專利名稱：一種用于促進胰島素分泌的基因、其制備方法及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種用于促進胰島素分泌的基因、其制備方法及其應用。
背景技術(shù)：
RNA 干擾(RNA interference, RNAi)現(xiàn)象是一種雙鏈 RNA(doublestrandedRNA dsRNA)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因靜默機制。將與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA存在同源互補序列的 雙鏈RNA(double strand RNA, dsRNA)導入細胞后，能特異性地降解該mRNA，從而產(chǎn)生 相應的功能表型缺失，這一過程屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制(posttranscriptional gene siliencing, PTGS)范疇。RNAi廣泛存在于生物界，從低等原核生物，到植物，真菌，無脊椎 動物，甚至近來在哺乳動物中也發(fā)現(xiàn)了此種現(xiàn)象，機制也更為復雜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于促進胰島素分泌的基因。本發(fā)明的目的之二在于提供該基因的制備方法。本發(fā)明的目的之三在于提供該基因的應用。為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案—種用于促進胰島素分泌的基因，其特征在于該基因具有下列核苷酸序列之一(1).具有SEQ NO 1所示的DNA序列；(2).與序列表中序列1限定的核酸序列具有95%以上的同源性，且編碼相同功能 蛋白質(zhì)的DNA序列。。一種制備上述的用于促進胰島素分泌的基因的方法，其特征在于該方法的具體步 驟為根據(jù)SilenCircle TM RNAi Transcription Kit中載體設計的具體要求，設計對應于 Kir6. 2基因733-753位，即GCA TCT TCA TGA AAA CGG CAC的shRNA的寡核苷酸序列引物， 各為53bp，然后進行合成，得到用于促進胰島素分泌的基因；所述的shRNA的寡核苷酸序列 引物為Sense 5' -ACA CCG CAT CTT CAT GAA AAC GGC TTG CTT GAA GCC GTT TTC ATG AAG ATG CT-3'Anti-sense :5， -AAA AAG CAT CTT CAT GAA AAC GGC TTC AAG CAA GCC GTT TTC ATG AAGATG CG-3，。一種上述的用于促進胰島素分泌的基因在制備促進胰島素的分泌藥物中的應用。本發(fā)明設計對與胰島素分泌有關(guān)聯(lián)的基因的RNAi，并應用胰島β細胞模型研究 其對胰島素分泌的促進作用。為RNAi在糖尿病的治療應用提供了一種新方法。


圖1為shRNA的寡核苷酸序列引物和Psilenrarcle質(zhì)粒的連接圖。
具體實施例方式一、正常胰島β細胞的培養(yǎng)胰島β細胞ΗΙΤ-15細胞系培養(yǎng)于37°C，5% 0)2恒 溫培養(yǎng)箱。對數(shù)生長期的細胞用胰酶消化脫壁，再加入適量培養(yǎng)液以易于混勻細胞；用移液 器將其移入15ml離心管中，1500rpm離心3min ；去上清；用5ml無菌1 XPBS將細胞懸起，并 吹打混勻；加約Iml細胞懸液于裝有5ml新鮮培養(yǎng)基的新培養(yǎng)瓶中，放入37°C，5% CO2培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)，約3天左右傳代1次(主要查看細胞有無鋪滿培養(yǎng)瓶)。二、大鼠胰島β細胞的分離正常大鼠和“糖尿病”大鼠一只，體重200 300g. 頸椎脫白處死后消毒腹部，迅速打開左側(cè)腹腔，沿脾動脈剪取胰腺體尾部分，立即浸入4°C 的KRBB溶液中.清洗二次，剪去白色脂肪組織，然后將胰腺剪成小塊，轉(zhuǎn)移至盛有5mL消化 酶液的三角瓶中，于恒溫搖床中37°C保溫，搖床轉(zhuǎn)速lOOr/min，每IOmin玻璃管反復吹打一 次，放置30min將該懸液離心500-1000rpm，離心5min，最后剩下的為夾有少量腺泡團的胰 島.在黑背景的體視顯微鏡下，胰島呈圓或橢圓形，灰色或淡棕色，易與腺泡團分辨開.將 胰島用玻管挑出，每只大鼠可以得到直徑在100-300 μ m的胰島80-100個。三、Kir6.2-RNAi 質(zhì)粒的設計和轉(zhuǎn)染根據(jù) SilenCircle TM RNAi Transcription Kit中載體設計的具體要求，設計對應于Kir6. 2基因733-753位(GCA TCT TCA TGA AAA CGG CAC)的shRNA的寡核苷酸序列引物，各為53bp，并進行合成。Kir6. 2-RNAi對應的序列為Sense :5’ -ACA CCG CAT CTT CAT GAA AAC GGC TTG CTT GAA GCC GTT TTC ATG AAG ATG CT-3'Anti-sense 5' -AAA AAG CAT CTT CAT GAA AAC GGC TTC AAG CAA GCC GTT TTC ATG AAG ATGCG-3'根據(jù)SilenCircle TM RNAi Transcr iption Kit中載體設計的具體要求，將設計 的ir6. 