列以及不能被銜接分子(5)和靶分子(3)識別的一個序列。優(yōu)選后者是至少約20或30個堿基的間隔序列，優(yōu)選至少約50或70個堿基，更優(yōu)選至少約100或150個堿基長，或包括在所述參數(shù)之間的序列。
在一個優(yōu)選實施方案中，通過與全能性捕獲分子(4)結合的特異性銜接分子(5)而實現(xiàn)的與靶分子的間接結合效率等同于與存在于標準微陣列產(chǎn)物(7)上的第一組(A)特異性捕獲分子(2)的直接結合效率。在本發(fā)明的另一具體實施方案中，可以調(diào)整加入樣品溶液的銜接分子(5)的數(shù)量以便使兩個組(A，B)具有相同或類似的靶分子(1，3)結合效率，即對靶分子(1，3)的直接和間接結合。
在另一具體實施方案中，存在于樣品中的靶分子(1，3)的定量是利用校正完成的，該校正通過使用內(nèi)部特定已知標準序列，該標準序列加入到樣品中的數(shù)量是具體已知的。這些序列分子中的一些是通過與第一組(A)捕獲分子(2)直接結合進行檢測，而其它序列是通過利用上述銜接分子(5)間接地進行檢測，兩種結合類型可通過各組(A，B)不同的系數(shù)進行校正。
在本發(fā)明的一個特定具體實施方案中，同一內(nèi)標物將會通過直接雜交被第一組(A)捕獲分子捕獲，而通過利用銜接分子(5)被第二組全能性捕獲分子捕獲。
在另一具體實施方案中，兩組靶分子雜交效率的修正系數(shù)是通過利用兩組捕獲分子中檢測的至少1種，優(yōu)選至少3種共同靶分子而獲得。在另一優(yōu)選具體實施方案中，選擇的所述3種共同靶分子是以高，中和低的基因拷貝數(shù)存在于樣品中。這種基因相對數(shù)量的差異至少是3倍(factor)，優(yōu)選10或更多倍。
在一個具體實施方案中，同一組的一個分子與另一分子的校正系數(shù)各不不同。一個亞組(subset)分子的校正系數(shù)相同，但與同一組的另一分子亞組的校正系數(shù)不同。在一個特定具體實施方案中，分子根據(jù)濃度被區(qū)分為不同的亞組，適用的校正系數(shù)各不相同。
像基因或其產(chǎn)物(mRNA或蛋白質(zhì))等存在于樣品中的靶分子的定量最好通過利用陣列掃描器中的3種不同掃描設置(settings)完成(如用于光電倍增管的Packard陣列掃描器設置是50，70和100)。利用3種設置和以不同數(shù)量存在的3種靶或3種內(nèi)標物能夠校正3種不同掃描設置中的兩組靶分子的結合效率。
根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方案，捕獲分子(4)通過銜接分子(5)對靶分子(3)的間接結合效率類似或相同于至少約100或150，更優(yōu)選至少約200或300，更優(yōu)選至少約400或500個堿基長度的捕獲分子(2)對靶分子(1)的直接結合效率。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，微陣列含有至少約100或150個堿基長度的捕獲分子(2)，更優(yōu)選至少約200或300個堿基，最優(yōu)選至少約400或500個堿基，用于直接捕獲生物樣品或試驗溶液中的待檢測靶分子(1)。
在另一具體實施方案中，兩組(A，B)捕獲分子由附著于支持物表面的至少約20或30個堿基長度，優(yōu)選至少約50或70個堿基長度，更優(yōu)選約100或150個堿基長度的非特異性或不相關的序列(間隔序列)和在其末端的待檢測(直接結合的情況)靶分子(1)或靶序列特異的序列或者銜接分子(5)(間接結合的情況)特異的序列組成。捕獲分子的特異性或銜接子特異性部分(11)至少為10或15個堿基長，更優(yōu)選大于約20或30，更優(yōu)選大于約40或50個堿基長。能夠與相應靶核苷酸序列雜交的捕獲核苷酸序列(2)的特異性序列長度可以由約10到約60個堿基組成，更優(yōu)選約20到約30個堿基。本文中“約”是指可能比提到的數(shù)目多或少1，2，3直至5個核苷酸。
在本發(fā)明的一個特定具體實施方案中，第二組(B)捕獲分子是通過PCR合成，利用一個公共(common)序列作為模板。一個引物具有一個浮動序列(floating sequence)，各捕獲序列的浮動序列均不相同，用于識別銜接分子(5)。
本發(fā)明的陣列或微陣列(7，7′，7″)非常適于檢測和/或定量由細胞表達的基因，可能是靶基因序列復制后至少部分地變成cDNA鏈而cDNA雜交到本發(fā)明提供的特異性捕獲分子上。
本發(fā)明的方法特別適于檢測彼此同源的序列。通過利用小或短的特異性序列可以鑒別同源或幾乎相同的序列。例如，用于鑒別同源靶核苷酸序列(1)的第一組(A)捕獲分子或銜接分子(5)的靶特異性部分可以在約15到約50個堿基長。同源性的百分比優(yōu)選高于約40％或50％，優(yōu)選高于約60％，65％或70％，更優(yōu)選高于約75％，80％，85％或90％。
