專利名稱：治療糖尿病合并周圍神經(jīng)病變并發(fā)癥的蛇毒酶神經(jīng)生長因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療糖尿病合并周圍神經(jīng)病變并發(fā)癥的藥物，尤其是指利用生物活性物質(zhì)提取配制而得的藥物。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種由于體內(nèi)糖代謝紊亂導(dǎo)致血糖升高為主臨床特征為全身性內(nèi)分泌代謝性疾病。糖尿病發(fā)展到一定程度，尤其是合并有慢性血管、神經(jīng)病變時，或者長期使用胰島素治療者常常伴有瘀血癥表現(xiàn)，諸如面有瘀斑、面部晦暗、肢體疼痛、麻木，痛處固定不移，心前區(qū)疼痛，舌邊有瘀斑或瘀點(diǎn)等等。西醫(yī)治療糖尿病人多用磺脲類，雙胍類及胰島素藥物治療，它們降血糖作用雖然明顯，但僅僅能夠達(dá)到調(diào)節(jié)代謝紊亂的程度，而且西藥副作用大，長期服用會損害肝、腎，影響胃腸功能，導(dǎo)致發(fā)生多種糖尿病合并癥。中醫(yī)治療糖尿病歷史悠久、滋陰清熱、生津止渴一直是治療糖尿病所遵循的基本法則。糖尿病患者通過中藥治療以后，雖然在血糖和尿糖方面控制比較理想，但主觀癥狀仍未消除。致使糖尿病周圍神經(jīng)病變的患病率約為60％。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用生物活性物質(zhì)改善神經(jīng)組織中的糖代謝，促進(jìn)神經(jīng)元增大，改善微循環(huán)的治療糖尿病合并周圍神經(jīng)病變并發(fā)癥的蛇毒酶神經(jīng)生長因子。
本發(fā)明的技術(shù)方案是制備工藝所有操作均在10℃以下完成。
①CM-SephadexC50層析取眼鏡蛇毒10g，溶于0.01M乙酸鈉緩沖液100ml中，PH5.8，溶解后，離心10000轉(zhuǎn)，10分鐘，取上清，對上述緩沖液5000ml透析，換3次緩沖液，然后樣品上樣于用0.01M乙酸鹽緩沖液平衡好的層析柱5.5×100cm中，用0-0.7MNaCL線性梯度洗脫，收集具有神經(jīng)生長因子活性的蛋白峰，濃縮凍干。
②CM-SpharoseFF層析將上述濃縮的樣品，溶于20ml0.01M乙酸鈉緩沖液中，PH5.8，上樣于用0.01M乙酸鈉緩沖液PH5.8平衡好的層析柱2.6×50cm中，用0-1MNaCL線性梯度洗脫，收集具有神經(jīng)生長因子活性的蛋白峰，濃縮凍干。
③SephdexG75層析將上述CM-SpharoseFF層析下的樣品，溶解在10ml0.01M乙酸鈉緩沖液，PH5.8，內(nèi)含0.15MNaCL中，離心10000轉(zhuǎn)，取上清，上樣于用0.01M乙酸鈉緩沖液，PH5.8，內(nèi)含0.15MNaCL平衡好后的SephdexG75柱中，收集含有NGF活性的對稱峰，經(jīng)電泳及高效液相色譜證明為單一峰后，透析除鹽，凍干即得半成品，約3mg。
④制劑處方原料神經(jīng)生長因子半成品，按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的測定半成品的活性，每支規(guī)格1000單位，按135％-145％投料。加入1％右旋糖苷(分子量1萬)，及每支藥中含有1.5mg人血白蛋白，過濾分裝，凍干制得。
