專利名稱：神經(jīng)絲蛋白的優(yōu)選區(qū)段及其使用方法
發(fā)明領域
本發(fā)明涉及可用于例如結(jié)合測定、蛋白質(zhì)和抗體純化、治療學和診斷學的神經(jīng)絲蛋白(neural thread protein)的優(yōu)選區(qū)段。
背景技術：
早老性癡呆(AD)是一種目前不能治愈的神經(jīng)變性性疾病，在全球影響至少1200萬人。AD主要是一種老年病，其中在65歲老年人中發(fā)病率約1％，而至85歲時發(fā)病率上升至大約40％。因為醫(yī)學進步、生命期望增加和出生高峰一代(the baby boomer generation)衰老，使人口整體老化，預期AD的總體發(fā)病率將上升，從而給健康保健系統(tǒng)以及患者和他們的護理人員和家庭增加更多的負擔。
迄今為止仍不能有效地治療AD。目前可利用的治療諸如Aricept(鹽酸多奈哌齊；Pfizer Corp.)、Exelon(酒石酸利伐斯的明；NovartisPharmaceuticals Corp.)和Cognez(他克林；Warner Lambert Corp.)，用來提供一種輕微至中度AD患者癥狀緩解的措施，因而并不能克服所述疾病的病因。
AD的臨床診斷也不完善；準確度從普通執(zhí)業(yè)醫(yī)師的大致50-60％至轉(zhuǎn)診病人(referral)中心的早老性癡呆專家的80-90％之間變動(Molsa等，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry，48(11)1085-90(1985)；Rocca等，Ann.Neurol.，19415-424(1986)；Bums等，BMJ，301(6759)1026(1990)；Risse等，Am.J.Psychiatry，147(2)168-72(1990)；Gilleard等，ActaPsychiatr.Scand.，85(4)264-9(1992)；Mendez等，Alzheimer Dis.Assoc.Disord，635-43(1992)；Fleming等，Mayo Clin.Proc.71093-1107(1995)；Corey-Bloom等，Neurology，45211-218(1995)和Bowler等，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry，64(1)18-24(1998)。從初期癥狀至作出AD診斷時平均延遲約三年(Jorst等，J.Am.Geriatr.Soc.，43(11)1248-55(1995))。
人們已經(jīng)認識到，可靠的生物標記在AD的準確診斷和早期診斷方面具有較大的幫助(Growdon等，Neurobiol.Aging，19109-116(1998))。雖然幾種生化標記和遺傳標記是目前可利的，但是總的來講認為其臨床病理相關性對于常規(guī)臨床應用而言太低。例如載脂蛋白Eε4等位基因是一種只在AD病例的50％中發(fā)現(xiàn)的遺傳危險因子(Myers等，Neurology，46(3)673-7(1996))，而在腦脊液(CSF)中的τ和β淀粉狀蛋白測定以及血清Aβ在AD水平和非AD水平間有較大的重疊，從而限制其實用性(Pirttila等，J.Neurol.Sci.，127(1)90-5(1994)；Arai等，Ann.Neurol.，38649-652(1995)；Jensen等，Neurosci.Lett.，186(2-3)189-91(1995)；Motter等，Ann.Neurol.，38(4)643-8(1995)；Munroe等，Ann.Clin.Lab.Sci.，25(3)207-17(1995)；Tata等，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatr.，59280-283(1995)；Vigo-Pelfrey等，Neurology，45(4)788-93(1995)；Iwatsubo T.，Neurobiol.Aging，19161-163(1998)；Nitsch等，Ann.Neurol.，37(4)512-8(1995)；van Gool等，Ann.Neurol.，37(2)277-9(1995)；Tamaoka等，J.Neurol.Sci.，151(1-2)65-8(1996)和Pirtilla等，Arch.Neurol.，53(2)189-93(1996))。其它已提出的標記例如對托吡卡胺的瞳孔反應(Scinto等，Science，2661051-1054(1994)和Growdon等，Arch.Neurol.，54(7)841-4(1997))和血清因子例如p-97(Kennard等，Nat.Med.2(11)1230-5(1996))，尚未在重復受控臨床研究中得到證實。大多數(shù)已提出的AD標記的主要缺點是所述標記通常不是與AD病理相關的腦特異性分子，并且它們在外周體液中不能可靠地測量。
神經(jīng)絲蛋白(NTP)是最近表征的腦蛋白的一個新家族。NTP是一種～41kD膜相關磷蛋白，其功能與神經(jīng)炎性出芽和細胞死亡有關(de laMonte等，J.Clin.Invest.，1003093-3104(1997)和de la Monte等，Alz.，Rep.，2327-332(1999))。有使人信服的NTP與AD相關的證據(jù)。NTPmRNA在AD腦中與對照相比被正調(diào)節(jié)；AD大腦和CSF中的NTP蛋白水平高于對照；NTP免疫反應性在老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)、變性中的神經(jīng)元、神經(jīng)纖維絲以及在AD和唐氏綜合征(Down syndrome)腦中的營養(yǎng)不良性神經(jīng)炎性出芽中清晰可見(Ozturk等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86419-423(1989)；de la Monte等，J.Clin.Invest.，86(3)1004-13(1990)；de la Monte等，J.Neurol.Sci.，113(2)152-64(1992)；de la Monte等，Ann.Neurol.，32(6)733-42(1992)；de la Monte等，J.Neuropathol.Exp.Neurol.，55(10)1038-50(1996)，de la Monte等，J.Neurol.Sci.，133(1-2)26-35(1996)，de la Monte等，J.Neurol.Sci.，135(2)118-25(1996)；de la Monte等，J.Clin.Invest.，1003093-3104(1997)和de la Monte等，Alz.，Rep.，2327-332(1999))。在AD神經(jīng)變性早期(在NFT形成之前)在神經(jīng)元中發(fā)生NTP累積。在唐氏綜合征(Down′s Syndrome)腦組織中也鑒定出NTP(Wands等，國際專利公布號WO 90/06993；de la Monte等，Alz.，Rep.，2327-332(1999))。大多數(shù)唐氏綜合征患者在中年后表現(xiàn)出與AD相似的神經(jīng)病理，并且在生命后期發(fā)生與AD相似的多種認知缺陷。
已經(jīng)顯示AD患者和對照的腦脊液(CSF)中NTP水平在AD中持續(xù)升高(Chong等，J.Clin.Lab Anal.，6(6)379-83(1992)；de la Monte等，Ann.Neurol.，32733-742(1992)；de la Monte等，J.Clin.Ivest.，1003093-3104(1997)；Ghanbari等，J.Clin.Lab.Anal.，12(4)223-6(1998)；Ghanbari等，J.Contemp.Neurol.，19982-8(1998)；Kahle等，Neurology，54(7)1498-504(2000))。顯示與非AD神經(jīng)病對照相比，在AD中NTP升高有特異性，并且NTP升高與癡呆程度正相關(de laMonte等，J.Clin.Invest.，1003093-3104(1997)和de la Monte等，Alz.，Rep.，2327-332(1999)和Kahle等，Neurology，54(7)1498-504(2000))。在一項重要的研究中，89％早期AD患者CSF的NTP水平高于2ng/mL，而89％非AD對照CSF的NTP水平低于2ng/mL(de la Monte等，J.Clin.Invest.，1003093-3104(1997))。
接下來，通過高效液相色譜、毛細管電泳和ELISA在尿中鑒定出NTP蛋白(Ghanbari等，J.Clin.Lab.Anal.，12(4)285-288(1998)和de laMonte等，Alz.，Rep.，2327-332(1999))。發(fā)現(xiàn)在AD患者和對照中尿NTP水平與CSF水平相關，并且與非AD患者相比，尿NTP水平在AD患者中顯著升高(Ghanbari等，J.Clin.Lab.Anal.，12(4)285-288(1998))。開發(fā)了一種在液相中使用金微粒與結(jié)合的單克隆抗NTP對尿樣的測定，證明對AD而言所述測定既是高度靈敏的又是特異性的(Fitzpatrick等，Alzheimer′s Reprorts，3(3)155-159(2000))。
需要改進對于NTP的現(xiàn)有測定，包括需要開發(fā)可以在普通醫(yī)學實驗室或醫(yī)生辦公室進行的針對NTP的point-of-care測定。諸如以經(jīng)濟有效的方式從尿中常規(guī)純化天然NTP方法的技術進步或者NTP的容易生產(chǎn)的類似物的研制也將改進任何這樣的測定。
有證據(jù)表明，NTP可能在AD發(fā)病機理中起主導作用，從而使其成為藥物開發(fā)的靶，以治療AD。NTP與神經(jīng)炎性出芽相關；異常神經(jīng)炎性出芽與AD相關。NTP的過量表達可以引起磷酸-τ的細胞累積，而磷酸-τ又在NFT-一種在AD中癡呆的重要神經(jīng)解剖學相關因子的生成之前(de la Monte等，Alz.，Rep.，2327-332(1999))。另外，NTP的過量表達可以引起與氧化應激相關的凋亡性質(zhì)的細胞死亡增加(de laMonte等，1999)。抑制NTP的表達或生化作用提供一種有效治療AD、有前景的途徑。
已經(jīng)鑒定并描述了NTP的基因和預測的蛋白質(zhì)序列(de la Monte等，J.Clin.Invest.，1003093-3104(1997))。神經(jīng)絲蛋白在美國專利第5,948,634號、第5,948,888號和第5,830,670號中首先描述并且要求保護，所有這些專利都關于“Neural Thread Protein Gene Expression andDetection of Alzheimer’s Disease(神經(jīng)絲蛋白基因表達和早老性癡呆的檢測)”。
