專利名稱：活性成分的新脂質(zhì)體載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于活性成分穩(wěn)定的，呈粉末狀的脂質(zhì)體，更具體講，該活性成分對(duì)消化和/或血漿的降解是敏感的，例如蛋白質(zhì)，本發(fā)明還涉及所述脂質(zhì)體作為醫(yī)藥產(chǎn)品的應(yīng)用。
眾多載體已被提議用來(lái)保護(hù)脆弱的活性成分；其中，可提到的有脂質(zhì)體，它已被考慮作為入選的載體。
脂質(zhì)體口服的首先研究尚未被下結(jié)論(Deshmukh DS.et al.，LifeSciences，1981，28，239-242)。所得結(jié)果指出，具有下列配方二乙醚卵磷脂(未消化的卵磷脂同系物)/膽固醇-7∶1可對(duì)包封的肽有胃腸道保護(hù)，但它不能過(guò)腸道屏障。
有幾種理由可提出來(lái)解釋通道的不存在脂質(zhì)體過(guò)分地大和未校準(zhǔn)的尺寸，結(jié)構(gòu)的低穩(wěn)定性，或被包封的化合物滲透到脂質(zhì)體介質(zhì)外。
最近，Robert Greenwood的研究組(Drug Dev.and Ind.Pharm.，1993，19，11，1303-1315)在美國(guó)Campbell大學(xué)已經(jīng)成功地指出，脂質(zhì)體載體化的胰島素的十二指腸插管，導(dǎo)致高度的低血糖效應(yīng)，這比游離胰島素溶液的十二指腸插管所得的結(jié)果要高。
已進(jìn)行許多試驗(yàn)，以獲得具有良好運(yùn)送活性成分能力的脂質(zhì)體，特別是就活性成分的吸收百分率的作用以及脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和活性成分的生物利用度而言。可提到的這方面研究有——S.B.Kulkarni et al.(J.Microencapsulation，1995，12，3，229-246)指出參與脂質(zhì)體醫(yī)藥產(chǎn)品微包封的因素為脂質(zhì)體的大小，脂質(zhì)體的類型，脂質(zhì)體的表面電荷，雙層的剛性，加入的包封佐劑。從評(píng)價(jià)角度講含有幾個(gè)雙層并具有100nm-20mm直徑MLVs(多片層囊泡)對(duì)包封與雙層作用的疏水性醫(yī)藥產(chǎn)品是需要的；而含有單一雙層并具有粒徑100-1000nm的LUVs(大的單片層囊泡)則最適用于包封親水性醫(yī)藥產(chǎn)品。
——I.De Miguel et al.，(Biochemica et Biophysica Acta，1995，1237，48-49《sic》)提議由一種內(nèi)核組成的毫微粒子，內(nèi)核由交聯(lián)的多糖形成，后者用脂肪酸移植到其外表上，并被一層磷脂所包圍；——P.S.Uster et al.，(FEBS Lettters，1996，386，243-246)建議在經(jīng)過(guò)初步加工的脂質(zhì)體中，植入用聚乙二醇修飾的磷脂，以改善其生物利用度。
有關(guān)肽類口服的一系列實(shí)驗(yàn)已被進(jìn)行，并采用了不同的脂質(zhì)體包封法或者用通過(guò)移植親脂性官能團(tuán)對(duì)脂質(zhì)的活性成分作改良。在所有情況中，目標(biāo)是將脂質(zhì)活性成分轉(zhuǎn)變?yōu)椤扒八帯?；該前藥具有抵擋胃腸道運(yùn)送的性質(zhì)，即，耐胃中pH，耐生理去污劑(膽汁鹽)，耐蛋白酶(腸內(nèi)肽鏈端解酶和肽鏈內(nèi)切酶)以及耐通過(guò)腸內(nèi)菌絲產(chǎn)生的代謝。例如，跨過(guò)1，3-甘油二酯的2-位到五肽上面，使得如此修飾的藥物的這些性質(zhì)成為可能。
可是，先有技術(shù)的各種各樣脂質(zhì)體如不修飾活性成分不能既獲得良好穩(wěn)定性以及可以接受的活性成分包封產(chǎn)率，又獲得所述活性成分口服生物利用度的明顯改進(jìn)，并由此保留活性成分所有的功能和性質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“生物利用度”意指藥物的藥理學(xué)活性形式達(dá)到全身循環(huán)時(shí)吸收劑量的程度和速度的綜合參數(shù)。
J.C.Hauton描述了帶有凝膠化內(nèi)核的脂質(zhì)體(商品名lipogelosomes)，其懸浮在含有凝膠化物質(zhì)的水相介質(zhì)中，特別是他已經(jīng)開發(fā)一種制造這種脂質(zhì)體的方法(歐洲專利0 393 049)，其不同于常規(guī)的脂質(zhì)體在于包封的水相呈半固體的凝膠狀，而不是液體狀，這防止了脂質(zhì)體在碰撞時(shí)熔化。這種lipogelosomes完全從天然物質(zhì)產(chǎn)生而得，因此將不可承受的風(fēng)險(xiǎn)降低到最低限度。具體講，在歐洲專利0 393 049中，這些lipogelosomes由一種雙層界面相所組成，在單層lipogelosomes或許多雙層界面相情況下，其是中心疊架的，在多層lipogelosomes以及凝膠化的包封的內(nèi)部極性水相情況下，其中凝膠化物質(zhì)可以是聚合或不聚合的，其選自多糖、多肽、聚丙烯基酰胺；例如，非聚合的膠凝化物質(zhì)選自明膠、瓊脂糖或角叉菜膠，而聚合的膠凝化物質(zhì)選自聚丙烯酰胺凝膠。這些lipogelosomes，與先有技術(shù)中的脂質(zhì)體相比具有顯著提高的穩(wěn)定性，特別是因?yàn)椴淮嬖谂鲎策^(guò)程中發(fā)生顆粒間的熔化。
可是，它們有在液相中脂質(zhì)體為分散形式的弊端，這不適宜于制備易儲(chǔ)存和服用的固體配方。
因而，申請(qǐng)人目的是提供新的載體，與先有技術(shù)中脂質(zhì)體相比，其可有效地獲得活性成分的顯著包封產(chǎn)率，以及活性成分明顯改進(jìn)的口服生物利用度，與此同時(shí)還顯示出良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和體內(nèi)穩(wěn)定性。所述載體適合于口服給藥；含水溶液也適合于其它給藥途徑例如透皮、經(jīng)肺、經(jīng)鼻、生殖器、靜脈、皮下或眼睛，這取決于所選擇的賦形劑。
