Skp1癌蛋白及其靶向藥物在腫瘤治療中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[OOm] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，設(shè)及公開一種新型癌蛋白Skpl(S-phase kinase-associatedprotein1，中文名S期激酶相關(guān)蛋白1)及其祀向藥物，更具體的設(shè)及 能勒1 向Skpl的化合物巧vodiamine，Liriodenine, 6-〇-angel〇}dplenolind等）即W下所 述式I化合物）在治療腫瘤性疾病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤是威脅人類健康的頭號殺手。2012年世界范圍內(nèi)約新增1410萬癌癥病例， 共有820萬癌癥死亡病例和3260萬癌癥患者巧年內(nèi)診斷），并且運(yùn)些數(shù)字仍在持續(xù)增長 中。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識到腫瘤的形成、發(fā)展是由于癌基因突變或者過表達(dá) 造成的，由此發(fā)現(xiàn)促進(jìn)癌癥發(fā)生發(fā)展的癌蛋白并開發(fā)相應(yīng)的小分子祀向藥物，在腫瘤治療 中具有關(guān)鍵作用。
[0003] 目前祀向治療藥物在腫瘤的治療中已取得顯著的效果。例如，吉非替尼和厄洛替 尼是祀向EGFR(表皮生長因子受體）的小分子化合物，可W有效抑制EGFR的憐酸化，已成 為肺癌臨床治療的一線藥物；STI-57U格列衛(wèi)）是祀向Bcr-Abl的酪氨酸激酶競爭性抑制 劑，目前已經(jīng)成為治療慢性髓樣白血?。–ML)病人的一線用藥。但運(yùn)些激酶抑制劑在治療 過程中會由于激酶蛋白突變而出現(xiàn)耐藥，導(dǎo)致治療失敗。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)新的治療祀點(diǎn) 并開發(fā)新的祀向治療藥物W改善患者預(yù)后。
[0004] Skpl-化11-F-盒蛋白（SC巧復(fù)合體在蛋白質(zhì)的泛素化修飾和降解中發(fā)揮重要作 用。SCF復(fù)合體由SkplXullinUF-盒蛋白及化xl四部分組成，其中化llinl、多種F-box 蛋白、化xl已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在肺癌等多種癌癥中過表達(dá)。由于F-box蛋白負(fù)責(zé)特異底物的識別，其 在癌癥發(fā)生發(fā)展中的功能W及特異祀向藥物研究也最為廣泛。目前研究最為清楚的F-box 蛋白包括Skp2、訊xw7、P-TrCP等。Skp2與P-TrCP在許多腫瘤組織中高表達(dá)，而且與腫 瘤的轉(zhuǎn)移W及預(yù)后密切相關(guān)，而Fbxw7具有一定的抑癌作用。NIPA也屬于F-box蛋白，可W 調(diào)控cyclinB1的降解參與細(xì)胞周期有絲分裂進(jìn)程的調(diào)控，但其在腫瘤中的作用尚不清楚。 研究還發(fā)現(xiàn)，特異性祀向Skp2的抑制劑對一些腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用，但迄今沒有報(bào)道 Skpl能否做癌癥的治療祀點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]發(fā)明人首次使用免疫印跡技術(shù)（Westernblot),對56例病人的癌及癌旁正常組 織進(jìn)行了Skpl表達(dá)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Skpl蛋白在運(yùn)些肺癌病人腫瘤組織中的表達(dá)顯著高于 其對應(yīng)的癌旁正常組織，高表達(dá)率為33/56(58.9% );用免疫組化技術(shù)對運(yùn)些標(biāo)本進(jìn)行檢 巧Ij，驗(yàn)證了Westernblot檢測的結(jié)果。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Skpl在肺癌中的表達(dá)水平與病人 的生存期成負(fù)相關(guān)，Skpl高表達(dá)患者的生存期顯著短于Skpl低表達(dá)的病人。
[0006] 進(jìn)一步，發(fā)明人利用高通量分子對接計(jì)算模擬方法篩選祀向Skpl的小分子化合 物，發(fā)現(xiàn)30個(gè)可W與Skpl結(jié)合而影響其功能的抑制劑，并研究了其中3個(gè)與Skpl結(jié)合能量 值較高的小分子化合物的抗癌作用及分子機(jī)理。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，3個(gè)代表性的化合物吳榮英堿 巧vodiamine)、碟掌秋堿（Xiriodenine),6-氧-安杰萊普諾嘟巧-〇-angel〇}dplenolin， 簡稱6-0AP)通過結(jié)合Skpl、影響Skpl與F-box蛋白的相互作用，顯示顯著的抗腫瘤作用。 運(yùn)3個(gè)化合物可W有效降低F-box蛋白穩(wěn)定性；上述F-box蛋白包括但不限于Skp2、NIPA 等F-box蛋白。
[0007] 一方面，本發(fā)明提供了Skpl作為一種新的癌蛋白與腫瘤病人的預(yù)后顯著負(fù)相關(guān) 的分子標(biāo)記。其中，所述腫瘤為包括但不限于肺癌、多發(fā)性骨髓瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、前列 腺癌、肝癌、食道癌、胃癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、白血病、淋己瘤、直腸癌、腦瘤、皮膚癌。
