專利名稱：新的單體胰島素，藥物組合物及其制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和藥物學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及新的胰島素B鏈、含該B鏈的單體胰島素、含所述單體胰島素的藥物組合物，及其制法和用途。
背景技術(shù)：
糖尿病發(fā)病率逐年上升，并能引發(fā)心血管疾病致死，是當(dāng)今威脅人類健康的主要疾病之一。高血糖是引發(fā)各種糖尿病并發(fā)癥的原因，而嚴(yán)格控制每天24小時(shí)的血糖濃度在正常范圍是防止、延緩糖尿病后期并發(fā)癥的最關(guān)鍵因素。
胰島素從20世紀(jì)20年代用于治療糖尿病以來，一直是無可替代的特效藥。但是，正常人體內(nèi)胰島素的分泌是受血糖濃度調(diào)控的，一般是在進(jìn)餐后30-60分鐘血胰島素濃度達(dá)到峰值，4-5小時(shí)后恢復(fù)到基礎(chǔ)濃度，這樣能夠保證血糖濃度不因進(jìn)餐而有大的波動(dòng)。
常規(guī)胰島素制劑在臨床給藥中不能模仿生理胰島素分泌的時(shí)相性，很難有效的控制飯后的血糖升高，還有給患者帶來低血糖的危險(xiǎn)。這是因?yàn)樵谥行匀芤褐?，濃度高?00nM時(shí)胰島素以二聚體、六聚體的形式存在，而其必須解離成單體后結(jié)合專一受體發(fā)揮生理功能。這種分子間的聚合提高了胰島素的穩(wěn)定性，利于貯存和調(diào)節(jié)活性，確保能夠精細(xì)、靈活地調(diào)控血糖，但給胰島素的吸收造成很大的障礙。胰島素制劑(0.6mM)以六聚體形式存在，注射后經(jīng)過5-10萬倍的稀釋由六聚體轉(zhuǎn)為二聚體在轉(zhuǎn)為單體胰島素方能被毛細(xì)血管吸收進(jìn)入血液循環(huán)，在肌肉或皮下這種高倍的稀釋是一個(gè)慢而長的過程，2-4小時(shí)只有50％的胰島素被吸收。皮下注射胰島素制劑后，90-120分鐘后血胰島素達(dá)到比較低的峰值，之后又不能快速降低。(Home，P.D.，et al.，Metabolism，1981，30439；Blundall，T.，et al.，Adv.Protein Chem.，1972，26279；Drejer，K.，Diabetes/Metabolism Reviews，1992，8259；Insulin research group，Academia Sinica，Sci.Sin.，1974，17779；Brange，J.Stability of insulin，1994；Brange，J.et al.，Advanced Drug Delivery Reviews，1999，35307-335)。
在中性溶液中自聚合性質(zhì)降低的胰島素稱為單體胰島素，在給藥處無須經(jīng)過高倍稀釋即可被迅速吸收，且縮短了給藥后藥物作用的時(shí)程，故而獲得可用于臨床的單體速效胰島素是開發(fā)新一代治療糖尿病藥物的主要目標(biāo)之一。EliLilly公司開發(fā)的單體胰島素Lyspro于1996年分別在歐洲和美國用于臨床，取得很好效果。皮下注射Lyspro后15分鐘起效，1個(gè)小時(shí)血胰島素濃度達(dá)到峰值，2-4小時(shí)后恢復(fù)到，飯后15分鐘給Lyspro和飯前20分鐘給常規(guī)胰島素的效果相當(dāng)。目前Novo公司研發(fā)的另一種單體胰島素Aspart正處于臨床研究中。(Howey，D.C.，et al.，Diabetes，1994，43396-402；Torlone，E.et al.，Diabetologia，1994，37713-720；Rami，B.et al.，Eur.J.Pediatr.1999，156838-840；Vajo，Z.et al.Pharmacological reviews.2000，521-9)。
中國專利ZL98 110912.8公開了在啤酒酵母中分泌表達(dá)單體胰島素前體(MIP)，通過酶促轉(zhuǎn)肽獲得單體胰島素的方法。該單體胰島素的B鏈C端去五肽胰島素DPI，或者B鏈C端去四肽胰島素DTI)(Cui，D.F.，et al.，JPept Res，2001.57188-92)。然而，該工藝因以下主要缺點(diǎn)而難以大規(guī)模生產(chǎn)(1)需要化學(xué)合成小肽，如GFFY(But)Obut；(2)胰蛋白酶酶促轉(zhuǎn)肽時(shí)，得率在80％以內(nèi)；(3)酶促轉(zhuǎn)肽后中間體需要經(jīng)過強(qiáng)酸，如三氟乙酸(TFA)處理以脫去保護(hù)基；(4)工藝流程復(fù)雜，存在化學(xué)副反應(yīng)。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的制法簡(jiǎn)便、適合大規(guī)模生產(chǎn)的單體胰島素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種制法簡(jiǎn)便、適合大規(guī)模生產(chǎn)的單體胰島素。
本發(fā)明的另一目的是提供含有該單體胰島素的藥物組合物。
本發(fā)明的再一目的是提供所述單體胰島素和藥物組合物的制法和用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種胰島素B鏈，具有以下氨基酸序列FVNQH LCGSH LVEAL YLVCG ERX23X24X25X26Y27(SEQID NO1)