所述載體的特征在于——基本上由單層狀脂質(zhì)體所組成的粉狀組合物，其包括外部類脂相和內(nèi)部含水核，脂相由4類脂(磷脂類)，及選擇性與2類物質(zhì)(長(zhǎng)鏈三甘油酯類、膽固醇酯類)，3類物質(zhì)(膽固醇，非離子化的長(zhǎng)鏈脂肪酸類)和/或5類物質(zhì)(膽酸鹽、梭鏈孢酸衍生物)結(jié)合而組成含水核形成了溫度可逆的含水凝膠，其輻射到外部類脂相，內(nèi)部含水核基本上由，至少兩種不同的非聚合的膠凝劑G1和G2的混合物M組成，G1和G2的凝膠-溶膠相過(guò)渡點(diǎn)高于或等于37℃，G1是選自明膠和角叉菜膠，如k-角叉菜膠的凝膠劑；G2選自角叉菜膠，但其性質(zhì)不同于為G1選擇的角叉菜膠(例如i-角叉菜膠)以及纖維素，例如羥丙基甲基纖維素；脂質(zhì)體直徑20nm-1mm，優(yōu)選20nm-500nm；粒子單位形式的平均直徑為10mm-1000mm，形成自一種或多種上述脂質(zhì)體，其被選自脫水的溫度可逆含水凝膠、糊精或其混合物所組成的基質(zhì)包圍，該水凝膠和上述內(nèi)核的水凝膠是同樣的，以致于包括平均1016-1018脂質(zhì)體/克粉末，以及—至少包括一種活性成分，取決于在所述組合物的凝膠化內(nèi)核中，或外部親脂相中。意想不到的是該載體克服了常規(guī)脂質(zhì)體有關(guān)的缺陷，特別是能—增加脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，因?yàn)椴淮嬖谂鲎策^(guò)程中顆粒間的融合。
—增加活性成分的生物利用度(在胃腸道得到保護(hù)并通過(guò)腸道屏障)；特別是在大鼠體上，按照本發(fā)明(LGS)，從口服載體算起，載體通過(guò)腸屏障的時(shí)間在2-4小時(shí)內(nèi)，即一小時(shí)胃排空，1-3小時(shí)從腸腔通道進(jìn)入全身循環(huán)；于是當(dāng)用本發(fā)明載體包封活性成分時(shí)，不用改進(jìn)活性成分的活性或組分，細(xì)胞內(nèi)在化容量是低的或不存在的活性成分能有效地混入分化的腸上皮細(xì)胞中。
—降低包封的活性成分的毒性，以及—較少地導(dǎo)致包封的產(chǎn)物泄漏，因?yàn)樵谀z凝化包著的水相中降低了分子流動(dòng)性。
意想不到的是，通過(guò)選擇膠凝劑，可得到脂質(zhì)體(SUVs或小單層囊泡)，它適宜以干燥形式(粉末)使用，而且作為活性成分的載體具有特別有利的性質(zhì)；按專門術(shù)語(yǔ)來(lái)說(shuō)，所述活性成分具有意外的口服生物利用度，特別是對(duì)消化降解敏感的，吸收差的，具有高度毒性的活性成分而言，生物利用度有顯著增加(當(dāng)它們，用本發(fā)明載體包封或結(jié)合時(shí))。
此外，該粉狀載體保存了脂質(zhì)體所有的完整性，它們既以粉末狀又以懸浮狀隨時(shí)間保持穩(wěn)定，基于維持了脂類組成的完整性(無(wú)降解產(chǎn)物)以及維持膠凝劑特征的完整性，特別是對(duì)G1和G2的混合物(粘度、凝膠強(qiáng)度、破裂力、分子質(zhì)量)。
在此上下文中，為了活性成分口服給藥的目的，應(yīng)用lipogelosomes受益于穩(wěn)定的脂質(zhì)體形式(J.C.Hauton et al.，Eur.J，Surg.，1994，suppl.574，117-119)。生產(chǎn)LGSs的方法使有可能獲得膠凝化親水相的包封平均程度接近10％。這一百分率會(huì)改變，特別根據(jù)活性成分的分子量，并可按此比率計(jì)算包封活性成分的量/所用活性成分的量。例如，對(duì)500Da的分子，可觀察到至少5％包封；對(duì)20kDa的分子，可觀察到至少50％包封。例如，就肽類而言，大體上可觀察到10-50％包封；而對(duì)于活性成分，大體上包封的百分率范圍為5-80％，視情況而定。
膠凝劑G1和G2之不同，特別在于以下方面粘度、分子質(zhì)量和凝膠-溶膠過(guò)渡點(diǎn)(即熔點(diǎn))。對(duì)膠凝劑G1，該溫度小于或等于45℃，而對(duì)膠凝劑G2，則大于或等于45℃。
如上定義的至少兩種膠凝劑G1和G2混合物M具有織構(gòu)特征(凝膠強(qiáng)度和斷裂力)，從所得脂質(zhì)體穩(wěn)定性和包封活性成分的生物利用度的觀點(diǎn)看，這是特別有益的。因而，至少兩種膠凝劑G1和G2的混合物M于5℃優(yōu)先具有70-100％松弛特性，優(yōu)選81-89％，和1000-1600g斷裂力，優(yōu)選1109-1503g。
根據(jù)所述組合物的另一有利實(shí)施方式，所述脂質(zhì)體的含水內(nèi)核也至少包含一種配糖性質(zhì)穩(wěn)定劑和/或至少一種用來(lái)調(diào)節(jié)介質(zhì)和/或至少一種表面活性劑，如膽質(zhì)鹽和/或非離子表面活性劑的滲透性的試劑。
所述脂質(zhì)體優(yōu)選包括，以％(m/m)表示25-75％4類類脂類，5-45％膠凝劑，0-70％具配糖性質(zhì)的穩(wěn)定劑，0-15％調(diào)節(jié)介質(zhì)容積滲克分子濃度(滲透性)的試劑，0-20％表面活性劑以及0-15％糊精，優(yōu)選8-12％；該組合物不包括活性成分。
按照本發(fā)明所述粉狀組合物的另一優(yōu)選實(shí)施方式，所述含水內(nèi)核包括70-95％膠凝劑G1以及5-30％膠凝劑G2。
按照本發(fā)明所述粉狀組合物另一優(yōu)選實(shí)施方式，具有糖苷性質(zhì)的穩(wěn)定劑是果糖、海藻糖或任何其它的保護(hù)劑。
本發(fā)明的主題也包括制備本發(fā)明粉狀脂質(zhì)體的方法，其中顆粒單位的外部基質(zhì)包括溫度可逆的含水凝膠的部分，其特性在于包括下列步驟(1)，在含水相中制備帶有膠凝內(nèi)核(lipogelosomes)的脂質(zhì)體分散體，其是通過(guò)下面步驟制備的(a)制備至少一種合適的膠凝劑溶液，特別是膠凝劑G1和G2的混合物M，即通過(guò)將所述膠凝劑伴隨慢速攪拌于高于所述膠凝劑的凝膠-溶膠相轉(zhuǎn)移溫度的溫度下溶于水相溶液中，該水溶液的pH與被包封的活性成分是相容的，(b)將活性成分摻入得自(a)所得溶液，(c)將類脂摻入(b)所得溶液，慢速攪拌混合物，歷時(shí)少于5小時(shí)，優(yōu)選在真空下，于是形成乳劑，(d)通過(guò)快速攪拌得自(c)的乳劑，優(yōu)選真空下，在含有所述膠凝劑的含水相中得到上述帶有膠凝內(nèi)核的脂質(zhì)體(lipogelosomes)；和(2)將所得的分散體作合適的干燥處理，以生產(chǎn)粉末狀產(chǎn)品。根據(jù)所述方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，干燥是通過(guò)霧化、凝聚，薄層或成粒進(jìn)行的。
本發(fā)明另一目的是制備本發(fā)明粉狀載體的方法，其中顆粒單位的外部基質(zhì)包含溫度可逆性含水凝膠和/或糊精部分，其特征在于包括如下步驟(1)，在含水相中制備帶有膠凝內(nèi)核(lipogelosomes)的脂質(zhì)體分散體，其通過(guò)如下步驟制備(a)制備至少一種合適的膠凝劑溶液，特別是膠凝劑G1和G2的混合物M溶液，即通過(guò)將上述膠凝劑伴隨溫和攪拌于高于上述膠凝劑的凝膠-溶膠相轉(zhuǎn)移溫度的溫度下溶于在水相溶液中，水相溶液pH與包封的活性成分是相容的，(b)將活性成分摻入得自(a)的溶液，(c)將類脂摻入得自方法(b)的溶液，緩慢攪拌混合物，歷時(shí)少于5小時(shí)，優(yōu)選在真空下，于是形成乳劑，(d)通過(guò)快速攪拌得自方法(c)的乳劑，優(yōu)選在真空下，在含有上述膠凝劑的外部含水相中得到上述帶有膠凝內(nèi)核的脂質(zhì)體(lipogelosomes)，和(2)部分除去含有所述膠凝劑的含水液相，其中脂質(zhì)體被分散，(3)添加至少一種合適的糊精，以及(4)通過(guò)霧化干燥得自步驟(3)的產(chǎn)品制備粉狀產(chǎn)物。