[0008] 另一方面，本發(fā)明提供的如結(jié)構(gòu)式I所示的小分子化合物在制備預(yù)防、治 療與Skpl高表達(dá)相關(guān)的腫瘤疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明證明了Evodiamine， Liriodenine,6-〇-angel〇}dplenolin可W特異性的結(jié)合Skpl,并顯著干擾Skpl與F-box 蛋白相互作用，進(jìn)一步抑制SCFE3連接酶NIPA、Skp2、P-TrCP等的活性，導(dǎo)致其相應(yīng)底物 切ClinBl、p27、IkBa等的累積，從而顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞周期，使癌細(xì)胞 有絲分裂受到抑制，產(chǎn)生顯著的抗腫瘤功能。其中，所述腫瘤為包括但不限于肺癌、多發(fā)性 骨髓瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、肝癌、食道癌、胃癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、白血病、淋己 瘤、直腸癌、腦瘤、皮膚癌。
[0009] 再一方面，本發(fā)明提供了一種篩選Skpl祀向藥物的方法，該方法為針對Skpl與 Skp2相互作用氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行高通量分子對接方法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)對接方法的實(shí)例如 下：
[0010] Skpl的蛋白晶體結(jié)構(gòu)（PDB蛋白數(shù)據(jù)庫號為：2AST)為分子對接的受體，來自 chemdiv公司的化合物和文獻(xiàn)已報(bào)道的天然化合物-共21008個(gè)小分子化合物為分子對接 配體。運(yùn)些化合物的3D結(jié)構(gòu)模型大部分下載自Pub化em化合物數(shù)據(jù)庫，剩余的化合物利 用化e血raw程序和化合物的二維結(jié)構(gòu)進(jìn)行S維結(jié)構(gòu)模型，并在化em3D叫tra程序中遵循 能量最低和分子動(dòng)力學(xué)原則進(jìn)行優(yōu)化模擬。21008化合物和Skpl分子對接利用Autodock Vina程序進(jìn)行剛性對接和柔性對接兩部對接，化合物在Skpl蛋白對接位點(diǎn)包括Skpl與 Skp2蛋白相互結(jié)合的兩個(gè)口袋。第一個(gè)口袋用來對接的氨基酸位點(diǎn)包括：97位谷氨酷胺 怕97)，100位亮氨酸化100)，101位苯丙氨酸（F101)，104位異亮氨酸（1104)，123位鄉(xiāng)氨酸 (V123)，139位苯丙氨酸（F139)和141位異亮氨酸（1141);第二個(gè)口袋包括135位異亮氨酸 (1135)，136位精氨酸巧136)，141位異亮氨酸（1141)，143天冬酷胺（N143)，144位天冬氨 酸值144)，150位谷氨酸巧150)，153位鄉(xiāng)氨酸（V153)和157位天冬酷胺（N157)。最后根 據(jù)化合物與Skpl兩個(gè)結(jié)合口袋中的氨基酸對接時(shí)的Pi-Pi相互作用力，氨鍵作用力W及分 子距離(心計(jì)算得到結(jié)合能量值，根據(jù)結(jié)合能量值選擇排名在前的化合物進(jìn)行下一步驗(yàn)證。
[0011] 再一方面，本發(fā)明提供一種預(yù)防、治療與Skpl高表達(dá)相關(guān)的腫瘤的藥物組合物。 其中，所述腫瘤包括但不限于肺癌、多發(fā)性骨髓瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、肝癌、食 道癌、胃癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、白血病、淋己瘤、直腸癌、腦瘤、皮膚癌。
[0012] 該藥物組合物中包含如結(jié)構(gòu)式I所示的小分子化合物。還可W包含一種或多種藥 學(xué)上可接受的載體或賦形劑。所述載體或賦形劑可W包括甘油、乙醇、緩沖鹽水、生理鹽水 及其組合。所述藥物組合物還可W進(jìn)一步包含滲透促進(jìn)劑、抗氧化劑等。
[0013] 本發(fā)明測試結(jié)果表明，Evodiamine、Li;riodenine、6-〇-angel〇5dplenolin通過結(jié) 合Skpl抑制SCFE3連接酶活性，抑制腫瘤細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期達(dá)到抗腫瘤效果。
[0014]
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于制備腫瘤祀向藥物的方法，包括：
[0016] 篩選能夠有效降低Skpl腫瘤蛋白高表達(dá)的化合物；W及
[0017] 利用所述化合物制備相應(yīng)的腫瘤祀向藥物。
[0018] 上述化合物優(yōu)選具有上述結(jié)構(gòu)式I之一。
[0019] 上述腫瘤可W為肺癌、多發(fā)性骨髓瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、肝癌、食道 癌、胃癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、白血病、淋己瘤、直腸癌、腦瘤、皮膚癌。
[0020] 上述腫瘤祀向藥物優(yōu)選是針對Skpl與Skp2相互作用結(jié)合口袋W及其中的活性氨 基酸位點(diǎn)。所述活性氨基酸位點(diǎn)可W為結(jié)合口袋1中的Q97、L100、F101、I104、V123、F139 和 1141W及結(jié)合口袋 2 中的I135、R136、I141、N143、D144、E150,V153 和N157。
【附圖說明】
[0021] W下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：
[0022] 圖1是檢測Skpl在肺癌組織與癌旁組織中的表達(dá)；其中圖1A與圖1C是通過免疫 印跡與免疫組化比較Skpl在肺癌與癌旁組織中的表達(dá)；圖1B和圖1D是對免疫印跡與免疫 組化進(jìn)行量化后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
[0023] 圖2是