已經(jīng)鑒定出神經(jīng)絲蛋白的其它種類(～26kD、～21kD、～17kD和～15kD)，并且其與神經(jīng)外胚層腫瘤、星形細胞瘤和成膠質(zhì)細胞瘤以及由于低氧、局部缺血或腦梗塞引起的損傷相關(de la Monte等，J.Neuropathol.Exp.Neurol.，55(10)1038-50(1996)，de la Monte等，J.Neurol.Sci.，138(1-2)26-35(1996)；de la Monte等，J.Neurol.Sci.，135(2)118-25(1996)；de la Monte等，J.Clin.Invest.，100393-3104(1997)和de la Monte等，Alz.，Rep.，2327-332(1999))。
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本領域需要可用于與AD和唐氏綜合征相關治療和診斷的改進的NTP組合物以及用于與可用于以下疾病治療和診斷的其它種類的神經(jīng)絲蛋白有關的組合物神經(jīng)外胚層腫瘤、星形細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤和其它神經(jīng)變性性疾病以及由于低氧、局部缺血和腦梗塞引起的損傷。本發(fā)明滿足了這些要求。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及一個具有共有序列“HARLIL”及其同系物的NTP的新重復序列的家族。本發(fā)明所包括的Harlil肽包括但不限于“HARLIL”、“HARLCL”、“HHARLCL”、“HARL”、“MFARLIL”、“ARLIL”、“HARLIF”、“HHARLIF”及其同系物和結(jié)合配偶體。該組NTP肽和同源肽統(tǒng)稱為“Harlil肽”。
本發(fā)明基于這樣的意外發(fā)現(xiàn)所述Harlil肽具有以下獨特的結(jié)合特性
□它們具有與NTP結(jié)合的親和性，從而使其可用來作為捕獲NTP的結(jié)合配偶體從體液例如尿液、CSF或血液中純化NTP，檢測和測量體液例如尿液、CSF或血液中的NTP，用于AD和唐氏綜合征的藥物開發(fā)以及下文公開的其它主題；
□它們具有與多種免疫球蛋白結(jié)合的親和性，從而使其可用來純化免疫球蛋白、檢測和測量這樣的免疫球蛋白；
□它們具有與自身結(jié)合的親和性，從而使其可用來分離、分析測定和/或純化與其綴合的蛋白質(zhì)，在測定中用作NTP類似物以及下文公開的其它主題；且
□它們似乎在自動裝配和/或與NTP和其它蛋白質(zhì)相互作用中起作用，從而使其可用作治療靶。
本發(fā)明也包括針對所述Harlil肽序列的抗體以及這類抗體的功能性片段。所述抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。
本發(fā)明的再一方面涉及NTP蛋白上所述Harlil序列的結(jié)合配偶體。這樣的結(jié)合配偶體包括但不限于同源肽、有機肽模擬物、抗體或抗體部分以及共生同源物。
本發(fā)明包括對應于所述Harlil肽的核酸、含有至少一種編碼至少一種Harlil肽的核酸的載體以及用于繁殖這類載體的宿主細胞例如大腸桿菌(E.coli)或其它有用的細菌或酵母菌種。所述載體可用于例如治療性治療或制備Harlil肽的方法中。
本發(fā)明還公開了采用本領域已知的常規(guī)技術制備本發(fā)明Harlil肽、抗體和核酸的方法。
本發(fā)明的另一方面涉及包含一種或多種Harlil肽、Harlil肽模擬物和/或其結(jié)合配偶體的藥用組合物以及包含一種或多種編碼一種或多種Harlil肽的核酸的藥用組合物。所述藥用組合物可用于例如治療性治療AD、神經(jīng)外胚層腫瘤、星形細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤和其它神經(jīng)變性性疾病。
本發(fā)明包括Harlil肽、相應的核酸或Harlil模似物在AD、神經(jīng)外胚層腫瘤、星形細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤和其它神經(jīng)變性性疾病診斷中的應用。使用一種或多種Harlil肽的診斷試驗可以用來檢驗抗NTP或Harlil肽序列的抗體的存在，所述抗體可指示NTP的存在。雖然在所有人中都發(fā)現(xiàn)NTP，但在醫(yī)學診斷為患有AD的患者(即DSM4患者)中發(fā)現(xiàn)的NTP量升高。另一方面，診斷試驗可以使用可用來檢測NTP存在的、抗一種或多種Harlil肽序列的一種或多種抗體。NTP的數(shù)量與以下疾病的存在相關AD、神經(jīng)外胚層腫瘤、星形細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、其它神經(jīng)變性性疾病。最后，診斷試驗可以使用編碼一種或多種Harlil肽的一種或多種核酸。在這類核酸和生物樣品中的核酸之間的雜交指示NTP的存在。再者，NTP的數(shù)量與以下疾病的存在相關AD、神經(jīng)外胚層腫瘤、星形細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤和其它神經(jīng)變性性疾病。在這類診斷試驗中可以將本發(fā)明的Harlil肽、Harlil模擬物、抗體和核酸進行標記。
本發(fā)明的再一方面涉及用于實施本發(fā)明診斷方法的診斷試驗試劑盒。這樣的試驗試劑盒包含一種或多種Harlil肽、Harlil模擬物、抗體、Harlil結(jié)合配偶體和/或核酸以及合適的試劑。
本發(fā)明也包括采用Harlil肽或Harlil模擬物從溶液中純化NTP的方法。本發(fā)明包括應用這類方法的試劑盒。這樣的試劑盒包含至少一種Harlil肽、Harlil模擬物或它們的混合物以及合適的試劑。
本發(fā)明也包括采用本發(fā)明的Harlil肽純化抗體的方法和試劑盒。這樣的試劑盒包含本發(fā)明的Harlil肽以及合適的試劑。
本發(fā)明還涉及治療AD、神經(jīng)外胚層腫瘤、星形細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤或其它神經(jīng)變性性疾病的方法，所述方法包括給予需要治療的哺乳動物治療有效量的本發(fā)明的一種或多種Harlil肽、Harlil模擬物(不限于Harlil肽模擬物)、抗體和/或核酸。
上文的概述和下文詳細描述都是示例性的和說明性的，并且用來提供對要求保護的本發(fā)明的進一步解釋。根據(jù)下文的詳細描述，本發(fā)明的其它目的、優(yōu)勢和新的特征對于本領域技術人員而言是顯而易見的。
附圖簡述


圖1顯示完整的NTP序列和完整的NTP序列中Harlil序列的位置(de la Monte等，J.Neuropathol.Exp.Neurol.，551038-1050(1996))；
圖2顯示兔抗小鼠免疫球蛋白綴合物與Harlil肽(NTP-3)包被的微量滴定板結(jié)合的抑制隨競爭性NTP-3/RGG的濃度(x軸)而變(在實施例5中描述的數(shù)據(jù))；
圖3顯示采用基于Harlil肽的膜測定對107個生物樣品測定的結(jié)果(在實施例4中顯示的數(shù)據(jù))；
圖4顯示測定與NTP結(jié)合的抗體部分的測定結(jié)果(在實施例6中顯示的數(shù)據(jù))；
圖5比較對照尿樣和重組NTP在ELISA形式競爭性NTP測定中的線性關系(在實施例8中顯示的數(shù)據(jù))；
圖6顯示在ELISA形式中使用Harlil肽將AD診斷的樣品與年齡匹配的正常樣品區(qū)分開來的競爭性親和測定結(jié)果，證明在AD陽性患者中存在的閾值量(在實施例8中描述的數(shù)據(jù))。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及一種包含NTP的一個、被稱為“Harlil序列”的新重復序列的組合物。所述序列在NTP的氨基酸序列中出現(xiàn)四次
(a)45-51 THARLIL
(b)90-96 HHARLCL
(c)263-269 MFARLIL
(d)292-296 HHARLIF
參見圖1。
本發(fā)明包括具有(a)、(b)、(c)、(d)區(qū)中任一個的序列或這些序列的同系物(包括但不限于“HARLML”)的肽。所述Harlil肽也可以在接頭肽上的Harlil序列之前或之后具有額外的氨基酸殘基。所述額外的氨基酸殘基或接頭肽可以是在NTP序列中在所述Harlil序列之前和之后發(fā)現(xiàn)的那些序列。例如氨基酸殘基GITGMCT出現(xiàn)在殘基46之前，而氨基酸殘基YFFLV出現(xiàn)在NTP序列中的氨基酸50之后。因此，本發(fā)明所包括的Harlil肽包括NTP肽GITGMCTHARLILYFFLV。對于在(b)、(c)和(d)中敘述的Harlil肽而言，所述額外的氨基酸殘基是鄰接NTP序列中的Harlil序列的那些氨基酸殘基。然而，沒有證據(jù)表明所述側(cè)翼序列不是作為接頭起作用。具有額外的氨基酸殘基的Harlil肽的總長度最好不超過25個氨基酸殘基。
本發(fā)明范圍也包括所述Harlil肽的同系物和變異體。通常通過用一種氨基酸取代另一種氨基酸來改變肽序列。根據(jù)改變氨基酸的目的，所述氨基酸可以用相似氨基酸或同源氨基酸或不相似氨基酸取代。有多種將氨基酸分類為相似或同源的標準。(Gunnar von Heijne，Sequence Analysis in Molecular Biology.第123-39頁(Academic Press，New York，NY 1987)。
所述Harlil重復序列具有以下的獨特特征(1)它可以與NTP結(jié)合；(2)它可以與多種免疫球蛋白結(jié)合；和(3)它可以與自身結(jié)合。這些獨特的特征使得能夠進行和提出如下所述的各種診斷應用和治療應用。
A.組合物
本發(fā)明涉及NTP的Harlil肽，應用這類肽、肽模擬物、結(jié)合配偶體和/或同系物作為NTP的親和結(jié)合配偶體以測定或純化NTP，應用Harlil肽、肽模擬物及其同系物封閉NTP上的Harlil肽位點或者通過所述Harlil序列與NTP相互作用的物質(zhì)的應用。本發(fā)明也包括針對這類Harlil肽序列的抗體以及對應于所述Harlil肽及其同系物的核酸。
Harlil肽及其同系物可以采用常規(guī)肽合成技術來制備。Harlil肽的模擬物可以采用聯(lián)合化學技術來產(chǎn)生。
抗Harlil肽序列的單克隆抗體可以例如通過Kohler和Milstein，Nature，256495(1975)首先描述的雜交瘤方法或者通過重組DNA方法(參見例如美國專利第4,816,567號)來制備。多克隆抗體(即抗血清)可以例如通過用Harlil肽作為免疫原來免疫宿主動物例如兔或綿羊而制備。所述免疫通常包括用所述免疫原重復接種，通常以大約一周的間隔，至少接種兩次。這樣的接種產(chǎn)生針對所述免疫原的免疫應答并且使接種宿主的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對所述免疫原的抗體。通常大約在最后一次加強接種后3-10天收集來自所述免疫宿主的血清。可以通過硫酸銨沉淀、凝膠電泳、透析、色譜或其它方便的分離和純化技術，從所述血清中分離出免疫球蛋白。