本發(fā)明的方法甚至可以辨別僅有一個或數(shù)個核苷酸差異并因此含有一個或數(shù)個SNPs(單核苷酸多態(tài)性)的靶序列。
本發(fā)明的方法和陣列的優(yōu)點在于能夠用于鑒定和/或定量DNA序列，單或雙鏈序列，所述序列可直接獲自生物體或其部分——即無需預先擴增步驟——，或者也可在基因組DNA或RNA部分擴增之后獲得。靶序列的擴增可通過本領域任何公知方法實現(xiàn)，包括但不限于PCR，LCR，NASBA，滾動循環(huán)(rolling circle)或可以產(chǎn)生相當可靠地復制指定序列的任何其它方法。在遺傳學擴增方法中可以使用一種或多種(PCR)引物或引物組。引物可以是通用引物，共有序列引物(consensusprimers)和/或類型-特異性引物。本發(fā)明的試劑盒可以包括各容器(chamber)，在其中檢測是否存在(微)生物體的任一擴增序列，遺傳學擴增是在同一個容器內(nèi)完成的。可以通過本發(fā)明試劑盒進行來自所述(微)生物體的靶核苷酸序列的遺傳學擴增方法。
擴增的核苷酸序列可以是最初被反轉(zhuǎn)錄為cDNA的mRNA，可以利用相同引物對進行反轉(zhuǎn)錄和擴增。
在遺傳學擴增循環(huán)及其后在陣列上的鑒定過程中可能首先檢測到是否存在任何擴增序列。
在微陣列上捕獲的靶分子可通過任何本領域公知的物理或化學檢測方法進行檢測，包括但不限于利用熒光標記，比色法，生物發(fā)光，化學發(fā)光，電，表面胞質(zhì)基因共振(surface plasmon resonance)，電磁信號等。由于捕獲分子與固體支持物上定義明確的位置相連，因此放大了捕獲或雜交信號的閱讀和解釋。
用于構建本發(fā)明微陣列的(不溶的)固體支持物或基質(zhì)優(yōu)選選自玻璃，電子器件，硅支持物，硅石，金屬或其混合物，是以載玻片，盤狀物，凝膠層和/或珠粒形式制備。珠?？梢孕纬申嚵?，只要它們具有某些能夠彼此區(qū)分的特征，以便將珠粒的鑒定與指定捕獲分子的鑒定相聯(lián)系，從而鑒定靶序列。上述實例并非窮舉性的。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，利用包含至少檢測和/或定量裝置的儀器，用于檢測和/或定量靶分子或來自(微)生物體的組分在陣列上被捕獲的位置形成的信號，可以促進被捕獲的靶序列的檢測，鑒定和/或定量，該裝置可以是一個讀數(shù)裝置，用于閱讀在所述固體支持物表面記錄的信息，或一個計算機程序，用于識別帶有與相應捕獲分子結合的靶分子的離散區(qū)域及其位置，可以是該位置存在的信號的一個定量程序，以及將在這些位置上存在的信號與所述(微)生物體或組分的診斷和/或定量相關聯(lián)的一個程序。本發(fā)明涉及適合于這些目的并能閱讀本發(fā)明微陣列且解釋其結果的儀器。
本發(fā)明進一步涉及定制陣列在用于檢測、鑒定和/或定量第一和第二組靶分子的生物分子混合物的試劑盒或檢測方法中的應用。這些靶分子可屬于組分或(微)生物體的不同組、亞組或亞亞組(sub-sub-group)。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，第一組捕獲分子可以對單獨的靶組分或其亞組特異，而第二組則對該組的所有組分特異，或反之亦然。
本發(fā)明的方法和試劑盒可用于檢測任一種(微)生物體或其任一組分。(微)生物體及其組分的實例包括但不限于選自下列的葡萄球菌種S.aureus，S.epidermidis，S.saprophyticus，S.hominis和/或S.haemolyticus，屬于分枝桿菌屬的樣品，屬于MAGE家族或HLA-A家族的序列，G偶聯(lián)受體，多巴胺受體，膽堿受體，組胺受體，細胞色素P450家族的成員，GRAM+或GRAM-家族細菌。
可以選擇相應于各科，屬，種，亞型或個體生物的組，亞組或單個靶分子或靶序列。優(yōu)選該科，屬，種，亞類或個體是細菌，例如葡萄球菌(Staphylococcus)，腸球菌(Enterococcus)，鏈球菌屬(Streptococcus)，haemolyticus，假單胞菌屬(Pseudomonas)，彎曲桿菌屬(Campylobacter)，腸桿菌屬(Enterobacter)，奈瑟氏菌屬(Neisseria)，變形菌屬(Proteus)，沙門氏菌屬(Salmonella)，西蒙斯菌屬(Simonsiella)，Riemerella，埃希桿菌屬(Escherichia)，奈瑟菌屬(Neisseria)，腦膜炎球菌(Meningococcus)，摩拉克菌屬(Moraxella)，金氏桿菌屬(Kingella)，色桿菌屬(Chromobacterium)及布蘭漢氏球菌屬(Branhamella)。上述列表并非窮舉性的。
實施例實施例1構建具有靶特異性捕獲分子和靶非特異性捕獲分子的微陣列并通過使用60個堿基的特異銜接分子檢測靶分子玻璃支持物的功能化 根據(jù)歐洲專利申請EP1184349中描述的方法，利用醛將玻璃載片功能化。
