091 ]供試品:材料浸提液
[0092]陰性對(duì)照:同批浸提介質(zhì)
[0093]接觸途徑:皮內(nèi)注射
[0094]評(píng)判指標(biāo):觀察24h、48h、72h紅斑、水腫反應(yīng)程度
[0095]結(jié)果:注射后24h、48h、72h注射局部及周?chē)つw組織均無(wú)紅斑、水腫反應(yīng)，試驗(yàn)側(cè)皮膚反應(yīng)不大于對(duì)照側(cè)皮膚反應(yīng)。
[0096]結(jié)論:參照GB/T 16886.10-2005，該供試品無(wú)皮內(nèi)刺激反應(yīng)。
[0097]3.急性全身毒性試驗(yàn)
[0098]參照/技術(shù)標(biāo)準(zhǔn):GB/T16886.11-1997/ASTM F 750
[0099]試驗(yàn)動(dòng)物:健康小白鼠
[0100]浸提介質(zhì):0.9%氯化鈉注射液
[0101]供試品:材料浸提液
[0102]陰性對(duì)照:同批浸提介質(zhì)
[0103]接觸途徑:尾靜脈注射
[0104]評(píng)判指標(biāo):觀察4h、24h、48h、72h動(dòng)物一般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)和死亡動(dòng)物數(shù)。
[0105]結(jié)果:72h觀察期內(nèi)供試品組動(dòng)物反應(yīng)不大于陰性對(duì)照組動(dòng)物。
[0106]結(jié)論:參照GB/T 16886.11-1997/ASTM F 750，該供試品急性全身毒性試驗(yàn)結(jié)果符合要求。
[0107]4.溶血試驗(yàn)
[0108]參照/ 技術(shù)標(biāo)準(zhǔn):GB/T 16886.4-2003/GB/T 16175-1996
[0109]試驗(yàn)動(dòng)物:健康新西蘭兔
[0110]稀釋抗凝兔血制備:新鮮抗凝兔血+0.9%氯化鈉注射液
[0111]陰性對(duì)照:0.9%氯化鈉注射液
[0112]陽(yáng)性對(duì)照:蒸餾水
[0113]接觸途徑:尾靜脈注射
[0114]試驗(yàn)方法:將供試品按一定比例浸入0.9%氯化鈉注射液中，37°C水浴保溫30min后，加入0.2ml稀釋新鮮抗凝兔血，37°C水浴保溫GOminJSOOrpm離心5min后取上清液，用紫外分光光度計(jì)在545nm處測(cè)定其吸光度，計(jì)算溶血率。
[0115]結(jié)果:該供試品的溶血率為0.2%。
[0116]結(jié)論:參照GB/T 16886.4-2003，該供試品的溶血試驗(yàn)結(jié)果符合醫(yī)用材料的要求。
[0117]實(shí)施例12
[0118]穩(wěn)定性和完整性試驗(yàn):
[0119]在無(wú)菌工作臺(tái)中，準(zhǔn)備一高分子材料平板(經(jīng)洗滌、滅菌及除熱原處理)，干燥;分別配制帶陽(yáng)離子基團(tuán)材料的A溶液(2mg/ml殼聚糖，0.lmol/L乙酸，0.2mol/L NaCl，pH=4)和帶陰離子基團(tuán)材料的B液(2mg/ml的透明質(zhì)酸，0.15mo 1/L NaCl，pH=6)簡(jiǎn)稱(chēng)B液;取部分B液加入小干擾核酸藥物(如實(shí)施例1，10ug/mL)配制成C液，把上述溶液分別灌裝到高壓瞬時(shí)噴涂設(shè)備中，首先往培養(yǎng)皿內(nèi)高壓瞬時(shí)噴涂A液，干燥成膜;接著高壓瞬時(shí)噴涂液B，用注射用水沖洗;接著高壓瞬時(shí)噴涂液A，用注射用水沖洗，如此交替噴涂A液、B液、沖洗，重復(fù)操作總共4次;接著再高壓瞬時(shí)噴涂A液，用注射用水沖洗;再高壓瞬時(shí)噴涂C液，用注射用水沖洗，干燥，如此交替噴涂A液、C液、沖洗，重復(fù)操作總共7次，揭膜，貼面用注射用水沖洗，干燥處理得載小干擾核酸藥物植入式組織粘貼膜。