對應于Harlil肽的核酸可以例如采用(a)標準重組方法、(b)合成技術或(c)它們的組合來制備。
B.Harlil肽的特性
1.與NTP結(jié)合
Harlil序列顯示與NTP的結(jié)合特異性。當將Harlil肽或其類似物固定化時，它可以用來從溶液中純化NTP。當用它來作為親和測定的部分捕獲NTP時，與NTP結(jié)合的特異性非常高并且在pH3.5至pH8時不受影響。該親和測定的靈敏度至少與免疫測定一樣高。例如通過ELISA測定含有約0.5ng/mL NTP的陽性尿混合液可以幾乎稀釋4倍，而仍可通過該親和測定與陰性混合液區(qū)分開來(這在下文實施例6中有更加詳述的描述)。此外，測定靈敏度可以通過應用一種更加靈敏的檢測手段例如通過應用熒光或化學發(fā)光底物或放射性標記分析加以改進。
因為本發(fā)明的Harlil肽與NTP特異性地結(jié)合，所以它們可以用于檢測生物樣品中NTP或抗NTP的抗體存在的診斷分析中。已經(jīng)顯示體液中NTP高于正常水平指示AD、唐氏綜合征或其它變性性腦部疾病的存在。
2.與免疫球蛋白結(jié)合
Harlil肽可與多種免疫球蛋白結(jié)合。所述肽結(jié)合似乎是通過所述抗體的Fc部分，而不是通過Fab部分。在生理pH下發(fā)生與免疫球蛋白的結(jié)合，盡管某些免疫球蛋白也在較低pH下結(jié)合。在較低pH下結(jié)合指示Harlil肽和某些抗體間的強親和性，并且消除所述結(jié)合是由于電荷/電荷相互作用而不是親和性所致的可能性。
因為Harlil肽與免疫球蛋白結(jié)合，所以它們可用于純化免疫球蛋白分子。Harlil單體對免疫球蛋白的親和性相當?shù)?，因此可以通過控制肽密度來控制Harlil綴合物的親和力。隨著Harlil肽密度的增加，對免疫球蛋白的親和性也增加。最好是使用低至中等親和柱，因為高親和柱需要苛刻的洗脫條件，該洗脫條件可以使蛋白質(zhì)和抗體變性，并且在寬稀釋峰下洗脫，因為洗脫產(chǎn)物被稀釋，所以這是不想要的(Wikstrm等，J.of Chromatography，59783-92(1999))。這樣的稀釋需要進一步濃縮被洗脫蛋白質(zhì)或抗體，從而導致蛋白質(zhì)或抗體產(chǎn)物的損失和/或損傷。
相比之下，低親和色譜例如可以與Harlil肽一起使用的低親和色譜具有使洗脫峰變窄的優(yōu)點，從而避免了苛刻的條件(出處同上)。這樣的純化方法由于提供可用于制藥和診斷應用的純化蛋白，對于純化治療性和診斷性抗體是有價值的。
可用于免疫球蛋白純化的現(xiàn)有已知肽類似物的序列比Harlil肽的序列長得多，并且所述類似物似乎需要模擬它們與免疫球蛋白相互作用所用的二級結(jié)構(gòu)(Fassina等，J.of Mol.Recognition，9564-569(1996)；Guerrier等，J.of Mol.Recognition，11107-109(1998)；Palombo等，J.ofMol.Recognition，11247-249(1998)；Braisted等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，935688-5692(1996)；Fassina等，J.of Mol.Recognition，11128-133(1998)；Palombo等，J.of Mol.Recognition，11243-246(1998)；Li等，Nat.Biotechnol.，16190-195(1998)和美國專利第5,084,559號；第5,100,788號；第6,013,763號。本發(fā)明相對短的Harlil肽對于生產(chǎn)和貯存而言容易得多且有經(jīng)濟效益。
本發(fā)明Harlil肽的再一應用涉及其在諸如ELISA和免疫色譜紙條的形式的診斷試驗中的應用。因為本發(fā)明的Harlil肽與免疫球蛋白結(jié)合，所以所述肽提供在免疫測定系統(tǒng)中用于捕獲、分離或錨定的抗抗體和A蛋白和G蛋白的有經(jīng)濟效益的捕獲(trap)材料代用品。目前在ELISA和免疫色譜紙條中使用的捕獲材料即抗抗體和A蛋白和G蛋白對于制備和保持而言是昂貴的。這正好與相對簡單地制備和有經(jīng)濟效益地貯存本發(fā)明的Harlil肽相反。
3.與自身結(jié)合
本發(fā)明的Harlil肽和類似物能夠與自身結(jié)合，因此當與蛋白質(zhì)綴合時，所述蛋白質(zhì)如果不在非常低pH或非常低稀釋度下保持的話將會自我聚集。所述載體蛋白在中性pH下可以自我聚集并且從溶液中沉淀出來。
另外，因為其獨特的自身結(jié)合特性，所以Harlil肽可以在測定中用作NTP類似物。這是因為所述Harlil肽復制了NTP的自身結(jié)合特性。在序貫測定或競爭性測定中，NTP將會與Harlil肽綴合物固相結(jié)合，并且在洗滌期間仍保持結(jié)合，在此期間它阻斷免疫球蛋白(例如兔IgG)的結(jié)合。所述Harlil肽也可以在夾心測定中用作捕獲抗體替代物。本發(fā)明的Harlil肽是比NTP蛋白便宜并且更有經(jīng)濟效益的測定材料。
Harlil肽的自我聚集特性可以具有治療應用。因為Harlil序列使與其綴合的蛋白質(zhì)相互結(jié)合，這表明通過這些序列NTP自我締合和/或與其它蛋白質(zhì)締合。這種締合可以是分子內(nèi)或分子間的。親和柱和微量滴定板結(jié)合游離NTP(如下文實施例中所述的)的能力表明，在天然NTP中所述Harlil序列可能是表面可及的。
有可能NTP的毒性全部或部分是由于高度相互作用性Harlil序列所致。因此，NTP的毒性可能是由于自我聚集所致，或它可能是由于高反應性Harlil序列與其它腦組分的相互作用所致。通過阻斷NTP的該序列，人們可以阻斷其可相互作用的能力。
顯然NTP參與神經(jīng)變性級聯(lián)。通過靶向NTP而中斷或改變級聯(lián)方向的能力提供了一個治療機會。例如，通過應用Harlil肽與NTP結(jié)合部位相互作用的能力，從而封閉NTP上潛在的反應部位進行治療性干涉是可行的。另一方面，本發(fā)明的Harlil肽和模擬物可用于使藥物靶向表達Harlil序列的細胞。
自身締合的肽已經(jīng)在生物材料中作為生物膠粘劑使用。因此，人們可以利用所述肽自身締合或自我識別的性質(zhì)，來誘導非締合的蛋白或肽締合，使多種部分錨定于表面，或者指導分子至靶部位。人們認識到，這樣的細胞粘附誘導肽可以用來設計合成組織和器官(Mayo，K.H.，TIBTECH，18-212-217(2000年5月)。也已經(jīng)顯示這樣的材料本身可用來構(gòu)建作為pH和結(jié)合敏感性的凝膠系統(tǒng)(出處同上)。另外，Harlil肽序列的聚合作用和/或多次重復可以提供具有結(jié)構(gòu)特征和較高親和力的組合物。
NTP序列中Harlil序列的重復表明，Harlil序列可能在NTP的裝配或聚合方面起作用。例如，在膠原蛋白中，在各條鏈上隨后形成吡啶啉鍵合的位點自我締合的區(qū)域也表現(xiàn)出高度同源性，表明這些自我鑒定同源區(qū)充當關鍵結(jié)構(gòu)并且有功能作用。可能所述“HARLIL”位點獨立地或在聚合物陣列中與其它腦蛋白相互作用并且對于NTP的功能性是關鍵性的。
如果NTP的過量產(chǎn)生引起AD和相關疾病-神經(jīng)變性性疾病病理，則可以用基于所述HARLIL模型的治療藥，抑制NTP蛋白的產(chǎn)生或折疊，和/或阻止NTP與其它組分的聚合或相互作用。例如，如果通過給予一種或多種Harlil肽或Harlil模擬物，NTP聚集、或折疊或裝配可以被抑制，則人們可以預期NTP的蛋白酶降解得到增強。因此人們可以通過給予一種或多種Harlil肽或Harlil模擬物達到除去過量的NTP。另一方面，Harlil肽或Harlil模似物治療藥可用來控制NTP單體或聚集物與神經(jīng)變性級聯(lián)其它組分的相互作用。
許多自我裝配或聚合的蛋白質(zhì)具有重復結(jié)構(gòu)。最了解的是帶有在每條鏈中重復多達6次的短重復序列gly X Y的膠原蛋白。(Lacy等，“Identification of FLRT1，F(xiàn)LRT2 and FLRT3a novel family oftransmembrane leucine rich repeat proteins(一個跨膜富亮氨酸重復蛋白的新家族—FLRT1、FLRT2和FLRT3的鑒定)，”Genomics，62(3)417-26(1999))。其它研究表明，特定的重復序列涉及結(jié)合的成核現(xiàn)象。(Snellman等，“A short Sequence in the N-terminal region is required for thetrimerization of type XIII collagen and is conserved in other collagenoustransmembrane proteins(XIII型膠原蛋白的三聚化需要N末端區(qū)的一個短序列并且所述短序列在其它膠原跨膜蛋白中是保守的)，”EABO J.，19(19)5051-59(2000))。還有研究表明，對于自我裝配關鍵性的膠原蛋白肽Pro Pro Gly，在原膠原蛋白與侶伴蛋白HSP7的相互作用中也是關鍵性的。(Koide等，“Conformational requirements of collagenouspeptides for recognition by the chaperone protein HSP47(侶伴蛋白HSP7識別對膠原蛋白肽的構(gòu)象需求)，”Biol.Chem.，275(36)27957-27963(2000))。對層粘連蛋白中自我識別的特異性進行了研究。(Schittny，J.C.，“Affinity Retardation ChromatographyCharaterization of the Method andIts Application(親和滯留色譜方法的表征及其應用)，”Anal.Biochem.，222140-148(1994))。
因此，有證據(jù)表明，聚合或形成原纖維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)一般通過蛋白質(zhì)上識別自身的特定結(jié)構(gòu)域(自我識別)的特定結(jié)構(gòu)域自我裝配而做到這一點。再者，這些蛋白可以利用這些相同的識別位點與其它蛋白相互作用。如同A蛋白與Fc相互作用一樣(Deisenhofer，J.，“Crystallographic Refmement and Atomic Models of a Human Fc Fragmentand Its complex with Fragment B of Protein A from Staphylococcus aureusat2.9-and 2.8-A Resolution(人Fc片段及其與來自金黃色葡萄球菌的A蛋白B片段的復合物在2.9-A和2.8-A分辨率下的晶體學精修和原子模型)，”Biochem.，20(9)2361-2370(1981))，這些相互作用同Harlil序列的相互作用一樣，似乎是通過疏水作用和離子相互作用。