靶特異性(組A)和靶非特異性捕獲分子(組B)在支持物上的固定 按照Delongueville等，2002(Biochem，Pharmacol，64137-149)的描述，特異性捕獲分子針對59個基因。它們靶向大鼠Hepatochip dualchip中59個毒理學相關的基因(Eppendorf，HamburgGermany)。合成3種靶-不相關捕獲分子并點樣在陣列上。PCR擴增插入到質(zhì)粒中的植物克隆序列，合成了這3種捕獲分子。通過銜接子而被固定在靶不相關捕獲分子上的這3種靶分子是同時固定在3種靶特異性捕獲分子上的。由于3種靶分子是在兩組捕獲分子上同時被定量，因此可校正這些靶分子的定量。
所用的PCR有義引物如下序列1的PALFAS1(SEQ ID NO1)5′-gcatggatgttgctctcgcgtagacgactggatggctagttactgctctg-3′序列2的PALUCP21(SEQ ID NO2)5′-agtacgtcgacagacttagtcctgaagctcgatggctagttactgctctg-3′序列3的PALL191(SEQ ID NO3)5′-ggctgatcatgtactccaaggtttgttatcgatggctagttactgctctg-3′有義引物在5′末端(黑體)包含30個浮動堿基(floating bases)，后面20個堿基是插入物特異的。
3個PCR反應中反義引物是共同的。在5′末端胺化，并是插入物特異的。
PAL2(SEQ ID NO4)5′-胺-atgagtttcaagatttcaacag-3′ 3種捕獲分子的序列如下TPALFAS(SEQ ID NO5)5′胺-
atgagtttcaagatttcaacatgagtttcaagatttcaacagcttctgatgttttccttgaagagattaagcccaaggagtttacatcttgattgtgttgttcagcactttgaacatggttggtcactggattggctaaaaattgaagttcagagcagtaactagccatccagagcagtaactagccatccagtcgtctacgcgagagcaacatccatgc-3′TPALUCP2(SEQ ID NO6)5′胺-atgagtttcaagatttcaacatgagtttcaagatttcaacagcttctgatgttttccttgaagagattaagcccaaggagtttacatcttgattgtgttgttcagcactttgaacatggttggtcactggattggctaaaaattgaagttcagagcagtaactagccatccagagcagtaactagccatcgagcttcaggactaagtctgtcgacgtact-3′TPALL19(SEQ ID NO7)5′胺-atgagtttcaagatttcaacatgagtttcaagatttcaacagcttctgatgttttccttgaagagattaagcccaaggagtttacatcttgattgtgttgttcagcactttgaacatggttggtcactggattggctaaaaattgaagttcagagcagtaactagccatccagagcagtaactagccatcgataacaaaccttggagtacatgatcagcc-3′ 陰性對照由相同長度捕獲分子組成，包含30個堿基的隨機序列，其不能被存在于溶液中的銜接子識別。
在點樣溶液中稀釋捕獲分子(EAT Namur，Belgium)。使用平針(plain pins)在支持物的空間分離位置上將兩組捕獲分子點樣到一個陣列上。在室溫下干燥載玻片1h。用洗滌緩沖液洗滌載玻片2min，共2次，然后用水洗滌3次。在4℃儲藏載玻片待用。
在本發(fā)明的定制微陣列上檢測靶cDNA 用雜交框包圍含有第一和第二組捕獲分子的支持物表面，該框限定了與含有靶分子的溶液接觸的支持物表面的界限。首先用3種不同的合成銜接分子55℃溫育陣列30min。該銜接分子是約60個堿基的多核苷酸。它們含有30個互補于捕獲分子的堿基和30個互補于靶cDNA序列的堿基。3種靶cDNA是FAS(登錄號U03470，并入本文作為參考)，UCP2(登錄號AB010743，并入本文作為參考)和L19(登錄號J02650，并入本文作為參考)。
3種銜接分子的序列如下
AFAS 30(SEQ ID NO8)5′-ataaagttttgggctgctgtgtggcaatgcgcatggatgttgctctcgcgtagacgactg-3′AUCP230(SEQ ID NO9)5′-atgccattgtcaactgtactgagctggtgaagtacgtcgacagacttagtcctgaagctc-3′AL1930(SEQ ID NO10)5′-cgtcctccgctgtggtaaaaagaaggtgtgggctgatcatgtactccaaggtttgttatc-3′互補于捕獲分子的序列以黑體表示。