[0120]將上述制備獲得的多層薄膜置于IMNaCl溶液中，孵育一定時(shí)間，將所得的緩釋液先經(jīng)過(guò)截留分子量為30KDa的超濾離心管過(guò)濾處理，除去大分子物質(zhì)。然后經(jīng)過(guò)截留分子量為3KDa的超濾離心管再過(guò)濾處理，去除緩釋液中的鹽離子，即脫鹽處理。最后把處理過(guò)的緩釋液，作為樣品液在電泳槽跑膠處理。本文采用聚丙烯酰氨凝膠電泳法(PAGE)，來(lái)驗(yàn)證多層薄膜釋放siRNA的基因完整性和相關(guān)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。
[0121]圖1的凝膠電泳實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證緩釋siRNA序列的穩(wěn)定性和完整性。載SiRNA的組織粘貼膜在IM NaCl溶液中孵育，膜逐漸破裂溶解，6天后，已難以觀察到成型物。從圖1凝膠電泳實(shí)驗(yàn)中，我們可看到，6天溶解液脫鹽后未能觀察到解離的siRNA，而10天溶解液脫鹽后能清晰地看到解離的siRNA，由此我們推測(cè)，膜在逐漸破裂溶解過(guò)程中，溶出物為siRNA與陰、陽(yáng)離子基團(tuán)結(jié)合體，隨著陰、陽(yáng)離子基團(tuán)的降解，siRNA逐漸解離出來(lái)，并保持了siRNA序列的穩(wěn)定性和完整性。
[0122]實(shí)施例13
[0123]細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn):
[0124]在無(wú)菌工作臺(tái)中，準(zhǔn)備一高分子材料平板(經(jīng)洗滌、滅菌及除熱原處理)，干燥;分別配制帶陽(yáng)離子基團(tuán)材料的A溶液(2mg/ml殼聚糖，0.lmol/L乙酸，0.2mol/L NaCl，pH=4)和帶陰離子基團(tuán)材料的B液(2mg/ml的透明質(zhì)酸，0.15mo 1/L NaCl，pH=6)簡(jiǎn)稱(chēng)B液;取部分B液加入小干擾核酸藥物(如實(shí)施例1，10ug/mL)配制成C液，把上述溶液分別灌裝到高壓瞬時(shí)噴涂設(shè)備中，首先往培養(yǎng)皿內(nèi)高壓瞬時(shí)噴涂A液，干燥成膜;接著高壓瞬時(shí)噴涂液B，用注射用水沖洗;接著高壓瞬時(shí)噴涂液A，用注射用水沖洗，如此交替噴涂A液、B液、沖洗，重復(fù)操作總共4次;接著再高壓瞬時(shí)噴涂A液，用注射用水沖洗;再高壓瞬時(shí)噴涂C液，用注射用水沖洗，干燥，如此交替噴涂A液、C液、沖洗，重復(fù)操作總共2次，揭膜，貼面用注射用水沖洗，干燥處理得載小干擾核酸藥物植入式組織粘貼膜。
[0125]將上述制備獲得的組織粘貼膜作為實(shí)驗(yàn)組，即實(shí)驗(yàn)組為載有eGFP-siRNA交替聚電解質(zhì)反應(yīng)2次的膜，陰性對(duì)照組為載有普通siRNA交替聚電解質(zhì)反應(yīng)2次的膜(制備方法同實(shí)驗(yàn)組，僅eGFP-siRNA替換為普通siRNA)。將實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組分別放置6孔板中，分別將eGFP-HEK 293T細(xì)胞接種于其上的6孔板中(另外將未放置粘貼膜的孔直接接種細(xì)胞作為空白對(duì)照組)，分別于I天、2天和3天觀察其熒光強(qiáng)度變化情況，結(jié)果顯示圖2。圖3中，列出了實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白組的相對(duì)熒光強(qiáng)度，可以看到，空白組和陰性對(duì)照組在3天內(nèi)熒光強(qiáng)度幾乎沒(méi)有變化，而實(shí)驗(yàn)組在3天內(nèi)隨著時(shí)間增加熒光強(qiáng)度明顯減少。由次驗(yàn)證載有eGFPsiRNA的組織粘貼膜能使eGFP-HEK 293T細(xì)胞的熒光強(qiáng)度減弱，說(shuō)明eGFP siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞誘導(dǎo)了靶基因沉默。
[0126]綜上所述，本發(fā)明效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點(diǎn)而具高度產(chǎn)業(yè)利用價(jià)值。
