專利名稱：靶向治療性給藥維生素d化合物的制作方法
交叉參考相關(guān)申請根據(jù)35 U.S.C.§119，本發(fā)明要求于1997年2月13日申請的第60/038,364號美國臨時申請的優(yōu)先權(quán)日之權(quán)益。有關(guān)聯(lián)邦資助之研究或開發(fā)的聲明不適用發(fā)明背景本發(fā)明涉及靶向治療性給藥維生素D化合物，更具體而言是向骨和腫瘤組織靶向給藥維生素D化合物。
醫(yī)生經(jīng)常面臨難以解決的兩難處境。為有效地治療疾病，必須在疾病所造成的損害和治療該疾病所用之藥物產(chǎn)生的毒性作用之間進行平衡。雖然治療應(yīng)代表著對給藥方案的完全耐受性，但從絕對意義上來講，其通常處于折中的處境，并由此僅實現(xiàn)“可接受”水平的治療。
在沒有對抗疾病發(fā)生的預(yù)防措施時，接下來理想的替代方法是設(shè)計一種能夠特異性識別疾病的起源并對其進行校正的藥物。該所謂的“魔彈”或者定位給藥概念并不是一個新的概念。此概念涉及將藥物的作用與特異性受體介導(dǎo)的作用聯(lián)系在一起。這些概念仍是連續(xù)研制藥物和抗體的主要基礎(chǔ)。
在某些情況下，對藥物進行化學(xué)改性可增強其目標(biāo)器官的特異性。例如，對于例如雌二醇和乙炔雌二醇的化合物，已研制出基于二氫吡啶—吡啶鎓鹽氧化還原相互轉(zhuǎn)化作用的腦靶向給藥系統(tǒng)。Brewster等人，31 J.Med.Chem.(1988)244。在藥物上共價偶聯(lián)某些糖可增強它們的肝吸收。Ponpinom等人，in Receptor Mediated Targeting of Drugs，(Gregoriadis等人編輯)，NATO ASI series，Plenum Press，New York，1983，第53頁。
但在大多數(shù)情況下，需要具體的載體以將藥物運送并釋放至目標(biāo)組織。在此情況下，藥物本身的分布特性是無關(guān)的，這是因為載體的特征決定了藥物是否被釋放至目標(biāo)細胞處。但是，一旦被釋放至目標(biāo)細胞，則仍需要考慮藥物在細胞內(nèi)作用部位處的分布。
已有人提出許多的顆粒作為藥物載體系統(tǒng)。最近的焦點主要集中在單克隆抗體和膠體給藥系統(tǒng)如脂質(zhì)體和聚合物微球。見例如Davis等人，in Site-Specific Drug Delivery，(Tomlinson等人編輯)，John Wiley，New York，1986，第93頁。
還有人提出用可溶性分子作為藥物載體，包括DNA、卵磷脂、聚L-賴氨酸、病毒體、胰島素、葡聚糖、HCG、二肽以及細胞系統(tǒng)如紅細胞和成纖維細胞。見例如Poznansky等人，36 Pharmacol.Rev.(1984)277。還有其它人建議并試圖使用脂蛋白作為藥物載體，特別是低密度脂蛋白。見例如Counsell等人，25 J.Med.Chem.(1982)1115。
顯而易見的是，在如癌癥和嚴(yán)重的病毒感染等的病癥中，最需要定位給藥系統(tǒng)。治療腫瘤疾病中所用的藥物的副作用經(jīng)常是相當(dāng)嚴(yán)重的。抗腫瘤藥物影響其它快速生長的組織，如骨髓和胃腸道邊緣細胞，而且通常不得不停止治療。
在骨疾病、特別是骨質(zhì)疏松癥中也特別需要定位給藥系統(tǒng)。人們已認(rèn)識到在所有的絕經(jīng)后婦女中都發(fā)生某種程度的骨質(zhì)疏松癥，并由此提出向礦物化的骨基質(zhì)定位給藥骨治療劑。已知某些藥劑具有骨尋靶特性或者骨親和性，而且發(fā)現(xiàn)將此等骨尋靶劑與酶、甾體、或激素連接在一起可形成骨特異性藥物釋放劑。例如，已有人提出通過橋連劑將骨尋靶劑如四環(huán)素連接在碳酸脫氫酶抑制劑上，由此提供用于治療或預(yù)防變性骨疾病的化合物。見第201,057號歐洲專利申請。
另外，已有人提出將激素如降鈣素或者胰島素樣生長因子連接在氨基亞甲基二膦酸上。見第2104-593A號日本專利申請。第5,183,815號美國專利公開了將甾體連接在烷基二膦酸上，對骨具有局部治療作用。第0 521 844 A1號歐洲專利申請公開了將骨生長因子如轉(zhuǎn)化生長因子-β連接在骨靶向分子如四環(huán)素、降鈣素、二膦酸酯、聚天冬酸、聚谷氨酸、氨基磷酸糖或者雌激素上，以形成局部骨增強形成劑。
維生素D早已被認(rèn)為對骨和礦物質(zhì)代謝具有重要的生理作用。眾所周知，維生素D在刺激鈣吸收和調(diào)節(jié)鈣代謝方面具有關(guān)鍵性的作用。維生素D活性形式(M.F.Holick等人，68 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，803-804(1971)；G.Jones等人，14 Biochemistry，1250-1256(1975))和活性維生素D類似物(M.F.Holick等人，Science 180，190-191(1973)；H.Y.Lam等人，Science 186，1038-1040(1974))的發(fā)現(xiàn)，對于這些維生素D化合物在治療骨缺失性疾病中的作用產(chǎn)生了更多的興奮和推測。
檢驗這些活性維生素D化合物之作用的動物研究表明，此等藥劑可用于恢復(fù)鈣平衡。另外，早期的臨床研究表明，向一組絕經(jīng)后婦女給藥0.5μg/天的1α，25-二羥基維生素D3--維生素D3的激素活性形式，可改善這些婦女的鈣腸吸收和鈣平衡。在此基礎(chǔ)上，第4,225,596號美國專利(′596專利)描述并要求保護1α，25-二羥基維生素D3在增加鈣吸收和保留中的應(yīng)用。該專利還要求保護1，25-二羥基維生素D2和1α-羥基維生素D2的此等應(yīng)用，此專利稱這些化合物是“非常適合于而且易于替代1，25-二羥基膽骨化醇[1α，25-二羥基維生素D3]”。
