一種治療和緩解神經(jīng)變性疾病的化合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種治療和緩解神經(jīng)變性疾病的化合物，屬于醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】：
[000引隨著世界人口的老齡化，阿爾茨海默?。ˋlzheimerdisease，AD)等神經(jīng)變性疾病 發(fā)病率呈明顯上升趨勢，已成為老年人中最常見的一種癡呆癥，是僅次于屯、腦血管、腫瘤之 后又一嚴(yán)重威脅老年人健康的疾病。神經(jīng)變性疾病的病因和發(fā)病機制尚未完全弄清，缺乏 完全模擬AD等神經(jīng)變性疾病特征的理想動物模型，治療AD等神經(jīng)變性疾病缺乏有效藥物。 研究AD等神經(jīng)變性疾病的病因和發(fā)病機制，開發(fā)治療AD等神經(jīng)變性疾病的有效藥物，提高 老年人健康質(zhì)量成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重大課題。
[0003] 在真核生物中，自隧是高度保守的過程，它發(fā)生在細胞質(zhì)中，細胞內(nèi)過多或 異常的細胞器或蛋白質(zhì)被運輸?shù)饺苊阁w中被降解。在細胞內(nèi)主要有=種類型的自 隧：巨自隧（macroauto地agy)，微自隧（microauto地ary)和分子伴侶介導(dǎo)的自隧 (chaperonemedi-atedauto地agy，CMA)。運些自隧過程都有一個共同點，即都是在溶酶體中 實現(xiàn)蛋白質(zhì)的降解。目前，巨自隧在神經(jīng)退行性病變中的作用尤為受到關(guān)注。在自隧的活 性調(diào)節(jié)中，mTOR是調(diào)節(jié)自隧信號途徑的關(guān)鍵信號分子。mTOR信號途徑在控制體內(nèi)蛋白質(zhì)平 衡、維持正常神經(jīng)功能過程中發(fā)揮必不可少的作用。mTOR信號途徑可W調(diào)控許多形式的記 憶和學(xué)習(xí)功能。在AD動物模型中，mTOR信號途徑抑制劑雷帕霉素（"Rapamycin"，一種臨 床上的免疫抑制劑，目前臨床上也用于治療神經(jīng)變性疾?。┩ㄟ^增強自隧來改善認知功能 障礙，其機制與減輕AI3及tau蛋白的病理損傷作用相關(guān)。在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，長期使用 雷帕霉素抑制mTOR,可W阻止AD樣認知功能障礙，降低AB水平。上述結(jié)果表明mTOR抑制 劑可W通過增強自隧，降低AI3、改善認知功能，運為AD模型的改善認知功能障礙的治療提 供了可行的治療路徑。
[0004] 另外，研究發(fā)現(xiàn)TAU蛋白（微管相關(guān)蛋白）、BACE1蛋白（淀粉蛋白前P位分解酶 1)、AP蛋白（P-淀粉樣蛋白）等分子與阿爾茨海默病、帕金森氏病和亨廷頓病等神經(jīng)變 性疾病有密切關(guān)系，運=種蛋白在運類神經(jīng)變性疾病的病人中的表達量均增高，用于臨床 治療的祀分子藥物篩選也主要集中在包括mTOR在內(nèi)的運四種祀蛋白上。能夠有效抑制或 下調(diào)mT0R、TAU蛋白、BACE1蛋白、AP蛋白的藥物均能夠在臨床上有效緩解AD、PD和皿等 神經(jīng)變性疾病。
[0005] 目前臨床常用的干預(yù)藥物主要有雷帕霉素，但運種化合物有極大的毒副作用，不 可能長期服用。所W，篩選有效低毒的抗神經(jīng)變性疾病的藥物或化合物一直是研發(fā)臨床用 藥的難題和重點。
[0006] 同時，大量的研究已證實mTOR與動物的壽命相關(guān)，調(diào)低mTOR的表達量可延長細胞 和動物體的衰老周期。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007] 針對上述問題，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種治療和緩解神經(jīng)變性疾病的 化合物。
[0008] 本發(fā)明的一種治療和緩解神經(jīng)變性疾病的化合物，該化合物為青葛素 (Artemisinin)衍生物，所述的青葛素（Artemisinin)衍生物包含葛甲酸（Artemether)、葛 乙酸（Arteether)、青葛班醋（Artesunatum)、雙氨青葛素值ihy化oartemisinin)和藥學(xué)上 可接受的輔料。