其中，X23、X24、X25和X26各自獨(dú)立，分別是Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Pro，Met，His，Val或不存在，且X23、X24、X25和X26中至多有一個(gè)不存在；Y27是Lys，或Arg。
在一優(yōu)選例中，Y27是Lys。
在另一優(yōu)選例中，X23X24X25X26是GFFY。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種胰島素，它上述的B鏈。
在一優(yōu)選例種，所述胰島素是單體胰島素。
在另一優(yōu)選例中所述的胰島素的結(jié)構(gòu)如下 其中，X23、X24、X25、X26、Y27如上定義。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，含有本發(fā)明所述的胰島素和藥學(xué)上可接受的載體。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種單體胰島素表達(dá)前體，它從氨基端至羧基端分別含有本發(fā)明上述的胰島素B鏈、連接肽、和胰島素A鏈，其中連接肽為Ala-Ala-Lys。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種分離的DNA，該DNA編碼上述的胰島素B鏈、或單體胰島素表達(dá)前體。還提供了含有所述DNA的載體，以及含有所述DNA或所述載體的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第六方面，提供了一種制備胰島素的方法，包括步驟(a)在表達(dá)條件下，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有編碼單體胰島素表達(dá)前體的DNA，從而表達(dá)出所述的單體胰島素表達(dá)前體；所述的前體從氨基端至羧基端分別含有胰島素B鏈、連接肽、和胰島素A鏈，其中胰島素B鏈具有以下氨基酸序列FVNQH LCGSH LVEAL YLVCG ERX23X24X25X26Y27式中，X23、X24、X25、X26和Y如上定義；(b)分離出所述的單體胰島素表達(dá)前體；
(c)用胰蛋白酶酶切割所述的單體胰島素表達(dá)前體；(d)分離出單體胰島素。


圖1，DOI的DEAE-Sephadex A25分離圖，流動(dòng)相為pH7.3，50mmol/L Tris緩沖液，含有40％異丙醇，鹽梯度為(0.05-0.2mol/L NaCl)；主峰為DOI。橫坐標(biāo)為流出體積，縱坐標(biāo)為A280nm。
圖2，Gly-Phe-Phe-Tyr-Lys(Boc)Obut的薄層層析，左，粗品；右，純化后產(chǎn)物。3/7系統(tǒng)展開劑為3份A(吡啶4V，醋酸1V，水1.5V)、7份B(醋酸丁酯10V，異丙醇4V)，氯氣-淀粉-KI顯色。
圖3，Gly-Phe-Phe-Tyr-Lys(Boc)Obut的HPLC分析，C8柱，(Beckman，4.6×250mm)，流動(dòng)相B為含0.1％TFA的70％乙腈，流動(dòng)相A為含0.1％TFA的水，梯度(0-100％B/0-50min)，流速為1ml/min。橫坐標(biāo)為流出時(shí)間，縱坐標(biāo)為A280nm。
圖4，pH8.3聚丙烯酰胺凝膠電泳，膠濃度為15％，考馬斯亮蘭染色。從左到右分別為DOI，酶促反應(yīng)液，B27K-DTrI粗品，B27K-DTrI純品，豬胰島素。
圖5，酶促反應(yīng)液的sephadex G50(f)柱(1.6×60cm)的分離圖，流動(dòng)相為30％乙酸，峰2為B27K-DTrI和DOI的混合物。橫坐標(biāo)為流出體積，縱坐標(biāo)為A280nm。
圖6，B27K-DTrI(Boc)Obut的RP-HPLC的分離圖，C8柱(Beckman，10×250mm)，流動(dòng)相B為含0.1％TFA的70％乙腈，流動(dòng)相A為含0.1％TFA的水，梯度(10-60％B/10-40min)，流速為2ml/min.峰1為DOI，峰2為B27K-DTrI(Boc)Obut，峰3為Gly-Phe-Phe-Tyr-Lys(Boc)Obut。橫坐標(biāo)為流出時(shí)間，縱坐標(biāo)為A280nm。
圖7，B27K-DTrI的RP-HPLC的分離圖，C8柱(Beckman，10×250mm)，流動(dòng)相B為含0.1％TFA的70％乙腈，流動(dòng)相A為含0.1％TFA的水，梯度(10-60％B/10-40min)，流速為2ml/min，主峰為B27K-DTrI。橫坐標(biāo)為流出時(shí)間，縱坐標(biāo)為A280nm。
圖8，B27K-DTrI HPLC分析，C8柱(Beckman，4.6×250mm)，流動(dòng)相B為含0.1％TFA的70％乙腈，流動(dòng)相A為含0.1％TFA的水，梯度(30-70％B/10-40min)，流速為1ml/min。橫坐標(biāo)為流出時(shí)間，縱坐標(biāo)為A230nm。