但是，維生素D化合物在預(yù)防和治療缺失性骨疾病中的效用的最佳指示是骨本身，而不是鈣吸收或者鈣平衡。最近的臨床數(shù)據(jù)表明，在′596專利公開的劑量范圍內(nèi)，1α，25-二羥基—維生素D3在預(yù)防或恢復(fù)骨質(zhì)或骨礦物含量丟失中最多僅有中等的效用(S.M.Ott和C.H.Chesnut，Ann.Int.Med.110267-274(1989)；J.C.Gallagher等人，Ann.Int.Med.113649-655(1990)；J.Aloia等人，Amer.J.Med.84401-408(1988))。
這些用1α，25-二羥基維生素D3以及其它用1α-羥基維生素D3進行的臨床研究(M.Shiraki等人，Endocrinol.Japan 32，305-315(1985))表明，這兩種維生素D化合物恢復(fù)丟失的骨質(zhì)或骨礦物含量的能力是與劑量相關(guān)的。但是，這些研究還表明，在達到有效作用所需的化合物劑量范圍內(nèi)，以高鈣血癥和高鈣尿癥為表現(xiàn)形式的毒性是最主要的問題。具體而言，將1α，25-二羥基維生素D3的量增加至0.5μg/天以上，常導(dǎo)致毒性產(chǎn)生。在低于0.5μg/天的劑量時，沒有觀察到對骨質(zhì)或礦物含量產(chǎn)生作用。(見G.F.Jensen等人，Clin.Endocrinol.16，515-524(1982)；C.Christiansen等人，Eur.J.Clin.Invest.11，305-309(1981))。發(fā)現(xiàn)2μg/天的1α-羥基維生素D3對增加老年骨質(zhì)疏松癥患者的骨質(zhì)具有效用(O.H.Sorensen等人，Clin.Endocrinol.7，169S-175S(1977))。在日本對低鈣吸收人口群進行的臨床研究數(shù)據(jù)表明，給藥1μg/天的1α-羥基維生素D3時，發(fā)現(xiàn)具有效用(M.Shiraki等人，Endocrinol.Japan.32305-315(1985)；H.Orimo等人，Bone andMineral 3，47-52(1987))。但是，在2μg/天時，在大約67％的患者中發(fā)生1α-羥基維生素D3的毒性，而在1μg/天時，該百分?jǐn)?shù)約為20％。
最近，還發(fā)現(xiàn)了維生素D的其它作用。在不參與鈣體內(nèi)平衡的不同器官的細胞中發(fā)現(xiàn)了1α，25-二羥基維生素D3的特異性核受體。例如，Miller等人(52 Cancer Res.(1992)515-520)已證實了在人前列腺癌細胞系--LNCaP中的1α，25-二羥基維生素D3的生理活性的、特異性的受體。
更具體而言，已有報道稱，某些維生素D化合物和類似物是惡性細胞增殖作用的強效抑制劑和細胞分化作用的誘導(dǎo)劑/刺激劑。例如，頒與Suda等人的第4,391,802號美國專利公開了1α-羥基維生素D化合物，特別是1α，25-二羥基維生素D3和1α-羥基維生素D3，由于誘導(dǎo)惡性細胞(具體為白血病細胞)分化為非惡性的巨噬細胞(單核細胞)而具有強效的抗白血病活性，而且可用于治療白血病。在另一個例子中，Skowronski等人(136 Endocrinology(1995)20-26)報道了1α，25-二羥基維生素D3和其它維生素D3類似物對前列腺癌細胞系的抗增殖作用和分化作用。
如上所述的增殖作用研究絕大多數(shù)集中于維生素D3化合物。即使此等化合物的確能夠有效地分化培養(yǎng)基中的惡性細胞，但是由于它們作為影響鈣代謝的藥劑的高效用，其在分化治療中作為抗癌劑的實際應(yīng)用受到了嚴(yán)重的限制。在體內(nèi)有效作為抗白血病劑所需要的劑量時，由于其固有的鈣血癥活性，這些相同的化合物可明顯誘導(dǎo)血鈣濃度的增高并至危險的水平。也就是說，高血鈣癥的危險阻礙或者嚴(yán)重地限制了臨床使用1α，25-二羥基維生素D3和其它維生素D3類似物作為抗癌劑。這表明仍需要化合物在發(fā)揮作用時具有更大的特異性活性和選擇性，即、具有抗增殖作用和分化作用但比維生素D的已知化合物或類似物的治療量低的鈣血癥活性的維生素D化合物。
實際上，在本領(lǐng)域中還沒有人提出用于向特異性靶組織如骨或者惡性腫瘤部位如前列腺癌細胞靶向給藥維生素D化合物的材料或者方法。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供維生素D化合物或類似物和靶向分子的結(jié)合物，其能夠定位給藥維生素D。具體的結(jié)合物包括骨治療結(jié)合物和抗腫瘤結(jié)合物。本發(fā)明還提供此等結(jié)合物的藥物制劑，以及向患者目標(biāo)組織定位給藥結(jié)合物中維生素D部分的方法。本發(fā)明令人驚奇地提供用于向目標(biāo)組織(如靶組織)給藥維生素D化合物、類似物或衍生物的手段。
本發(fā)明的結(jié)合物包括至少一種維生素D部分，該維生素D部分與對靶組織具有親和性的靶向分子締合。在本發(fā)明的一個實施方案中，結(jié)合物包括至少一種維生素D部分，該維生素D部分通過至少一個連接基團與靶向分子部分締合，所述連接基團例如是維生素D部分和靶向分子部分之間的鍵連、二官能連接基團、或者其它連接基團如生物素—抗生物素蛋白連接。在另一個實施方案中，結(jié)合物包括對目標(biāo)組織具有親和性的靶向分子部分，該靶向分子部分與至少一種維生素D部分以及除維生素D外的第二種治療藥劑締合。
