苯乙醇苷類化合物Savatiside A的新用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域，涉及苯乙醇苷類化合物Savatiside A的新用途，具體涉 及Savatiside A在制備用于預(yù)防或治療老年神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著老年性社會(huì)的來(lái)臨，老年神經(jīng)系統(tǒng)疾病得到越來(lái)越多的關(guān)注。以阿爾茨海默 ?。ˋlzheimer' s Disease，AD)為例，該病于1906年首次由德國(guó)精神病學(xué)家和神經(jīng)發(fā)病學(xué) 家Alzheimer Alois發(fā)現(xiàn)并以其名字命名。作為一種慢性神經(jīng)退行性疾病，其臨床特征主 要表現(xiàn)為獲得性持續(xù)性記憶減退、認(rèn)知功能障礙、行為異常和社交障礙等；其病理特征為大 腦皮層萎縮，伴有淀粉樣蛋白（Αβ)聚集成老年斑，細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白異常聚集形成神經(jīng) 元纖維纏結(jié)（NFT)和神經(jīng)元死亡。隨著老齡化社會(huì)的來(lái)臨，AD發(fā)病率持續(xù)上升。目前，AD 已經(jīng)成為繼心血管疾病、腫瘤和腦卒中之后的第4位殺手。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，到2050年，全 世界AD患者將超過(guò)1億，尋找和開(kāi)發(fā)新型的對(duì)抗AD的藥物已成為很多科研工作者關(guān)注的 焦點(diǎn)。
[0003] 中藥以其在治療AD方面獨(dú)特的藥理作用一直以來(lái)吸引著人們的廣泛關(guān)注。近年 來(lái)的研宄表明，植物中的一大類成分--苯乙醇苷表現(xiàn)出多種生理活性，例如心血管保護(hù)、 抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤轉(zhuǎn)移、保肝、抗病毒、抗菌等。然而，對(duì)于其是否具有神經(jīng)保護(hù)作用的 報(bào)道尤為罕見(jiàn)，更未見(jiàn)有文獻(xiàn)記載其治療或預(yù)防AD的功效。鑒于苯乙醇苷類化合物具有多 種生理活性，且分布廣泛、資源豐富，對(duì)其藥用價(jià)值的研宄已成為天然藥物研發(fā)的新熱點(diǎn)， 盡快開(kāi)發(fā)出一種能夠有效對(duì)抗AD的苯乙醇苷化合物將具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)上述情況，本發(fā)明以包含多種苯乙醇苷類成分的鹿茸草為研宄對(duì)象，通 過(guò)天然藥物化學(xué)的方法，提取、分離并鑒定了一種苯乙醇苷類化合物Savatiside Α， 其化學(xué)名為（R)-(l " -〇-2-(3, 4-二羥基苯基）-2_羥基乙氧基）-0-a-L-鼠李糖 基_(1" ' -2" )-(6" -0-咖啡?；?β-D-葡萄糖苷，其結(jié)構(gòu)如下式I所示。
[0005] 谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)毒性在一些神經(jīng)病理性病變疾病，特別是在阿爾茨海默氏 病、帕金森氏病（Parkinson's disease，Η))、癲癇（epilepsy)和缺血性中風(fēng)（ischemic stroke)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。與谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)毒性最為相關(guān)的可能是Ca2+超載，其隨 后導(dǎo)致Ca 2+依賴性蛋白激酶如一氧化氮合酶（NOS)的過(guò)度活化，活性氧族（ROS)形成增加， 并最終導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)生。本發(fā)明即以谷氨酸導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞毒性來(lái)建立細(xì)胞模型， 多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合顯示，Savatiside A能夠有效地抑制谷氨酸所導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞毒性，并 可抑制淀粉樣蛋白所致的神經(jīng)細(xì)胞死亡。因此，本發(fā)明提供了 Savatiside A在制備用 于預(yù)防或治療老年神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的用途。
[0006] 優(yōu)選的，在上述技術(shù)方案中，所述老年神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括(但不限于）阿爾茨海默 病、帕金森氏病、癲癇和缺血性中風(fēng)。
[0007] 優(yōu)選的，在上述技術(shù)方案中，所述藥物可以包含預(yù)防或治療有效量的Savatiside A以及藥學(xué)上可接受的輔料，如崩解劑、潤(rùn)滑劑、乳化劑、粘合劑等。
[0008] 優(yōu)選的，在上述技術(shù)方案中，所述藥物還可以包含其他用于預(yù)防或治療老年神經(jīng) 系統(tǒng)疾病的活性成分，如針對(duì)阿爾茨海默病的石杉?jí)A甲、加蘭他敏，針對(duì)帕金森氏病的左旋 多巴、苯海索，針對(duì)癲癇的苯妥英鈉、卡馬西平，以及針對(duì)缺血性中風(fēng)的潘生丁、尿激酶等。
[0009] 優(yōu)選的，在上述技術(shù)方案中，所述藥物可以通過(guò)常規(guī)的藥物制劑方法被制成常用 劑型如片劑、丸劑、滴丸劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、涂劑、巴布劑、噴霧劑或注射劑。
[0010] 優(yōu)選的，在上述技術(shù)方案中，所述藥物可以通過(guò)以下方式給藥：口服、噴霧吸入、直 腸給藥、鼻腔給藥、陰道給藥、外用給藥、非腸道給藥如皮下、靜脈、肌肉、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室 內(nèi)、胸骨內(nèi)或顱內(nèi)注射或輸入。
[0011] 優(yōu)選的，在上述技術(shù)方案中，所述藥物的使用劑量和使用方法取決于諸多因素，包 括患者的年齡、體重、性別、自然健康狀況、營(yíng)養(yǎng)狀況、化合物的活性強(qiáng)度、服用時(shí)間、代謝速 率、病程嚴(yán)重程度以及診治醫(yī)師的主觀判斷等，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)上述因素可以容易地 決定使用劑量和使用方法。
