)損傷組，C為低濃度Savatiside A (100 μ M)處理組，D 為高濃度Savatiside A (200 μ Μ)處理組。
[0021] 圖5中顯示了顯微鏡下觀察到的Savatiside A對PC12細(xì)胞形態(tài)的影響，其中A 為空白對照組，B為谷氨酸（15mM)損傷組，C為低濃度Savatiside A (50 μ Μ)處理組，D為 高濃度 Savatiside A (100 μ Μ)處理組。
[0022] 圖6為Savatiside A對SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS的影響效果圖。
[0023] 圖7為Savatiside A對PC12細(xì)胞內(nèi)ROS的影響效果圖。
[0024] 圖8為Savatiside A對SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率的影響效果圖。
[0025] 圖9為Savatiside A對SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響效果圖。
[0026] 圖10為Savatiside A對PC12細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響效果圖。
[0027] 圖11為Savatiside A對Αβ 25-35淀粉蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率的影響效果圖。
【具體實施方式】
[0028] 下面將結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明做出進(jìn)一步的描述。特別需要指出的是， 所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明 的范圍之內(nèi)。
[0029] 實施例一：Savatiside A的提取與分離。
[0030] (1)藥材提?。?鹿茸草藥材50kg，切成l~2cm的小段，15倍量水加熱回流提取三次，每次2小時。合并 提取液，70°C減壓濃縮至50L(相對密度為I. 15~1. 18)，加入95%乙醇250L，邊加邊攪拌，靜 置過夜，取上清液，再70°C減壓濃縮至50L。
[0031] (2)AB-8 樹脂純化： 樹脂用量：藥材質(zhì)量/樹脂質(zhì)量=1:1 ; 上樣速度：lmL/min. cm2; 洗脫速度：2~3mL/min. cm2; 樹脂床的徑高比1:10 ; 取處理好的AB-8樹脂50kg，裝入直徑為30cm的不銹鋼層析柱中，水洗，待用。提取液 上樣兩次，靜態(tài)吸附12h。先用水洗4BV，再用60%乙醇洗3BV，用90%乙醇洗2BV，收集50% 乙醇部位，回收溶劑得浸膏l(xiāng)〇〇〇g。
[0032] (3) NM100 樹脂純化： 樹脂用量：藥材質(zhì)量/樹脂質(zhì)量=1:0. 5 ; 上樣速度：lmL/min. cm2; 洗脫速度：2~3mL/min. cm2; 樹脂床的徑高比1:10 ; 取處理好的匪100樹脂25kg，裝入直徑為20cm的不銹鋼層析柱中，水洗，待用。取AB-8 樹脂50%乙醇部位的浸膏用25L水溶解，上樣兩次，靜態(tài)吸附12h。先用25%甲醇4BV，再用 50%甲醇洗4BV，用90%甲醇洗2BV，收集50%甲醇部位，回收溶劑得浸膏800g。
[0033] (4)聚酰胺純化： 聚酰胺用量：藥材質(zhì)量/聚酰胺質(zhì)量=1:0. 1 ; 上樣速度：lmL/min. cm2; 洗脫速度：2~3mL/min. cm2; 柱床的徑高比1:5 ; 取處理好的聚酰胺l〇kg，裝入直徑為IOcm的玻璃層析柱中，水洗，待用。取匪100樹脂 50%甲醇部位的浸膏用IOL水溶解，上樣。先用10%甲醇4BV，再用50%甲醇洗4BV，用90% 甲醇洗2BV，收集50%甲醇部位，回收溶劑得浸膏500g。
[0034] (5 ) DAC柱(動態(tài)軸向柱）純化： ODS 粒徑：3~5 μπι ; ODS 孔徑：5nm ; ODS 填料：3kg ; 每次上樣量：IOg ; 洗脫速度：30mL/min ; 流動相：30%甲醇； 檢測波長：254nm ; 取聚酰胺純化50%甲醇部位的浸膏用IOL水溶解，上樣，根據(jù)第四個大峰的出峰時間， 收集該部分洗脫液，7〇°C旋轉(zhuǎn)薄膜真空濃縮，凍干即得。所得Savatiside A總計200g，并通 過HPLC檢測其純度大于90%，結(jié)果如圖1所示。
[0035] HPLC液相色譜條件如下： 儀器：安捷倫1260液相色譜儀； 色譜柱：Kromasil C18Column (4. 6mmX250 i.d. ;AKZ0N0BEL); 檢測波長：330nm ; 流速：1· OmL/min ; 流動相：〇~35min，甲醇：水(含0. 1%甲酸）=35:65 ; 35~45min，甲醇：水(含 0· 1% 甲酸）=90:10 ; 樣品制備：將Img樣品溶解于ImL甲醇中，搖勻即可。
[0036] 實施例二：Savatiside A對神經(jīng)細(xì)胞存活率的影響。
[0037] 1、對SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞存活率的影響。
[0038] 調(diào)整SH-SY5Y細(xì)胞濃度為I X IO5個/ml，將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔 100 μ 1，于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，隨機(jī)分組進(jìn)行實驗。實驗分為正常細(xì)胞對照 組、1-谷氨酸損傷組以及不同濃度的5 &￥&衍8丨(^4組（5(^1、10(^1、20(^1〇。受試藥物 加入細(xì)胞24h后，用L-谷氨酸（IOmM)造模。造模24h后，每孔加入IOyl MTT(5mg/ml)培 養(yǎng)4h，傾去上清液，加入100 μ I DMSO,振搖lOmin。用全自動酶標(biāo)儀測定570nm處的吸光度 值（OD57tlnm),用于定量細(xì)胞存活率。實驗重復(fù)三次。細(xì)胞存活率參照下述公式計算：細(xì)胞存 活率％=(實驗組OD 57tlm/對照組OD57J X 100%，其結(jié)果如圖2所示。