圖9，B27K-DTrI的電噴霧質(zhì)譜分析(MATLCQ ESI-MS)，電噴電壓為4.25KV，毛細(xì)管溫度為200℃。理論分子量為5508.3，實(shí)測(cè)分子量為5509.0，誤差為0.01％。
圖10，蛋白質(zhì)濃度對(duì)脫鋅豬胰島素(上)和B27K-DTrI(下)的凝膠層析的影響，Superdex75柱，流動(dòng)相為pH7.4的PBS，流速為0.4ml/min；蛋白質(zhì)濃度從低到高分別為40，80，200，400，600μmol/L。橫坐標(biāo)為流出時(shí)間，縱坐標(biāo)為A280nm。
圖11，蛋白質(zhì)濃度對(duì)層析的峰形(上)和保留時(shí)間(下)的影響。橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)濃度，縱坐標(biāo)中Fs為對(duì)稱因子，Kav為保留因子。
圖12，脫鋅豬胰島素(I)，Lyspro(II)，B27K-DTrI(III)和DPI(IV)的凝膠層析，Superdex75柱，流動(dòng)相為pH7.4的PBS，流速為0.4ml/min，蛋白質(zhì)濃度均為80μmol/L。
圖13，本發(fā)明一種單體胰島素的結(jié)構(gòu)。
圖14，本發(fā)明B27K-DtrI與現(xiàn)有技術(shù)中DTI的生產(chǎn)工藝比較。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)在胰島素B鏈末端添加堿性氨基酸，可以大大簡(jiǎn)化胰島素的生產(chǎn)工藝，而對(duì)胰島素活性基本無影響，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。例如，在羧端去四肽胰島素上再添加一個(gè)堿性氨基酸后得到胰島素類似物B27K去三肽胰島素(B27K-DTrI)，B27K-DtrI不僅具有單體胰島素(生理pH值、較高濃度時(shí)不聚合)的性質(zhì)，整體生物活力為正常胰島素的80％，而且利用酵母等表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)單體胰島素前體時(shí)，可通過酶切得B27K-DtrI，從而省卻傳統(tǒng)工藝中的酶促轉(zhuǎn)肽步驟，從而提高終產(chǎn)率，特別適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
如本文所用，術(shù)語“DOI”指B鏈羧端去八肽胰島素。
如本文所用，術(shù)語“B27K-DtrI”指B鏈27位氨基酸為賴氨酸的B鏈羧端去三肽胰島素。其基本結(jié)構(gòu)如下FVNQH LCGSH LVEAL YLVCG ERX23X24X25X26Y27(SEQID NO1)其中，X23、X24、X25和X26各自獨(dú)立，分別是Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Pro，Met，His，Val或不存在，且X23、X24、X25和X26中至多有一個(gè)不存在；Y27是Lys，或Arg。研究已表明，胰島素B鏈只要具有前25個(gè)氨基酸(從第23位起的氨基酸可以任意變化)就可具有一定活性。在本發(fā)明中，第23-26位的氨基酸可以是任意氨基酸，較佳地是除了Lys，Arg和Cys之外的任何氨基酸，尤其是L型氨基酸。
如本文所用，“本發(fā)明的多肽”指B27K-DtrI、含B27K-DtrI的胰島素、及相應(yīng)的單體胰島素表達(dá)前體(MIP)。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽或合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
本發(fā)明的B27K-DtrI核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。首先可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，因?yàn)橐葝u素的長度較短。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
本發(fā)明中，B27K-DtrI多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含B27K-DtrI編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS細(xì)胞等動(dòng)物細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
在一優(yōu)選例中，本發(fā)明的B27K-DtrI是先以單體胰島素表達(dá)前體形式表達(dá)，然后在經(jīng)酶切處理得到B27K-DtrI。從氨基端至羧基端，單體胰島素表達(dá)前體分別含有本發(fā)明的胰島素B鏈、連接肽、和胰島素A鏈。連接肽沒有特別限制，只要起連接作用，并且在與A鏈相連的氨基酸殘基為Lys或Arg即可。一類連接肽例子是(Ala)2-5Lys，例如Ala-Ala-Lys。
酶切處理可以用任何切割Lys和/或Arg的酶，例如胰蛋白酶。酶切條件可根據(jù)選用的酶而變化。一種優(yōu)選的酶切條件是溶劑0.02-0.05M Tris緩沖液，pH7-8，底物濃度，約5mg/ml，胰蛋白酶用量，約為底物質(zhì)量1/50，4-25℃，1-6小時(shí)。