本發(fā)明的藥物組合物包括與至少一種靶向分子部分締合的至少一種維生素D部分、以及合適的藥物學(xué)上可接受的載體。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供定位給藥維生素D或維生素D類似物的方法，該方法包括向患者給藥在藥物學(xué)上可接受的載體中的治療有效量的結(jié)合物，其中，所述結(jié)合物包括至少一種通過連接基團與至少一種靶向分子締合的維生素D部分，而且所述靶向分子對目標(biāo)組織具有親和性。該方法用于實現(xiàn)向患者的目標(biāo)組織定位給藥維生素D部分。
本發(fā)明的結(jié)合物、藥物組合物和方法能夠向患者的目標(biāo)組織定位給藥維生素D。特異性地導(dǎo)向并釋放作為本發(fā)明之結(jié)合物的一部分的維生素D化合物，人們由此可通過向患者給藥較給藥該化合物本身更小量的結(jié)合物來向目標(biāo)組織釋放相同量的化合物。由于降低了維生素D化合物的給藥量，本發(fā)明顯著地減少了使用常規(guī)給藥裝置所產(chǎn)生的高血鈣癥以及向患者給藥維生素D化合物或類似物的其它副作用。
在參考附圖詳細閱讀優(yōu)選實施方案的具體描述后，可了解本發(fā)明的其它優(yōu)點和具體的適應(yīng)癥、組分的變化和物理特性。應(yīng)完全可以理解的是，這些附圖僅是用于說明和描述本發(fā)明，而不是對本發(fā)明范圍的限制。
附圖簡述以下將參考附圖來詳細描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，其中類似的標(biāo)號表示類似的部分。在附圖中

圖1顯示了制備由1α，24-二羥基維生素D2(“1α，24-(OH)2D2”)和連接在所述維生素D部分的C-24處的氨基烷基-1，1-二膦酸酯所形成的結(jié)合物的反應(yīng)路線；圖2A和2B顯示了制備由1α，24-(OH)2D2和連接在所述維生素D部分的C-1處的氨基烷基-1，1-二膦酸酯所形成的結(jié)合物的反應(yīng)路線；圖3顯示了制備由1α，24-(OH)2D2和連接在所述維生素D部分的C-3處的氨基烷基-1，1-二膦酸酯所形成的結(jié)合物的反應(yīng)路線；圖4A和4B顯示了制備由1α，25-二羥基維生素D3(1α，25-(OH)2D3)和連接在所述維生素D部分的C-1處的氨基烷基-1，1-二膦酸酯所形成的結(jié)合物的反應(yīng)路線；
圖5顯示了制備由1α，25-(OH)2D3和連接在所述維生素D部分的C-3處的氨基烷基-1，1-二膦酸酯所形成的結(jié)合物的反應(yīng)路線；圖6顯示了制備由1α，25-(OH)2D3和連接在所述維生素D部分的C-25處的氨基烷基-1，1-二膦酸酯形成的結(jié)合物的反應(yīng)路線；以及圖7是使用生物素—抗生物素蛋白連接基團制備維生素D和單克隆抗體之結(jié)合物的示意圖。
發(fā)明詳細描述本發(fā)明涉及維生素D制劑在靶向應(yīng)用中的用途。但是，本發(fā)明更具體地是涉及在向骨和腫瘤細胞定位給藥維生素D中的用途。因此，以下將在此方面更詳細地描述本發(fā)明。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可認(rèn)識到，本發(fā)明的此等描述僅是說明性的，而不應(yīng)被視為對其全部范圍的限制。
本發(fā)明的特征在于通過使用由維生素D和對目標(biāo)組織具有親和性的靶向分子所形成的結(jié)合物能夠定位靶向給藥維生素D化合物。例如，維生素D和骨親和劑的結(jié)合物可用于向骨轉(zhuǎn)運并釋放維生素D。這些特性是通過物理和化學(xué)特征的新結(jié)合而實現(xiàn)的。
除非另有說明，在本發(fā)明的以下描述中，是在室溫和大氣壓下進行處理步驟。
在此所用術(shù)語“靶向分子”是指與目標(biāo)組織結(jié)合或影響其代謝的分子。例如，骨靶向劑可包括骨尋靶分子，如四環(huán)素、降鈣素、二膦酸酯、螯合劑、磷酸酯、聚天冬酸、聚谷氨酸、氨基磷酸糖，已知可與骨中的礦物相締合的肽如骨結(jié)合素、骨唾液蛋白和osteopontin，帶有骨礦物結(jié)合域的蛋白，等等。骨靶向分子還包括本身能夠影響骨吸收和骨形成速率的分子，如二膦酸酯、雌激素和其它載體如脫氫表雄酮(DHEA)。這些骨尋靶分子也可具有骨生長治療性質(zhì)和/或與維生素D化合物一起對骨重吸收或形成產(chǎn)生協(xié)同或附加作用。皮膚尋靶分子包括某些金屬離子—氨基酸螯合物；前列腺尋靶分子包括某些甾體如DHEA。腫瘤尋靶劑包括某些抗體。
在此所用術(shù)語“目標(biāo)組織”或“靶組織”是指身體中待治療或者施用維生素D化合物或類似物的希望目標(biāo)或部位。術(shù)語“治療”是指修復(fù)、防止、緩解、改善、預(yù)防患病或者有缺陷的目標(biāo)組織，以及抑制異常生長如細胞的過度增殖，和促進細胞分化。
在此所用術(shù)語“治療劑”是指在給藥或釋放于目標(biāo)組織時具有或者表現(xiàn)出治愈能力的物質(zhì)。在此所用術(shù)語“骨治療劑”是指具體類型的治療劑，其在釋放或者給藥于骨時能夠緩解骨疾病。骨治療劑的例子包括維生素D化合物、結(jié)合雌激素或者它們的等同物、抗雌激素、降鈣素、二膦酸酯、鈣添加劑、鈷胺素、百日咳毒素、硼、和其它骨生長因子如轉(zhuǎn)化生長因子β、抗生物素蛋白或者骨形態(tài)發(fā)生蛋白。
本發(fā)明的結(jié)合物包括至少一種維生素D化合物、類似物、組分或部分(在此稱為“D”)，其與至少一種靶向分子部分(在此稱為“T”)締合，并包括式(I)所代表者