[0009] 本發(fā)明的有益效果為：它可W治療早老性癡呆、帕金森氏綜合征和亨廷頓病，毒副 作用低，價格低廉，不產(chǎn)生賴藥性，可長期服用，實用性強。
【附圖說明】：
[0010] 為了易于說明，本發(fā)明由下述的具體實施及附圖作W詳細描述。
[0011] 圖1為本發(fā)明所述藥物組與對照組細胞中祀基因蛋白的凝膠電泳圖，
[0012] 圖2為本發(fā)明所述藥物組與對照組各組細胞中祀基因蛋白表達情況。
【具體實施方式】：
[0013] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明了，下面通過附圖中示出的具體 實施例來描述本發(fā)明。但是應(yīng)該理解，運些描述只是示例性的，而并非要限制本發(fā)明的范 圍。此外，在W下說明中，省略了對公知結(jié)構(gòu)和技術(shù)的描述，W避免不必要地混淆本發(fā)明的 概念。
[0014] 如圖1所示，本【具體實施方式】采用W下技術(shù)方案：該化合物為青葛素 (Artemisinin)衍生物，所述的青葛素（Artemisinin)衍生物包含葛甲酸（Artemether)、葛 乙酸（Arteether)、青葛班醋（Artesunatum)、雙氨青葛素值ihy化oartemisinin)和藥學(xué)上 可接受的輔料。
[0015] 進一步的，藥學(xué)上可接受的輔料包含異丙醇、乙醇、苯甲醇、肉豆寇酸異丙醋、正丙 醇、丙S醇、二甘醇、S乙酸甘油醋、二甲基甲酯胺、二甲基亞諷值MS0)、S甘醇、油酸乙醋 等。
[0016] 進一步的，該化合物還包含其臨床制劑。
[0017] 本【具體實施方式】通過細胞試驗顯示：青葛素衍生物可作用于引起早老性癡呆和 帕金森氏綜合征的相關(guān)祀蛋白，同時也作用于與衰老相關(guān)的祀蛋白。明顯下調(diào)了引起上述 疾病的祀分子濃度和與衰老相關(guān)的祀分子濃度。青葛素衍生物在小鼠口服的半數(shù)致死量 (LD50)為895~977mg/kg，大鼠肌內(nèi)注射油劑的LD50為597mg/kg，并已被用于臨床治療追 疾和腫瘤，是一類安全有效的藥物分子。動物腦膠質(zhì)瘤原位抑制實驗和惡性追引起的腦型 追臨床用藥顯示青葛素及其衍生物可透過血腦屏障進入大腦。
[0018]青葛素（Artemisinin)衍生物包括葛甲酸（Artemether)、葛乙酸（Arteether)、青 葛班醋（Artesunatum)和雙氨青葛素值ihy化oartemisinin)等藥物已在臨床上用于治療 追疾，更為重要的是利用該藥或化合物具有透過血腦屏障的特性，用于治療腦型追疾并具 有顯著療效。近年的研究發(fā)現(xiàn)，青葛素及其衍生物如葛甲酸在體內(nèi)外有明顯的抗腫瘤和抑 制腫瘤細胞生長的作用，且不產(chǎn)生賴藥性及不良反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)青葛素及其衍生物具有 下調(diào)和降低TAU蛋白（微管相關(guān)蛋白）、BACE1蛋白（淀粉蛋白前P位分解酶1)、AP蛋白 (e-淀粉樣蛋白）和mTOR蛋白表達濃度的活性，其主要的作用機制如下所述：
[0019] 1、下調(diào)神經(jīng)元外的P-淀粉樣蛋白（P-amyloidp;rotein，AP)的濃度：在細胞水 平上青葛素及其衍生物能夠明顯下調(diào)神經(jīng)元外的P-淀粉樣蛋白（P-amyloidprotein， A0)的濃度和表達量，且具劑量依賴性。
[0020] 2、下調(diào)TAU蛋白（微管相關(guān)蛋白）的濃度：在細胞水平上青葛素及其衍生物能夠 明顯下調(diào)TAU蛋白（微管相關(guān)蛋白）的濃度和表達量，且具劑量依賴性。
[0021] 3、下調(diào)BACE1蛋白（淀粉蛋白前P位分解酶1)的濃度：在細胞水平上青葛素及 其衍生物能夠明顯下調(diào)BACE1蛋白（淀粉蛋白前P位分解酶1)的濃度和表達量，且具劑 量依賴性。
[002引 4、下調(diào)mTOR蛋白的濃度：在細胞水平上青葛素及其衍生物能夠明顯下調(diào)mTOR的 濃度和表達量，且具劑量依賴性。