MIP酶切后，用分子篩層析等方法分離酶切產(chǎn)物，即可獲得本發(fā)明的B27K-DtrI。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明B27K-DtrI多肽以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
本發(fā)明藥物組合物可用于治療糖尿病及其并發(fā)癥。使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的B27K-DtrI蛋白或其拮抗劑、激動(dòng)劑施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明的單體胰島素不僅可以單獨(dú)使用，還可以與其他治療糖尿病的藥物(如其他胰島素)一起使用。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明的胰島素具有強(qiáng)的單體性質(zhì)。
(2)本發(fā)明的單體胰島素可以由表達(dá)的單體胰島素前體經(jīng)過一步酶切得到，無需酶促轉(zhuǎn)肽或體外復(fù)性處理。
(3)含有該結(jié)構(gòu)的胰島素的藥物組合物用于注射以外的給藥途徑，有很高的生物利用度。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1 DOI的制備613毫克脫鋅胰島素溶解在127毫升(5毫克/毫升)0.05mol/L硼砂溶液中(含0.001M OCaCl2)，調(diào)pH＝8.9。加入24.5毫克結(jié)晶胰蛋白酶(酶與底物的質(zhì)量比為1∶25)，在37℃水浴中攪拌反應(yīng)3小時(shí)，經(jīng)DEAE-Sephadex A25離子交換柱純化，收集主峰(圖1)對(duì)水透析后凍干，后經(jīng)Sephadex G25脫鹽，得到DOI。
實(shí)施例2 GFFYK(Boc)Obut的制備2.1 Boc-Phe-Osu的制備取3.18g Boc-Phe(12mmol)和等摩爾量的HOsu溶于15ml THF中，置于反應(yīng)瓶-5℃鹽冰浴10分鐘；另取等摩爾量的DCCI溶于2ml THF，緩慢滴加入反應(yīng)瓶中，同時(shí)-5℃電磁攪拌；加液完成后，繼續(xù)-5℃攪拌2小時(shí)，有白色的DCU沉淀出現(xiàn)。反應(yīng)瓶密封置于4℃過夜，三層濾紙過濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后呈白色固體。固體加入15ml異丙醇并加熱到90℃，呈黃色溶液，室溫靜置重結(jié)晶。白色結(jié)晶經(jīng)抽濾、洗滌、干燥后得2.5g產(chǎn)物，熔點(diǎn)為138-140℃，薄層層析顯示均一，硅膠板，層析展開相為3/7系統(tǒng)；產(chǎn)率為53％。
2.2(TFA)Phe-Tyr-OC2H5的制備取5.97g(16.5mmol)Boc-Phe-Osu置250ml圓底瓶，加干燥乙酸乙酯至80ml溶解，加入等摩爾量的HCl-Tyr-OC2H5，室溫電磁攪拌，加入約等摩爾量的N-甲基嗎啡啉使得反應(yīng)體系的pH值為8，室溫?cái)嚢柽^夜。次日，分別用10％檸檬酸、1％碳酸鉀、飽和氯化鈉溶液萃取洗滌反應(yīng)液三次，再用無水硫酸鈉干燥反應(yīng)液2小時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)反應(yīng)液至粘稠狀，滴加石油醚至微渾，室溫靜置重結(jié)晶。白色結(jié)晶經(jīng)抽濾、洗滌、干燥后得6.1g產(chǎn)物，熔點(diǎn)為126-128℃，Boc-Phe-Tyr-OC2H5薄層層析顯示均一(3/7系統(tǒng))，產(chǎn)率為81％。結(jié)晶溶于100ml無水的50％ TFA/DCM中，室溫下攪拌35分鐘后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用DCM反復(fù)洗滌成粘稠油狀，真空干燥，產(chǎn)物對(duì)茚三酮顯色為紫色。
2.3(TFA)Phe-Phe-Tyr-OC2H5的制備取13mmol(TFA)Phe-Tyr-OC2H5溶于20ml干燥THF中，鹽冰預(yù)冷，緩慢滴加N-甲基嗎啡啉5.4ml，調(diào)pH值為7；另取等摩爾量的Boc-Phe-oSU溶于35ml干燥THF中，滴加到反應(yīng)瓶中，補(bǔ)加適量N-甲基嗎啡啉維持反應(yīng)液為中性，室溫電磁攪拌過夜。次日，抽干反應(yīng)液中的THF，再用乙酸乙酯溶解，經(jīng)10％檸檬酸、1％碳酸鉀、飽和氯化鈉溶液萃取洗滌反應(yīng)液三次，用無水硫酸鈉干燥反應(yīng)液2小時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至極小體積，加大量的乙醚室溫靜置后有結(jié)晶析出，干燥得2g產(chǎn)物，略黃，熔點(diǎn)為106-108℃的Boc-Phe-Phe-Tyr-OC2H5，薄層層析顯示均一(3/7系統(tǒng))，產(chǎn)率為30％。將產(chǎn)物全部溶于25ml DCM，冰浴滴加25ml TFA，室溫電磁攪拌30分鐘后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，DCM反復(fù)洗滌5次以上后即為(TFA)Phe-Phe-Tyr-OC2H5。