就NTP而論，似乎表明，在自我裝配中最有可能起作用的Harlil結(jié)構(gòu)域是高度同源的，并且事實上，幾乎是完全保守的?！傲涟彼崂湣崩米晕易R別，其中富亮氨酸序列段結(jié)合在一起。然而，亮氨酸拉鏈不如Harlil序列獨特。設想Harlil序列在自我裝配以及NTP與其它腦組分的相互作用中起關鍵作用。
朊病毒和用朊病毒組分在酵母中的實驗提供這樣的證據(jù)，蛋白質(zhì)可以呈現(xiàn)自我聚集構(gòu)象。(Serio等，“Nucleated ConformationalConversion and the Replication of Conformational Information by a PrionDeterminant(由朊病毒決定簇引起的構(gòu)象信息的成核構(gòu)象轉(zhuǎn)換和復制)，”Science，2891317-21(2000)；和Sparrer H.E.，“Evidence for thePrion HypothesisInduction of the Yeast(PSI+)Factor by in vitro-Converted Sup35 protein(朊病毒假說的證據(jù)體外轉(zhuǎn)換的Sup35蛋白可誘導酵母(PSI+)因子)，”Science，289(5479)595-599(2000))。
Li和Lindquist已經(jīng)說明，他們可以通過含有肽序列22-69的SUP蛋白的遺傳融合部分給無關蛋白賦予SUP朊病毒活性。因此，他們證明，賦予SUP35蛋白特征的朊病毒位于SUP 22-69肽中。同樣，本發(fā)明涉及引起聚集的自我鑒定的肽。通過在蛋白上移植所述序列(通過綴合)，可以給該蛋白質(zhì)賦予自我聚集結(jié)果，觀察到高達95％的Harlil蛋白綴合物在生理pH下立即沉淀。
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給出以下實施例用以說明本發(fā)明。然而，應當理解，本發(fā)明并不限于這些實施例中描述的具體條件或細節(jié)。在整個說明書中，包括美國專利在內(nèi)的公眾可得到的文獻的任何和所有參考文獻都通過引用結(jié)合到本文中。
實施例1
本實施例的目的是鑒定神經(jīng)絲蛋白的若干Harlil序列并且測定其與NTP的反應性。
合成以下Harlil序列(Synpep，Dublin CA)，將其與馬來酰亞胺活化兔IgG(Jackson Immunoresearch，West Grove PA)綴合，評價它們的NTP免疫反應性。加入一個接頭，該接頭為在NTP的90-96HHARLCL序列之前和之后出現(xiàn)的蛋白質(zhì)序列重復。
1.(NTP-1)LHARLCLANFCGRNRV
2.(NTP-2) LARLCLANFCGNNNV
3.(NTP-3) CARYRTGHHARLM
4.(NTP-4)HHARLPLANFCG
5.(NTP-5) RTGHHARLC*LANFC
6.(NTP-6)CESARYRTGHHARLC*
7.(NTP-7) DNTHHARLIL
8.(NTP-8)SHHARLIL
*用乙酰氨基甲基(Acetamido Methyl)(C3H6NO)封閉。
與載體蛋白綴合是通過一個半胱氨酸。因此，肽NTP-1和NTP-2產(chǎn)生混合綴合物的結(jié)果是因為存在不止一個半胱氨酸殘基。因此，對于肽NTP-5和NTP-6而言，將第二個半胱氨酸用ACM封閉。
所述NTP序列中所鑒定的序列位置示于圖1中。盡管所有的Harlil類似物都顯示一定的反應性，但是選擇NTP-3供大多數(shù)研究用，是因為它提供良好反應性，同時由于它具有一個半胱氨酸殘基，而便于操作。
如上所述，本發(fā)明范圍也包括Harlil肽的同系物和變異體。為了構(gòu)建本實施例的同源肽，使用同源氨基酸。所用的取代標準是電荷和/或大小。因此，在NTP肽3中選擇用甲硫氨酸取代半胱氨酸是基于在這兩個氨基酸之間的總體相似性以及從該關鍵性氨基酸序列段中除去一個反應性半胱氨酸的需要。選擇用脯氨酸取代半胱氨酸是試圖觀察當它在所述蛋白質(zhì)中而所述半胱氨酸在二硫鍵中時這是否可以模擬所述肽的構(gòu)象形式。
本領域技術人員已知影響或研究親和性相互作用的其它變化包括但不限于例如用其它疏水性氨基酸例如異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸或甘氨酸替換亮氨酸；替換酸性氨基酸或堿性氨基酸；用苯丙氨酸替換組氨酸以測定電荷與空間的效應；用天冬氨酸替換天冬酰胺或者用谷氨酸替換谷氨酰胺，以評估電荷與空間的效應；以及用蘇氨酸替換絲氨酸、用半胱氨酸替換蘇氨酸、用谷氨酸替換天冬氨酸、用賴氨酸或組氨酸替換精氨酸以及用色氨酸或苯丙氨酸替換酪氨酸。
似乎沒有理由表明需要NTP的側(cè)翼序列，除非作為間隔序列，因為只有Harlil肽序列有活性。給所述側(cè)翼序列引入改變使所述肽的堿性或疏水性降低。
實施例2
本實施例的目的是證明可應用NTP-3作為親和配體來親和純化NTP。在該方法中，在親和柱上從得自AD患者的尿樣中純化NTP。供試驗用的含NTP尿樣的制備所用的NTP生物來源是診斷患有AD的患者(BOU1)的尿液。在加樣至柱材料之前，按照以下尿液加工方案處理所述生物樣品以供AD試驗用
1.尿液用Ames MultistixTM(Bayer，Indiana)檢驗。如果樣品有以下任一種情況則將其棄去(a)細菌污染陽性；(b)病理性高水平的蛋白例如與腎病相關的蛋白(該試驗不排除對缺乏病理水平的蛋白的NTP陽性的樣品)、酮、血液、尿膽素原、亞硝酸鹽、白細胞陽性；(c)pH高于7.5或低于4.5；或(d)比重高于1.025。
2.將尿液以3000xg離心15分鐘，以除去細胞碎片。
3.用注射器使尿液通過0.22μm醋酸纖維素濾膜過濾，使濾液含有0.05％疊氮化物。
4.將所得的等份樣品置于Amicon CentriconYM-10 Millipore的頂部儲存器中，以3000xg離心1小時。
5.從離心機中取出樣品，此時該樣品約為原始體積的25％用1.5mL Tris緩沖鹽溶液(TBS)使其恢復至原始體積。
6.重復步驟4和5，將樣品以3000xg再離心30分鐘，然后從離心機中取出樣品，向樣品中加入1.5mL TBS。
7.然后將樣品以3000xg離心30分鐘，然后從離心機中取出樣品，此時樣品為原始體積的四分之一。
8.然后將樣品轉(zhuǎn)移至硼硅酸鹽玻璃小瓶中并于-20℃冷藏。柱子的制備按照生產(chǎn)商的說明，將NTP-3與溴化氰活化的瓊脂糖(Sigma，St.Louis，MO)綴合。一旦制成，則將柱材料在含有0.01％疊氮化物的25mM TRIS緩沖鹽溶液(TBS)pH7中貯存。色譜法將11mL親和柱材料與25mL尿樣(如上所述處理以獲得4倍濃縮樣品的TBS(pH7)溶液)和25mL 0.025M甘氨酸緩沖液(PH3.5)一起溫育1小時。收集未吸附的材料(流通液)。然后柱子用5倍體積的1x TBS(pH7)洗滌，在11mL 0.1M甘氨酸(pH2)中洗脫。洗脫后，立即將洗出液用NaOH調(diào)至pH7，然后如實施例1所述采用AmiconCentriconYM-10(Millipore，Beverly MA)濃縮至1mL。分析親和柱洗出液中存在的NTP活性采用檢驗尿液中神經(jīng)元絲蛋白的7C GoldTM Stirps，測定親和測定活性(Nymox Pharmaceutical Corp.，Maywood NJ.參見例如Fitzpatrick等，Alzheimer′s Reports，3(3)155-159(2000))。用7C GoldTM紙條測定的所有活性位于pH2洗出液流分中。蛋白質(zhì)濃度通過考馬斯藍染色(BioRad，Hercules，CA)測定，洗出液中的蛋白質(zhì)濃度為108μg。這大約是起始蛋白質(zhì)濃度的3％。用Bicinchoninic Acid kit(Cat.M 23223，BioRad)測定，蛋白質(zhì)濃度為145μg。緩沖液校正的280nm的吸光度為390，表明有390μg蛋白質(zhì)。用吸光度測量獲得的較大蛋白質(zhì)量可能是在NTP中存在大量的芳族氨基酸的結(jié)果，采用這種測量技術可以引起對蛋白質(zhì)的過高估計。通過凝膠電液分析來自親和柱洗出液的NTP蛋白將1μg洗出物(大約110-145ng)在12.5％十二烷基硫酸鈉(SDS)微型凝膠(AmershamPharmacia Biotech，Sweden)上電泳，然后用銀染色。大約在29kD、33kD、40-45kD和60kD處觀測到條帶。在20-35kD、35-45kD和45-65kD處將凝膠切成條狀，置于100μlTBS中，讓其針對TBS透析過夜。然后如實施例1所述采用Amicon CentriconYM-10濃縮條帶洗出液，采用7C GoldTM Assay測定活性。
在35-45kD條帶中，大約在41kD觀測到NTP反應性。其它條帶沒有觀測到活性。NTP的報道分子量為41kD。因此，數(shù)據(jù)表明，與親和柱結(jié)合的NTP-3選擇性地結(jié)合AD患者尿樣中存在的NTP蛋白。
該實施例證明，Harlil肽NTP-3與NTP特異性結(jié)合，并且可應用Harlil肽例如NTP-3作為用于親和純化NTP的親和配體。
實施例3
本實施例的目的是說明Harlil肽的自我聚集能力。Harlil肽NTP-3在中性pH下形成二硫鍵(因為半胱氨酸殘基)且二聚化。由于二聚化肽可以結(jié)合二個免疫球蛋白，所以它可以引起沉淀。使用兔免疫球蛋白證實了Harlil肽的這一特性。
在pH7下加入1mg Harlil肽NTP-3的1ml二甲基亞砜(DMSO)溶液至3.4mg兔IgG(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)。讓混合物透析過夜，第二天早晨觀察到明顯的白色沉淀。通過離心除去沉淀，采用Perkin Elmerλ3B型分光光度計，根據(jù)280nm的吸光度測定上清液的蛋白質(zhì)濃度。結(jié)果示于表1中。在低pH例如pH為3.5或3.5以下可防止免疫球蛋白的沉淀。
*兔IgG
該實施例證明所用的Harlil肽具有分離和/或純化免疫球蛋白的能力。
實施例4
本實施例說明Harlil肽在檢測和定量NTP存在中的實用性。基于膜的測定7C GoldTM測定由5mm×45mm紙條構(gòu)成，有2個捕獲帶和1個的樣品接受區(qū)位于所述紙條上。第1和第2捕獲帶分別與樣品接受區(qū)相距16mm和24mm。每個捕獲帶約深4cm。
P22-1
7C金紙條
第2捕獲帶
第1捕獲帶
裝有標記金微粒的容器