根據(jù)所述方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，至少部分除去含有上述膠凝劑的含水液相步驟(2)是通過(guò)稀釋和/或過(guò)濾進(jìn)行的。
按照本發(fā)明的制備方法，步驟(a)中的水溶液也包括用于調(diào)節(jié)介質(zhì)的滲透性的試劑(例如0.9％NaCl)和/或配糖性質(zhì)的穩(wěn)定劑和/或表面活性劑，優(yōu)選5類物質(zhì)(膽質(zhì)鹽)。
作為一種變化，活性成分可在與得自步驟(a)的混合物摻合之前，加到外部類脂相中。
例如，降鈣素，AZT和阿霉素被摻入時(shí)的pH值分別為5、7.5和3。
令人驚奇地，這種方法可在一步中得到粉末狀載體，這基于帶有膠凝化內(nèi)核(lipogelosomes)的穩(wěn)定脂質(zhì)體，其包括在低速下于水相中組成物的相成熟(即成熟之意)隨后在高速下相分散(形成lipogelosomes)，其包括一個(gè)步驟，其間在液相中得到形態(tài)均勻的穩(wěn)定分散lipogelosomes隨后進(jìn)行干燥；帶有有效凝膠化內(nèi)核的脂質(zhì)體分散體具有如下的形態(tài)學(xué)特征·直徑在20-500nm囊狀結(jié)構(gòu)，優(yōu)選20-80nm，·負(fù)染色顯微鏡觀察，冷破裂，冷傳導(dǎo)和原子力囊泡或囊泡集合，帶有磷脂雙層的特征表觀；負(fù)染色使有可能觀察到包封的外部磷脂層的膠凝劑混合物M的或多或少存在，以及·帶有10-55％(優(yōu)選10-30％)膠凝化內(nèi)相的脂質(zhì)體的多分散度。
該方法具有可重復(fù)性并完全適用于工業(yè)規(guī)模的優(yōu)點(diǎn)。
該方法也具有比先有技術(shù)中方法更少的處理步驟，其中在專利0393049中聲處理、擠壓或去污劑的除去是需要的。
按照上述方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，步驟(C)優(yōu)選在剪切速率小于200S-1下進(jìn)行；通常，剪切速率基于如下比率得出攪拌設(shè)備的速度/反應(yīng)器內(nèi)壁和攪拌葉片末端之間的空間(也稱作空隙)。
本發(fā)明另一方面涉及藥物組合物，其特征在于其包含如上定義的粉末狀脂質(zhì)體活性成分載體，以及至少一種藥用賦形劑。
按照所述組合物的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其為固體形式(凝膠囊，片劑或被溶入水中的粉劑)。
按照所述組合物的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其還包含cAMP活化劑。
除了前述以外，本發(fā)明也包含其它描述，這將隨著下面描述，參照實(shí)施本發(fā)明的實(shí)施例及附圖而變得更清晰，其中—

圖1表示血鈣隨時(shí)間的變化，(-D-＝游離降鈣素；-■-＝本發(fā)明LGS-降鈣素載體)；—圖2表示從游離降鈣素得到的血鈣和口服本發(fā)明LGS-降鈣素載體的血鈣之后所得AUC的差異；—圖3表示尿鈣隨時(shí)間的變化，(-■-＝500kDa LGS-降鈣素載體，-□-＝游離降鈣素，-□-＝300kDa LGS-降鈣素載體)；—圖4表示磷酸鹽血作為時(shí)間函數(shù)的評(píng)價(jià)(-D-＝游離降鈣素，-■-＝本發(fā)明LGS-降鈣素載體)；—圖5表示從游離降鈣素得到的磷酸鹽血和口服本發(fā)明LGS-降鈣素載體得到的磷酸鹽血之間AUC的差異；—圖6表示磷酸鹽尿隨時(shí)間的變化(-■-＝LGS-降鈣素載體((PA-載體)結(jié)構(gòu))，分子量至少大于500kDa，其相等于lipogelosomes包封的降鈣素且直徑至少大于40nm)，-□-＝游離降鈣素；-□-＝LGS-降鈣素載體((PA-載體)結(jié)構(gòu))，分子量至少大于300kDa，其相等于lipogelosomes包封的降鈣素且直徑至少大于20nm；—圖7表示SGOT(IU/1)隨時(shí)間的變化(-□-＝游離降鈣素；-◆-＝本發(fā)明LGS-降鈣素載體)；—圖8表示SGPT(IU/1)隨時(shí)間的變化(-□-＝游離降鈣素；-◆-＝本發(fā)明LGS-降鈣素載體)；—圖9表示用游離降鈣素處理的組和用本發(fā)明LGS-降鈣素載體處理的組之間SGPT的AUC差異。
但應(yīng)清楚地明白為描述本發(fā)明主題給出的實(shí)施例不意味著對(duì)本發(fā)明任何限制。實(shí)施例1對(duì)膠凝劑G1和G2混合物的結(jié)構(gòu)特征測(cè)量a)材料和方法在TA-XT2i機(jī)器(來(lái)自Rheo公司)上進(jìn)行。研究涉及破裂和松弛試驗(yàn)中凝膠的性質(zhì)，凝膠由明膠，i-，k-角叉菜膠的混合物組成。
·樣品的濃縮凝膠/i-/k-角叉菜膠混合物(80/17.5/2.5)在5mM Na2HPO4及0.9％或2％NaCl介質(zhì)中濃度為7.5％w/v。
·膠凝劑溶液的制備將氯化鈉在裝配有汽輪式混合器和行星齒輪構(gòu)件并含有純化水(在10rpm下進(jìn)行15分鐘)的混合器中溶解，混合器升溫到75℃(于10rpm攪拌45分鐘)，將膠凝劑(凝膠、i-和k-角叉菜膠)于75℃加入混合器中，汽輪式混合器設(shè)定在1500rpm溶解步驟持續(xù)約30分鐘。當(dāng)溶液澄清且懸浮液里不含顆粒時(shí)，溶解完成。
·樣品的制備為作松弛試驗(yàn)，45ml凝膠趁熱倒入平底Petri皿(外徑92±2mm)，為作破裂試驗(yàn)，30ml凝膠趁熱倒入平底結(jié)晶皿(外徑50±2mm)。通過(guò)冷卻至溫度低于或等于37℃得到凝膠。凝膠成熟時(shí)間，即凝膠的最大水化程度，在研究的溫度下和在靜止的狀態(tài)中為2.5天。
·操作條件為作松弛試驗(yàn)，對(duì)凝膠在給定時(shí)間施加壓力，所用流動(dòng)元件是鋁圓筒(直徑25mm)，初速為1.0mm/s，速度為0.5mm/s，后速為10.0mm/s。流動(dòng)元件的置換為30秒1.0mm。為了做破裂試驗(yàn)，所用流動(dòng)元件為硬質(zhì)膠筒(直徑為10mm)，初速，速度及后速為1.0mm/s，流動(dòng)元件的置換為12mm。
b)在5℃下的研究結(jié)果，用0.9％氯化鈉。
松弛(％)最小值81±2.2最大值89±0.8破裂力(克)最小值1109±25最大值1503±35c)溫度和不同氯化鈉含量的作用結(jié)果操作條件相同于a)所敘述的那些，但不同于松弛試驗(yàn)中的流動(dòng)元件的置換(凝膠總厚度20％的置換)。