2.4 Z-Gly-Osu的制備取10g(47mmol)Z-Gly和等摩爾量的HOsu溶于100ml干燥的THF中，置于反應(yīng)瓶-5℃鹽冰浴10分鐘；另取等摩爾量的DCCI溶于2ml THF，緩慢滴加入反應(yīng)瓶中，同時(shí)-5℃電磁攪拌；加液完成后，繼續(xù)-5℃攪拌2小時(shí)，有白色的DCU沉淀出現(xiàn)。反應(yīng)瓶密封置于4℃過夜，三層濾紙過濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至少量油狀物，加少量DCM溶解，再加入大量的乙醚，研磨瓶壁至有黃色沉淀、溶液變清，清夜倒出，室溫靜置有白色針狀結(jié)晶析出，經(jīng)抽濾、洗滌、干燥后得6.5g產(chǎn)物，熔點(diǎn)為100-102℃，薄層層析顯示均一(3/7系統(tǒng))，產(chǎn)率為46％。
2.5 Z-Gly-Phe-Phe-Tyr-OC2H5的制備取3.3mmol(TFA)Phe-Phe-Tyr-OC2H5與5mol Z-Gly-Osu溶于10ml干燥的THF中，加適量的N-甲基嗎啡啉調(diào)pH值到8，室溫下電磁攪拌72小時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)反應(yīng)液至粉狀，再用乙酸乙酯溶解，經(jīng)10％檸檬酸、1％碳酸鉀、飽和氯化鈉溶液萃取洗滌反應(yīng)液三次，再用無水硫酸鈉干燥反應(yīng)液2小時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至極小體積，加大量的乙醚，溶液由清變渾再轉(zhuǎn)清，室溫靜置72小時(shí)后有灰黃色沉淀，乙醚洗滌后真空干燥得2g產(chǎn)物，熔點(diǎn)為148-151℃，薄層層析顯示均一(3/7系統(tǒng))，產(chǎn)率為87％。
2.6 Z-Gly-Phe-Phe-Tyr-NHNH2的制備取Z-Gly-Phe-Phe-Tyr-OC2H52g(2.9mmol)，溶于9ml無水甲醇，加入15mmol的85％的水合肼回流2小時(shí)，冷卻后有白色晶體析出。10ml無水乙醚、10ml甲醇/無水乙醚(5V/5V)各洗滌一次，水洗至中性，干燥后共得1.29g Z-Gly-Phe-Phe-Tyr-NHNH2，薄層層析顯示均一(3/7系統(tǒng))，產(chǎn)率為65％。
2.7 Z-Gly-Phe-Phe-Tyr-Lys(Boc)Obut的制備取37g亞硝酸鈉溶于150ml蒸餾水，置于500ml圓底瓶，加入38g叔丁醇，電磁攪拌，1小時(shí)內(nèi)滴加60ml 35％硫酸，繼續(xù)攪拌30分鐘，同時(shí)撤除冰浴，靜置15分鐘，分液取上層，5％碳酸氫鈉洗滌三次，無水硫酸鈉干燥，得30ml亞硝酸叔丁酯，密封于棕色瓶中，4℃保存。另取1.25g(1.9mmol)Z-Gly-Phe-Phe-Tyr-NHNH2于50ml圓底瓶，加入8ml干的DMF，電吹風(fēng)稍加熱使溶解，加入2ml 2N HCl/THF(4mmol)，圓底瓶置于液氮中，控制溫度為-20℃，緩慢滴加0.3ml亞硝酸叔丁酯(2.5mmol，搖動(dòng)10分鐘，加入預(yù)冷至-20℃的干燥乙酸乙酯10ml，液氮中冷至-30℃；同時(shí)稱取(HCl)Lys(Boc)Obut0.65g(1.9mmol)，溶于7ml干燥的DMF中，冷至-30℃，加入247微升三乙胺，然后加入圓底瓶中混合再加入預(yù)冷至-20℃的干燥乙酸乙酯10ml，加三乙胺調(diào)pH值為8，4℃搖動(dòng)30分鐘，再靜置72小時(shí)。反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至粉狀，用乙酸乙酯溶解，經(jīng)10％檸檬酸、1％碳酸鉀、飽和氯化鈉溶液萃取洗滌反應(yīng)液三次，再用無水硫酸鈉干燥反應(yīng)液2小時(shí)，經(jīng)10％檸檬酸、1％碳酸鉀、飽和氯化鈉溶液萃取洗滌反應(yīng)液三次，再用無水硫酸鈉干燥反應(yīng)液2小時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至油狀，加入3倍體積乙醚得到白色結(jié)晶，結(jié)晶抽干后用冷的乙酸乙酯和冷的乙醚洗滌后得到干燥產(chǎn)物1g，熔點(diǎn)為160-162℃，薄層層析正確，產(chǎn)率為56％。
2.8 Gly-Phe-Phe-Tyr-Lys(Boc)Obut的制備取Z-Gly-Phe-Phe-Tyr-Lys(Boc)Obut 0.56g溶于90ml無水甲醇中，置于氫化反應(yīng)瓶中，加少許冰醋酸調(diào)pH值至3，再加入0.12g鈀碳，通氫氣6小時(shí)后，將反應(yīng)液用硅藻土過濾，鈀碳用氯仿浸泡后棄置，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濾液至干，干燥后得到塊狀物，用乙酸乙酯反復(fù)洗滌后得到產(chǎn)物，產(chǎn)物對(duì)茚三酮顯色，薄層層析顯示基本均一(圖2)，HPLC為單一(圖3)，氨基酸分析值與理論值相符Gly1.2(1.0)；Tyr1.0(1.0)；Phe2.2(2.0)；Lys1(1.0)，產(chǎn)率為93％。
