具有內(nèi)化作用的酸敏感脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，尤其涉及腫瘤靶向脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)及其制備方法， 屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于生物相容性、生物可降解性，載藥多樣性，以及能夠提高藥物穩(wěn)定性，脂質(zhì)體 已經(jīng)成為一種被廣泛應(yīng)用的納米載體系統(tǒng)[1]。1995年第一個(gè)抗腫瘤藥物脂質(zhì)體制劑阿霉 素脂質(zhì)體被FDA首次批準(zhǔn)，進(jìn)入臨床[2]，其明顯改善了阿霉素的心臟毒性，但其藥效并沒 有顯著提高。為了增加藥物在靶區(qū)的蓄積進(jìn)一步提高藥效，脂質(zhì)體研究領(lǐng)域先后出現(xiàn)了具 有物理靶向性的pH敏感脂質(zhì)體[3,4]，熱敏脂質(zhì)體[5]，磁敏脂質(zhì)體[6, 7]，配體或抗體修飾 的能夠?qū)崿F(xiàn)主動(dòng)靶向的免疫脂質(zhì)體[8,9]以及多功能脂質(zhì)體[10]。
[0003] 近20年來，靶向脂質(zhì)體的修飾主要集中于受體介導(dǎo)[11-13]，受體介導(dǎo)的胞吞作 用實(shí)現(xiàn)了藥物在靶細(xì)胞的濃集。然而，當(dāng)藥物及其載體以胞吞作用入胞后第一步形成胞內(nèi) 體，然后被溶酶體吞噬，并在溶酶體內(nèi)豐富酶作用下被降解，由此造成藥物難以從溶酶體逃 逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，限制了藥物到達(dá)真正的靶點(diǎn)如細(xì)胞核或線粒體等亞細(xì)胞器發(fā)揮作用實(shí)現(xiàn)藥 效。
[0004] 近年來，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞穿透肽（cell penetrating peptides, CPP)因其富含精 氨酸殘基，可與細(xì)胞表面的陰離子物質(zhì)，包括糖胺聚糖、膜磷脂頭部等，發(fā)生強(qiáng)烈的相互作 用，激活細(xì)胞的攝取[14,15]。尤其當(dāng)CPP攜載的藥物進(jìn)入細(xì)胞形成胞內(nèi)體被溶酶體融合 后，CPP上的氨基可吸附H+，使細(xì)胞質(zhì)中的Cl-內(nèi)流進(jìn)入，造成溶酶體內(nèi)滲透壓增加，最終 使溶酶體破裂，藥物從溶酶體釋放于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核[16]，為其充分發(fā)揮藥效提供了前 提，這種效應(yīng)被稱作"質(zhì)子海綿效應(yīng)"。弗.哈夫曼-拉羅切有限公司申請(qǐng)了 PCT中國(guó)專利 CN103096932A，發(fā)明了一種具有氨基酸序列GRKKRRQRRRPPQ的TAT肽的內(nèi)化效力至少80%， 優(yōu)選至少90%的效力內(nèi)化入細(xì)胞，可攜載核酸和蛋白轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，在預(yù)防 和/或治療選自癌癥、免疫疾病、心血管疾病、神經(jīng)疾病、感染和炎性疾病的病癥中具有一 定的用途。但遺憾的是，目前為止發(fā)明的細(xì)胞穿透肽（CPP)均缺乏組織和細(xì)胞特異性[17]， 其在穿透腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)于正常細(xì)胞也有促攝取作用，由此造成了對(duì)正常組織的損害。 為進(jìn)一步發(fā)揮CPP對(duì)腫瘤組織的選擇性和靶向性，有文獻(xiàn)報(bào)道[18]用靶細(xì)胞特異性配體如 RGD和CPP共同修飾載體系統(tǒng)，利用RGD等對(duì)腫瘤的特異性將CPP "帶"到腫瘤實(shí)現(xiàn)CPP的 穿透內(nèi)化作用。另外，中國(guó)專利CN102552929A發(fā)明了由屏蔽肽、酶解底物肽、穿膜肽順序連 接形成可激活細(xì)胞穿透肽，利用PSA敏感性發(fā)明了一種給藥系統(tǒng)，改善了 CPP的靶向性。但 這種系統(tǒng)設(shè)計(jì)較為復(fù)雜不易實(shí)現(xiàn)大生產(chǎn)，以及尚存在免疫原性等問題，因此限制了其實(shí)際 應(yīng)用。