2-RNAi的干擾片段和PSil—質(zhì)粒連接，參見圖1，然后轉(zhuǎn)染進胰島β細胞。Kir6. 2-RNAi質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前一天，在含有5ml無抗生素的RPMI 1640生長培 養(yǎng)基的60-mm培養(yǎng)皿里種上2 X IO7個胰島β細胞。然后用500 μ 1無血清的培養(yǎng)基(DMEM 或 RPMI1640)溶解 8. 0 μ g 的 Kir6. 2-RNAi 表達載體，用 500 μ 1 培養(yǎng)基(DMEM 或 RPMI1640) 溶解LipOfectamineTM2000 (20 μ 1)，輕輕地混勻，再室溫孵育5分鐘。孵育5分鐘后，這個 shRNA表達載體與LipOfectamineTM2000充分結(jié)合，然后將它們輕輕混勻，室溫孵育20分鐘， 這樣做是為了形成Lipofectamine 2000的復合物。DNA-Lipofectamine 2000復合物被加 入到60mm培養(yǎng)皿里，之后細胞在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6小時，換上正常細胞培養(yǎng)液。四、實驗分組與檢測指標正常對照組正常胰島β細胞和糖尿病鼠胰島β細胞細 胞，培養(yǎng)液為正常胰島β細胞培養(yǎng)液；RNAi組正常胰島β細胞和糖尿病鼠胰島β細胞。 不同濃度葡萄糖加入轉(zhuǎn)染RNAi片段的培養(yǎng)液中正常胰島β細胞和糖尿病鼠胰島β細胞 中，作為實驗組.相同濃度梯度的葡萄糖加入到未轉(zhuǎn)染RNAi的正常胰島β細胞和糖尿病 鼠胰島β細胞中，形成對照組。胰島β細胞胰島素分泌將ImL密度為5 X IO5Hir1各組細胞懸液置于24孔板
中，置InsulinMock(mIU/L)Control(mlU/L) RNAi(mlU/L)secretion
3d0. 849862 士 0. 002 0. 850773 士 0. 010 1.4552 士 0.0124d0. 850293 士 0. 014 0. 851994 士 0. 004 1. 116674 士 0. 0075d0. 820966 士 0. 017 0. 811966 士 0. 020 1. 09053 士 0. 008于37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用Elisa大鼠胰島素檢測試劑盒檢測胰島素 分泌的情況。五、結(jié)果RNAi組胰島β細胞分泌胰島素在3d以后胰島素分泌量明顯多于對照 組胰島β細胞。RNAi組糖尿病大鼠胰島β細胞分泌胰島素和對照組相比在3d以后也 明顯增加(P <0.001)。RNAi組細胞在相同葡萄糖濃度刺激下，分泌胰島素明顯增加(P <0.001)。說明在胰島β細胞中和糖尿病大鼠的胰島β細胞中Kir6. 2-RNAi在3d后可 以明顯促進胰島素的分泌。
權(quán)利要求
一種用于促進胰島素分泌的基因，其特征在于該基因具有下列核苷酸序列之一(1).具有SEQ NO 1所示的DNA序列；(2).與序列表中序列1限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
2.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于促進胰島素分泌的基因的方法，其特征在于該 方法的具體步驟為根據(jù)SilenCircle TM RNAi Transcription Kit中載體設計的具體要 求，設計對應于 Kir6. 2 基因 733-753 位，即 GCA TCT TCA TGA AAA CGG CAC 的 shRNA 的寡 核苷酸序列引物，各為53bp，然后進行合成，得到用于促進胰島素分泌的基因；所述的shRNA的寡核苷酸序列引物為Sense 5' -ACA CCG CAT CTT CAT GAA AAC GGC TTG CTT GAA GCC GTT TTC ATG AAG ATG CT-3'Anti-sense 5'-AAA AAG CAT CTT CAT GAAAAC GGC TTC AAG CAA GCC GTT TTC ATG AAGATG CG-3，。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于促進胰島素分泌的基因在制備促進胰島素的分泌 藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于促進胰島素分泌的基因、其制備方法及其應用。該基因具有下列核苷酸序列之一(1)具有SEQ NO 1所示的DNA序列；(2)與序列表中序列1限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明設計對與胰島素分泌有關(guān)聯(lián)的基因的RNAi，并應用胰島β細胞模型研究其對胰島素分泌的促進作用。為RNAi在糖尿病的治療應用提供了一種新方法。
文檔編號A61P5/48GK101935656SQ20101012665
公開日2011年1月5日 申請日期2010年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月17日
發(fā)明者余抗抗, 趙璟, 鄭大, 陳付學 申請人:上海大學