(D)m*(T)n(I)其中n和m代表1或更大的整數(shù)；而*表示靶向分子部分(T)與維生素D化合物、類似物、組分或部分(D)締合。應(yīng)理解的是，在此所用術(shù)語“維生素D”包括所有具有A、C和D環(huán)之常規(guī)維生素D結(jié)構(gòu)和C-17側(cè)鏈的化合物，以及作為相應(yīng)維生素D形式的熱異構(gòu)體的前維生素D化合物，其中的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)可是經(jīng)取代、未經(jīng)取代或者經(jīng)改性的，例如19-去甲基化合物。還應(yīng)理解的是，維生素D部分在結(jié)合物中保持其生理作用，即、相對于骨的有益作用，或者在前維生素D的情況時，異構(gòu)化成具有生理作用的相應(yīng)維生素D形式。
在此所用術(shù)語“締合”是指結(jié)合物的一個組分(如維生素D部分)或者維生素D部分和連接基團通過共價鍵、氫鍵、金屬鍵、范德華力、離子鍵、庫侖力、疏水或親水力、吸收或吸附、螯合類型的締合、或者它們的組合而與結(jié)合物的其它組分如靶向分子或者靶向分子和連接基團連接在一起。在涉及維生素D或D、或者靶向分子部分或T時所用的術(shù)語“部分”或者“組分”是指例如在締合發(fā)生后以結(jié)合形式存在的維生素D或靶向分子。根據(jù)靶向分子的官能度，在維生素D類似物和靶向分子之間的締合作用可發(fā)生在維生素D類似物分子的任何位置上。例如，二膦酸酯或酰胺可適當(dāng)?shù)剡B接在維生素D化合物或者維生素D類似物分子具有羥基基團的位置上，如在C-1、C-3、C-24、C-25上。
可用于本發(fā)明中的維生素D化合物和類似物可適當(dāng)?shù)赜檬?II)表示
其中R1是H或OH；Z代表飽和或不飽和、經(jīng)取代或未取代、直鏈或支鏈的C1-C18烴基；Y是＝CH2基團；而t是0或1，這樣，當(dāng)t是0時，式(II)的化合物為19-去甲基化合物。優(yōu)選的是，Z為式(IIIA)所表示的側(cè)鏈
其中m是0或1；R5是H或OH；R6和R7獨立地是H、OH、低級烷基、低級氟代烷基、O-低級烷基、O-低級?；?、O-芳香性烷基、低級環(huán)烷基，或者與它們所連接的碳(如C-25)一起形成C3-C8環(huán)烴環(huán)；而Q是-C＝C-、-C≡C-、或者
(其中n是0或者1-7的整數(shù)，R3是CH3或H，而R4是H或OH)。例如，Z包括式(IIIB)所表示的膽固醇或麥角甾醇
其中R8和R9分別為H或者一起在C-22和C-23之間形成雙鍵；R3是CH3或H；R4和R5獨立地是H或OH；而R6和R7獨立地是H、OH、低級烷基、低級氟代烷基、O-低級烷基、O-低級酰基、O-芳香性酰基、低級環(huán)烷基，或者與它們所連接的碳(如C-25)一起形成C3-C8環(huán)烴環(huán)。
本發(fā)明范圍內(nèi)的維生素D化合物還包括前維生素D化合物，優(yōu)選為1α-羥基前維生素D，其可包括普通的被任選取代但優(yōu)選在C-24或C-25處羥基取代的膽固醇和麥角甾醇側(cè)鏈。前維生素D化合物是相應(yīng)維生素D化合物的熱異構(gòu)體，例如，1α-羥基前維生素D3是1α-羥基維生素D3的熱異構(gòu)體，并與后者存在于熱平衡中。
靶向分子中優(yōu)選的是那些在用作式(I)之結(jié)合物的組分時至少能夠使結(jié)合物的一部分、特別是結(jié)合物中的維生素D組分被釋放至所希望的靶(如靶細胞、靶器官、腫瘤等)者。優(yōu)選的靶向分子包括具有特異性的化學(xué)官能團、激素(如生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑)、和抗體，優(yōu)選單克隆或多克隆抗體，或者具有所需要的靶特異性的抗體片段。優(yōu)選的對骨有特異性親和性的靶向分子包括二膦酸酯、四環(huán)素、聚丙二酸酯和脫氫表雄酮。
式(I)的結(jié)合物是在不損壞具體的結(jié)合物組分以及存在合適的所需要的溶劑的條件(如具體的pH、溫度或者鹽濃度)下制備的。為控制pH，可使用緩沖劑或者添加合適的酸或堿。反應(yīng)條件取決于在維生素D化合物或類似物(D)與靶向分子部分(T)之間所形成的締合類型，以形成結(jié)合物。
式(I)結(jié)合物中的TD摩爾比優(yōu)選為1∶1。
其中D通過D和T之間的連接基團(在此稱為“G”)而與T締合的那些結(jié)合物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)；這些優(yōu)選的結(jié)合物可用式(IV)表示[(T)n-(G′)f]g*[(G″)h-(D)m]k(IV)其中G′代表相同或不同的連接基團；G″代表相同或不同的連接基團；g和k分別獨立地代表1或更大的整數(shù)；f和h分別獨立地代表0或更大的整數(shù)；—表示在存在連接基團時的鍵；n和m如前所定義；而*表示靶向分子組分通過連接基團G′或G″或者在這兩個連接基團都存在時通過這兩個連接基團而與維生素D組分締合。應(yīng)理解的是，D在結(jié)合物中保持其生理作用，或者在D為前維生素D時，異構(gòu)化為具有生理作用的相應(yīng)維生素D形式。
在f或h為零(而且g和k為1)的情況時，式(IV)的結(jié)合物可簡單地用式(V)表示Dm-G-Tn(V)在此情況下，G合適地為二官能連接基團，如聚谷氨酸或聚天冬酸，或者為通過改性D和/或T而形成的連接基團，并隨后形成鍵連。