通過化學合成獲得銜接分子(Eurogentec，Liege，Belgium)。在溫育以后，用SSC2X溶液洗滌陣列。然后按照本文上述(Delongueville等，2002)，用來自大鼠肝臟的生物素化cDNA溫育陣列。用生物素化靶cDNA雜交后，用含有0.01％阻斷劑的B1緩沖液以1/1000稀釋抗青色素抗體(Jackson ImmunoResearch，Cy3ref-200.162.096，Cy5ref-200.172.096)，用其溫育陣列。然后用B1緩沖液洗滌生物芯片2min，洗滌4次。在室溫下干燥生物芯片并用GMS418 ScanArray(General Scanning)掃描。圖像數(shù)字化后，使用imagene軟件(Biodiscovery，Marina Del Rey，USA)來確定點樣表面的界限，整合各點樣的信號，去掉各點樣附近局部背景，鑒定各點樣的定位并將定位與靶分子的鑒定相聯(lián)系?；旧习凑丈厦?Delongueville等，2002)所述定量樣品中存在的靶分子。校正兩組的靶分子定量值，以確定其在分析所用的初始樣品中的數(shù)量。通過使用在兩組捕獲分子上同時定量的3種共同靶cDNAs(上述FAS，UCP2和L19)進行校正。
實施例2構建具有靶特異性捕獲分子和靶非特異性捕獲分子的微陣列并通過使用80個堿基的特異性銜接分子檢測靶分子 實驗按照實施例1進行。用于檢測3種靶cDNA的銜接分子是80個堿基的多核苷酸。它們含有30個互補于捕獲分子的堿基(黑體)和50個互補于靶cDNA序列的堿基。
3種銜接分子的序列如下AFAS50(SEQ ID NO11)5′-ataaagttttgggctgctgtgtggcaatgcagaggcaaagagaaggaactgcatggatgttgctctcgcgtagacgactg-3′AUCP250(SEQ ID NO12)5′-atgccattgtcaactgtactgagctggtgacctatgacctcatcaaagatagtacgtcgacagacttagtcctgaagctc-3′AL1950(SEQ ID NO13)5′-cgtcctccgctgtggtaaaaagaaggtgtggttggaccccaatgaaaccaggctgatcatgtactccaaggtttgttatc-3′實施例3構建具有靶特異性捕獲分子和靶非特異性捕獲分子的微陣列并通過使用60個堿基的特異性銜接分子檢測靶分子和內(nèi)標物 按照實施例1進行實驗，在兩組捕獲分子上檢測3種共同靶分子。本微陣列在組A中還含有3種內(nèi)部標準特異性捕獲分子(RBCL，CAB10B，核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶激活酶(rubisco activase))。使用3種額外的靶不相關捕獲分子校正雜交效率。它們用來捕獲部分互補于內(nèi)標cDNA的銜接分子。
PCR擴增來自被插入到質(zhì)粒中的植物克隆序列，合成了這3種新的靶不相關捕獲分子。引物5′末端的30個堿基的浮動序列不同于 使用了以下有義引物
序列1的PALRBCL1(SEQ ID NO14)5′-tctgttcccttacgactcgataagagctctgatggctagttactgctctg-3′序列2的PALCAB1(SEQ ID NO15)5′-actcttgctgaggctattcaaggcggcatcgatggctagttactgctctg-3′序列3的PALRUBI1(SEQ ID NO16)5′-atacagttcaatcgccgagtctacgcggtagatggctagttactgctctg-3′ 同樣，有義引物在5′末端(黑體)包含30個浮動堿基(floating bases)，后面20個堿基是插入特異性的。
反義引物同實施例1(SEQ ID NO4)。
用于3種內(nèi)標物的3種捕獲分子序列如下TPALRBCL(SEQ ID NO17)5′胺-atgagtttcaagatttcaacatgagtttcaagatttcaacagcttctgatgttttccttgaagagattaagcccaaggagtttacatcttgattgtgttgttcagcactttgaacatggttggtcactggattggctaaaaattgaagttcagagcagtaactagccatccagagcagtaactagccatcagagctcttatcgagtcgtaagggaacaga-3′TPALCAB(SEQ ID NO18)5′胺-atgagtttcaagatttcaacatgagtttcaagatttcaacagcttctgatgttttccttgaagagattaagcccaaggagtttacatcttgattgtgttgttcagcactttgaacatggttggtcactggattggctaaaaattgaagttcagagcagtaactagccatccagagcagtaactagccatcgatgccgccttgaatagcctcagcaagagt-3′TPALRUBI(SEQ ID