表明（圖5)，本發(fā)明制備的酸敏感脂質(zhì)體在pH7.0時(shí)穩(wěn)定存在，在 pH6. 5,6. 0及4. 5條件下，酸敏感脂質(zhì)體的腙鍵完全斷裂，使得PEG離開脂質(zhì)體。三種酸性 條件下，PEG斷裂相對(duì)量與處方量相一致，說明只要在弱酸性pH6. 5下，該給藥系統(tǒng)就可以 完全斷裂PEG，具有較強(qiáng)的酸敏感性。
[0087] 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)表明（圖6)，本發(fā)明所制備的酸敏感脂質(zhì)體在pH7. 0條件下的攝取 與PEG存在的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體（SSL) -致，在pH6. 0條件下的攝取與不含PEG的普通脂質(zhì)體 (CL) 一致。進(jìn)一步說明了本發(fā)明給藥系統(tǒng)的酸敏感性，實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明給藥系統(tǒng)的設(shè)計(jì)目的。
[0088] 實(shí)施例5具有內(nèi)化作用的酸敏感脂質(zhì)體中CPP密度的優(yōu)化
[0089] 通過流式細(xì)胞術(shù)，測(cè)定了所制備的不同CPP密度的酸敏感脂質(zhì)體在腫瘤區(qū)酸性 (pH6. 0)條件下，細(xì)胞攝取與CPP密度的關(guān)系，并與正常組織環(huán)境（pH7. 0)相比較（圖7)。 結(jié)果表明，在腫瘤酸性環(huán)境下，細(xì)胞攝取與CPP密度正相關(guān)，并且無飽和性；但在正常組織 環(huán)境下，CPP密度小于4%時(shí)，細(xì)胞攝取與無 CPP修飾的SSL -致，而當(dāng)CPP密度增加到8% 時(shí)，細(xì)胞攝取陡然增加。結(jié)果說明在正常組織環(huán)境下，本發(fā)明的給藥系統(tǒng)PEG不斷裂，能夠 最多能有效掩蓋4%的CPP。由此，選擇本發(fā)明中CPP的修飾密度定為4%。其含義代表在 體循環(huán)中，該系統(tǒng)對(duì)正常組織無損傷，但對(duì)于腫瘤細(xì)胞，能有效促使其發(fā)揮內(nèi)化作用。
[0090] 進(jìn)一步，在酸敏感PEG密度為15%時(shí)，CPP的最佳修飾密度為8%。
[0091] 實(shí)施例6具有內(nèi)化作用的酸敏感脂質(zhì)體具有明顯的細(xì)胞內(nèi)化作用
[0092] 通過激光共聚焦顯微鏡觀察，本發(fā)明的給藥系統(tǒng)能夠有效從溶酶體逃逸，廣泛分 布于細(xì)胞質(zhì)中，為進(jìn)一步入細(xì)胞核核提供了條件。而對(duì)照組，SSL，不可見溶酶體逃逸，所載 香豆素與溶酶體共定位。結(jié)果說明了本發(fā)明的給藥系統(tǒng)具有更強(qiáng)的亞細(xì)胞器靶向性。
[0093] 實(shí)施例7具有內(nèi)化作用的酸敏感脂質(zhì)體具有較低溶血性，基本無毒
[0094] 通過簡(jiǎn)單的溶血實(shí)驗(yàn)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的給藥系統(tǒng)（CPL)的溶血性與對(duì)照組SSL 沒有顯著性差別（圖8)，給藥系統(tǒng)中磷脂濃度在400nmole / mL以下時(shí)溶血性小于10%， 認(rèn)定為無毒.在臨床上〇(^嗯的磷脂臨床使用劑量為1.2-2.411^/1^，給藥方式為滴注，處 方中一般DOX與磷脂的比例為I :10(質(zhì)量比），成人血液體積為86mL/kg，由此算得，磷脂濃 度為186~372nmole / mL。由此可見，本發(fā)明的給藥系統(tǒng)在臨床應(yīng)用上具有一定的安全 性。
[0095] 實(shí)施例8具有內(nèi)化作用的酸敏感脂質(zhì)體具有更強(qiáng)的腫瘤靶向性
[0096] 本發(fā)明的給藥系統(tǒng)（CPL)經(jīng)荷瘤鼠尾靜脈給藥后，在腫瘤的分布遠(yuǎn)大于對(duì)照組 (SSL)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在腫瘤部位的攝取減弱，但給藥8小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組仍然大于SSL。相 反，SSL在脾有一定的分布，但本給藥系統(tǒng)在脾中分布較少。在肝中分布相對(duì)較多，在腦，心， 肺，腎的分布均較少。由此可見，本給藥系統(tǒng)在正常器官的攝入量較低，較多分布于腫瘤，進(jìn) 一步說明了本發(fā)明的給藥系統(tǒng)提升了 CPP的靶向性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有內(nèi)化作用的酸敏感脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，其特征在于細(xì)胞穿透肽通過長(zhǎng)鏈有機(jī) 酸直接偶聯(lián)于脂質(zhì)體表面，同時(shí)具有酸敏感性的聚乙二醇-腙鍵-長(zhǎng)鏈有機(jī)酸偶聯(lián)物修飾 脂質(zhì)體表面。