[0127]上述實(shí)施例僅例示性說(shuō)明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種載藥組織粘貼膜，所述載藥組織粘貼膜包括交替疊加的陽(yáng)離子層和陰離子層，所述陽(yáng)離子層和陰離子層中的至少一層為藥物層、或所述陽(yáng)離子層和陰離子層中的至少一層含有帶電荷的藥物，所述藥物為蛋白或多肽藥物。2.如權(quán)利要求1所述的一種載藥組織粘貼膜，其特征在于，當(dāng)所述陽(yáng)離子層和陰離子層中的至少一層為藥物層時(shí)，作為藥物層的陽(yáng)離子層和/或陰離子層為帶電荷的藥物，不作為藥物層的陽(yáng)離子層含有帶陽(yáng)離子基團(tuán)的載體材料，不作為藥物層的陰離子層含有帶陰離子基團(tuán)的載體材料；當(dāng)所述陽(yáng)離子層和陰離子層中的至少一層含有帶電荷的藥物時(shí)，陽(yáng)離子層含有帶陽(yáng)離子基團(tuán)的載體材料，陰離子層含有帶陰離子基團(tuán)的載體材料。3.如權(quán)利要求2所述的一種載藥組織粘貼膜，其特征在于，所述帶陽(yáng)離子基團(tuán)的載體材料選自帶陽(yáng)離子基團(tuán)的有機(jī)高分子聚合物、帶陽(yáng)離子基團(tuán)的多聚糖、帶陽(yáng)離子基團(tuán)的多肽、帶陽(yáng)離子基團(tuán)的蛋白、以及陽(yáng)離子脂質(zhì)體中的一種或多種的組合。4.如權(quán)利要求2所述的一種載藥組織粘貼膜，其特征在于，所述帶陰離子基團(tuán)的載體材料選自帶陰離子基團(tuán)的有機(jī)高分子聚合物、帶陰離子基團(tuán)的多聚糖、帶陰離子基團(tuán)的多肽、帶陰離子基團(tuán)的蛋白、以及陰離子脂質(zhì)體中的一種或多種的組合。5.如權(quán)利要求2所述的一種載藥組織粘貼膜，其特征在于，所述帶陽(yáng)離子基團(tuán)的載體材料和帶陰離子基團(tuán)的載體材料選用生物相容性材料。6.如權(quán)利要求1所述的一種載藥組織粘貼膜，其特征在于，所述陽(yáng)離子層整體上顯示為正電荷，所述陰離子層整體上顯示為負(fù)電荷。7.如權(quán)利要求1所述的一種載藥組織粘貼膜，其特征在于，所述帶電荷的藥物為藥物復(fù)合體。8.如權(quán)利要求1-7任一權(quán)利要求所述的載藥組織粘貼膜的制備方法，包括如下步驟:在基板上交替沉積陽(yáng)離子層和陰離子層，制備獲得組織粘貼膜。9.一種組織粘貼膜在制備藥物載體材料中用途，所述組織粘貼膜包括交替疊加的陽(yáng)離子層和陰離子層。10.如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述陽(yáng)離子層和陰離子層中的至少一層為藥物層或所述陽(yáng)離子層和陰離子層中的至少一層用于包含帶電荷的藥物。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種蛋白或多肽藥物載藥組織粘貼膜及其制備方法。本發(fā)明提供一種載藥組織粘貼膜，所述載藥組織粘貼膜包括交替疊加的陽(yáng)離子層和陰離子層，所述陽(yáng)離子層和陰離子層中的至少一層為藥物層、或所述陽(yáng)離子層和陰離子層中的至少一層含有帶電荷的藥物，所述藥物為蛋白或多肽藥物。本發(fā)明所提供的載藥組織粘貼膜具有良好的組織黏附性、良好的生物相容性及可降解吸收性、良好的穩(wěn)定性，其物理、化學(xué)性能可通過(guò)調(diào)節(jié)材料的組成而調(diào)節(jié)。
【IPC分類(lèi)】A61K47/36, A61K9/70, A61K38/02
【公開(kāi)號(hào)】CN105687165
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610143021
【發(fā)明人】劉光萬(wàn), 吳昌琳
【申請(qǐng)人】蘇州博創(chuàng)康源生物技術(shù)有限公司
【公開(kāi)日】2016年6月22日
【申請(qǐng)日】2016年3月14日