NO19)5′胺-atgagtttcaagatttcaacatgagtttcaagatttcaacagcttctgatgttttccttgaagagattaagcccaaggagtttacatcttgattgtgttgttcagcactttgaacatggttggtcactggattggctaaaaattgaagttcagagcagtaactagccatccagagcagtaactagccatctaccgcgtagactcggcgattgaactgtat-3′ 3種內(nèi)標物cDNA是RBCL(登錄號L14403，并入本文作為參考)，CAB10B(登錄號M32606，并入本文作為參考)和Lycopersiconpennellii核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶激活酶(登錄號AF037361，并入本文作為參考)。
用于3種內(nèi)標物的3種銜接分子序列如下ARBCL30(SEQ ID NO20)5′-gtagcttaccctttagacctttttgaagaatctgttcccttacgactcgataagagctct-3′ACAB30(SEQ ID NO21)5′-ccaccacatctgctactgcagtgctgaatgactcttgctgaggctattcaaggcggcatc-3′ARUBI 30(SEQ ID NO22)5′-gacggcttctacattgcccctgctttcatgatacagttcaatcgccgagtctacgcggta-3′3種內(nèi)標物是以1000ng(AB)，100ng(RBCL)和30ng(RCA)的濃度加入。以3個掃描器設置計算兩組捕獲分子的相對結合效率，并用于校正兩組捕獲分子中靶分子的檢測值。校正是在針對定量是線性的基因的各掃描器設置下進行。
互補于捕獲分子的銜接分子部分以黑體表示。
通過化學合成獲得銜接分子。其余方面，實驗是按照實施例1進行，在內(nèi)標物捕獲分子上獲得的信號用于校正靶特異性和靶非特異性捕獲分子之間的雜交效率。
序列表<110>Eppendorf AG<120>專門的微陣列構建及其用于靶分子檢測的用途<130>BP.EAT.004A/EP<140>EP04447112.6<141>2004-05-04<160>22<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PALFAS1有義引物<400>1gcatggatgt tgctctcgcg tagacgactg gatggctagt tactgctctg 50<210>2<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PALUCP21有義引物<400>2agtacgtcga cagacttagt cctgaagctc gatggctagt tactgctctg 50<210>3<211>50<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>PALL191有義引物<400>3ggctgatcat gtactccaag gtttgttatc gatggctagt tactgctctg50<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PAL2反義引物<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(1)<223>氨基化a<400>4atgagtttca agatttcaac ag 22<210>5<211>220<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TPALFAS捕獲分子<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(1)<223>氨基化a<400>5atgagtttca agatttcaac atgagtttca agatttcaac agcttctgat gttttccttg60aagagattaa gcccaaggag tttacatctt gattgtgttg ttcagcactt tgaacatggt120
tggtcactgg attggctaaa aattgaagtt cagagcagta actagccatc cagagcagta180actagccatc cagtcgtcta cgcgagagca acatccatgc 220<210>6<211>220<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TPALUCP2捕獲分子<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(1)<223>氨基化a<400>6atgagtttca agatttcaac atgagtttca agatttcaac agcttctgat gttttccttg60aagagattaa gcccaaggag tttacatctt gattgtgttg ttcagcactt tgaacatggt120tggtcactgg attggctaaa aattgaagtt cagagcagta actagccatc cagagcagta180actagccatc gagcttcagg actaagtctg tcgacgtact 220<210>7<211>220<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TPALL19捕獲分子<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(1)<223>氨基化a<400>7