實(shí)施例3 B27K-DTrI的制備取0.237g(0.172mmol)Gly-Phe-Phe-Tyr-Lys(Boc)Obut，加入0.26mlDMSO，50℃以下加熱至全溶，置于37℃水浴保溫；另取DOI 86mg(0.0172mmol)，緩慢加到反應(yīng)器中使全部溶解，然后加入預(yù)熱至37℃的1-4丁二醇1.82ml，反應(yīng)液略渾，再加入預(yù)熱至37℃的去離子水，反應(yīng)液變清，加入5微升N-甲基嗎啡啉調(diào)pH值精確到6.5(以pH計(jì)測(cè)定)。加入7.8mgTPCK-Trypsin后，將水浴溫度緩慢降至30℃，2小時(shí)和4小時(shí)后分別加入TPCK-Trypsin 4.5g，酶量為DOI量的五分之以一。20小時(shí)后反應(yīng)液呈中度渾濁，加入.1.1ml冰醋酸和少量1N HCl調(diào)pH為3終止酶促反應(yīng)，溶液變清。將反應(yīng)液直接上樣到Sephadex G50(f)柱分離，流動(dòng)相為30％醋酸，得到76mg粗產(chǎn)物B27K-DTrI(Boc)Obut，除去TPCK-Trypsin和過量的小肽(圖5)，產(chǎn)率為80％。再經(jīng)過C8反相柱純化得到B27K-DTrI(Boc)Obut(圖6)，用冷丙酮干燥后，加入無水TFA(多肽濃度為3mg/ml)，以去除Boc保護(hù)基，10℃靜置1小時(shí)后抽干TFA并用二氯甲烷反復(fù)洗滌至白色，溶于0.1％TFA后經(jīng)過C8反相柱純化得到B27K-DTrI(圖7)。樣品尿素PAGE電泳為單一條帶(圖4)、C18HPLC分析為單一峰(圖8)。電噴霧質(zhì)譜測(cè)定為單一分子量5509Da(圖9)，理論分子量為5508.3，誤差為0.01％，測(cè)定了N端14個(gè)氨基酸和C端2個(gè)氨基酸的序列(表1)，說明樣品的電荷和親疏水性均一，蛋白質(zhì)序列與設(shè)計(jì)序列相符(SEQ ID NO5)。
表1 B27K-DtrI的N端、C端序列(N端→C端)

實(shí)施例4自聚合性質(zhì)的測(cè)定在中性溶液中較高濃度胰島素聚合后形成單體、二體六體的混合物，使用分子篩層析Superdex 75(HR 10/30)柱，流動(dòng)相為PBS(phosphate-bufferedsaline，pH7.4)，流速為0.4ml/min，上樣量為0.1ml，室溫，280nm檢測(cè)。用對(duì)稱因子Fs描述混合物均一度，用分配系數(shù)Kav描述混合物的平均分子量。Fs＝W0.05h/2A，其中W0.05h為在0.05峰高處的峰寬，A為0.05峰高處的前半峰寬；Kav＝(Vr-V0)/(Vc-Vo)，其中Vr為流出體積，V0為外水體積，Vc為總的柱床體積。隨著脫鋅胰島素濃度的上升，其在Superdex 75柱上的保留時(shí)間縮短、峰的不對(duì)稱性增強(qiáng)，說明高濃度的胰島素是不均一的含有大的聚合體的混合物。而B27K-DTrI的出峰時(shí)間和峰形不隨蛋白質(zhì)濃度的變化。(圖10A和10B，圖11A和11B)在同一濃度下比較了脫鋅胰島素、Lyspro、DPI(B鏈C端去5肽胰島素，despentapeptide insulin)和B27K-DTrI在Superdex 75柱上的層析行為，B27K-DTrI的Kay值為0.51，Lyspro的Kav值為0.48，這說明B27K-DTrI為單體胰島素。(圖12)實(shí)施例5生物活性測(cè)定5.1鼠驚厥法(中國藥典，1985，附錄100頁)
雄性昆明小鼠，體重為27-30g，按體重隨機(jī)分四組，每組24只，實(shí)驗(yàn)前禁食2小時(shí)。樣品用鹽酸調(diào)至pH值為5的生理鹽水溶解，10D280nm＝1mg/L。估計(jì)樣品效價(jià)為標(biāo)準(zhǔn)品的80％，高劑量為0.09U/ml，低劑量為0.045U/ml，溶劑為鹽酸調(diào)節(jié)pH為2.5的生理鹽水。25℃，15分鐘內(nèi)每只小鼠皮下注射0.3ml，置于37℃觀察90分鐘，驚厥的、死亡的、使其仰臥后3秒內(nèi)不能自行翻身者均認(rèn)為是陽性反應(yīng)。數(shù)據(jù)按質(zhì)反應(yīng)測(cè)定法計(jì)算。
5.2小鼠降血糖法(中國藥典，2000，附錄106頁)雄性昆明小鼠，體重為28-30g，按體重隨機(jī)分四組，每組10只。估計(jì)樣品效價(jià)為標(biāo)準(zhǔn)品的80％，高劑量為0.07U/ml，低劑量為0.035U/ml，溶劑為鹽酸調(diào)節(jié)pH為2.5的生理鹽水。25℃，每只小鼠皮下注射0.25ml，注射40分鐘后眼靜脈叢取血測(cè)定血糖；三小時(shí)以后按照雙交叉法給每組各鼠第二次給藥(標(biāo)準(zhǔn)品低劑量組給測(cè)試品高劑量)，40分鐘后測(cè)定血糖。數(shù)據(jù)按照量反應(yīng)測(cè)定法計(jì)算。
小鼠驚厥法測(cè)得活性為21U/mg，可信限率FL％為23.5％(＜30％)(表2)；小鼠降血糖法測(cè)得活性為23U/mg，F(xiàn)L％為11.9％(＜25％)(表3)。實(shí)驗(yàn)中所用的標(biāo)準(zhǔn)品為中檢所提供的27U/mg的胰島素。兩種方法得到的結(jié)果吻合，B27K-DTrI的活性為天然胰島素的80％。