標記金微粒遷移至第1或第2捕獲帶。第1和第2捕獲帶中的標記金比率與樣品中存在的NTP量相關。參見Fitzpatrick等的美國專利第6,121,008號。NTP-3綴合物的制備3.8mg/mL濃度的馬來酰亞胺活化兔免疫球蛋白(RGG)(Pierce，Rockford，IL))用1 M檸檬酸使pH為3.5。然后向RGG中加入30倍摩爾濃度過量的Harlil肽NTP-3的DMSO溶液。監(jiān)測NTP-3/RGG綴合物的pH，讓其在緩慢攪拌下于室溫反應過夜。然后將綴合物針對0.5mM檸檬酸磷酸緩沖液(pH3.5)充分透析。7C GoldTM紙條測定物的制備將經(jīng)透析的、與RGG綴合的NTP-3在0.5mM檸檬酸磷酸緩沖液(pH3.5)中稀釋至1mg/mL。靜置過夜后，使用XY3000TM Biodot(IrVine.CA)，將6μl/cm綴合物包被在膜(Loprodyne 3，Pall，East Hills，NY)上第1捕獲帶中。接下來，將0.5mg/mL山羊抗小鼠免疫球蛋白(DAKO#20109，Denmark)包被在膜上NTP-3/RGG綴合物之上1cm的第2捕獲帶中(采用與NTP-3/RGG包被相同的參數(shù))。將所述膜或7C GoldTM紙條加熱風干30分鐘，切成5mm的紙條，干燥下貯存。該捕獲帶在NTP不存在時將結(jié)合抗NTP抗體包被的金。7C GoldTM測定使用抗NTP抗體N314(de la Monte等，J.of Neuropath.Exp.Neurol.551038-1050(1996))。該測定的基礎是NTP被金上的N314抗NTP抗體螯合并運輸至NTP-3捕獲帶，在此NTP受到競爭而離開N314并且與第1捕獲帶結(jié)合，在這種情況下，NTP阻斷金上的抗體與第1捕獲帶結(jié)合，結(jié)果，金遷移至第2捕獲帶。因此，在NTP存在時，更多的金遷移至第2捕獲帶。膠體金膠體金如Colloidal Gold，M.A.Hayat編著(Academic PressLimited，London(1991))中所述的方法制備，然后用20μg/mL濃度的純化N314抗NTP抗體包被。然將抗體包被的膠體金在冷凍保護緩沖液(Serex Inc.，Maywood，NJ)中稀釋并凍干。使用Virtus(Gardiner，NY)600SL & 12SL型凍干機，在2mL硼硅酸鹽管形瓶(Wheaton #223683；Millville，NJ)中將足以用于一個紙條的量凍干。
患者樣品如實施例2中所述，將107個患者樣品加工并濃縮。7C GoldTM測定將50μl每種經(jīng)加工和濃縮的患者樣品加入至NTP-抗體包被的凍干金中。將混合物在室溫下溫育15分鐘，然后將7CGoldTM紙條置于所述管形瓶中，直到紙條頂部出現(xiàn)綠色線指示測定完成。取出紙條，讓其干燥。
結(jié)果總結(jié)在NTP不存在時，大多數(shù)NTP抗體包被的金與Harlil肽NTP-3捕獲帶結(jié)合。NTP Harlil肽固相微量滴定板以非常低的親和力結(jié)合小鼠抗體，而當其在金上為聚集狀態(tài)時，N314單克隆抗體與所述捕獲帶結(jié)合。然后，采用光密度計(Gretag D19C，Switzerland)讀出條帶1和2中的顏色強度。計算比值，該比值等于第1捕獲帶反射率除以第1捕獲帶反射率加上第2捕獲帶反射率之和，將樣品比值除以指標或截止樣品的比值。該數(shù)值被稱為指標值。圖3中圖示的測定結(jié)果顯示正常樣品與AD樣品非常好地分開。
實施例5
本實施例的目的是說明NTP與Harlil肽包被的微量滴定板的結(jié)合可以被未綴合的Harlil肽抑制。
微量滴定板的制備將如實施例4中制備的、30∶1比率的Harlil肽/免疫球蛋白復合物NTP-3-RGG以0.5μg/孔的濃度包被在Immulon4微量滴定板(Dynex，Chantilly，VA)上。
標準品重組NTP的TBS(在de la Monte等，J.of Neuropath.Exp.Neurol.，551038-1050(1996)中有描述)，0.01％疊氮化物(Nymox Pharm.Corp.，Lot4-7-98)在TBS中連續(xù)稀釋。將100μl每種稀釋液在pH3.5下溫育1小時。然后將各個稀釋液在TBS、0.1％白蛋白和0.05％Tween80中洗滌15分鐘。接著在TBS和0.05％Tween80中洗滌3次。
微量滴定板測定然后加入100μl 1∶8000稀釋度的過氧化物酶綴合的兔IgG(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)，讓其反應30分鐘。微量滴定板用TBS和0.05％Tween 80洗滌2次，然后加入150μl四甲基苯(TMB)(Serex Inc.，Maywood，NJ)。然后將混合物溫育10分鐘，用50μl 2N HCl終止。在SLT340ATTC分光光度計上讀出吸光度。
采用該系統(tǒng)，顯示單體NTP-3抑制綴合物與板的結(jié)合。參見圖2。
實施例6
本實施例的目的是證明抗體與Harlil肽包被的微量滴定板特異性地結(jié)合并且檢驗抗體的哪個部分(Fc或Fab)正與Harlil包被的板結(jié)合。被測抗體以下抗體得自Jackson Immunoresearch(West Grove，PA)(1)堿性磷酸酶(AP)標記的親和純化兔IgG抗小鼠抗體；(2)AP標記的親和純化兔IgG抗小鼠(Fab2)；和(3)AP標記的親和純化兔IgG抗雞。
用兔IgG抗雞(抗體(3))來消除兔抗小鼠(抗體(2))識別NTP-3/RGG綴合物中的RGG的可能性?？贵w(2)與抗體(1)相同，只是抗體(2)缺少IgG的Fc部分。
測定方式如實施例5中所述。加入非免疫純化兔、雞和小鼠IgG至1mg/mL(參見圖4)。對照為1mg/mL BSA(牛血清白蛋白)、α-糖蛋白、AD陽性和陰性對照尿液以及80、40、20、10和5單位的重組NTP。兔IgG和雞IgG均以劑量依賴性方式競爭置換下AP綴合物。參見圖4。Fab2不與該板結(jié)合。
結(jié)果總結(jié)兩種全分子—兔抗小鼠和兔抗雞均與用NTP-3/兔IgG包被的微量滴定板結(jié)合。Fab標記的抗體不表現(xiàn)出任何結(jié)合(結(jié)果未顯示)。這些結(jié)果表明，Harlil肽抗體的結(jié)合通過抗體Fc區(qū)的識別來實現(xiàn)。
Harlil肽對不同種類的IgG的親和力有所變化。例如，小鼠單克隆抗體表現(xiàn)出對NTP-3綴合物的親和力比對兔IgG的親和力低得多。參見Fig4。
實施例7
本實施例的目的是確定NTP是否識別G蛋白中識別抗體Fc部分的序列。
G蛋白通過Fc區(qū)結(jié)合抗體。由于該實施例的結(jié)果表明，Harlil肽也結(jié)合免疫球蛋白的Fc部分，而不結(jié)合Fab部分，因此測定NTP是否識別G蛋白中識別抗體Fc部分的序列。具體地說，由于Harlil肽識別Harlil肽、Harlil肽識別抗體的Fc區(qū)以及G蛋白識別抗體的Fc區(qū)，因此該實驗確定G蛋白是否識別NTP。
NTP陽性樣品和NTP陰性樣品均可通過G蛋白柱。NTP并未顯著減少。這些結(jié)果支持這樣的結(jié)論G蛋白不與NTP結(jié)合。
通過Fc區(qū)的結(jié)合可能具有治療應用，因為在免疫系統(tǒng)中Fc區(qū)用來識別受體。
實施例8
本實施例的目的是證明在微量滴定板測定形式中使用Harlil肽的競爭性親和測定。
微量滴定板的制備將如實施例4中制備的、30∶1比率的Harlil肽/免疫球蛋白復合物NTP-3/RGG以20μg/孔的濃度包被在ImmulonII微量滴定板(Dynex，Chantilly， VA)上。
樣品的制備如實施例2中所述制備30個尿樣供試驗用。由于抗體Fc在該測定中可能有干擾，因此將樣品在100 K Amicon Centricon(Millipore Inc.，Beverly MA)中離心，以除去任一抗體，然后對濾液進行測試。(為了防止診斷試驗中的假陽性，消除Harlil肽結(jié)合非NTP抗體的能力。例如，免疫球蛋白水平高于100μg/mL的樣品在測定前必須使免疫球蛋白水平降至低于100μg/mL)。
對照使從未診斷出任何神經(jīng)變性性疾病的個體的尿液制備的尿混合液通過如實施例2中所述制備的親和柱。所得的尿混合液被稱為“經(jīng)吸附的(stripped)”尿。
然后用經(jīng)吸附的尿通過適當稀釋的高濃度混合液(high pool)制備中等范圍對照。從在NTP測定中測試為陽性的、診斷患有AD的患者的一批樣品中制備高濃度混合液(參見實施例4)。
標準品將重組NTP(Nymox Pharmaceutical Corp，Montreal Canada)在TBS中稀釋，以形成標準品。標準品指定的單位值為40、20、10和0。因為有證據(jù)表明尿液中的NTP可被部分降解，所以NTP量以重組NTP單位表示，而不以重量表示。圖5比較對照尿樣和重組NTP在微量滴定形式競爭性NTP測定中的線性關系。
測定在所述測定中如下測試患者樣品向板的各孔中加入50μl1∶5000稀釋度的過氧化物酶綴合的兔IgG(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)和50μl樣品或標準品。將板在室溫下溫育1小時，然后在TBS、0.1％白蛋白和0.05％Tween80中洗滌3次。向各孔中加入100μl PNPP(磷酸對硝基苯酯)(Moss，Pasadena，MD)。先于30分鐘時，此后以15分鐘的間隔，在BioRad Reader上讀出405nm的OD，直至TBS標準品的OD在2-2.5之間。圖6所示的結(jié)果表明，雖然NTP存在于所有樣品中，但在AD陽性患者中存在的量升高。可以采用年齡匹配的對照容易地測定出這一升高的量。因此，測定生物樣品中NTP量的診斷試驗可以用來以高準確度診斷AD或其它神經(jīng)變性性疾病。
對于本領域技術人員顯而易見的是，在不偏離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，可以對本發(fā)明的方法和組合物進行各種修改和變化。因此，本發(fā)明包括本發(fā)明的所述修改和變化，條件是它們在所附權(quán)利要求書及其等同方案的范圍內(nèi)。
序列表
<110>尼莫克斯藥品公司(NYMOX PHARMACEUTICALS CORPORATION)
<120>神經(jīng)絲蛋白的優(yōu)選區(qū)段及其使用方法
<130>018792/0195
<140>PCT/US01/42813
<141>2001-10-25
<150>09/697,590
<151>2000-10-27
<160>12
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>1442
<212>DNA
<213>未知生物體
<220>
<223>未知生物體的描述NTP DNA序列
<220>
<221>CDS
<222>(15)..(1139)
<400>1
tttttttttt tgag atg gag ttt tcg ctc ttg ttg ccc agg ctg gag tgc 50
Met Glu Phe Ser Leu Leu Leu Pro Arg Leu Glu Cys
1 5 10
aat ggc gca atc tca gct cac cgc aac ctc cgc ctc ccg ggt tca agc 98