[0005] 此外，如我們所知，在脂質(zhì)體發(fā)展過程中，用聚乙二醇（poly (ethylene glycol)， PEG)衍生物對(duì)脂質(zhì)體膜層的修飾是一座歷史的里程碑[19]。然而，PEG對(duì)脂質(zhì)體的修飾是 一把"雙刃劍"。其在消弱了脂質(zhì)體與調(diào)理素作用的同時(shí)，也將減弱長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體達(dá)到靶部 位時(shí)與靶細(xì)胞的相互作用，甚至PEG鏈的水化層阻礙了所連接的配體、抗體的"靶向"作用， 降低靶向輸送和細(xì)胞攝取的效率[20]。上述中國(guó)專利CN102552929A中CPP即用聚乙二醇 連接后修飾于脂質(zhì)體表面，這種聚乙二醇水化層對(duì)于CPP作用的發(fā)揮具有"阻礙"作用，不 能充分發(fā)揮CPP的作用。
[0006] 眾所周知，腫瘤部位的pH明顯低于正常組織和血液[21]，腙鍵在低pH時(shí)容易水 解斷裂。因此，PEG通過腙鍵連接于脂質(zhì)體表面使得這種酸敏感脂質(zhì)體能夠最優(yōu)發(fā)揮其在 腫瘤部位的作用，也就是說在體循環(huán)PH7. 0條件下，PEG穩(wěn)定存在于脂質(zhì)體表面起到"保護(hù) 作用"，而在腫瘤低pH值的酸性區(qū)域，鏈接PEG的腙鍵斷裂使得PEG "離開"脂質(zhì)體表面促 進(jìn)細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的攝取。Kale，A.A. and Torchilin，V.P. [22]·曾經(jīng)提出一種TATp修飾的 pH敏感脂質(zhì)體，其中TATp通過與短鏈聚乙二醇（PEG1000 )-PE偶合形成TATp-PEGlOOO-PE 插入脂質(zhì)體表面，聚乙二醇長(zhǎng)鏈mPEG2000通過腙鍵與PE偶聯(lián)（mPEG2000-HZ-PE)插入脂質(zhì) 體表面實(shí)現(xiàn)酸敏感的長(zhǎng)循環(huán)。這種酸敏感給藥系統(tǒng)雖然在一定程度上提高了 CPP的對(duì)于腫 瘤的選擇性，但依然沒有考慮并改善PEG的水化層的阻礙作用，沒有使CPP的作用充分發(fā)揮 出來。除此之外，長(zhǎng)循環(huán)酸敏感部分mPEG2000-HZ-PE中所用到的PE是具有兩個(gè)長(zhǎng)鏈有機(jī) 酸的磷脂分子，其具有較小的臨界膠束濃度，在該酸敏感脂質(zhì)體制備中更易形成膠束而難 以插入脂質(zhì)體表面，在制備中存在酸敏感偶合物修飾率低的問題。
[0007] 針對(duì)Kale, A. A. and Torchilin，V. P.設(shè)計(jì)的這種酸敏感脂質(zhì)體中存在的問題， 我們?cè)O(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單有效的CPP修飾的酸敏感脂質(zhì)體，其中CPP與硬脂酰（STR)直接偶聯(lián) 修飾脂質(zhì)體表面，避免了 PEG的"阻礙"作用，另外，用單鏈有機(jī)酸（如硬脂酸STR)合成了 mPEG20000-Hz-STR，其中用單鏈STR代替了雙鏈PE，較（mPEG2000-HZ-PE)有更高的臨界膠 束濃度，在脂質(zhì)體制備中不易形成膠束，反而更容易插入脂質(zhì)體表面，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)循環(huán)性。這種 簡(jiǎn)單有效的靶向脂質(zhì)體制劑兼具體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)、腫瘤物理靶向以及細(xì)胞穿透內(nèi)化三種特性， 能同時(shí)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤藥物在腫瘤區(qū)的高效定位濃集和快速細(xì)胞穿透兩個(gè)目的。而且該制劑制 備簡(jiǎn)單，易于大生產(chǎn)，對(duì)所有腫瘤具有廣譜適用性，有望助于腫瘤靶向給藥制劑在臨床應(yīng)用 上零的突破。
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