表2 小鼠驚厥法測(cè)定B27K-DTrI的生物活性(中國藥典，1985版)樣品 劑量(U/ml) 測(cè)試的小鼠 驚厥的小鼠標(biāo)準(zhǔn)胰島素 0.09 24 170.04524 4B27K-DTrI 0.09 24 190.04524 2表3.小鼠降血糖法測(cè)定B27K-DTrI的生物活性(中國藥典2000版)鼠號(hào) 第1組 第2組 第3組 第4組1 69.9 28.9 61.3 31.7
268.942.450.635.8364.142.453.751.3464.124.565.848.6565.554.466.839.6662.732.455.847.2764.158.654.825.8868.240.355.840.0961.342.448.640.010 52.757.954.840.0均值 64.142.455.840.0136.953.437.235.8244.152.439.332.7341.358.633.858.2428.953.444.148.2534.152.039.347.2643.451.740.647.2736.959.940.047.2837.953.440.648.9936.947.939.347.510 28.950.639.359.6均值 36.953.339.347.3實(shí)施例6 基因工程表達(dá)B27K-DTrI在本實(shí)施例中，將B27K-DTrI的B鏈C端用連接肽(如Ala-Ala-Lys)與其A鏈N端相連構(gòu)成表達(dá)前體(MIP，monomeric insulin precusor)，因?yàn)镸IP的結(jié)構(gòu)有利于胰島素在生物合成后折疊并形成正確的二硫鍵。步驟如下化學(xué)合成得到MIP基因(SEQ ID NO3)，在MIP基因5’端加上信號(hào)肽序列(α-MFL，α-mating factor leader)，利用BamH1和EcoR1酶切位點(diǎn)克隆到pPIC9K質(zhì)粒中得到pPIC9K/MIP。pPIC9K/MIP經(jīng)BglII線性化處理后轉(zhuǎn)化到甲醇酵母P.pastoris中，用點(diǎn)雜交法篩選高拷貝菌株。
通過高密度發(fā)酵，得到發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)疏水層析得到MIP，氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。
MIP經(jīng)胰蛋白酶酶切(溶劑0.03M Tris緩沖液，pH7.5，20℃，2小時(shí))處理后，經(jīng)分子篩層析得到高純度的B27K-DTrI(結(jié)構(gòu)如圖13所示)。
討論同樣的技術(shù)路線也可用于其它的酵母表達(dá)系統(tǒng)或分泌型大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)B27K-DTrI。該技術(shù)路線與中國專利申請(qǐng)98110912.8中所公開DTI的制備方法相比，可以避免化學(xué)合成小肽GFFY(But)Obut，酶促轉(zhuǎn)肽，HPLC分離等煩瑣的工藝，可以大幅度提高產(chǎn)率，更適合于工業(yè)生產(chǎn)。兩種工藝的比較見圖14。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所<120>新的單體胰島素，藥物組合物及其制法<130>023970<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><221>MISC_FEATURE<222>(23)..(26)<223>Xaa＝Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Pro，Met，His，Val，或不存在<220><221>MISC_FEATURE<222>(27)..(27)<223>Xaa＝Lys或Arg<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(27)<223>胰島素B鏈<400>lPhe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25<210>2<211>21<212>PRT<213>人工序列<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(21)<223>胰島素A鏈<400>2Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu1 5 10 15Glu Asn Tyr Cys Asn20<210>3<211>153<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)..