松弛作用(％)在5℃ 0.9％ NaCl 89±0.82％ NaCl 90±0.2在25℃ 0.9％ NaCl 32±3.9
2％ NaCl 38±4.4在37℃ 0.9％ NaCl 36±3.72％ NaCl 40±4.9破裂力(g)在5℃ 0.9％ NaCl 1413±662％ NaCl 1114±143在25℃ 0.9％ NaCl 211±2.72％ NaCl 173±1.5在37℃ 0.9％ NaCl 25.7±2.42％ NaCl 44.7±3.9實(shí)施例2制備含有降鈣素的本發(fā)明粉狀載體的方法1)制備帶有凝膠化內(nèi)部相脂質(zhì)體的分散體(lipogelosomes)組分大豆卵磷脂11.915kg(7.943％)明膠B150 7.149kg(4.766％)i-角叉菜膠1.565kg(1.043％)k-角叉菜膠0.222kg(0.148％)蔗糖 8.936kg(5.957％)氯化鈉1.073kg(0.715％)純化水119.15kg(79.43％)總含量150.01kg(100％)a)脂質(zhì)體分散體的制備下列物質(zhì)的混合物—明膠B150 7.149kg—i-角叉菜膠 1.565kg—k-角叉菜膠 0.222kg—蔗糖 8.936kg
—氯化鈉 1.073kg—鵝脫氧膽酸鈉1.131kg—純化水 118.00kgq.s.150kg上述物質(zhì)置混合器內(nèi)(速度10rpm)預(yù)混合，其平面構(gòu)件的轉(zhuǎn)速為1500rpm/1.5小時(shí)(在真空下)。
b)降鈣素的摻合用6N濃醋酸降低混合物的pH值，通過(guò)持續(xù)添加達(dá)到穩(wěn)定的pH值4.5。然后加入4.075克鮭降鈣素(Bachem，加利福尼亞)，其比活性為7017IU/mg。
c)磷脂類摻入得自a)的溶液混合器中將大豆卵磷脂(11.915kg)加入先前的混合物中，混合器轉(zhuǎn)速為10rpm，其中平面構(gòu)件的轉(zhuǎn)速為1500rpm，在真空下進(jìn)行5小時(shí)，直到乳劑形成。最后的分散通過(guò)平面構(gòu)件(25rpm)和汽輪混合器(2500rpm)攪拌速度增加來(lái)進(jìn)行，歷時(shí)足以獲得多分散度(小于40％)。在含水相中得到lipogelosomes的分散體。
負(fù)染色顯微鏡觀察，低溫?cái)嗔?，低溫透射和原子力顯微鏡法囊泡或囊泡的集群具有磷脂雙層的特征面貌，負(fù)染色使得有可能或多或少觀察到外部膠凝劑的顯著存在(按照所選定的制備和/或分離方法)。
d)正切過(guò)濾一個(gè)體積lipogelosomes的分散體(得自上述步驟的分散體)被稀釋于20倍體積的熱的0.9％NaCl溶液中，并攪拌。稀釋物(0.9％NaCl)用8.25×10-4％鵝脫氧膽酸酯補(bǔ)充，這取決于先前分散體中表面活性劑的存在。未被包封的相經(jīng)過(guò)連續(xù)的熱正切超過(guò)濾被排除。超過(guò)濾在帶選擇性的多孔膜(300或500kDa)上進(jìn)行，這取決于所得lipogelosomes所需的顆粒大小。該產(chǎn)物是至少包封17％鮭降鈣素的lipogelosomes懸浮體，其中當(dāng)懸浮體通過(guò)300kDa超過(guò)濾時(shí)脂質(zhì)體的直徑范圍為20-500nm；以及當(dāng)懸浮體通過(guò)500kDa超過(guò)濾時(shí)，為40nm-500nm。
2)所得分散體的干燥所形成的在含水相中的lipogelosomes分散體被轉(zhuǎn)移到干燥器中(50-100毫巴真空度)，約需要4小時(shí)。得到十分均勻的深灰稻草黃色粉末，所含顆粒直徑為0.1-1mm。
在電子顯微鏡下觀察到類脂包囊的自身收縮是由于脫水的緣故。進(jìn)一步在液態(tài)情況下被注意到，LGSs經(jīng)常聚集在均勻的膠凝化基質(zhì)內(nèi)側(cè)，處于無(wú)數(shù)被分離的泡囊結(jié)構(gòu)的環(huán)境里。干燥步驟在聚集體的表面改變了膠凝化基質(zhì)成為干燥膠凝劑的絲狀體，但也在游離的囊狀結(jié)構(gòu)的表面發(fā)生了所述變化。
作為一個(gè)變型，干燥步驟如下在含水相中l(wèi)ipogelosomes的分散體被直接分布到旋轉(zhuǎn)鼓形干燥器中(溫度為120-150℃，轉(zhuǎn)速為3-6rpm)。所得“削下薄片”被研磨，并在合適的柵板上校準(zhǔn)。得到具有如上定義特征的lipogelosomes(以下也稱為L(zhǎng)GS)粉末。通過(guò)加入填料賦形劑，例如，麥芽糊精或β-環(huán)糊精，使干燥最佳優(yōu)化。實(shí)施例3大鼠口服后，按實(shí)施例2得到的游離或包封的降鈣素(在載體內(nèi))的比較作用與游離態(tài)降鈣素口服效應(yīng)相比，分析實(shí)施例2制劑對(duì)鈣血、鈣尿、磷酸鹽血和磷酸鹽尿的效應(yīng)，對(duì)服用兩種形式的降鈣素的藥物動(dòng)力學(xué)也作了比較。
其它參數(shù)也做了分析轉(zhuǎn)氨酶(SGOT的SGPT)和血糖。
重要的是注意到在血鈣正常的大鼠和人體上的降鈣素的效應(yīng)難以顯示，而處于病理狀態(tài)的個(gè)體(高鈣血個(gè)體)對(duì)此激素的反應(yīng)是比較敏感的。
實(shí)驗(yàn)原始記錄·LGS-降鈣素的制備 見實(shí)施例2。
·動(dòng)物和藥理學(xué)治療動(dòng)物10組，每組10只Wistar Ico大鼠(IOPS AF/Han，IFFA CREDO)，即總共100只大鼠，6周齡，體重160-180克。動(dòng)物體重在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)稱量，就此參數(shù)而言，能確保個(gè)組每一只大鼠均勻分配。6個(gè)實(shí)驗(yàn)組事先喂食7天，生活制度基于消毒的“AO4(UAR＝Usined’Alimentation Rationelle(方案提供者))。大鼠被禁食，并在服用實(shí)驗(yàn)劑量前24小時(shí)隨意給予葡萄糖。動(dòng)物的體重在服用實(shí)驗(yàn)劑量前加以監(jiān)控。
實(shí)驗(yàn)方案動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)組A，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I和J的組成如下A組10只對(duì)照大鼠，在0時(shí)分取血漿樣和尿樣。
B組10只大鼠被插管，1.8ml的500kDa LGS-Cal的懸浮體(降鈣素濃度54IU/大鼠，即330IU/kg)給予每只大鼠。在45分鐘時(shí)取血漿和尿。
C組10只大鼠被插管，1.8ml的500kDa LGS-Cal的懸浮體(降鈣素濃度54IU/大鼠，即330IU/kg)給予每只大鼠。在90分鐘時(shí)取血漿和尿。
D組10只大鼠被插管，1.8ml的500kDa LGS-Cal的懸浮體(降鈣素近似濃度54IU/大鼠，即330IU/kg)給予每只大鼠。在180分鐘時(shí)取血漿和尿。