用于形成式(IV)之結(jié)合物的合適連接基團是那些將維生素D部分連接在靶向分子部分上但不明顯損壞維生素D的生理作用以及結(jié)合物之靶向分子組分的親和性的基團。連接基團在結(jié)合物的靶向分子部分和維生素D部分之間形成連接，該連接必須足夠穩(wěn)定以至少在將結(jié)合物釋放至鄰近靶的區(qū)域時保持完整性。在某些情況下，作為結(jié)合物的一部分而被釋放至靶區(qū)域中的維生素D在連接靶向分子部分和維生素D部分的至少一個連接基團斷開后更為有效。在此情況下，一旦結(jié)合物被釋放接近于靶，至少一個此等連接基團優(yōu)選立即斷開。換言之，通過在此情況下斷開連接基團，可避免維生素D和在一些本發(fā)明結(jié)合物中存在的靶向分子部分之間的立體障礙，而這種立體障礙會降低結(jié)合物中維生素D的作用。
在一個示例性實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合物包括有效治療骨疾病的藥劑，即、該結(jié)合物包括維生素D部分和骨尋靶劑。在具有骨親和性的藥劑中優(yōu)選的是二膦酸酯(“BP”)(也稱為雙膦酸酯)。例如，可適用于本發(fā)明中的具體二膦酸酯部分可用式(VI)表示
其中R2是H或OH；Y是NH、O或NR8(其中R8是H或者C1-C4烷基)；而n是1-4的整數(shù)。其中T是BP的特別優(yōu)選的骨治療結(jié)合物如式(VII)所表示D-BP(VII)其中BP適當(dāng)?shù)剡B接在例如D部分的C-1、C-3、C-17、C-24或者C-25位置處。
其中T是二膦酸酯并可用于本發(fā)明中的具體骨治療結(jié)合物包括式(VIII)的結(jié)合物
其中R1是H或OH；R2是H或OH；X是O或S；Y是NH、O或NR(其中R是H或C1-C4烷基)；n是1-4；以及其藥物學(xué)上可接受的鹽，即、二膦酸酯連接在維生素D部分的C-17位上。
本發(fā)明還提供了式(IX)的結(jié)合物
其中R1是H或OH；R2是H或OH；R3是CH3或H；R4是H或OH；X是O或S；Y是NH、O或NR(其中R是H或C1-C4烷基)；n是1-4的整數(shù)；R8和R9分別是H或者一起在C-22和C-23之間形成雙鍵；以及其藥物學(xué)上可接受的鹽，即、二膦酸酯連接在維生素D部分的C-25位上。
本發(fā)明還提供了式(X)的結(jié)合物
其中R1是H或OH；R2是H或OH；R3是CH3或H；R4是H或OH；X是O或S；Y是NH、O或NR(其中R是H或C1-C4烷基)；R5是H或OH；n是1-4的整數(shù)；R8和R9分別是H或者一起在C-22和C-23之間形成雙鍵；以及其藥物學(xué)上可接受的鹽，即、二膦酸酯連接在維生素D部分的C-3位上。
本發(fā)明還提供了式(XI)的結(jié)合物
其中R2是H或OH；R3是CH3或H；R4是H或OH；X是O或S；Y是NH、O或NR(其中R是H或C1-C4烷基)；R5是H或OH；n是1-4的整數(shù)；R8和R9分別是H或者一起在C-22和C-23之間形成雙鍵；以及其藥物學(xué)上可接受的鹽，即、二膦酸酯連接在維生素D部分的C-1位上。
應(yīng)注意的是，二膦酸酯部分和維生素D部分之間的連接通常是通過維生素D上的羥基，其中將羥基轉(zhuǎn)化為以下基團
并連接在二膦酸酯的酰胺或羥基基團--Y上，形成氨基甲酸酯型或碳酸酯型連接。X可以為O或S。例如，羥基可于C-1、C-3、C-24、C-25處包含在維生素結(jié)構(gòu)中，而且結(jié)合作用可在任何一個羥基位置處進行，但合適的是在上述位置之一。
可根據(jù)圖1-6所示的反應(yīng)路線來合成其中T為二膦酸酯的式(I)結(jié)合物。通常情況下，合成方法包括將維生素D中的羥基轉(zhuǎn)化為鹵代甲酸酯(如氯甲酸酯)或者硫代甲酸酯，然后與二膦酸酯的合適氨基或羥基反應(yīng)形成氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、碳酸酯或者硫代碳酸酯鍵連。如果R2是羥基或者維生素D化合物除所希望的羥基外還包含一個或多個羥基時，這些羥基可通過常規(guī)的羥基保護基如芐基、甲硅烷氧基等在將所希望的羥基轉(zhuǎn)化為鹵代甲酸酯或硫代甲酸酯基團前進行保護。
具體而言，在示例性的實施方案中，起始維生素D化合物或類似物(如果需要，羥基被保護)與光氣反應(yīng)，形成氯甲酸酯，該氯甲酸酯與氨基丁基-1，1-二膦酸酯反應(yīng)，形成氨基甲酸酯鍵連。然后將任何被保護的羥基脫保護。
圖1是合成1α，24-(OH)2D2-氨基烷基和1，1-二膦酸酯之結(jié)合物的示例性路線。如圖1所示，1α，24-(OH)2D2起始物用甲硅烷氧基在C-1和C-3位置處進行保護。該經(jīng)保護的D化合物(1)在甲苯中與光氣反應(yīng)，形成氯甲酸酯(2)。氯甲酸酯(2)與四異丙基4-氨基丁基-1，1-二膦酸酯(例如羥基被保護)在二氯甲烷中反應(yīng)，然后通過快速色譜純制反應(yīng)混合物，以產(chǎn)生經(jīng)保護的結(jié)合物(4)。經(jīng)保護的結(jié)合物(4)與四氫呋喃(THF)和四丁基氟化銨(TBAF)反應(yīng)，以使C-1和C-3的羥基脫保護，產(chǎn)生結(jié)合物的四異丙基酯(5)。四異丙基酯(5)用三甲基溴化硅進行水解，形成結(jié)合物二膦酸結(jié)構(gòu)(6)。在甲醇中照射化合物(6)和9-乙?；欤缓筮^濾、濃縮，并凍干，形成結(jié)合物(7)。
圖2-6所示的合成將在以下的實施例部分中詳細描述。
式(I)結(jié)合物中還優(yōu)選那些T是DHEA者。DHEA的共有甾體結(jié)構(gòu)具有17-酮基和1-羥基。這些基團都適用于通過例如醚或酯型鍵連而連接在維生素D的羥基化位置上。此等連接的反應(yīng)是眾所周知的。