(153)<223><400>3ttc gtt aac caa cac ttg tgc ggt tcc cac ttg gtt gag gct ttg tac 48Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15ttg gtt tgc ggt gaa aga ggt ttc ttc tac aag gct gct aag ggt att 96Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Lys Ala Ala Lys Gly Ile20 25 30gtc gaa caa tgc tgt acc tcc atc tgc tcc ttg tac caa ttg gaa aac 144Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn35 40 45tac tgc aac 153Tyr Cys Asn50<210>4<211>51<212>PRT<213>人工序列<400>4Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Lys Ala Ala Lys Gly Ile20 25 30Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn35 40 45Tyr Cys Asn50<210>5<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(27)<223>一種胰島素B鏈B27K-DTrI<400>5Phe Val Ash Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Lys20 2權(quán)利要求
1.一種胰島素B鏈，其特征在于，具有以下氨基酸序列FVNQH LCGSH LVEAL YLVCG ERX23X24X25X26Y27其中，X23、X24、X25和X26各自獨(dú)立，分別是Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Pro，Met，His，Val或不存在，且X23、X24、X25和X26中至多有一個(gè)不存在；Y27是Lys，或Arg。
2.如權(quán)利要求1所述的胰島素B鏈，其特征在于，Y27是Lys。
3.如權(quán)利要求1所述的胰島素B鏈，其特征在于，X23X24X25X26是GFFY。
4.一種胰島素，其特征在于，它具有權(quán)利要求1所述的B鏈。
5.如權(quán)利要求4所述的胰島素，其特征在于，它是單體胰島素。
6.如權(quán)利要求4所述的胰島素，其特征在于，其結(jié)構(gòu)如下 其中，X23、X24、X25和X26各自獨(dú)立，分別是Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Pro，Met，His，Val或不存在，且X23、X24、X25和X26中至多有一個(gè)不存在；Y27是Lys，或Arg。
7.一種藥物組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求4所述的胰島素和藥學(xué)上可接受的載體。
8.一種單體胰島素表達(dá)前體，其特征在于，從氨基端至羧基端分別含有權(quán)利要求1所述的胰島素B鏈、連接肽、和胰島素A鏈。
9.一種分離的DNA，其特征在于，它編碼權(quán)利要求1所述胰島素B鏈、或權(quán)利要求8所述的單體胰島素表達(dá)前體。
10.一種表達(dá)載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求9所述的DNA。
11.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求10所述的表達(dá)載體或含有權(quán)利要求9所述的DNA。
12.一種制備胰島素的方法，其特征在于，包括步驟(a)在表達(dá)條件下，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有編碼單體胰島素表達(dá)前體的DNA，從而表達(dá)出所述的單體胰島素表達(dá)前體；所述的前體從氨基端至羧基端分別含有胰島素B鏈、連接肽、和胰島素A鏈，其中胰島素B鏈具有以下氨基酸序列FVNQH LCGSH LVEAL YLVCG ERX23X24X25X26Y27式中，X23、X24、X25和X26各自獨(dú)立，分別是Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Pro，Met，His，Val或不存在，且X23、X24、X25和X26中至多有一個(gè)不存在；Y是Lys，或Arg；且連接肽為Ala-Ala-Lys；(b)分離出所述的單體胰島素表達(dá)前體；(c)用胰蛋白酶酶切割所述的單體胰島素表達(dá)前體；(d)分離出單體胰島素。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的胰島素B鏈、含該B鏈的單體胰島素、含所述單體胰島素的藥物組合物，及其制法和用途。本發(fā)明的胰島素類似物B
文檔編號(hào)C07K14/62GK1468864SQ0213610
公開日2004年1月21日 申請(qǐng)日期2002年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月19日
發(fā)明者張友尚, 丁金國, 崔大敷, 石嘉豪 申請(qǐng)人:上海中科生龍達(dá)生物技術(shù)(集團(tuán))有限公司, 上海中科生龍達(dá)生物技術(shù)(集團(tuán))有限