本發(fā)明的有益效果是糖尿病周圍神經(jīng)病變的患病率約60％，其發(fā)病機(jī)制考慮可能與下列因素有關(guān)。①代謝障礙，近年通過動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究發(fā)現(xiàn)糖尿病時，周圍神經(jīng)中Myo-肌醇(myo-inositol)減少和山梨醇積存，Na+/k+三磷酸腺苷酶的活性降低，從而影響興奮細(xì)胞的傳導(dǎo)性。由于胰島素不足，葡萄糖代謝不能正常進(jìn)行，而不需胰島素參與的山梨醇旁路代謝活躍，這種代謝主要在神經(jīng)組織中進(jìn)行，因山梨醇難以透過神經(jīng)細(xì)胞膜，使其在神經(jīng)組織中堆積，神經(jīng)細(xì)胞滲透壓升高、水分增多，導(dǎo)致細(xì)胞水腫、缺氧、壞死、神經(jīng)纖維脫髓鞘、軸索變性以及神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢。②血管閉合，糖尿病病人營養(yǎng)神經(jīng)的血管閉合率較非糖尿病病人為高，伴有神經(jīng)病變者更高。血管的閉合，可致神經(jīng)組織缺血壞死，其原因可能與糖尿病病人血脂增高，血小板聚集性增強(qiáng)以及血管基底膜增厚有關(guān)。③神經(jīng)生長因子功能異常，神經(jīng)生長因子NGF是維持神經(jīng)組織正常生長和作用不可缺少的物質(zhì)，文獻(xiàn)報道實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠其NGF減少。糖尿病病人可能有NGF減少和功能異常。因NGF與胰島素有相似的氨基酸序列，兩者有相同的抗原簇。糖尿病病人NGF減少和功能異常可能是引起神經(jīng)病變的原因之一。采用蛇毒酶神經(jīng)生長因子治療糖尿病并發(fā)周圍神經(jīng)病變?nèi)〉妹黠@的療效，其原因(1)蛇毒酶神經(jīng)生長因子含有NGF，NGF是從蛇毒中分離出來，是促進(jìn)神經(jīng)生長的生物活性分子。它能促進(jìn)神經(jīng)元的增大，使軸突從近端向遠(yuǎn)端生長，使細(xì)胞器數(shù)量增多，從而改善神經(jīng)細(xì)胞功能。(2)調(diào)節(jié)糖代謝，本申請含有NGF，它與胰島素有類似的結(jié)構(gòu)和作用部位，可彌補(bǔ)神經(jīng)細(xì)胞中NGF的不足，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞利用葡萄糖及合成蛋白與脂質(zhì)，改善代謝狀況，使神經(jīng)組織中的糖代謝進(jìn)入正常途徑，減少山梨醇積聚，糾正神經(jīng)細(xì)胞的水腫和缺氧。(3)改善微循環(huán)，蛇毒酶神經(jīng)生長因子含有精氨酸脂酶、水解蛋白酶及磷酸二脂酶等，能抑制血小板聚集，改善血液粘度，具有溶栓、擴(kuò)血管等功能。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)本申請制劑能降低TxB2濃度，抑制血小板聚集，擴(kuò)張局部小血管，改善微循環(huán)。由于蛇毒酶神經(jīng)生長因子的獨(dú)特作用，為防治糖尿病合并的神經(jīng)病變開辟了一條新途徑。另外經(jīng)神經(jīng)生長因子對糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變作用的實(shí)驗(yàn)研究，得出結(jié)論為早期、長期應(yīng)用外源性神經(jīng)生長因子，可增加糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)髓鞘面積，減少神經(jīng)纖維髓鞘脫失，軸突萎縮，可以改善糖尿病大鼠脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元，運(yùn)動終板和骨髓肌纖維的形態(tài)和功能。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例及病例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
實(shí)施例制備工藝為所有操作均在10℃以下完成。