其中T為金屬離子--M的結(jié)合物也是式(I)結(jié)合物中令人所希望的。已知金屬離子可尋靶至許多組織，如鍶對于骨。結(jié)合物可為維生素D部分和金屬離子之間直接形成的配合物，其中所述維生素D部分具有負電荷端基，如在C-24、C-25位等上具有一個或多個羧基，通常表示為D-X-。該結(jié)合物可用式(XII)來表示
其中X是負電荷基團，如羧基-CO2-；而M是二價金屬離子。
另外，該結(jié)合物也可為式(V)的形式，其中D和M通過連接基團而締合，所述連接基團例如是氨基酸。例如，已有人公開金屬離子—氨基酸螯合物能夠進行組織靶向定位給藥。參見例如第4,863,898、4,176,564和4,172,072號美國專利，這些文獻的內(nèi)容在此并入作為參考。例如，鎂—賴氨酸螯合物已表現(xiàn)為可以尋靶骨組織；而鋅和蛋氨酸可尋靶皮膚。此等螯合物為以下形式(AA)*M*(AA)其中M是金屬離子，而AA是氨基酸殘基(例如賴氨酸、精氨酸等)，*表示氨基酸殘基(AA)與金屬離子(M)的締合。在本發(fā)明的結(jié)合物中，金屬—氨基酸螯合物中的氨基酸通過T為二膦酸酯時所示的酰胺型鍵連而連接在維生素D部分上。該結(jié)合物可用式(XIII)表示D-(AA)*M(XIII)其中D是具有能夠形成與氨基酸鍵連之基團如羥基的維生素D部分；(AA)是氨基酸殘基，而M是金屬離子，優(yōu)選為二價離子，如Sr2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Ca2+、Cu2+、Co2+、Cr2+或Mo2+。更具體而言，所述結(jié)合物用下式(XIV)表示
其中D、M、AA和*如以上所定義。
式(I)結(jié)合物中還優(yōu)選那些其中T是抗體者?？捎糜诖说葍?yōu)選結(jié)合物中的抗體或者抗體片段可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)來制備。合適抗體的例子是免疫球蛋白，如IgG、IgA、IgD和IgE?？捎帽绢I(lǐng)域已知的雜交技術(shù)來制備高特異性的單克隆抗體。例如見Kohler等人，245 Nature(1975)495-497；以及6 Eur.J.Immuno.(1976)511-519。這兩份文獻的內(nèi)容在此并入作為參考。此等抗體通常具有高的特異反應(yīng)性。多克隆抗體也適合用作結(jié)合物中的靶向分子組分。但是，當(dāng)靶向分子部分是抗體時，最優(yōu)選單克隆抗體(Mab)。
所選的單克隆抗體對單一表位具有高度特異性，使得單克隆抗體特別適合用作本發(fā)明結(jié)合物中的靶向分子組分。維生素D和單克隆抗體組成的結(jié)合物可在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)尋靶特異性的部位，如癌變組織表面上的和骨組織中的特異性維生素D受體。分離和制備針對特異性抗原的單克隆或多克隆抗體是已知的，如對所選目標(biāo)組織或甚特異性目標(biāo)蛋白的抗體。例如參見Molecular Cloning，第2版，Sambrook等人編輯，Cold Spring Harbor Lab.Press 1989，§18.3 et seq.。也可使用多克隆抗體，其可比單克隆抗體更廉價地制造。但是，多克隆抗體本身是特異性較差的靶向分子。然而，可用組織培養(yǎng)(如雜交瘤細胞系)來制造大量適用于本發(fā)明結(jié)合物中的單克隆抗體。
使用此等抗體靶向分子制成的本發(fā)明結(jié)合物可直接針對如細胞、器官、腫瘤、分化、和其它細胞膜抗原、多核酸如DNA和RNA或者任何生理活性分子。針對靶細胞之維生素D受體的抗體可適用于本發(fā)明的結(jié)合物。
對于根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合物，當(dāng)T是單克隆抗體時，T*D締合適合通過連接基團“G”來完成，如G′-G″表示的生物素—抗生物素蛋白鍵連，并使用本領(lǐng)域已知的生物素—抗生物素蛋白方法。此等基于連接基團的結(jié)合物，如維生素D-生物素—抗生物素蛋白—抗體，可如下表示[D-G′]*[G″-T]圖7顯示了使用例如生物素—抗生物素蛋白結(jié)合物而將抗體偶聯(lián)至維生素D化合物或類似物上的示意圖。
參考圖7，抗生物素蛋白對輔酶生物素具有高親和性。這是一種強的非共價性的相互作用，已被利用將抗體結(jié)合與各種化合物上。生物素或者抗生物素蛋白適合于被偶聯(lián)至維生素D化合物或者抗體組分上。因此，在鍵連維生素D化合物和抗體時，可有許多不同的方法。例如，適當(dāng)?shù)貙⑸锼剡B接在抗體上，以形成生物素化的抗體復(fù)合物，而將抗生物素蛋白適當(dāng)?shù)剡B接在維生素D化合物上，以形成抗生物素蛋白維生素D復(fù)合物。隨后使這兩種復(fù)合物反應(yīng)，以形成抗體—生物素—抗生物素蛋白—維生素D結(jié)合物。維生素D—生物素—抗生物素蛋白—抗體結(jié)合物可按照圖7所示的類似方法來形成。
在式(I)的結(jié)合物上結(jié)合激素或其它藥劑(以“A”表示)也是令人所希望的，以形成如式(XV)表示的二官能結(jié)合物(D)m*(T)n*(A)p(XV)其中A代表除維生素D外的治療劑，p是1或更大的整數(shù)，D、T、m、和n如前所定義，其條件是D和A保持其生理作用，而*表示靶向分子部分與維生素D部分締合以及與除維生素D外的治療劑締合。例如，式(XV)的二官能結(jié)合物是能夠向骨釋放維生素D以及其它骨發(fā)生劑如雌激素者。