[0012] 神經(jīng)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)的主體，神經(jīng)元的損傷是諸多神經(jīng)疾病的主要原因，卒中、中 毒、外傷、感染、變性都是因?yàn)樯窠?jīng)元受到致病因子的損害而導(dǎo)致不可逆的功能喪失。神 經(jīng)元損傷的機(jī)制主要包括氧化損傷、自由基、炎癥、興奮性毒性、鈣離子超載、凋亡及免疫 損傷等，其中凋亡是多種致病因素導(dǎo)致的細(xì)胞程序性死亡，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)退行性 病變和興奮性神經(jīng)元損傷中均起重要作用。神經(jīng)保護(hù)治療就是通過(guò)藥物等手段阻斷神經(jīng) 細(xì)胞壞死的不同環(huán)節(jié)，增加神經(jīng)細(xì)胞存活能力，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。本發(fā)明通過(guò)神經(jīng)細(xì) 胞存活率實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)考察了 Savatiside A對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果顯示， 在100~200 μ mol/L的給藥濃度下，Savatiside A能夠有效提高SH-SY5Y細(xì)胞的存活率并 對(duì)抗L-谷氨酸引起的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，并且在50~100 ymol/L的給藥濃度下，能夠有效 提高PC12細(xì)胞的存活率并對(duì)抗L-谷氨酸引起的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。此外，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn) 在lOOymol/L的給藥濃度下，Savatiside A能夠有效提高SH-SY5Y細(xì)胞的存活率，對(duì)抗 淀粉樣蛋白所致的神經(jīng)細(xì)胞死亡。因此，本發(fā)明提供了 Savatiside A在制備具有營(yíng)養(yǎng) 和保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)作用的保健品中的用途。
[0013] 苯乙醇苷化合物的神經(jīng)保護(hù)作用與其能夠減少自由基的生成、抑制氧化應(yīng)激應(yīng)發(fā) 生等有關(guān)?；钚匝鯔z測(cè)試劑盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一種利用焚光探 針DCFH-DA進(jìn)行活性氧檢測(cè)的試劑盒。DCFH-DA本身沒(méi)有熒光，可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入 細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容 易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可氧化無(wú)熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測(cè)DCF 的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。本發(fā)明即采用活性氧檢測(cè)試劑盒來(lái)考察神經(jīng)細(xì)胞 內(nèi)ROS的水平。結(jié)果顯示，在100~200 μ mol/L的給藥濃度下，Savatiside A能夠有效降低 SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平，并且在50~100 μ mol/L的給藥濃度下，能夠有效降低PC12細(xì) 胞內(nèi)的活性氧水平。因此，本發(fā)明提供了 Savatiside A在制備針對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的活性氧清除 劑中的用途。
[0014] 在正常細(xì)胞中，磷脂酞絲氨酸（Phosphatidylserine，Ps)只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙 層的內(nèi)側(cè)面；而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外表面。Annexin V是一種 分子量為35-36kD大小的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酞絲氨酸有很高的親和力，以已 標(biāo)記的Annexin V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀可以檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生。碘化丙 啶（Propidium Iodide，PI)是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但對(duì)處于凋亡晚期 的細(xì)胞和壞死細(xì)胞而言，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此，將Annexin V與PI匹 配使用，就可以區(qū)分處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞。本發(fā)明即采用Annexin V和PI雙染法來(lái)考 察神經(jīng)細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果顯示，在100~200 μ mol/L的給藥濃度下，Savatiside A能 夠有效降低L-谷氨酸引起的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率。因此，本發(fā)明提供了 Savatiside A在 制備神經(jīng)細(xì)胞凋亡抑制劑中的用途。
[0015] Flu〇-3AM是一種可以穿透細(xì)胞膜的熒光指示染料，是最常用的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃 度的熒光探針之一。Flu 〇-3AM自身的熒光非常弱，并且其熒光不會(huì)隨著鈣離子濃度的升高 而增強(qiáng)，但其進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的酶剪切成Fluo-3,滯留在細(xì)胞內(nèi)的Fluo-3可以與鈣 離子結(jié)合，進(jìn)而產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光。本發(fā)明即采用F1UO-3AM熒光探針來(lái)考察神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca 2+ 濃度的改變。結(jié)果顯示，在100~200 ymol/L的給藥濃度下，Savatiside A能夠有效降低 SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度，并且在50~100 μ mol/L的給藥濃度下，能夠有效降低PC12細(xì) 胞內(nèi)的Ca2+濃度。因此，本發(fā)明提供了 Savatiside A在制備針對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的鈣離子調(diào)節(jié)劑 中的用途。
[0016] 本發(fā)明通過(guò)對(duì)Savatiside A進(jìn)行中藥藥理學(xué)研宄與分析，成功揭示了該苯乙醇苷 類單體化合物具有多種生物活性，可以開(kāi)發(fā)成用于預(yù)防或治療多種老年神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥 品，具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的潛在價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為實(shí)施例一中制得的Savatiside A的HPLC譜圖。
[0018] 圖2為Savatiside A對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞存活率的影響效果圖。
[0019] 圖3為Savatiside A對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的PC12神經(jīng)細(xì)胞存活率的影響效果圖。
[0020] 圖4中顯示了顯微鏡下觀察到的Savatiside A對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的影響，其中 A為空白對(duì)照組，B為谷氨酸（IOmM