atgagtttca agatttcaac atgagtttca agatttcaac agcttctgat gttttccttg60aagagattaa gcccaaggag tttacatctt gattgtgttg ttcagcactt tgaacatggt120tggtcactgg attggctaaa aattgaagtt cagagcagta actagccatc cagagcagta180actagccatc gataacaaac cttggagtac atgatcagcc 220<210>8<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AFAS30街接分子<400>8ataaagtttt gggctgctgt gtggcaatgc gcatggatgt tgctctcgcg tagacgactg 60<210>9<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AUCP230街接分子<400>9atgccattgt caactgtact gagctggtga agtacgtcga cagacttagt cctgaagctc 60<210>10<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AL1930街接分子<400>10cgtcctccgc tgtggtaaaa agaaggtgtg ggctgatcat gtactccaag gtttgttatc 60
<210>11<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AFAS50街接分子<400>11ataaagtttt gggctgctgt gtggcaatgc agaggcaaag agaaggaact gcatggatgt60tgctctcgcg tagacgactg80<210>12<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AUCP250街接分子<400>12atgccattgt caactgtact gagctggtga cctatgacct catcaaagat agtacgtcga 60cagacttagt cctgaagctc 80<210>13<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AL1950街接分子<400>13cgtcctccgc tgtggtaaaa agaaggtgtg gttggacccc aatgaaacca ggctgatcat60gtactccaag gtttgttatc80<210>14
<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PALRBCL1有義引物<400>14tctgttccct tacgactcga taagagctct gatggctagt tactgctctg 50<210>15<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PALCAB1有義引物<400>15actcttgctg aggctattca aggcggcatc gatggctagt tactgctctg 50<210>16<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PALRUBI1有義引物<400>16atacagttca atcgccgagt ctacgcggta gatggctagt tactgctctg 50<210>17<211>220<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TPALRBCL捕獲分子