因此，作為骨治療結(jié)合物的式(XV)結(jié)合物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其中，A是激素或者已知能夠緩解骨疾病或病變的其它藥劑。此等骨治療劑可包括結(jié)合雌激素或者它們的等價物、抗雌激素、降鈣素、二膦酸酯、鈣添加劑、鈷胺素、百日咳毒素、硼、DHEA和其它骨生長因子如轉(zhuǎn)化生長因子β、抗生物素蛋白或者骨形態(tài)發(fā)生蛋白。
本發(fā)明提供的式(XV)結(jié)合物也可以是其中A為細胞毒性藥劑的抗增殖結(jié)合物。此等藥劑包括estromustene、磷酸酯、松龍苯芥、順鉑、S-氟尿嘧啶、苯丙氨酸氮芥、羥基脲、絲裂霉素、去甲氧柔紅霉素、氨甲蝶呤、阿霉素和柔紅霉素。
本發(fā)明結(jié)合物的所有可能的對映體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，這些對映體由于雙鍵處的順—反構(gòu)型而具有光學(xué)異構(gòu)體和所有可能的幾何異構(gòu)體。另外，本發(fā)明還包括所述化合物的所有藥物學(xué)上可接受的鹽，如鈉、鉀、鋰、銨鹽等。
根據(jù)本發(fā)明之結(jié)合物的預(yù)防或者治療劑量大小取決于待治療病癥的性質(zhì)或嚴(yán)重性以及具體的組合物和給藥途徑而變化。通常情況下，用于骨病的日劑量范圍為約0.025-2.5nmol/kg體重。治療過度增殖性疾病如癌癥的日劑量范圍為約0.025-5nmol/kg體重。
式(I)的結(jié)合物可在藥物組合物中作為活性化合物，該組合物與維生素D3活性形式的已知類似物相比具有更低的副作用和毒性。
本發(fā)明的藥物活性結(jié)合物可根據(jù)藥學(xué)中常規(guī)的方法來處理，以制備用于給藥于患者的藥劑，所述患者例如為哺乳動物，其包括人。為提供有效劑量的結(jié)合物，可使用任何合適的給藥途徑。例如，可使用口服、直腸、局部、非胃腸道、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、眼睛、鼻、頰等給藥途徑。
本發(fā)明的藥物組合物包括作為活性組分的本發(fā)明結(jié)合物或其藥物學(xué)上可接受的鹽，還可包括藥物學(xué)上可接受的載體和任選的其他治療性成分。所述組合物是那些適合于上述各種給藥途徑給藥者，但最合適的給藥途徑取決于待治療之病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重性以及活性成分的性質(zhì)而變化。它們通常為單元劑量劑型。
用于本發(fā)明組合物或方法中合適的藥物學(xué)上可接受的載體包括但不限于水、鹽溶液、醇、阿拉伯膠、植物油(如玉米油、棉籽油、花生油、橄欖油、椰子油)、魚肝油、油酯如Polysorbate80、聚乙二醇、明膠、碳水化合物(如乳糖、直鏈淀粉或淀粉)、硬脂酸鎂、滑石、硅酸、粘性石蠟、脂肪酸單甘油酯和二甘油酯、季戊四醇脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、等等。
藥物制劑可是無菌的，而且如果需要的話，可與輔助試劑混合，所述輔助試劑例如是潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽、緩沖劑、著色劑和調(diào)味劑。另外，本發(fā)明的結(jié)合物可進行包衣，以防止例如肝臟的免疫原性或網(wǎng)狀內(nèi)皮(RES)反應(yīng)?？捎糜诖四康牡脑噭┌ň垡叶?PEG)及本領(lǐng)域中其他的已知試劑。
在另一個方面中，本發(fā)明提供向患者目標(biāo)組織定位給藥維生素D的方法，其包括(1)提供在藥物學(xué)上可接受的載體中由維生素D和至少一種靶向分子形成的結(jié)合物；和(2)給藥治療有效劑量的所述本發(fā)明結(jié)合物。但是，根據(jù)具體的給藥方法，所述結(jié)合物優(yōu)選以下述劑型之一的形式給藥。
對于非胃腸道給藥，無菌注射液是特別合適的，優(yōu)選為油性或含水溶液、以及混懸液、乳液、或者植入劑包括栓劑。安瓿是常規(guī)的單元劑量。
對于腸內(nèi)給藥，特別合適的是片劑、糖衣片劑、液體、滴劑、栓劑、錠劑、粉末或膠囊劑。如果需要甜味載體，糖漿、甘香酒劑等也可使用。由于容易給藥，片劑和膠囊劑是最有利的口服給藥劑量單元。
對于直腸給藥，結(jié)合物可形成為包含栓劑基質(zhì)如可可油或其他三甘油酯的藥物組合物。為延長儲存時間，所述組合物可有利地包括抗氧劑，如抗壞血酸、丁基化羥基茴香醚或氫醌。
合適的局部給藥制劑包括透皮裝置、氣霧劑、乳膏、軟膏、洗液劑、粉末劑等。
優(yōu)選口服給藥本發(fā)明的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的化合物的日劑量通常為約0.025-2.5nmol/kg體重，優(yōu)選為0.025-1nmol/kg體重。通常情況下，本發(fā)明的結(jié)合物以在藥物學(xué)上可接受的載體中的單元劑量劑型來分配。在治療增殖性疾病如癌癥時，式(I)結(jié)合物的腸內(nèi)劑量為約1-100nmol每單元劑量；治療骨病時，為約0.5-50nmol每單元劑量。
另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可認(rèn)識到，所述劑量可進行包膠，制成持續(xù)釋放、緩慢釋放或者直接釋放的給藥系統(tǒng)，如脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)、具有緩慢釋放性質(zhì)的多糖、salistic或其他聚合物植入劑或微球，以及那些活性成分通過微包膠、腸溶包衣、多層包衣等被合適地以一層或多層不同的可降解包衣保護者，而且此等裝置可實現(xiàn)連續(xù)給藥其中所包含的組分。例如，腸溶包衣合適地是耐受胃液崩解者。還可凍干活性成分，并使用如此得到的凍干物，例如來制備注射制劑。