其制備工藝包括如下步驟： (1) 載藥普通脂質(zhì)體的制備：負(fù)載脂溶性藥物的方法：適量磷脂、膽固醇及其衍生物、 長(zhǎng)鏈有機(jī)酸，脂溶性藥物溶于有機(jī)溶劑，25~60°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，等滲溶液水化即得；對(duì) 于水溶性蒽醌類弱堿性藥物的方法：適量磷脂、膽固醇及其衍生物、長(zhǎng)鏈有機(jī)酸，溶于有機(jī) 溶劑，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入酸性（包括有機(jī)酸或無機(jī)酸）水溶液水化，然后再調(diào)節(jié)外水相為 弱堿性PH7. 5~8. 0,加入水溶性蒽醌類弱堿性藥物孵育過夜，即得。 (2) 具有內(nèi)化作用脂質(zhì)體制備：在步驟（1)得到的載藥普通脂質(zhì)體溶液中，加入適量 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDCl)EDCl和巰基化-N-羥基丁二酰亞胺 (s-NHS)活化脂質(zhì)體中的長(zhǎng)鏈有機(jī)酸，調(diào)節(jié)pH為10~12,再加入CPP得到具有內(nèi)化作用的 CPP修飾脂質(zhì)體，其中CPP修飾密度為磷脂物質(zhì)的量的4%~8%，優(yōu)選4%。 (3) 具有內(nèi)化作用的算敏感脂質(zhì)體的制備：加入聚乙二醇-腙鍵-長(zhǎng)鏈有機(jī)酸，孵育過 夜。其密度為磷脂物質(zhì)的量的8%~20%，優(yōu)選8%。 ⑷用截留分子量5000Da~300000Da的透析袋透析4h~48h或用截留分子量 5000Da~300000Da的超濾管在4000g~15000g離心IOmin~30min，即得。優(yōu)選截留分 子量為lOOOODa，透析時(shí)間12h，離心速度為lOOOOg，離心時(shí)間為20min。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的給藥系統(tǒng)的組成，其特征在于：所述細(xì)胞穿透肽為多聚精氨 酸短膚，優(yōu)選序列為Gly-Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg(GGRRRRRRRRR)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的給藥系統(tǒng)，其特征在于：聚乙二醇-腙鍵-長(zhǎng)鏈有機(jī)酸的 合成方法為：醛基化聚乙二醇（mPEG-CHO)溶于含稍過量的3-(2-吡啶二硫）丙酰肼（PDPH) 的氯仿溶液中，室溫反應(yīng)48h，氬氣保護(hù)中攪拌，合成mPEG-HZ-PDP。巰基化長(zhǎng)鏈有機(jī)酸溶于 無水氯仿，氯仿中含有過量mPEG-HZ-PDP，加入三乙胺，于室溫中氬氣保護(hù)下攪拌過夜。減壓 除去氯仿，偶聯(lián)物用SepharoseCL-4B純化，冷凍干燥得到白色粉末。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的給藥系統(tǒng)的組成，其特征在于所述聚乙二醇分子量為 500Da~5000Da，優(yōu)選 2000Da。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的給藥系統(tǒng)，其特征在于長(zhǎng)鏈有機(jī)酸選自硬脂酸、月桂酸、油 酸、棕櫚酸，肉豆蘧酸。優(yōu)選硬脂酸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的給藥系統(tǒng)，其特征在于：磷脂選自天然、半合成、全合成磷脂 及其衍生物。優(yōu)選的方案是所述磷脂選自但并不限于下述的大豆卵磷脂（SPC)、蛋黃卵磷脂 (EPC)、卵磷脂酰甘油（EPG)、多烯磷脂酰膽堿、磷脂酸、心肌磷脂、鞘磷脂、磷脂酸絲氨酸、磷 脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、氫化大豆磷脂（HSPC)、氫化蛋黃卵磷脂（HEPC)、全合成磷脂，如 C3至C30的各種合成磷脂，如二硬脂酰磷脂酰膽堿（DSPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC)、二 油酰磷脂酰膽堿（DOPC)、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿（DMPC)、二月桂酰磷脂酰膽堿（DLPC)、二 硬脂酰磷脂酰甘油（鈉鹽DSPG)、二棕櫚酰磷脂酰甘油（鈉鹽DPPG)、L-a-二肉豆蘧酰磷脂 酰甘油（鈉鹽DMPG)、二月桂酰磷脂酰甘油（DLPG)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE)、二棕櫚 