Asn Gly Ala Ile Ser Ala His Arg Asn Leu Arg Leu Pro Gly Ser Ser
15 20 25
gat tct cct gcc tca gcc tcc cca gta gct ggg att aca ggc atg tgc 146
Asp Ser Pro Ala Ser Ala Ser Pro Val Ala Gly Ile Thr Gly Met Cys
30 35 40
acc cac gct cgg cta att ttg tat ttt ttt tta gta gag atg gag ttt 194
Thr His Ala Arg Leu Ile Leu Tyr Phe Phe Leu Val Glu Met Glu Phe
45 50 55 60ctc cat gtt ggt cag gct ggt ctc gaa ctc ccg acc tca gat gat ccc 242Leu His Val Gly Gln Ala Gly Leu Glu Leu Pro Thr Ser Asp Asp Pro
65 70 75tcc gtc tcg gcc tcc caa agt gct aga tac agg act ggc cac cat gcc 290Ser Val Ser Ala Ser Gln Ser Ala Arg Tyr Arg Thr Gly His His Ala
80 85 90cgg ctc tgc ctg gct aat ttt tgt ggt aga aac agg gtt tca ctg atg 338Arg Leu Cys Leu Ala Asn Phe Cys Gly Arg Asn Arg Val Ser Leu Met
95 100 105tgc cca agc tgg tct cct gag ctc aag cag tcc acc tgc ctc agc ctc 386Cys Pro Ser Trp Ser Pro Glu Leu Lys Gln Ser Thr Cys Leu Ser Leu
110 115 120cca aag tgc tgg gat tac agg cgt gca gcc gtg cct ggc ctt ttt att 434Pro Lys Cys Trp Asp Tyr Arg Arg Ala Ala Val Pro Gly Leu Phe Ile125 130 135 140tta ttt ttt tta aga cae agg tgt ccc act ctt acc cag gat gaa gtg 482Leu Phe Phe Leu Arg His Arg Cys Pro Thr Leu Thr Gln Asp Glu Val
145 150 155cag tgg tgt gat cac agc tca ctg cag cct tca act cct gag atc aag 530Gln Trp Cys Asp His Ser Ser Leu Gln Pro Ser Thr Pro Glu Ile Lys
160 165 170cat cct cct gcc tca gcc tcc caa gta gct ggg acc aaa gac atg cac 578His Pro Pro Ala Ser Ala Ser Gln Val Ala Gly Thr Lys Asp Met His
175 180 185cac tac acc tgg cta att ttt att ttt att ttt aat ttt ttg aga cag 626His Tyr Thr Trp Leu Ile Phe Ile Phe Ile Phe Asn Phe Leu Arg Gln
190 195 200agt ctc aac tct gtc acc cag gct gga gtg cag tgg cgc aat ctt ggc 674Ser Leu Asn Ser Val Thr Gln Ala Gly Val Gln Trp Arg Asn Leu Gly205 210 215 220tca ctg caa cct ctg cct ccc ggg ttc aag tta ttc tcc tgc ccc agc 722Ser Leu Gln Pro Leu Pro Pro Gly Phe Lys Leu Phe Ser Cys Pro Ser
225 230 235ctc ctg agt agc tgg gac tac agg cgc cca cca cgc cta gct aat ttt 770Leu Leu Ser Ser Trp Asp Tyr Arg Arg Pro Pro Arg Leu Ala Asn Phe
240 245 250
ttt gta ttt tta gta gag atg ggg ttc acc atg ttc gcc agg ttg atc 818
Phe Val Phe Leu Val Glu Met Gly Phe Thr Met Phe Ala Arg Leu Ile
255 260 265
ttg atc tct gga cct tgt gat ctg cct gcc tcg gcc tcc caa agt gct 866
Leu Ile Ser Gly Pro Cys Asp Leu Pro Ala Ser Ala Ser Gln Ser Ala
270 275 280
ggg att aca ggc gtg agc cac cac gcc cgg ctt att ttt aat ttt tgt 914
Gly Ile Thr Gly Val Ser His His Ala Arg Leu Ile Phe Asn Phe Cys
285 290 295 300
ttg ttt gaa atg gaa tct cac tct gtt acc cag gct gga gtg caa tgg 962
Leu Phe Glu Met Glu Ser His Ser Val Thr Gln Ala Gly Val Gln Trp
305 310 315
cca aat ctc ggc tca ctg caa cct ctg cct ccc ggg ctc aag cga ttc 1010
Pro Asn Leu Gly Ser Leu Gln Pro Leu Pro Pro Gly Leu Lys Arg Phe
320 325 330
tcc tgt ctc agc ctc cca agc agc tgg gat tac ggg cac ctg cca cca 1058
Ser Cys Leu Ser Leu Pro Ser Ser Trp Asp Tyr Gly His Leu Pro Pro
335 340 345
cac ccc gct aat ttt tgt att ttc att aga ggc ggg gtt tca cca tat 1106
His Pro Ala Asn Phe Cys Ile Phe Ile Arg Gly Gly Val Ser Pro Tyr
350 355 360
ttg tca ggc tgg tct caa act cct gac ctc agg tgacccacct gcctcagcct 1159
Leu Ser Gly Trp Ser Gln Thr Pro Asp Leu Arg
365 370 375
tccaaagtgc tgggattaca ggcgtgagcc acctcaccca gccggctaat ttagataaaa 1219
aaatatgtag caatgggggg tcttgctatg ttgcccaggc tggtctcaaa cttctggctt 1279
catgcaatcc ttccaaatga gccacaacac ccagccagtc acatttttta aacagttaca 1339
tctttatttt agtatactag aaagtaatac aataaacatg tcaaacctgc aaattcagta 1399
gtaacagagt tcttttataa cttttaaaca aagctttaga gca 1442
<210>2
<211>375
<212>PRT
<213>未知生物體
<220>
<223>未知生物體的描述NTP氨基酸序列
<400>2
Met Glu Phe Ser Leu Leu Leu Pro Arg Leu Glu Cys Asn Gly Ala Ile
1 5 10 15
Ser Ala His Arg Asn Leu Arg Leu Pro Gly Ser Ser Asp Ser Pro Ala
20 25 30
Ser Ala Ser Pro Val Ala Gly Ile Thr Gly Met Cys Thr His Ala Arg
35 40 45
Leu Ile Leu Tyr Phe Phe Leu Val Glu Met Glu Phe Leu His Val Gly
50 55 60
Gln Ala Gly Leu Glu Leu Pro Thr Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Ala
65 70 75 80
Ser Gln Ser Ala Arg Tyr Arg Thr Gly His His Ala Arg Leu Cys Leu
85 90 95
Ala Asn Phe Cys Gly Arg Asn Arg Val Ser Leu Met Cys Pro Ser Trp
100 105 110
Ser Pro Glu Leu Lys Gln Ser Thr Cys Leu Ser Leu Pro Lys Cys Trp
115 120 125
Asp Tyr Arg Arg Ala Ala Val Pro Gly Leu Phe Ile Leu Phe Phe Leu
130 135 140
Arg His Arg Cys Pro Thr Leu Thr Gln Asp Glu Val Gln Trp Cys Asp
145 150 155 160
His Ser Ser Leu Gln Pro Ser Thr Pro Glu Ile Lys His Pro Pro Ala
165 170 175
Ser Ala Ser Gln Val Ala Gly Thr Lys Asp Met His His Tyr Thr Trp
180 185 190
Leu Ile Phe Ile Phe Ile Phe Asn Phe Leu Arg Gln Ser Leu Asn Ser
195 200 205
Val Thr Gln Ala Gly Val Gln Trp Arg Asn Leu Gly Ser Leu Gln Pro
210 215 220
Leu Pro Pro Gly Phe Lys Leu Phe Ser Cys Pro Ser Leu Leu Ser Ser
225 230 235 240
Trp Asp Tyr Arg Arg Pro Pro Arg Leu Ala Asn Phe Phe Val Phe Leu
245 250 255
Val Glu Met Gly Phe Thr Met Phe Ala Arg Leu Ile Leu Ile Ser Gly
260 265 270