[0023] 青葛素及其衍生物用于治療腦型追和腦膠質(zhì)瘤的優(yōu)勢在于該藥能夠透過血腦屏 障，殺死追原蟲和誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細胞調(diào)亡。神經(jīng)變性疾病的病灶也主要集中于大腦，青葛素 及其衍生能夠透過血腦屏障進入大腦為該類藥物或化合物發(fā)揮作用提供了前提條件，加之 體外研究的結(jié)果已證實青葛素及其衍生能夠顯著下調(diào)和降低與阿爾茨海默病、帕金森氏病 和亨廷頓病等神經(jīng)變性疾病有密切相關(guān)的TAU蛋白、BACE1蛋白、AP蛋白和mTOR等分子表 達量和濃度。該類藥物或化合物具有毒副作用低，價格低廉，不產(chǎn)生賴藥性，可長期服用等 優(yōu)點。
[0024] 通過對IC50 (半數(shù)抑制率）的研究，其用量可為10-150mg/kg/。
[00巧]試驗研究結(jié)果顯示：青葛素及其衍生物對體外培養(yǎng)的N2a細胞株中的mT0R、TAU蛋 白、BACE1蛋白、AP蛋白度eta)表達濃度均能夠有效抑制或明顯下調(diào)，且具劑量依賴性。
[0026] 測定葛甲酸對N2a小鼠神經(jīng)母細胞瘤的抑制作用。
[0027] 實驗試劑：DMEMF12培養(yǎng)基購自美國GIBC0公司；胎牛血清購自美國GIBC0公司， 嚷挫藍（MTT)購自美國SIGMA公司，DMS0購自美國SIGMA公司。
[0028] 主要儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱（美國化rma公司）；酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）； 無菌操作臺（美國Forma公司）。
[0029] 細胞株及細胞培養(yǎng)：小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞株N2a用含10%胎牛血清的DMEMF12 細胞培養(yǎng)基于37°C，5%C02恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。
[0030] 藥物：葛甲酸（昆明制藥集團股份有限公司，50mg)。
[0031] 試驗方法：
[00礎(chǔ) 1.四甲基偶氮挫鹽法（MTT法）：
[0033]取對數(shù)生長期N2a細胞，調(diào)整細胞懸液為1X105個/mL。取=個96孔板，在細 胞y板的外周各孔均加入200iiL的新鮮培養(yǎng)基，其它各孔每孔用移液器加入細胞濃度為 1X105個/mL的細胞懸液200y以使每孔細胞數(shù)2. 0X104個，其中設(shè)置空白對照組1個包 括6個復(fù)孔、實驗組9個在此后的實驗中依次用于加入不同濃度的藥液（800、400、200、100、 50、25、12. 5yg/mL)，每個濃度的藥物組均設(shè)6個復(fù)孔，置37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h; 取出96孔板，用移液器小屯、吸去上清液，實驗組每孔分別加入用完全培養(yǎng)液配制的相應(yīng)濃 度的藥物溶液200y以每個濃度6個復(fù)孔。空白對照組加200yL的完全培養(yǎng)液，置37°C， 5%C02培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h、48h、72h;稱取50mgMlT溶于5血PBS中，過濾，避光保存； 取出已培養(yǎng)到相應(yīng)時間的培養(yǎng)板，用5mL注射器吸干孔內(nèi)的液體，每孔加入20yLMIT溶 液，放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)解育也去除MTT，每孔加入150yLDMSO,暗處振蕩15min，450型 ELISA-Reader酶標(biāo)儀度io-Rad公司）490皿主波長，630皿副波長檢測吸光度。W對照組細 胞活力為100%，按公式計算不同濃度葛甲酸對N2a細胞增殖的抑制率：細胞抑制率（％ ) =(1 -藥物組吸光度/對照組吸光度）X100%。借助SPSS17. 0軟件求的IC50值。
[0034] 2.蛋白印跡法（Westernblot)檢測祀基因蛋白量
[0035] 2. 1單層貼壁細胞總蛋白提取
[0036] 取出已加藥處理48h的小鼠神經(jīng)母瘤細胞，去除培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上 使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷?