柴胡皂苷類化合物在制備治療神經(jīng)退行性疾病藥物中應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及柴胡皂苷類化合物在制備治療神經(jīng)退行性疾 病藥物中應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)退行性疾?。╪eurodegenerationdisorders，ND)是一組以原發(fā)性神經(jīng)元 變性為基礎(chǔ)的慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要包括阿爾茨海默?。ˋlzheimer，sdisease， AD)、帕金森?。≒arkinson'sdisease，F(xiàn)*D)、多發(fā)性硬化癥（multiplesclerosis，MS)、亨 廷頓氏?。℉untington'sdisease，HD)等。研究發(fā)現(xiàn)，ND是由多種不同原因?qū)е碌?，包?神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞不能提供充分的營(yíng)養(yǎng)、神經(jīng)炎癥、軸突傳遞功能受損、谷氨酸受體活 性過(guò)高、活性氧水平過(guò)高、代謝通路受損、線粒體能量產(chǎn)生減少等因素。其中，腦內(nèi)神經(jīng)炎癥 對(duì)多種神經(jīng)退行性疾病如AD、H)和MS等的發(fā)生和發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。因此，能夠抑 制神經(jīng)炎癥的化合物具有很好的治療ND開發(fā)前景。
[0003] 隨著世界人口的老齡化，神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，如我國(guó)60歲 以上人群的AD患病率是5. 1 %，85歲以上者患病率是30%，全國(guó)患病人數(shù)在800萬(wàn)人以上， 而全世界約有3500萬(wàn)AD病人。的患病率僅次于AD，主要發(fā)生于中年以上人群，65歲以 上人群中患病率為2%。患者發(fā)病后病情呈進(jìn)行性加重，逐漸喪失獨(dú)立生活能力，最終因并 發(fā)癥而死亡。由于ND發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、部位特殊，至今仍缺乏有效的治療藥物。因此，尋找一 種安全性高、能夠防治ND的新藥已經(jīng)迫在眉睫。
[0004] 中藥是中華文明歷經(jīng)千年流傳下來(lái)的寶貴文化遺產(chǎn)，與人工合成藥物相比，中藥 具有使用歷史悠久、毒副作用相對(duì)較小的優(yōu)點(diǎn)，且中藥中的天然化合物不僅來(lái)源具有生物 多樣性，而且代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變，蘊(yùn)含著無(wú)窮無(wú)盡的結(jié)構(gòu)多樣性。多年來(lái)，民間在運(yùn)用 中草藥治療呆癥、健忘方面也已積累了豐富經(jīng)驗(yàn)。因此我們推測(cè)這些植物的有效成分中極 有可能存在能夠有效防治ND的物質(zhì)，所以從中藥中的天然化合物中篩選具有預(yù)防和治療 ND作用的藥物是該領(lǐng)域藥物研發(fā)的重要新思路。
[0005] 柴胡阜苷，是傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC?或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifoliumWilld.的干燥根中的一類成分，是中藥柴胡中的主要化學(xué)指標(biāo)和生物 活性成分，其中含量較大的成分主要有柴胡皂苷a，bl，b2,c，d等。藥理研究表明，柴胡皂 苷具有解熱、鎮(zhèn)靜、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供柴胡皂苷類化合物在制備治療神經(jīng)退行性疾病藥物中應(yīng) 用，其特征在于，該柴胡皂苷類化合物在制備治療神經(jīng)退行性疾病藥物中應(yīng)用包括五種柴 胡皂苷類化合物分別為柴胡皂苷a、柴胡皂苷bl、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d。
[0007] 進(jìn)一步，制備得到的治療神經(jīng)退行性疾病藥物包含柴胡皂苷a、柴胡皂苷bl、柴胡 皂苷b2、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d五種柴胡皂苷類化合物中的一種或幾種。
[0008] 進(jìn)一步，治療神經(jīng)退行性疾病藥物在抑制神經(jīng)炎癥方面的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：
[0010] 柴胡皂苷a、bl、b2、c、d可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子NO和ROS的 釋放。
[0011] 在NOR實(shí)驗(yàn)中，柴胡皂苷a能夠明顯升高LPS誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶損傷小鼠對(duì)新事物 的偏愛(ài)指數(shù)；在Y迷宮實(shí)驗(yàn)中，柴胡皂苷a能夠明顯升高LPS誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶損傷小鼠的自 發(fā)交替反應(yīng)率；在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，柴胡皂苷a能夠使LPS誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶損傷小鼠 的逃避潛伏期和逃避距離明顯降低；在筑巢實(shí)驗(yàn)中，柴胡皂苷a能夠明顯增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的學(xué) 習(xí)記憶損傷小鼠的筑巢能力，表現(xiàn)為小鼠巢穴緊湊且牢固，巢穴正中有淺窩；上述結(jié)果表明 柴胡皂苷a對(duì)LPS誘導(dǎo)的AD小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷具有明顯的保護(hù)作用。
[0012] 柴胡皂苷a、bl、b2、c、d為我國(guó)傳統(tǒng)中藥柴胡中的有效成分，為純天然提取物，用 藥較安全，毒副作用小。
[0013] 因此，柴胡皂苷a、bl、b2、c、d可用于神經(jīng)退行性疾病的治療和抑制神經(jīng)炎癥。
【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的實(shí)施例3柴胡皂苷a對(duì)LPS誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶損傷小鼠 新物體辨別能力的影響的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；
[0015] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的實(shí)施例4Y迷宮實(shí)驗(yàn)考察柴胡皂苷a對(duì)LPS誘導(dǎo)的學(xué) 習(xí)記憶損傷小鼠工作記憶能力的影響的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；
[0016] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的實(shí)施例5M〇rriS水迷宮逃避距離實(shí)驗(yàn)考察柴胡皂苷a 對(duì)LPS誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶損傷小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；
[0017] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的實(shí)施例5Morris水迷宮逃避潛伏期實(shí)驗(yàn)考察柴胡皂苷 a對(duì)LPS誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶損傷小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；
[0018]圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的實(shí)施例6筑巢實(shí)驗(yàn)考察柴胡皂苷a對(duì)LPS誘導(dǎo)的學(xué)習(xí) 記憶損傷小鼠筑巢能力的影響的統(tǒng)計(jì)分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0020] 下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。
[0021] 柴胡皂苷a(Saikosaponina)，分子式SC42H68O13，分子量為780. 99,熔點(diǎn)為 225-232°C;其結(jié)構(gòu)式如下所示：
[0022]

[0029] 柴胡皂苷d(Saikosaponind)，分子式為C42H68O13，分子量為780. 98,熔點(diǎn)為 212-218°C;其結(jié)構(gòu)式如下所示：
[0030]
[0031] 通過(guò)以下的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用效果做進(jìn)一步的說(shuō)明：
[0032] 實(shí)施例1和實(shí)施例2柴胡皂苷系列化合物對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子NO和ROS釋放 的影響的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表如表1 ;
[0033] 實(shí)施例I=Griess比色法考察柴胡皂苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞NO釋放的影響；
[0034] 細(xì)胞株：小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株BV-2 ;
[0035] 藥物：LPS;柴胡皂苷a;柴胡皂苷bl、b2、c、d;MIN0。
[0036]方法：
[0037] (1)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2的培養(yǎng)：
[0038] 細(xì)胞培養(yǎng)液以DMEM培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)配制而成，內(nèi)含10%FBSU00U青霉素和100U 鏈霉素及50yM2-巰基乙醇（均為終濃度）。在5%C02, 37°C條件下將BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞以 約4X105cells/ml的細(xì)胞密度置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，至細(xì)胞貼 壁面積約占培養(yǎng)瓶底面積50-60%時(shí)，以胰酶消化細(xì)胞并傳代，之后繼續(xù)培養(yǎng)。取3-7代細(xì) 胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0039] (2)亞硝酸鹽含量的測(cè)定：
[0040] 實(shí)驗(yàn)原理：NO含量測(cè)定一般是通過(guò)檢測(cè)其穩(wěn)定的氧化產(chǎn)物亞硝酸鹽的含量來(lái)確 定，利用Griess比色法可以檢測(cè)培養(yǎng)液中亞硝基NO2的含量從而確定亞硝酸鹽的含量。該 測(cè)定方法的原理是在弱酸性條件下，對(duì)氨基苯磺酸可與溶液中的NO2發(fā)生重氮化反應(yīng)，生 成的重氮鹽再與N-(1-萘基）_乙二胺發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，生成的偶氮化合物顯紫紅色，該產(chǎn)物 在540~550nm處存在較大吸收峰，使用酶標(biāo)儀測(cè)量產(chǎn)物溶液在540nm處的吸光強(qiáng)度，該吸 光度值與溶液中NO2的含量成正比，由此可以測(cè)得NO2的含量，從而反映出NO生成量的變 化。
[0041 ] 檢測(cè)方法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的N9細(xì)胞，以新鮮的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞接種于 96孔板內(nèi)，細(xì)胞密度為3X105cells/ml，接種量lOOyl/well，置于培養(yǎng)箱內(nèi)在37°C、5%CO2的條件下培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁培養(yǎng)3h后小心吸出培養(yǎng)液，按照實(shí)驗(yàn)分組，分別換成無(wú)血清的 DMEM培養(yǎng)液配置的不同藥物來(lái)孵育細(xì)胞，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，每組設(shè)五個(gè)復(fù)孔，置于37°C 培養(yǎng)箱中孵育24h，之后取50y1的細(xì)胞培養(yǎng)上清液加入96孔板中，再加入50y1的Griess 試劑（以5%磷酸配制的1 %對(duì)氨基苯磺酸溶液，以蒸餾水配制的0. 1 %萘乙二胺溶液，使用 時(shí)將二者I: 1等體積混合），室溫下反應(yīng)15min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定540nm處吸光度。
[0042] NO2含量與吸光度值的線性關(guān)系為：
[0043] NO2 濃度（ymol/L) =OD值 /0? 0099 ;
[0044] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：柴胡阜苷a、bl、b2、c、d可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞NO的釋放。
[0045] 買施例2:DCFHoxidation法考察柴胡皂苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞ROS釋放的 影響；
[0046] 細(xì)胞株：小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株BV-2 ;
[0047] 藥物：LPS;柴胡皂苷a;柴胡皂苷bl、b2、c、d;MIN0。
[0048] 實(shí)驗(yàn)原理：DCFH-DA(2'，7 '-dichlorodihydrofluororesceindiacetate)可 以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過(guò)脫乙?；磻?yīng)生成DCHLDCFH是一種非熒光性物質(zhì)，它可以被細(xì)胞內(nèi) 的ROS氧化生成熒光物質(zhì)DCF，通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度可反映出R