Pro Cys Asp Leu Pro Ala Ser Ala Ser Gln Ser Ala Gly Ile Thr Gly
275 280 285
Val Ser His His Ala Arg Leu Ile Phe Asn Phe Cys Leu Phe Glu Met
290 295 300
Glu Ser His Ser Val Thr Gln Ala Gly Val Gln Trp Pro Asn Leu Gly
305 310 315 320
Ser Leu Gln Pro Leu Pro Pro Gly Leu Lys Arg Phe Ser Cys Leu Ser
325 330 335
Leu Pro Ser Ser Trp Asp Tyr Gly His Leu Pro Pro His Pro Ala Asn
340 345 350
Phe Cys Ile Phe Ile Arg Gly Gly Val Ser Pro Tyr Leu Ser Gly Trp
355 360 365
Ser Gln Thr Pro Asp Leu Arg
370 375
<210>3
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>3
His Ala Arg Leu Met Leu
1 5
<210>4
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成NTP-1肽
<400>4
Leu His Ala Arg Leu Cys Leu Ala Asn Phe Cys Gly Arg Asn Arg Val
1 5 10 15
<210>5
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成NTP-2肽
<400>5
Leu Ala Arg Leu Cys Leu Ala Asn Phe Cys Gly Asn Asn Asn Val
1 5 10 15
<210>6
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成NTP-3肽
<400>6
Cys Ala Arg Tyr Arg Thr Gly His His Ala Arg Leu Met
1 5 10
<210>7
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成NTP-4肽
<400>7
His His Ala Arg Leu Pro Leu Ala Asn Phe Cys Gly
1 5 10
<210>8
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成NTP-5肽
<400>8
Arg Thr Gly His His Ala Arg Leu Cys Leu Ala Asn Phe Cys
1 5 10
<210>9
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成NTP-6肽
<400>9
Cys Glu Ser Ala Arg Tyr Arg Thr Gly His His Ala Arg Leu Cys
1 5 10 15
<210>10
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成NTP-7肽
<400>10
Asp Asn Thr His His Ala Arg Leu Ile Leu
1 5 10
<210>11
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成NTP-8肽
<400>11
Ser His His Ala Arg Leu Ile Leu
1 5
<210>12
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>12
Ala Arg Cys Leu
權(quán)利要求
1.一種具有選自以下的一種氨基酸序列的肽
(a)HHARL；
(b)HARL；
(c)HARLI；
(d)HARLIL；
(e)HHARLCL；
(f)ARLIL；
(g)HHARLIF；
(h)THARLIL；
(i)ARLI；
(j)ARL；
(k)HARLCL；
(l)ARLCL；
(m)ARCL；
(n)MFARLIL；
(o)FARLIL；
(p)FARLI；
(q)FARL；
(r)HARLIF；
(s)ARLIF；和它們的同系物。
2.一種組合物，所述組合物包含一種或多種權(quán)利要求1的肽及其載體。
3.一種具有選自以下的一種氨基酸序列的肽
(a)LHARLCLANFCGRNRV；
(b)LARLCLANFCGNNNV；
(c)CARYRTGHHARLM；
(d)HHARLPLANFCG；
(e)RTGHHARLC*LANFC；
(f)CESARYRTGHHARLC*；
(g)DNTHHARLIL；
(h)SHHARLIL；和它們的同系物。
4.一種組合物，所述組合物包含一種或多種權(quán)利要求3的肽及其載體。
5.一種肽，所述肽具有氨基酸序列ARLI，并且包含鄰接所述肽3’端或5’端的至少一個且至多25個額外的氨基酸。
6.一種肽，所述肽具有氨基酸序列HARL，并且包含鄰接所述肽3’端或5’端的至少一個且至多25個額外的氨基酸。
7.一種肽，所述肽具有氨基酸序列FARL，并且包含鄰接所述肽3’端或5’端的至少一個且至多25個額外的氨基酸。
8.一種肽，所述肽具有氨基酸序列ARL，并且包含鄰接所述肽3’端或5’端的至少一個且至多25個額外的氨基酸。
9.一種肽，所述肽具有氨基酸序列ARLC，并且包含鄰接所述肽3’端或5’端的至少一個且至多25個額外的氨基酸。
10.一種Harlil肽序列的聚合物，所述聚合物包含所述肽的至少兩個重復。
11.一種編碼選自以下的一種氨基酸序列的核酸
(a)HHARL；
(b)HARL；
(c)HARLI；
(d)HARLIL；
(e)HHARLCL；
(f)ARLIL；
(g)HHARLIF；
(h)THARLIL；
(i)ARLI；
(j)ARL；
(k)HARLCL；
(l)ARLCL；
(m)ARCL；
(n)MFARLIL；
(o)FARLIL；
(p)FARLI；
(q)FARL；
(r)HARLIF；
(s)ARLIF；和這些氨基酸序列的同系物。
12.一種組合物，所述組合物包含一種或多種權(quán)利要求11的核酸及其藥學上可接受的載體。
13.一種編碼選自以下的一種氨基酸序列的核酸
(a)LHARLCLANFCGRNRV；
(b)LARLCLANFCGNNNV；
(c)CARYRTGHHARLM；
(d)HHARLPLANFCG；
(e)RTGHHARLC*LANFC；
(f)CESARYRTGHHARLC*；
(g)DNTHHARLIL；
(h)SHHARLIL；和它們的同系物。
14.一種組合物，所述組合物包含一種或多種權(quán)利要求13的核酸及其載體。
15.一種核酸，所述核酸編碼氨基酸序列ARLI，并且包含編碼鄰接所述肽3’端或5’端的至少一個且至多25個額外的氨基酸的殘基。
16.一種核酸，所述核酸編碼氨基酸序列HARL，并且包含編碼鄰接所述肽3’端或5’端的至少一個且至多25個額外的氨基酸的殘基。
17.一種核酸，所述核酸編碼氨基酸序列FARL，并且包含編碼鄰接所述肽3’端或5’端的至少一個且至多25個額外的氨基酸的殘基。
18.一種核酸，所述核酸編碼氨基酸序列ARL，并且包含編碼鄰接所述肽3’端或5’端的至少一個且至多25個額外的氨基酸的殘基。
19.一種核酸，所述核酸編碼氨基酸序列ARLC，并且包含編碼鄰接所述肽3’端或5’端的至少一個且至多25個額外的氨基酸的殘基。
20.一種抗體，所述抗體特異性地識別具有選自以下的一種氨基酸序列的肽序列
(a)HHARL；
(b)HARL；
(c)HARLI；
(d)HARLIL；
(e)HHARLCL；
(f)ARLIL；
(g)HHARLIF；
(h)THARLIL；
(i)ARLI；
(j)ARL；
(k)HARLCL；
(l)ARLCL；
(m)ARCL；
(n)MFARLIL；
(o)FARLIL；
(p)FARLI；
(q)FARL；
(r)HARLIF；
(s)ARLIF；和它們的同系物。
21.一種抗體，所述抗體特異性地識別具有選自以下的一種氨基酸序列的肽序列
(a)LHARLCLANFCGRNRV；
(b)LARLCLANFCGNNNV；
(c)CARYRTGHHARLM；
(d)HHARLPLANFCG；
(e)RTGHHARLC*LANFC；
(f)CESARYRTGHHARLC*；
(g)DNTHHARLIL；
(h)SHHARLIL；和它們的同系物。
22.一種抗體，所述抗體特異性地識別具有選自以下的一種氨基酸序列的肽序列
(a)ARLI；
(b)HARL；
(c)FARL；
(d)ARL；和
(e)ARLC，
其中所述肽包含鄰接所述肽3’端或5’端的至少一個且至多25個額外的氨基酸。
23.一種具有選自以下的一種氨基酸序列的肽的模擬物
(a)HHARL；
(b)HARL；
(c)HARLI；
(d)HARLIL；
(e)HHARLCL；
(f)ARLIL；
(g)HHARLIF；
(h)THARLIL；
(i)ARLI；
(j)ARL；
(k)HARLCL；
(l)ARLCL；
(m)ARCL；
(n)MFARLIL；
(o)FARLIL；
(p)FARLI；
(q)FARL；
(r)HARLIF；
(s)ARLIF；和這些氨基酸序列的同系物。
24.一種具有選自以下的一種氨基酸序列的肽的模擬物
(a)LHARLCLANFCGRNRV；
(b)LARLCLANFCGNNNV；
(c)CARYRTGHHARLM；
(d)HHARLPLANFCG；
(e)RTGHHARLC*LANFC；
(f)CESARYRTGHHARLC*；
(g)DNTHHARLIL；
(h)SHHARLIL；和它們的同系物。
25.一種具有選自以下的一種氨基酸序列的肽的模擬物
(a)ARLI；
(b)HARL；
(c)FARL；
(d)ARL；和
(e)ARLC；
其中所述NTP肽包含鄰接所述肽3’端或5’端的至少一個且至多25個額外的氨基酸。
26.一種從生物樣品中純化NTP的方法，所述方法包括
(1)使生物樣品與一種或多種具有選自以下的一種氨基酸序列的肽接觸
(a)HHARL；
(b)HARL；
(c)HARLI；
(d)HARLIL；
(e)HHARLCL；
(f)ARLIL；
(g)HHARLIF；
(h)THARLIL；
(i)ARLI；
(j)ARL；
(k)HARLCL；
(l)ARLCL；
(m)ARCL；
(n)MFARLIL；
(o)FARLIL；
(p)FARLI；
(q)FARL；
(r)HARLIF；
(s)ARLIF；和這些氨基酸序列的同系物；
(2)分離所得的Harlil肽/NTP綴合物；且
(3)從所述一種或多種Harlil肽中分離NTP，以獲得純化NTP。
27.一種從生物樣品中純化NTP的方法，所述方法包括
(1)使生物樣品與一種或多種具有選自以下的一種氨基酸序列的肽接觸
(a)LHARLCLANFCGRNRV；
(b)LARLCLANFCGNNNV；
(c)CARYRTGHHARLM；