E組10只大鼠被插管，1.8ml的500kDa LGS-Cal的懸浮體(降鈣素濃度54IU/大鼠，即330IU/kg)給予每只大鼠。在300分鐘時(shí)取血漿和尿。
F組10只大鼠被插管，1.8ml游離降鈣素懸浮體(濃度54IU/大鼠，即330IU/kg)給予每只大鼠。在45分鐘時(shí)取血漿和尿。
G組10只大鼠被插管，1.8ml游離降鈣素懸浮體(濃度54IU/大鼠，即330IU/kg)給予每只大鼠。在90分鐘時(shí)取血漿和尿。
H組10只大鼠被插管，1.8ml游離降鈣素懸浮體(濃度54IU/大鼠，即330IU/kg)給予每只大鼠。在180分鐘時(shí)取血漿和尿。
I組10只大鼠被插管，1.8ml游離降鈣素懸浮體(濃度54IU/大鼠，即330IU/kg)給予每只大鼠。在300分鐘時(shí)取血漿和尿。
J組10只大鼠被插管，1.8ml 300kDa LGS-Cal懸浮體(降鈣素濃度36IU/大鼠，即228IU/kg)給予每只大鼠。在90分鐘時(shí)取血漿和尿。
麻醉—用Rompun(2％甲苯噻嗪；10mg/kg)Imalgene(10％氯胺酮；60mg/kg)、按實(shí)驗(yàn)方案所示時(shí)間經(jīng)腹膜內(nèi)注射。
取樣—在麻醉下通過(guò)導(dǎo)管插入，從腹主動(dòng)脈取出血樣，A組在0時(shí)間；B組和F組在45分鐘；C，G和J組在90分鐘；D和H組在180分鐘；E組和I組300分鐘。膀胱也作插套管，按照取血樣規(guī)定時(shí)間定時(shí)取尿樣。用離心分離法，在含3.8％EDTA(非蛋白質(zhì)抗凝血?jiǎng)?的管中離心分離(3000rpm，15分鐘)血樣后，得到全血漿。
分析對(duì)每個(gè)血漿樣品用比色法測(cè)定鈣血、磷酸鹽血和轉(zhuǎn)氨酶。
數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理—對(duì)每組10只大鼠的測(cè)定結(jié)果以平均±SEM表示。數(shù)據(jù)將用統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)試的方法作比較，其適合于這種類型的實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)處理(參數(shù)和藥物動(dòng)力學(xué)研究)。所選擇的統(tǒng)計(jì)學(xué)試驗(yàn)是ANOVA試驗(yàn)或方差分析，誤差的顯著性用Fisher試驗(yàn)和更加有識(shí)別性的Scheffe試驗(yàn)確定。
兩種方法用來(lái)表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果與所考慮的參數(shù)相關(guān)的10個(gè)數(shù)據(jù)平均值的圖解以及AUCs(曲線下面積)比較分析。該表達(dá)的方法能評(píng)定所得應(yīng)答范圍內(nèi)差別。
按照藥物動(dòng)力學(xué)技術(shù)所得的結(jié)果表示作為時(shí)間的函數(shù)的程度變化。在此情況下并不是劑量效應(yīng)的探索。
結(jié)果·游離降鈣素或以LGS-Calc形式包封的降鈣素對(duì)鈣血的藥物動(dòng)力學(xué)效應(yīng)圖1表示鈣血隨時(shí)間的變化。測(cè)定鈣濃度的分析通過(guò)藥典中的比色法進(jìn)行。鈣血的基礎(chǔ)值(在0時(shí)間)與先前的數(shù)據(jù)相關(guān)性甚好。每一個(gè)點(diǎn)代表10個(gè)數(shù)值的平均值，即10個(gè)獨(dú)立大鼠的9個(gè)組。平均值以±SEM表示。所得結(jié)果與變數(shù)的分析(ANOVA)相比較(對(duì)未成對(duì)的值)。顯著差別用**作記號(hào)，該記號(hào)相應(yīng)于高分辯Scheffe試驗(yàn)里的顯著性。
在口服游離降鈣素后，可觀察到鈣血的瞬間減少。可解釋的事實(shí)是在大量服用肽(例如降鈣素)期間，小量百分?jǐn)?shù)的未變性肽跨過(guò)腸障礙(1％)。在此情況下，服用330IU，其相當(dāng)于3.3IU通過(guò)淋巴(從腸腔到血漿，經(jīng)由淋巴管通道)。但降鈣素IV-途徑的效應(yīng)在0.9IU開始，因此觀察到游離降鈣素的效應(yīng)是正常的。在口服降鈣素后觀察到低鈣血隨時(shí)間減少，90分鐘后回到了正常水平。
就LGS Calc而言，在45分鐘觀察到同樣效應(yīng)，但這種低鈣血效應(yīng)是180分鐘時(shí)的兩倍。該事實(shí)指出LGS制劑(等價(jià)降鈣素濃度)比游離降鈣素的藥理作用更為有效。該雙相現(xiàn)象被歸因于外層LGS(初始作用)相聯(lián)系的降鈣素活性，而且其第二效應(yīng)可能是由于LGSs內(nèi)部所含的降鈣素。于是通過(guò)PA活性(因素2)的增加而加倍的遲發(fā)效應(yīng)被觀察到。
圖2代表游離降鈣素的鈣血和口服LGS-Calc的鈣血之間在AUC上的差別。該差別在Scheffe試驗(yàn)中是高度顯著的。AUC相應(yīng)于在實(shí)驗(yàn)中獲得的所有數(shù)據(jù)的累積；這些數(shù)值被整合并加以比較。AUC相應(yīng)于在曲線下的面積，曲線為隨時(shí)間的鈣血變化。AUC愈小，低鈣血效應(yīng)愈大(因?yàn)榍€到達(dá)了X-軸)。
·游離降鈣素或以LGS-Calc包封的降鈣素對(duì)鈣尿的藥物動(dòng)力學(xué)效應(yīng)所提的限制(指通過(guò)原子吸收光譜所得血漿結(jié)果)是通過(guò)用包封或未包封降鈣素處理的大鼠尿所得的分析值確認(rèn)的。從事實(shí)觀點(diǎn)看，圖3確證了圖1的數(shù)值，因?yàn)榈脱}常常伴隨著鈣尿的增加。
·游離降鈣素或以LGS-Calc形式包封的降鈣素對(duì)磷酸鹽血的藥物動(dòng)力學(xué)效應(yīng)(圖4)LGS-Calc和游離降鈣素引起低磷酸鹽血(比色法測(cè)定)，其僅僅在用LGS-Calc處理的實(shí)驗(yàn)組的情況下得以繼續(xù)。在Fisher試驗(yàn)中結(jié)果是顯著的。各自的AUCs的比較(見圖5)，很清楚地確證了藥物動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。兩種AUCs之間的差別在Scheffe試驗(yàn)中是顯著的。
·游離降鈣素或以LGS-Calc形式包封的降鈣素對(duì)磷酸鹽尿的藥物動(dòng)力學(xué)效應(yīng)(圖6)尿樣測(cè)定通過(guò)原子吸收光譜進(jìn)行，如同鈣尿情況(見前所述)。這些結(jié)果不如鈣尿中的顯著。因此下結(jié)論有困難。然而，在180分鐘時(shí)，LGS-Calc的效應(yīng)有大于非包封藥物的趨勢(shì)。