①CM-SephadexC50層析取眼鏡蛇毒10g，溶于0.01M乙酸鈉緩沖液100ml中，PH5.8，溶解后，離心10000轉(zhuǎn)，10分鐘，取上清，對上述緩沖液5000ml透析，換3次緩沖液，然后樣品上樣子用0.01M乙酸鹽緩沖液平衡好的層析柱5.5×100cm中，用0-0.7MNaCL線性梯度洗脫，收集具有神經(jīng)生長因子活性的蛋白峰，濃縮凍干。
③CM-SpharoseFF層析將上述濃縮的樣品，溶于20ml0.01M乙酸鈉緩沖液中，PH5.8，上樣于用0.01M乙酸鈉緩沖液PH5.8平衡好的層析柱2.6×50cm中，用0-1MNaCL線性梯度洗脫，收集具有神經(jīng)生長因子活性的蛋白峰，濃縮凍干。
③SephdexG75層析將上述CM-SpharoseFF層析下的樣品，溶解在10ml0.01M乙酸鈉緩沖液，PH5.8，內(nèi)含0.15MNaCL中，離心10000轉(zhuǎn)，取上清，上樣于用0.01M乙酸鈉緩沖液，PH5.8，內(nèi)含0.15MNaCL平衡好后的SephdexG75柱中，收集含有NGF活性的對稱峰，經(jīng)電泳及高效液相色譜證明為單一峰后，透析除鹽，凍干即得半成品，約3mg。
④制劑處方原料神經(jīng)生長因子半成品，按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的測定半成品的活性，每支規(guī)格1000單位，按140％投料。加入1％右旋糖苷(分子量1萬)，及每支藥中含有1.5mg人血白蛋白，過濾分裝，凍干制得。
臨床病例112例均為住院治療者，男58例，女54例。年齡40～65歲，平均53.8歲。糖尿病史1年～14年，平均7.5年。神經(jīng)病變病程6個月～5年，平均3.4年。全組除2例為胰島素依賴型糖尿病外，其余均為非胰島素依賴型糖尿病。為觀察感覺神經(jīng)癥狀，特設(shè)對照組40例，男女各20例。年齡42～66歲，平均54.2歲。神經(jīng)病變病程8個月～6年，平均4.2年。此組均為非胰島素依賴型糖尿病。
糖尿病的治療方法是兩組均在飲食治療基礎(chǔ)上加用降血糖藥物，治療組2例用胰島素，其余均用中藥消渴丸或世良降糖散治療。
神經(jīng)病變的治療，治療組用蛇毒酶神經(jīng)生長因子，每日1u，溶于生理鹽水250ml中靜滴，3周為1療程，必要時用第2療程。對照組用vit B130mg/d，vit B12150mg/d，口服。
觀察項(xiàng)目(1)、空腹血糖水平。(2)、感覺神經(jīng)癥狀(肢體疼痛及麻木)的變化。(3)、治療組中40例觀察治療前后右尺神經(jīng)和右腓神經(jīng)的傳導(dǎo)速度。(4)、療效判定，顯效癥狀完全消失，肌電圖示運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯增快。有效癥狀減輕，運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度增快。無效病情無變化。
結(jié)果感覺神經(jīng)癥狀，治療組用蛇毒酶神經(jīng)生長因子后，第4～10天癥狀開始改善，一般上肢恢復(fù)先于下肢，肢體近端先于遠(yuǎn)端，兩組對比，具有明顯的差別，見表1。
表1 兩組感覺神經(jīng)癥狀有效率比較(％)疼 痛 麻 木n顯 有 無有效 n顯 有 無 有效效 效 效 率 效 效 效率治療112 42 68 2 98.2112 26 86 0 100組對照4005 3512.540063415組運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度，40例采用1500 DISA型肌電圖機(jī)，觀察尺神經(jīng)和腓神經(jīng)傳導(dǎo)速度。治療組經(jīng)治療后神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯增快。見表2。