(d)HHARLPLANFCG；
(e)RTGHHARLC*LANFC；
(f)CESARYRTGHHARLC*；
(g)DNTHHARLIL；
(h)SHHARL1L；和它們的同系物；
(2)分離所得的Harlil肽/NTP綴合物；且
(3)從所述一種或多種Harlil肽中分離NTP，以獲得純化NTP。
28.一種從生物樣品中純化NTP的方法，所述方法包括
(a)使生物樣品與一種或多種具有選自以下的一種氨基酸序列的肽接觸
(i)ARLI；
(ii)HARL；
(iii)FARL；
(iv)ARL；和
(v)ARLC；
其中所述肽包含鄰接所述肽3’端或5’端的至少一個且至多25個額外的氨基酸；
(b)分離所得的Harlil肽/NTP綴合物；且
(c)從所述一種或多種Harlil肽中分離NTP，以獲得純化NTP。
29.一種用于確定早老性癡呆或其它神經(jīng)變性性疾病存在的診斷試驗，所述診斷試驗包括
(1)使生物樣品與一種或多種具有選自以下的一種氨基酸序列的肽接觸
(a)HHARL；
(b)HARL；
(c)HARLI；
(d)HARLIL；
(e)HHARLCL；
(f)ARLIL；
(g)HHARLIF；
(h)THARLIL；
(i)ARLI；
(j)ARL；
(k)HARLCL；
(l)ARLCL；
(m)ARCL；
(n)MFARLIL；
(o)FARLIL；
(p)FARLI；
(q)FARL；
(r)HARLIF；
(s)ARLIF；和這些氨基酸序列的同系物；
(2)測定所述樣品中存在的NTP量；且
(3)確定所述樣品中存在的NTP量是否高于指示早老性癡呆或其它神經(jīng)變性性疾病存在的閾值量。
30.一種用于確定早老性癡呆或其它神經(jīng)變性性疾病存在的診斷試驗，所述診斷試驗包括
(1)使生物樣品與一種或多種具有選自以下的一種氨基酸序列的肽接觸
(a)LHARLCLANFCGRNRV；
(b)LARLCLANFCGNNNV；
(c)CARYRTGHHARLM；
(d)HHARLPLANFCG；
(e)RTGHHARLC*LANFC；
(f)CESARYRTGHHARLC*；
(g)DNTHHARLIL；
(h)SHHARLIL；和它們的同系物；
(2)測定所述樣品中存在的NTP量；且
(3)確定所述樣品中存在的NTP量是否高于指示早老性癡呆或其它神經(jīng)變性性疾病存在的閾值量。
31.一種用于確定早老性癡呆或其它神經(jīng)變性性疾病存在的診斷試驗，所述診斷試驗包括
(a)使生物樣品與一種或多種具有選自以下的一種氨基酸序列的肽接觸
(i)ARLI；
(ii)HARL；
(iii)FARL；
(iv)ARL；和
(v)ARLC；
其中所述肽包含鄰接所述肽3’端或5’端的至少一個且至多25個額外的氨基酸，
(b)測定所述樣品中存在的NTP量；且
(c)確定所述樣品中存在的NTP量是否高于指示早老性癡呆或其它神經(jīng)變性性疾病存在的閾值量。
32.一種用于測定早老性癡呆或其它神經(jīng)變性性疾病存在的診斷試劑盒，所述診斷試劑盒包含
(1)一種或多種具有選自以下的一種氨基酸序列的肽；
(a)HHARL；
(b)HARL；
(c)HARLI；
(d)HARLIL；
(e)HHARLCL；
(f)ARLIL；
(g)HHARLIF；
(h)THARLIL；
(i)ARLI；
(j)ARL；
(k)HARLCL；
(l)ARLCL；
(m)ARCL；
(n)MFARLIL；
(o)FARLIL；
(p)FARLI；
(q)FARL；
(r)HARLIF；
(s)ARLIF；和這些氨基酸序列的同系物；和
(2)合適的試劑。
33.一種用于測定早老性癡呆或其它神經(jīng)變性性疾病存在的診斷試劑盒，所述診斷試劑盒包含
(1)一種或多種具有選自以下的一種氨基酸序列的肽
(a)LHARLCLANFCGRNRV；
(b)LARLCLANFCGNNNV；
(c)CARYRTGHHARLM；
(d)HHARLPLANFCG；
(e)RTGHHARLC*LANFC；
(f)CESARYRTGHHARLC*；
(g)DNTHHARLIL；
(h)SHHARLIL；和它們的同系物；和
(2)合適的試劑。
34.一種用于測定早老性癡呆或其它神經(jīng)變性性疾病存在的診斷試劑盒，所述診斷試劑盒包含
(a)一種或多種具有選自以下的一種氨基酸序列的肽
(i)ARLI；
(ii)HARL；
(iii)FARL；
(iv)HARLI；
(v)ARLC；
其中所述肽包含鄰接所述肽3’端或5’端的至少一個且至多25個額外的氨基酸；和
(b)合適的試劑。
35.一種在治療或診斷分析中使用一種肽作為NTP類似物的方法，所述方法包括在這種測定中用所述肽替代NTP，其中所述肽具有選自以下的一種氨基酸序列
(a)HHARL；
(b)HARL；
(c)HARLI；
(d)HARLIL；
(e)HHARLCL；
(f)ARLIL；
(g)HHARLIF；
(h)THARLIL；
(i)ARLI；
(j)ARL；
(k)HARLCL；
(l)ARLCL；
(m)ARCL；
(n)MFARLIL；
(o)FARLIL；
(p)FARLI；
(q)FARL；
(r)HARLIF；
(s)ARLIF；和這些氨基酸序列的同系物。
36.一種在治療或診斷分析中使用一種肽作為NTP類似物的方法，所述方法包括在這種測定中用所述肽替代NTP，其中所述肽具有選自以下的一種氨基酸序列
(a)LHARLCLANFCGRNRV；
(b)LARLCLANFCGNNNV；
(c)CARYRTGHHARLM；
(d)HHARLPLANFCG；
(e)RTGHHARLC*LANFC；
(f)CESARYRTGHHARLC*；
(g)DNTHHARLIL；
(h)SHHARLIL；和它們的同系物。
37.一種在治療或診斷分析中使用一種肽作為NTP類似物的方法，所述方法包括在這種測定中用所述肽替代NTP，其中所述肽具有選自以下的一種氨基酸序列
(a)ARLI；
(b)HARL；
(c)FARL ；
(d)ARL，和
(e)ARLC；
其中所述肽包含鄰接所述肽3’端或5’端的至少一個且至多25個額外的氨基酸。
38.一種在診斷或治療分析中使用一種肽作為捕獲材料的方法，其中所述肽具有選自以下的一種氨基酸序列
(a)HHARL；
(b)HARL；
(c)HARLI；
(d)HARLIL；
(e)HHARLCL；
(f)ARLIL；
(g)HHARLIF；
(h)THARLIL；
(i)ARLI；
(j)ARL；
(k)HARLCL；
(l)ARLCL；
(m)ARCL；
(n)MFARLIL；
(o)FARLIL；
(p)FARLI；
(q)FARL；
(r)HARLIF；
(s)ARLIF；和這些氨基酸序列的同系物。
39.一種在診斷或治療分析中使用一種肽作為捕獲材料的方法，其中所述肽具有選自以下的一種氨基酸序列
(a)LHARLCLANFCGRNRV；
(b)LARLCLANFCGNNNV；
(c)CARYRTGHHARLM；
(d)HHARLPLANFCG；
(e)RTGHHARLC*LANFC；
(f)CESARYRTGHHARLC*；
(g)DNTHHARLIL；
(h)SHHARLIL；和它們的同系物。
40.一種在診斷或治療分析中使用一種肽作為捕獲材料的方法，其中所述肽具有選自以下的一種氨基酸序列
(a)ARLI；
(b)HARL；
(c)FARL；
(d)ARL，和
(e)ARLC；
其中所述肽包含鄰接所述肽3’端或5’端的至少一個且至多25個額外的氨基酸。
41.一種使用肽從樣品中分離免疫球蛋白的方法，所述方法包括
(1)使包含免疫球蛋白的樣品與至少兩種肽接觸，使得免疫球蛋白/肽可以相互作用，且
(2)分離所得的肽/免疫球蛋白綴合物，其中所述肽具有選自以下的一種氨基酸序列
(a)HHARL；
(b)HARL；
(c)HARLI；
(d)HARLIL；
(e)HHARLCL；
(f)ARLIL；
(g)HHARLIF；
(h)THARLIL；
(i)ARLI；
(j)ARL；
(k)HARLCL；
(l)ARLCL；
(m)ARCL；
(n)MFARLIL；
(o)FARLIL；
(p)FARLI；
(q)FARL；
(r)HARLIF；
(s)ARLIF；和這些氨基酸序列的同系物。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述NTP肽/免疫球蛋白綴合物通過沉淀分離出來。
43.權(quán)利要求41的方法，其中所述NTP肽/免疫球蛋白綴合物在親和柱上分離出來。
44.權(quán)利要求41的方法，其中隨后純化所述免疫球蛋白。
45.一種使用肽從樣品中分離免疫球蛋白的方法，所述方法包括
(1)使包含免疫球蛋白的樣品與至少兩種肽接觸，使得免疫球蛋白/肽可以相互作用，且
(2)分離所得的肽/免疫球蛋白綴合物，其中所述肽具有選自以下的一種氨基酸序列
(a)LHARLCLANFCGRNRV；
(b)LARLCLANFCGNNNV；
(c)CARYRTGHHARLM；
(d)HHARLPLANFCG；
(e)RTGHHARLC*LANFC；
(f)CESARYRTGHHARLC*；
(g)DNTHHARLIL；
(h)SHHARLIL；和它們的同系物。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述肽/免疫球蛋白綴合物通過沉淀分離出來。
47.權(quán)利要求45的方法，其中所述肽/免疫球蛋白綴合物在親和柱上分離出來。
48.權(quán)利要求45的方法，其中隨后純化所述免疫球蛋白。
49.一種使用肽從樣品中分離免疫球蛋白的方法，所述方法包括
(1)使包含免疫球蛋白的樣品與至少兩種肽接觸，使得免疫球蛋白/肽可以相互作用，且
(2)分離所得的肽/免疫球蛋白綴合物，其中所述肽具有選自以下的一種氨基酸序列
(a)ARLI；
(b)HARL；
(c)FARL；
(d)ARL；和
(e)ARLC；
其中所述肽包含鄰接所述肽3’端或5’端的至少一個且至多25個額外的氨基酸。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述肽/免疫球蛋白綴合物通過沉淀分離出來。
51.權(quán)利要求49的方法，其中所述肽/免疫球蛋白綴合物在親和柱上分離出來。
52.權(quán)利要求49的方法，其中隨后純化所述免疫球蛋白。
53.一種用于防止NTP通過所述Harlil結(jié)構(gòu)域相互作用的方法，所述方法包括通過使用一種或多種Harlil肽、Harlil肽模擬物、抗這種結(jié)構(gòu)域的抗體或它們的組合封閉一個或多個Harlil結(jié)構(gòu)域。
全文摘要
本發(fā)明涉及神經(jīng)絲蛋白(NTP)的優(yōu)選重復序列，所述優(yōu)選序列的肽、模擬物、抗體和核酸，以及使用這些優(yōu)選NTP序列的診斷和治療方法。
文檔編號C07K16/00GK1492926SQ0182121
公開日2004年4月28日 申請日期2001年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月27日
發(fā)明者J·費茨帕特里克, P·阿弗巴克, M·S·S·?？颂? R·比比爾諾, J 費茨帕特里克, S ?？颂? ぐ涂 , 榷 申請人:尼莫克斯藥品公司