·毒理學(xué)方面的研究依靠所取得的樣品，可進(jìn)行服用兩種活性成分的轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定。隨時(shí)間SGOT含量分析顯示出包封降鈣素比起游離形式來(lái)有低毒性的傾向(圖7)。該差異在300分鐘的Fisher試驗(yàn)中是非常顯著的。然而，AUCs的比較并不顯出任何顯著的差別，就SGOT含量隨時(shí)間變化而言。
該傾向接近轉(zhuǎn)氨酶適度增加(低毒性)，這可通過(guò)隨時(shí)間分析SGPT含量得到確證(圖8)。
這些數(shù)據(jù)顯示包封形式的降鈣素與游離形式相比有著強(qiáng)的低毒性。圖9顯示出在AUC中SGPT含量的差別(在用游離降鈣素及用包封降鈣素的實(shí)驗(yàn)組中)。
在Scheffe試驗(yàn)中，這兩種面積的差別是顯著的。該效應(yīng)可用于，特別在服用高毒活性成分時(shí)的前后關(guān)系，以減少這些物質(zhì)產(chǎn)生肝毒的影響。
結(jié)論—降鈣素的LGS形式包封加強(qiáng)了腸道屏障的通過(guò)。
—口服的比較效果顯示了LGS形式的潛力均是較大的，因?yàn)楝F(xiàn)在有可能使粉劑中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
—LGS-Calc的雙相低鈣血效應(yīng)可解釋為降鈣素分布在LGSs表面及中心。
—該實(shí)驗(yàn)可評(píng)價(jià)LGS-Calc形式的低毒性，因?yàn)榕c游離形式相比后者顯然毒性更大。
—利用藥典所推薦的鑒定方法，獲得表明LGS-Calc形式優(yōu)于游離降鈣素的數(shù)據(jù)。
—口服兩種形式的PA之后帶來(lái)的低鈣血的兩個(gè)峰值被具體化服用后45和180分鐘。
—LGS-Calc的遲發(fā)效應(yīng)也許應(yīng)歸結(jié)于得自儲(chǔ)存基質(zhì)微球LGS-Calc濃縮物，其逐漸穿透腸道屏障，逐步釋放到腸中。實(shí)施例4包封于lipogelosomes及其衍生形式中主成分生物利用度的增加；脂質(zhì)體和lipogelosomes之間的比較1.lipogelosomes(LGS)和標(biāo)準(zhǔn)的脂質(zhì)體(LS)形式的耐受或穩(wěn)定性比較LGSs可制備用常規(guī)的脂質(zhì)體形式不能制備的藥物劑型(粉劑)；只有LGSs經(jīng)受得住這些生理學(xué)條件pH，溫度，腸能動(dòng)性，酶；其給予它們能力，經(jīng)口服或肺途徑使用；而LSs經(jīng)由這些途徑被服用時(shí)被破壞。
a)耐pH和腸內(nèi)膽質(zhì)鹽類系列的LGS和LS在37℃于膽汁鹽(牛磺脫氧膽酸鹽)及去污粉存在下培養(yǎng)1小時(shí)，由此破壞類脂泡囊的粉末。結(jié)果表明膽汁鹽濃度為0.25mM，LGSs的耐受為L(zhǎng)Ss的3倍。結(jié)構(gòu)的耐受通過(guò)激光顆粒學(xué)方法測(cè)試(粒子計(jì)數(shù)水平的變化通過(guò)激光衍射變化，以KHz計(jì))。
LGSs和LSs在不同pH值時(shí)培養(yǎng)1小時(shí)之后，其結(jié)構(gòu)比較(通過(guò)激光顆粒學(xué)方法觀察)表明在pH＝2.5-9時(shí)，LGSs是穩(wěn)定的，而LSs僅在pH＝6.3時(shí)占優(yōu)勢(shì)。
LGSs比LSs對(duì)pH水平以及在胃部遭遇的去污粉濃度更有耐受性；這可推理LSs在胃內(nèi)被降解，而LGSs具有更長(zhǎng)久的耐受抗性。
b)對(duì)絲膠介質(zhì)，溫度，攪拌的耐受系列LGS和LS的培養(yǎng)在37℃攪拌下進(jìn)行24小時(shí)。LGSs和LSs的類脂相(它們是嚴(yán)格相同的組成)，在同樣情況下用用同位素14C作標(biāo)記。自兩個(gè)類型結(jié)構(gòu)降解衍生出產(chǎn)物L(fēng)S和LGS隨時(shí)間分析。結(jié)果LSs的類脂成分比LGSs的類脂成分更加容易釋放。
這些結(jié)果表明LGS類型比LS類型更加穩(wěn)定。
c)從LGSs和LSs所得的包封活性成分的泄漏的比較小粒徑(500Da)的活性成分(AP)被包封于同量的LGSs及LSs中。其后，兩種制劑在37℃于絲膠介質(zhì)中攪拌。測(cè)定包封的AP釋放量。從LSs釋放出的AP量比從LGSs釋放出的AP量高60％(AP 1.6單位對(duì)LS；AP 1.01單位對(duì)LGS)。
借助于LGSs的值得注意的較高穩(wěn)定性，固態(tài)藥物劑型能被制備，而且可用于口服。但脂質(zhì)體的常規(guī)制劑不能做到。
2.在細(xì)胞模型中，lipogelosomes劑型和常規(guī)脂質(zhì)體劑型之間的生物利用度比較當(dāng)這些分子被包封于LGS(lipogelosomes)形式或在LS(脂質(zhì)體)形式中時(shí)，分析標(biāo)記物或AP的細(xì)胞內(nèi)在化差別。
a)脂質(zhì)體和lipogelosomes細(xì)胞內(nèi)在化比較LSs和LGS用放射性探針或熒光探針標(biāo)記，經(jīng)過(guò)一個(gè)時(shí)期在介質(zhì)中培育(在人巨噬細(xì)胞THP1株存在的介質(zhì)里于37℃培養(yǎng))；兩種結(jié)構(gòu)形式(LS和LGS)的內(nèi)在化比較在培育終了時(shí)分析，培育時(shí)間是同樣的。內(nèi)在化分析采用各種各樣的分析方法進(jìn)行。
A.熒光顯微術(shù)圖象顯示LSs和LGSs的內(nèi)在化。但在LSs的情況下，信號(hào)分布是均勻的，而LGSs信號(hào)的分布定位在點(diǎn)狀細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。
該結(jié)果指出LGSs細(xì)胞內(nèi)降解不比LS結(jié)構(gòu)快(其中LS結(jié)構(gòu)在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)擴(kuò)散得更快些)。
于是，在LGSs中包封的活性成分出現(xiàn)了緩慢的擴(kuò)散效果，而它不存在于LSs中。
B.放射性標(biāo)記放射性標(biāo)記的LGSs和LSs的分子內(nèi)計(jì)數(shù)指出在同樣實(shí)驗(yàn)條件下LGSs被內(nèi)在化程度是LSs的2.5倍。
LGSs被內(nèi)在化的量比LSs要大這一事實(shí)指出LSGs的分子生物利用度要比LSs大，這是由于兩種脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)之間的差別在LGS內(nèi)部相中存在專一的溫度可逆凝膠(其輻射出來(lái)直達(dá)粒子表面)，產(chǎn)生一種優(yōu)先的細(xì)胞攝入性質(zhì)。