<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(1)<223>氨基化a<400>17atgagtttca agatttcaac atgagtttca agatttcaac agcttctgat gttttccttg60aagagattaa gcccaaggag tttacatctt gattgtgttg ttcagcactt tgaacatggt120tggtcactgg attggctaaa aattgaagtt cagagcagta actagccatc cagagcagta180actagccatc agagctctta tcgagtcgta agggaacaga 220<210>18<211>220<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TPALCAB捕獲分子<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(1)<223>氨基化a<400>18atgagtttca agatttcaac atgagtttca agatttcaac agcttctgat gttttccttg60aagagattaa gcccaaggag tttacatctt gattgtgttg ttcagcactt tgaacatggt120tggtcactgg attggctaaa aattgaagtt cagagcagta actagccatc cagagcagta180actagccatc gatgccgccttgaatagcct cagcaagagt 220<210>19<211>220<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>TPALRUBI捕獲分子<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(1)<223>氨基化a<400>19atgagtttca agatttcaac atgagtttca agatttcaac agcttctgat gttttccttg60aagagattaa gcccaaggag tttacatctt gattgtgttg ttcagcactt tgaacatggt120tggtcactgg attggctaaa aattgaagtt cagagcagta actagccatc cagagcagta180actagccatc taccgcgtag actcggcgat tgaactgtat 220<210>20<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>ARBCL30街接分子<400>20gtagcttacc ctttagacct ttttgaagaa tctgttccct tacgactcga taagagctct 60<210>21<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>ACAB30街接分子<400>21ccaccacatc tgctactgca gtgctgaatg actcttgctg aggctattca aggcggcatc 60<210>22
<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>ARUBI30街接分子<400>22gacggcttct acattgcccc tgctttcatg atacagttca atcgccgagt ctacgcggta60
權利要求
1.在(微)陣列固體支持物表面(6)上檢測和定量可能同時存在于生物樣品中的第一組和第二組靶分子(1，3)的方法，所述(微)陣列(7)含有存在于固體支持物表面(6)不同位置(8，9)的第一組(A)和第二組(B)捕獲分子(2，4)，其中第一組捕獲分子(A)由對第一組靶分子(1)呈特異性的至少3種捕獲分子(2)組成并通過特異性分子識別作用直接固定第一組靶分子(1)，其中第二組捕獲分子(B)由和第二組靶分子(3)不相關并沒有直接結合親合性的至少3種捕獲分子(4)組成，第二組捕獲分子(B)能夠通過銜接分子(5)固定第二組靶分子(3)，其中第一組靶分子(1)相對于第二組靶分子(3)的相對定量是通過一個校正系數(shù)獲得，該校正系數(shù)通過使用在兩組(A，B)捕獲分子(2，4)上同時定量的至少一個相同的分子(x)計算得到。
2.權利要求1的方法，其中屬于一組的靶分子的相對定量被劃分為至少2個靶分子亞組，并根據(jù)不同校正系數(shù)校正。
3.權利要求1的方法，其中屬于一組的靶分子被劃分為至少2個靶分子亞組，通過不同檢測掃描器設置定量。
4.權利要求2的方法，其中靶分子的亞組相應于靶分子的不同濃度。
5.在前任一權利要求的方法，其中屬于第一組或第二組靶分子的靶分子(1，3)的檢測是定量的，其中所述定量檢測通過一個校正系數(shù)校正，該校正系數(shù)允許類似地和同步地定量所有起初存在于樣品中并被固定在相應捕獲分子上的靶分子。
6.權利要求5的方法，其中通過檢測至少一個被加到樣品中并接受與靶分子相同的檢測步驟的已知濃度的標準分子來校正定量的檢測。
7.權利要求5的方法，其中在兩組(A，B)捕獲分子(2，4)上檢測至少一個靶分子。
8.權利要求6或7的方法，其中通過在兩組(A，B)中定量檢測靶分子和/或標準分子來校正靶分子(1，3)在兩組(A，B)捕獲分子(2，4)上的固定效率。