表2 治療前后運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較(m/s)尺神經(jīng)X±S 腓神經(jīng)X±S治療前 53.04±7.62 44.06±8.50治療后 56.66±8.46 46.36±7.64P值 ＜0.05 ＜0.05血糖變化，經(jīng)治療后兩組血糖平均有不同程度的下降，治療組治療前后分別為17.2±6.4mmol/L和9.6±6.6mmol/L(p＜0.05)；對照組治療前后為18.2±8.4mmol/L和10.7±7.6mmol/L(p＜0.05)。促進(jìn)神經(jīng)元增大，調(diào)節(jié)糖代謝，改善微循環(huán)。
用法和用量及給藥途徑①每次1000-2000單位，肌肉注射，每日一次，20天為一個療程。
②四肢損傷手術(shù)中，可在術(shù)局部噴灑給藥或損傷神經(jīng)處局部注射，每次1-2支。
權(quán)利要求
1.治療糖尿病合并周圍神經(jīng)病變并發(fā)癥的蛇毒酶神經(jīng)生長因子，其特征是制備工藝為所有操作均在10℃以下完成，①CM-SephadexC50層析取眼鏡蛇毒10g，溶于0.01M乙酸鈉緩沖液100ml中，PH5.8，溶解后，離心10000轉(zhuǎn)，10分鐘，取上清，對上述緩沖液5000ml透析，換3次緩沖液，然后樣品上樣于用0.01M乙酸鹽緩沖液平衡好的層析柱5.5×100cm中，用0-0.7MNaCL線性梯度洗脫，收集具有神經(jīng)生長因子活性的蛋白峰，濃縮凍干，②CM-SpharoseFF層析將上述濃縮的樣品，溶于20ml0.01M乙酸鈉緩沖液中，PH5.8，上樣于用0.01M乙酸鈉緩沖液PH5.8平衡好的層析柱2.6×.50cm中，用0-1MNaCL線性梯度洗脫，收集具有神經(jīng)生長因子活性的蛋白峰，濃縮凍干，③SephdexG75層析將上述CM-SpharoseFF層析下的樣品，溶解在10ml 0.01M乙酸鈉緩沖液，PH5.8，內(nèi)含0.15MNaCL中，離心10000轉(zhuǎn)，取上清，上樣于用0.01M乙酸鈉緩沖液，PH5.8，內(nèi)含0.15MNaCL平衡好后的SephdexG75柱中，收集含有NGF活性的對稱峰，經(jīng)電泳及高效液相色譜證明為單一峰后，透析除鹽，凍干即得半成品，④制劑處方原料神經(jīng)生長因子半成品，按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的測定半成品的活性，每支規(guī)格1000單位，按135％-145％投料，加入1％右旋糖苷，及每支藥中含有1.5mg人血白蛋白，過濾分裝，凍干制得。
全文摘要
治療糖尿病合并周圍神經(jīng)病變并發(fā)癥的蛇毒酶神經(jīng)生長因子，涉及一種治療糖尿病合并周圍神經(jīng)病變并發(fā)癥的藥物，尤其是指利用生物活性物質(zhì)提取配制而得的藥物。從產(chǎn)率、比活性等技術(shù)參數(shù)優(yōu)選眼鏡蛇毒作為分離純化神經(jīng)生長因子的基料，經(jīng)三步層析，提純單一組份的神經(jīng)生長因子。利用生物活性物質(zhì)改善神經(jīng)組織中的糖代謝，促進(jìn)神經(jīng)元增大，使軸突從近端向遠(yuǎn)端生長，使細(xì)胞器數(shù)量增多，從而改善神經(jīng)細(xì)胞功能。改善微循環(huán)，蛇毒酶神經(jīng)生長因子含有精氨酸脂酶、水解蛋白酶及磷酸二脂酶等，能抑制血小板聚集，改善血液粘度，具有溶栓、擴(kuò)血管等功能?？蓮V泛應(yīng)用。
文檔編號C07K14/48GK1470528SQ0313347
公開日2004年1月28日 申請日期2003年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月17日
發(fā)明者郝文學(xué) 申請人:郝文學(xué)