C.流式血細(xì)胞計(jì)數(shù)法這些實(shí)驗(yàn)基于用熒光探針標(biāo)記的LGS和LS可比較的細(xì)胞攝粒作用。在培育之后，收集細(xì)胞。然后通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)，定量每個(gè)細(xì)胞的熒光信號(hào)。所得光譜指出，用LGSs培育的細(xì)胞散發(fā)出2.5倍于LSs培育細(xì)胞的熒光信號(hào)。
LGSs以2.5倍于LSs的量被內(nèi)在化該事實(shí)指出LGSs的細(xì)胞生物利用度大于LSs的生物利用度。
b)lipogelosomes-AP/游離AP的比較細(xì)胞藥理學(xué)A.在培養(yǎng)物中AZT和3TC對(duì)巨噬細(xì)胞的效應(yīng)在這些實(shí)驗(yàn)中，LGSs包封的AZT或3TC用人體巨噬細(xì)胞培育，分析游離產(chǎn)物或LGSs包封的產(chǎn)物的細(xì)胞毒性。結(jié)果指出包封Aps比游離AZT或3TC有效150倍，這針對(duì)于培養(yǎng)物中巨噬細(xì)胞。
這些實(shí)驗(yàn)指出就巨噬細(xì)胞而言，在等劑量下包封的AP活性要比游離AP大150倍，這很可能是由于其更好的細(xì)胞內(nèi)在化。
B.在培養(yǎng)基中的阿霉素和PEG 4000作用于肝細(xì)胞以及分化的腸上皮細(xì)胞兩個(gè)分子的細(xì)胞內(nèi)在化按照它們是否是游離形式還是LGS包膠形式比較阿霉素和PEG 4000。
在同樣實(shí)驗(yàn)時(shí)間和濃度的條件下，分子被包封的事實(shí)引起細(xì)胞摻合的增加或其(就肝或腸器官而言)藥理學(xué)活性增加，因數(shù)范圍為1.5-3。
這些實(shí)驗(yàn)指出LGS分子包封形式的生物利用度相對(duì)其游離形式在腸上皮細(xì)胞或肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞上。
C.當(dāng)它們處于LGSs的形式時(shí)，分子的改良生物利用度的解釋脂質(zhì)體(LS)通常用膜融合方法被內(nèi)在化于細(xì)胞內(nèi)，也就是已知的被動(dòng)擴(kuò)散，即這種方法不會(huì)引起任何第二信使對(duì)膜受體的表達(dá)負(fù)有責(zé)任?？墒牵琇GSs和LSs之間的不同點(diǎn)在于專一的溫度可逆凝膠的存在于LGS內(nèi)部相中，其輻射出來(lái)到粒子表面，及通過(guò)凝膠膜的存在到達(dá)外部表面上。該凝膠具有蛋白-糖的本性(凝膠和k-角叉菜膠和i-角叉菜膠的混合物)。
按照本發(fā)明，細(xì)胞內(nèi)在化和生物利用度在LSs和LGSs中的差別，實(shí)質(zhì)上在于這種凝膠的組合物的存在。
分化的或未分化的腸細(xì)胞(細(xì)胞株HT29，HT29gal，T84)被置于半多孔濾器(擴(kuò)散室)內(nèi)培養(yǎng)。LGSs在cpt-cAMP存在或不存在的條件下與這些細(xì)胞培育。在cpt-cAMP的存在下，LGSs的內(nèi)在化通過(guò)因素2被增加。
該實(shí)驗(yàn)表明LGSs的內(nèi)在化是一種cAMP-依賴現(xiàn)象。更進(jìn)一步，LGS內(nèi)在化作為劑量的函數(shù)的曲線表明LGS內(nèi)在化是可飽和的。這兩個(gè)基本事實(shí)表明通過(guò)受體介導(dǎo)LGSs內(nèi)在化。因而該內(nèi)在化方法不同于通過(guò)常規(guī)的脂質(zhì)體融合的細(xì)胞攝粒作用方法，其不依賴于受體。因而，包封于LGS中的藥物的最佳生物利用度被對(duì)LGSs有專一性的受體參與所解釋。
d)lipogelosomes劑型在大鼠體內(nèi)的生物利用度見實(shí)施例3。
e)lipogelosomes劑型在擴(kuò)散室模型上的生物利用度培養(yǎng)腸上皮細(xì)胞，匯合在半多孔濾器上，以獲得生物隔離系統(tǒng)，從腸腔介質(zhì)中分離出“血漿”介質(zhì)。LGSs被置于腸腔邊上，而后經(jīng)過(guò)一段培育期，分析血漿介質(zhì)。
在此隔室內(nèi)，激光顆粒法揭示帶有與LGSs同樣特性的結(jié)構(gòu)，其在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)儲(chǔ)存在腸腔隔室中。添加一定比例的CDCA(鵝脫氧膽酸鹽)到LGS的制劑中，增加了在血漿隔室中發(fā)現(xiàn)的顆粒數(shù)目。
這些實(shí)驗(yàn)表明若干LGSs跨過(guò)腸上皮很可能是經(jīng)過(guò)類細(xì)胞通道或轉(zhuǎn)細(xì)胞過(guò)程。當(dāng)LGS制劑通過(guò)添加CDCA加以改良后，通道被增加。
因而，有可能使包封于LGSs中分子的腸經(jīng)上皮通道最佳化(例如在口服以后)；LGS劑型使得有可能增加包封分子的腸生物利用度，而且當(dāng)鵝脫氧膽酸鹽被包括在LGS制劑內(nèi)時(shí)，這種性能加強(qiáng)。
作為來(lái)自上文事實(shí)的出現(xiàn)，本發(fā)明在任何情況下，不限于完成此發(fā)明的方法，或者是申請(qǐng)剛被敘述的大量細(xì)節(jié)。相反，其包括了所有的變化，其可發(fā)生在本領(lǐng)域技術(shù)的人員之中，只要不背離本發(fā)明的上下文或本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.脂質(zhì)體活性成分載體，其特征在于，它們組成如下—一種粉狀組合物，其基本上由單層狀脂質(zhì)體組成，其包括外部類脂相，其由4類類脂(磷脂類)及選擇性結(jié)合有下列物質(zhì)2類物質(zhì)(長(zhǎng)鏈三甘油酯類、膽固醇酯類)，3類物質(zhì)(膽固醇，非離子化的長(zhǎng)鏈脂肪酸類)和/或5類物質(zhì)(膽酸鹽、梭鏈孢酸衍生物)所組成，以及形成溫度可逆含水凝膠的內(nèi)部含水核，其輻射到外部類脂相，內(nèi)部含水核基本上由至少有兩種不同的非聚合膠凝劑G1和G2混合物M所組成，其凝膠-溶膠相過(guò)渡點(diǎn)高于或等于37℃，G1是選自明膠和角叉菜膠的膠凝劑，G2則選自角叉菜膠，其性質(zhì)不同于為G1選擇的角叉菜膠，以及纖維素，脂質(zhì)體的直徑為20nm-1mm，優(yōu)選20nm-500nm且粒子單位形式的平均直徑為10mm-1000mm，由上述一種或多種脂質(zhì)體形成，被選自脫水的溫度可逆含水凝膠基質(zhì)所包圍，該含水凝膠與所述的內(nèi)核、糊精或其混合物的水性凝膠是一致的，平均來(lái)說(shuō)，每克粉末中含有1016至1018個(gè)脂質(zhì)體，和—至少包括一種活性成分，根據(jù)情況，其在膠凝內(nèi)核中或在外部類脂相中。
2.權(quán)利要求1中的脂質(zhì)體活性成分載體，其特征在于，在它們的內(nèi)部水性核中，還包含至少一種配糖性質(zhì)的穩(wěn)定劑和/或一種用于調(diào)節(jié)介質(zhì)滲透性的試劑和/或至少一種表面活性劑，如膽質(zhì)鹽和/或非離子性的表面活性劑。