9.權利要求1的方法，其中第二組(B)捕獲分子(4)是全能性捕獲分子。
10.在前任一權利要求的方法，其中檢測是在存在于固體支持物表面(6)上的至少兩個陣列(7′，7″)上進行；其中所述至少兩個陣列(7′，7″)包含第一組(A)捕獲分子(2)用于檢測同一靶分子(1)；以及各陣列含有不同亞組(B，B′)的捕獲分子(4，4′)，用于檢測一個陣列(7′)與另一陣列(7″)之間不同的靶分子(3，3′)。
11.在前權利要求1到10任一項的方法，其中靶分子(3)固定到第二組(B)捕獲分子(4)是通過用戶向捕獲分子加入銜接分子(5)完成。
12.在前任一權利要求的方法，其中靶分子、捕獲分子和銜接分子是核苷酸序列。
13.權利要求12的方法，其中靶分子(3)固定到第二亞組(B)捕獲分子(4)是通過在捕獲分子(4)和靶分子(3)之間通過銜接分子(5)進行夾心雜交而完成。
14.權利要求13的方法，其中銜接分子(5)含有第一部分(11)，該部分可通過互補堿基配對與捕獲分子(4)的特異性末端部分雜交，其中銜接分子(5)還含有第二部分(10)，該部分對一種或多種靶分子(3)的至少一部分是特異的。
15.權利要求1到11任一項的方法，其中靶分子和捕獲分子是蛋白質(zhì)，其中銜接分子是嵌合的蛋白質(zhì)或雜合抗體。
16.權利要求1到11任一項的方法，其中靶分子和捕獲分子分別是抗原和抗體(或者所述抗體的高變的部分)或，抗體(或者所述抗體的高變的部分)和抗原。
17.在前任一權利要求的方法，其中第二組(B)捕獲分子(4)包含能夠特異性結合銜接分子(5)的末端反應性化學官能團。
18.權利要求17的方法，其中所述末端反應性化學官能團選自醛基、環(huán)氧基、丙烯酸根/鹽/酯基團，或是其混合物。
19.一種檢測和定量試劑盒，其含有-具有一個表面(6)的固體支持物，該表面含有至少兩組(A，B)捕獲分子(2，4)，這兩組捕獲分子存在于所述固體支持物表面(6)的不同位置(8，9)，-其中位于第一位置(8)的第一組(A)捕獲分子含有至少3種對樣品中待檢測和定量的第一組靶分子(1)特異的不同捕獲分子(2)，所述捕獲分子能夠直接固定靶分子(1)，-其中位于第二位置(9)的第二組(B)捕獲分子具有至少3種與待檢測和定量的第二組靶分子(3)不相關且不具備直接結合親合性以固定靶分子(3)的捕獲分子(4)，和-一種或多種能夠?qū)⒌诙M靶分子(3)結合到第二組(B)捕獲分子(4)上的銜接分子(5)，-用于獲得第一組靶分子(1)相對于第二組靶分子(3)的相對定量的可能手段和信息。
20.權利要求19的檢測和定量試劑盒，其中用于獲得相對定量的手段是一種將要隨靶分子(1，3)加入樣品中并接受相同檢測步驟的標準分子。
21.權利要求19或20的試劑盒，其中第二組(B)捕獲分子(4)是全能性捕獲分子。
22.在前權利要求19到21任一項的試劑盒，其中固體支持物表面(6)含有至少兩個陣列(7′，7″)，其中所述陣列包含第一組(A)捕獲分子(2)，用于檢測同一靶分子(1)，各陣列(7′，7″)還含有不同組(B，B′)捕獲分子(4，4′)，用于檢測一個陣列(7′)與另一陣列(7”)之間不同的靶分子(3，3′)。
23.在前權利要求19到22任一項的試劑盒，其中靶分子，捕獲分子和銜接分子是核苷酸序列。
24.權利要求19到22任一項的試劑盒，其中靶分子和捕獲分子是蛋白質(zhì)，其中銜接分子是嵌合的蛋白質(zhì)或雜合抗體。
25.在前權利要求19到22任一項的試劑盒，其中靶分子和捕獲分子分別是-抗原和抗體(或者所述抗體的高變的部分)；或-抗體(或者所述抗體的高變的部分)和抗原。
26.權利要求23的試劑盒，其中捕獲分子(4)結合到靶分子(3)是通過在捕獲分子(4)，靶分子(3)和銜接分子(5)之間進行夾心雜交而完成。
27.權利要求26的試劑盒，其中銜接分子(5)含有第一部分(11)，該部分可通過互補堿基配對與捕獲分子(4)的特異性末端部分雜交，其中銜接分子含有第二部分(10)，該部分對一種或多種靶分子(3)的至少一部分特異。
28.在前權利要求19到27任一項的試劑盒，其中第二組(B)捕獲分子(4)包含能夠特異性結合銜接分子(5)的末端反應性化學官能團。
29.權利要求28的試劑盒，其中所述末端反應性化學官能團選自醛基、環(huán)氧基和丙烯酸根/酯/鹽基團，或是其混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及可能同時存在于一種生物樣品內(nèi)的不同組靶分子(1，3)的檢測和定量方法，該方法利用存在于固體支持物表面(6)的微陣列，該微陣列含有不同組(A，B)的捕獲分子(2，4)，這兩組捕獲分子存在于固體支持物表面(6)的不同位置(8，9)。
文檔編號C12Q1/68GK1693481SQ20051005622
公開日2005年11月9日 申請日期2005年3月31日 優(yōu)先權日2004年5月4日
發(fā)明者喬斯·勒馬克勒, 拉斯－埃里克·彼得斯, 康拉德·拜羅伊特 申請人:埃佩多夫股份公司