酰磷脂酰乙醇胺（DPPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE)、二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺（DMPE)、 二月桂酰磷脂酰乙醇胺（DLPE)、雙二硬脂酰磷脂酰甘油（鈉鹽）、雙二棕櫚酰磷脂酰甘油 (鈉鹽）、雙二肉豆蘧酰磷脂酰甘油（鈉鹽）、雙二月桂酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰肌醇、 二棕櫚酰磷脂酰肌醇、二肉豆蘧酰磷脂酰肌醇、二月桂酰磷脂酰肌醇、棕櫚酰油酰磷脂酰膽 堿、棕櫚酰亞油酰磷脂酰膽堿、硬脂酰亞油酰磷脂酰膽堿、硬脂酰有酰磷脂酰膽堿、硬脂酰 花生四烯酰磷脂酰膽堿。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的給藥系統(tǒng)，其特征在于，包括膽固醇及其衍生物（如膽固醇 半琥珀酸酯）和谷甾醇。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述藥物為抗腫瘤藥物，包括蒽醌 類抗生素鹽酸阿霉素、阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素，鉬類藥物，如卡鉬、草酸鉬、依鉬、乙酸 鉬、順鉬，環(huán)磷酰胺、放線菌素、博來霉素、正定霉素、絲裂霉素、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、卡氮 芥（BCNU)、甲基-CCNU、鬼曰乙叉苷、依托泊苷、干擾素、喜樹堿及各種衍生物、苯芥膽甾醇、 紫杉酚（Taxol)及其衍生物、多西他賽及其衍生物、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞濱及其衍生 物、三苯氧胺、哌酰硫烷、四環(huán)三萜類化合物等。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的給藥系統(tǒng)，其特征在于，制備工藝步驟（1)中所述負(fù)載水溶 性藥物所用的有機(jī)酸或無機(jī)酸包括檸檬酸、乳酸、富馬酸、酒石酸、乙酸、葡萄糖酸、乳糖酸、 山梨酸、馬來酸、抗壞血酸、草酸、甲酸、苯磺酸、苯甲酸、谷氨酸、天冬氨酸、鹽酸、精氨酸等， 優(yōu)選梓檬酸。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的給藥系統(tǒng)，其特征在于：為脂質(zhì)體的混懸液或凍干粉針。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的給藥系統(tǒng)，其特征在于，制備方法包括過濾膜除菌。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的給藥系統(tǒng)，其特征在于，無溶血性，較強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)化作用，較強(qiáng) 腫瘤選擇性，是一種有前途的腫瘤靶向給藥系統(tǒng)。
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)中的藥物制劑領(lǐng)域。公開了一種具有內(nèi)化作用的酸敏感脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明將富有精氨酸殘基的細(xì)胞穿透肽與脂質(zhì)體表面長(zhǎng)鏈有機(jī)酸直接偶聯(lián)，結(jié)合具有酸敏感的聚乙二醇-腙鍵-長(zhǎng)鏈有機(jī)酸偶合物，采用薄膜水化法制備了負(fù)載脂溶性藥物和水溶性蒽醌類弱堿性藥物的腫瘤靶向脂質(zhì)體。其中，細(xì)胞穿透肽為多聚精氨酸短肽，優(yōu)選GGRRRRRRRRR，聚乙二醇分子量為500Da～5000Da，優(yōu)選2000Da，優(yōu)化細(xì)胞穿透肽密度為磷脂的2％～8%，優(yōu)選4%，聚乙二醇-腙鍵-長(zhǎng)鏈有機(jī)酸酸偶合物的密度為磷脂的5％～20%，優(yōu)選8％。本發(fā)明解決了目前脂質(zhì)體細(xì)胞內(nèi)化困難的問題，為抗腫瘤藥物靶向亞細(xì)胞器提供了可能。本發(fā)明的給藥系統(tǒng)基本無毒性，制備工藝簡(jiǎn)單，易于工業(yè)化應(yīng)用。
【IPC分類】A61K47-42, A61K9-19, A61K47-34, A61P35-00, A61K9-127, C08G65-48, A61K45-00
【公開號(hào)】CN104784118
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410026377
【發(fā)明人】謝輝, 陳建華
【申請(qǐng)人】謝輝, 陳建華
【公開日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2014年1月21日