3.權(quán)利要求1或2中的脂質(zhì)體活性成分載體，特征在于以％(m/m)計(jì)，其包含25-75％4類脂類，5-45％膠凝劑，0-70％配糖性質(zhì)的穩(wěn)定劑，0-15％用于調(diào)節(jié)介質(zhì)滲透性的試劑，0-20％表面活性劑以及0-15％糊精。
4.權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)中所述的脂質(zhì)體活性成分載體，其特征在于所述的含水內(nèi)核包含70-95％膠凝劑G1和5-30％膠凝劑G2。
5.權(quán)利要求2-4任意一項(xiàng)中所述的脂質(zhì)體活性成分載體，其特征在于配糖性質(zhì)穩(wěn)定劑為蔗糖，海藻糖或任何其它保護(hù)劑。
6.制備權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)中所述的粉狀載體的方法，其中，顆粒單位的外部基質(zhì)包含脫水的溫度可逆水性凝膠成分，其特征在于包括下列步驟(1)在水相中通過(guò)下面步驟制備具有膠凝化內(nèi)核的脂質(zhì)體分散體，(a)在高于所述膠凝劑的凝膠-溶液相的轉(zhuǎn)換溫度下，于pH與被包封的活性成分相容水相溶液中，將所述的膠凝劑在慢慢攪拌下溶于水溶液中，以制備得到至少一種合適的膠凝劑，特別是膠凝劑G1和G2的混合物M的溶液，(b)將活性成分混入(a)中得到的溶液中，(c)慢速攪拌混合物，歷時(shí)少于5小時(shí)，優(yōu)選在真空條件下，將類脂摻入得自(b)的溶液，形成乳劑；且(d)優(yōu)選在真空條件下迅速地?cái)嚢?c)中得到的乳化劑，得到所述的帶有存在于水相中的的膠凝化內(nèi)核(lipogelosomes)的脂質(zhì)體分散體，其中水相含所述凝膠劑，(2)適合的干燥得到的分散體，得到粉末狀產(chǎn)品。
7.權(quán)利要求6中所述的方法，其特征在于干燥步驟是通過(guò)霧化作用、凝聚作用、薄膜或顆?；饔脕?lái)進(jìn)行的。
8.制備權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)中所述的粉狀載體的方法，其中，顆粒單位的外部基質(zhì)包括脫水的溫度可逆的水性膠狀和/或糊精，其特征在于包括下列步驟(1)通過(guò)以下步驟，在水相中制備具有膠凝內(nèi)核(lipogelosomes)的脂質(zhì)體分散體，(a)在高于所述膠凝劑的凝膠-溶液相的轉(zhuǎn)換溫度下，于pH與被包封的活性成分相容水相溶液中，將所述的膠凝劑在慢慢攪拌下溶于水溶液中，可以制備得到至少一種合適的膠凝劑，特別是膠凝劑G1和G2的混合物M的溶液，(b)將活性成分混入(a)中得到的溶液中，(c)慢速攪拌混合物，歷時(shí)少于5小時(shí)，優(yōu)選在真空條件下，將類脂摻入得自(b)的溶液，形成乳劑；且(d)優(yōu)選的是在真空條件下迅速地?cái)嚢?c)中得到的乳化劑，得到所述的帶有存在與水性外相中的膠凝內(nèi)核(lipogelosomes)的脂質(zhì)體分散體，其中水相含所述凝膠劑，和(2)至少部分地除去含有所述膠凝劑的水性液體相，其中分散有所述的脂質(zhì)體，(3)加入至少一種合適的糊精，并且(4)霧化干燥(3)中得到的產(chǎn)品，得到粉末狀產(chǎn)品。
9.權(quán)利要求8中所述的方法，其特征是至少部分地除去含有所述膠凝劑的水性液體相的步驟(2)是通過(guò)稀釋和/或過(guò)濾來(lái)進(jìn)行。
10.權(quán)利要求6-9中任一所述的方法，其特征是步驟(a)中的水溶液包含有用于調(diào)節(jié)介質(zhì)滲透性的試劑(例如0.9％NaCl)和/或配糖性質(zhì)的穩(wěn)定劑和/或表面活性劑，優(yōu)選5類物質(zhì)(膽質(zhì)鹽)。
11.權(quán)利要求6-10任意一項(xiàng)中所述的制備方法，其特征在于摻入活性成分的步驟(b)是在外部類脂相摻入到步驟(a)中所得的混合物之前在外部類脂相中進(jìn)行的。
12.權(quán)利要求6-11中任一所述的方法，其特征是步驟(c)優(yōu)選的是在小于200s-1的切變速率下進(jìn)行的。
13.藥物組合物，特征在于其包含權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)中所述的活性成分載體以及至少一種制藥學(xué)上可接受的載體。
14.權(quán)利要求13中所述的組合物，特征在于其還包含cAMP活化劑。
15.權(quán)利要求13或14中所述的組合物，特征在于其以固體形式(凝膠膠囊，片劑或可溶于水的粉末)存在。
16.具有水性膠凝內(nèi)核的脂質(zhì)體分散體，其中含有權(quán)利要求1中所定義的凝膠劑混合物，該分散體中所述的脂質(zhì)體顯示出下列形態(tài)學(xué)·具有直徑為20nm至500nm的囊性結(jié)構(gòu)，優(yōu)選20-80nm，并且·具有10-55％，優(yōu)選10-30％膠凝化內(nèi)相的脂質(zhì)體的多分散性。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于活性成分穩(wěn)定的,呈粉末狀的脂質(zhì)體,更具體講,該活性成分對(duì)消化和/或血漿的降解是敏感的,例如蛋白質(zhì),本發(fā)明還涉及所述脂質(zhì)體作為醫(yī)藥產(chǎn)品的應(yīng)用。脂質(zhì)體活性成分載體由粉狀組合物組成,其基本上由單層狀脂質(zhì)體組成,其包括外部類脂相,其由4類類脂(磷脂類)及選擇性結(jié)合有下列物質(zhì)2類物質(zhì)(長(zhǎng)鏈三甘油酯類、膽固醇酯類),3類物質(zhì)(膽固醇,非離子化的長(zhǎng)鏈脂肪酸類)和/或5類物質(zhì)(膽酸鹽、梭鏈孢酸衍生物)所組成,以及形成溫度可逆含水凝膠的內(nèi)部含水核,其輻射到外部類脂相,內(nèi)部含水核基本上由至少有兩種不同的非聚合膠凝劑G1和G2混合物M所組成,其凝膠－溶膠相過(guò)渡點(diǎn)高于或等于37℃,G1是選自明膠和角叉菜膠的膠凝劑,G2則選自角叉菜膠,其性質(zhì)不同于為G1選擇的角叉菜膠,以及纖維素,脂質(zhì)體的直徑為20nm－1nm,優(yōu)選20nm－500nm且粒子單位形式的平均直徑為10mm－1000mm,由上述一種或多種脂質(zhì)體形成,被選自脫水的溫度可逆含水凝膠基質(zhì)所包圍,該含水凝膠與所述的內(nèi)核、糊精或其混合物的水性凝膠是一致的,平均來(lái)說(shuō),每克粉末中含有10
文檔編號(hào)A61K9/127GK1264297SQ9880728
公開日2000年8月23日 申請(qǐng)日期1998年6月11日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月11日
發(fā)明者J－P·紗利斯 申請(qǐng)人:利波格爾公司