[0039] 由圖2可知，與對照組相比，谷氨酸組細(xì)胞存活率明顯降低。Savatiside A處理 SH-SY5Y細(xì)胞后，SH-SY5Y細(xì)胞的存活率能夠提高至98. 00%。結(jié)果表明，Savatiside A對 L-谷氨酸誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞有明顯保護(hù)作用。
[0040] 2、對PC12細(xì)胞存活率的影響。
[0041] 調(diào)整PC12細(xì)胞濃度為IX IO5個/ml，將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔100 μ 1， 于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，隨機(jī)分組進(jìn)行實驗。實驗分為正常細(xì)胞對照組、L-谷氨 酸損傷組以及不同濃度的Savatiside A組（25 μ M、50 μ M、100 μ M)。受試藥物加入細(xì)胞24h 后，用L-谷氨酸（15mM)造模。造模24h后，每孔加入ΙΟμΙ MTT (5mg/ml)培養(yǎng)4h，傾去上 清液，加入100 μ I DMS0,振搖lOmin。用全自動酶標(biāo)儀測定570nm處的吸光度值（OD57tol), 用于定量細(xì)胞存活率。實驗重復(fù)三次。細(xì)胞存活率參照下述公式計算：細(xì)胞存活率％=(實 驗組OD57tlm/對照組OD57tlnm) X 100%，其結(jié)果如圖3所示。
[0042] 由圖3可知，與對照組相比，谷氨酸組細(xì)胞存活率明顯降低。Savatiside A處理 PC12細(xì)胞后，PC12細(xì)胞的存活率能夠提高至87. 45%。結(jié)果表明，Savatiside A對L-谷氨 酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞有明顯保護(hù)作用。
[0043] 實施例三、Savatiside A對神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的影響。
[0044] 1、對SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的影響。
[0045] 由圖4可知，正常細(xì)胞對照組（A)中SH-SY5Y細(xì)胞體積較大，細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)；在 谷氨酸（IOmM)損傷組（B)中，鏡下觀察可見SH-SY5Y細(xì)胞生長明顯受到抑制，折光率下降， 部分細(xì)胞裂解成碎片；給予Savatiside A (100、200 μΜ)組（C和D)中的細(xì)胞形態(tài)明顯恢 復(fù)，細(xì)胞數(shù)目變多。上述結(jié)果表明，不同濃度的Savatiside A均能有效對抗谷氨酸引起的 SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。
[0046] 2、對PC12細(xì)胞形態(tài)的影響。
[0047] 由圖5可知，正常組（A)未分化PC12細(xì)胞體積較大，細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)；在谷氨酸 (15mM)損傷模型中，鏡下觀察可見PC12細(xì)胞生長明顯受到抑制，折光率下降，部分細(xì)胞裂 解成碎片；給予Savatiside A (50、100 μΜ)組（C和D)均能有效對抗L-谷氨酸引起的細(xì) 胞損傷，形態(tài)學(xué)觀察表現(xiàn)為細(xì)胞損傷程度減輕，細(xì)胞碎片形成減少，孔板上貼壁生長良好， 生長旺盛。
[0048] 實施例四、Savatiside A對細(xì)胞內(nèi)ROS的影響。
[0049] 1、對SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS的影響。
[0050] 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整SH-SY5Y細(xì)胞濃度為I X IO5個/ml，將細(xì)胞懸液接種于6 孔板中，每孔2ml，37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，如上分組給藥，培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后吸去 上層液體，用PBS液洗滌一次，加入10 μ mol/L DCFH-DA的無血清培養(yǎng)基，200 μ 1/孔，使浸 滿底層細(xì)胞，37°C，5%C02培養(yǎng)箱反應(yīng)30min，PBS液輕洗一次，用胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞并 收集，1200r/min離心5min，PBS液再洗兩遍，加入300 μ I PBS懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測 (激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長525nm)，其結(jié)果如圖6所示。
[0051] 由圖6可知，對照組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度值為46. 07±3. 16,而谷氨酸組細(xì)胞平均熒 光強(qiáng)度值為 104. 00±6· 93,兩組間有顯著性差異（P〈0.0 lXSavatiside A (100、200 μmol/ L)組平均熒光強(qiáng)度分別為59. 73±3. 42以及37. 17±2. 15,與谷氨酸組相比，均有顯著性差