還可進一步理解到，在具體情況下活性化合物的實際優(yōu)選用量可根據(jù)所用具體化合物的功效、配制的具體組分、給藥形式以及所治療的具體部位和生物而變化。例如，對于具體患者的具體劑量取決于患者年齡、性別、體重、健康狀況、飲食、給藥的時間和方式、排泄速率、復(fù)合用藥、以及所治療疾病的嚴(yán)重性。用于某一宿主的劑量可根據(jù)常規(guī)方法來確定，例如通過合適的常規(guī)藥理學(xué)方法比較所用化合物與已知藥劑的不同活性。
以下將通過實施例進一步說明本發(fā)明，但這些實施例并不是用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1合成1α-(OH)-24-氨基烷基-1，1-二磷酸酯-D2結(jié)合物(7)參考圖1所示的反應(yīng)路線。將已知醇(1)(1.0g，1.52mmol)在甲苯(5ml)中的溶液添加至22ml的12.5％光氣甲苯溶液，然后在室溫下攪拌溶液20小時。減壓濃縮反應(yīng)混合物，以形成氯甲酸酯(2)。
將吡啶(0.18ml，2.2mmol)添加至(2)(1.1g，1.53mmol)和四異丙基4-氨基丁基-1，1-二磷酸酯(3)(見Saari等人的第5,183,815號美國專利)(0.92g，2.2mmol)在二氯甲烷(12ml)中的溶液，然后在室溫下攪拌混合物3天。減壓濃縮反應(yīng)混合物，并在硅膠上通過快速色譜純制殘留物，其中使用甲醇/氯仿作為洗脫劑，產(chǎn)生化合物(4)。
在室溫下攪拌化合物(4)(0.80g，0.74mmol)在四氫呋喃(THF)(10ml)中的溶液和四丁基氟化銨(TBAF)(2.2ml的1.0M THF溶液，2.2mmol)24小時。用水(30ml)稀釋反應(yīng)混合物，然后用二氯甲烷(3×40ml)萃取。合并二氯甲烷部分，用無水硫酸鈉干燥，過濾，然后減壓濃縮濾液。殘留物在硅膠上通過快速色譜進行純制，其中使用甲醇/氯仿作為洗脫劑，產(chǎn)生四異丙基酯化合物(5)。
將三甲基溴化硅(0.39ml，2.92mmol)添加至四異丙基酯化合物(5)(0.5g，0.58mmol)在二氯甲烷(6ml)中的溶液，然后在惰性氣氛下于室溫攪拌該混合物24小時。減壓濃縮反應(yīng)混合物，然后用水(15ml)稀釋殘留物。過濾混合物，然后凍干濾液，形成化合物(6)。
將化合物(6)(250mg，0.36mmol)和9-乙?；?21mg)在甲醇(93ml)中的溶液放置在ACE 500ml光反應(yīng)器中，并用氮氣清洗溶液15分鐘。將反應(yīng)混合物冷卻至0℃，然后用從鈾酰玻璃中濾過的400W Hanovia燈照射2小時。過濾反應(yīng)混合物，并減壓濃縮濾液。殘留物用水(10ml)稀釋。過濾混合物，凍干濾液，形成題述結(jié)合物(7)。實施例2合成1-氨基烷基-1，1-二磷酸酯-24-(OH)-D2(16)參考圖2A和2B中的反應(yīng)路線。在0℃的化合物(1)(2.0g，3.04mmol)和N，N-二異丙基乙基胺(0.78g，6.1mmol)在二氯甲烷(25ml)中的溶液中添加氯甲基甲基醚(0.29g，3.6mmol)。在0℃下攪拌所得的反應(yīng)混合物1小時，然后在室溫下攪拌7小時，接著用水(30ml)進行稀釋。用二氯甲烷(3×25ml)萃取經(jīng)分離的含水相，用無水硫酸鈉干燥經(jīng)合并的有機相，過濾，然后真空濃縮濾液。用硅膠快速色譜純制殘留物，形成化合物(8)。
在室溫下攪拌化合物(8)(1.99g，2.84mmol)在THF(38ml)中的溶液和TBAF(8.4ml的1.0M THF)24小時。用水(100ml)稀釋反應(yīng)混合物，然后用二氯甲烷(3×100ml)萃取。用無水硫酸鈉干燥經(jīng)合并的二氯甲烷相，過濾，然后真空濃縮濾液。在硅膠上通過快速色譜純制殘留物，其中使用甲醇/氯仿作為洗脫劑，形成二醇化合物(9)。
在二醇(9)(1.25g，2.64mmol)、N，N-二甲基甲酰胺(20ml)和咪唑(0.54g，7.93mmol)的溶液中添加叔丁基二甲基氯化硅(0.40g，2.64mmol)。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物6小時，然后用水(60ml)稀釋，并用二氯甲烷(3×70ml)萃取。用鹽水(50ml)洗滌經(jīng)合并的有機相，用無水硫酸鈉干燥，過濾，然后減壓濃縮濾液。殘留物在硅膠上通過快速色譜進行純制，分別形成兩種產(chǎn)物。它們在圖2A中表示為醇(10)和(11)。
如圖2B的上部所示，將醇(10)(0.5g，0.85mmol)在甲苯(2.5ml)中的溶液添加至12.3ml的12.5％光氣甲苯溶液，然后在室溫下攪拌該溶液20小時。減壓濃縮反應(yīng)混合物，形成氯甲酸酯(12)。
將吡啶(0.09ml，1.1mmol)添加至氯甲酸酯(12)(0.5g，0.77mmol)和四異丙基4-氨基丁基-1，1-二磷酸酯(3)(0.46g，1.1mmol)在二氯甲烷(6ml)中的溶液，然后在室溫下攪拌該混合物3天。減壓濃縮反應(yīng)混合物，殘留物在硅膠上通過快速色譜進行純制，其中使用甲醇/氯仿作為洗脫劑，形成化合物(13)。
在室溫下攪拌化合物(13)(0.50g，0.49mmol)在THF(7ml)中的溶液和TBAF(0.74ml的1.0M THF溶液，0.74mmol)24小時。用水(20ml)稀釋反應(yīng)混合物，然后用二氯甲烷(3×30ml)萃取。用無水硫酸鈉干燥經(jīng)合并的二氯甲烷部分，過濾，然后減壓濃縮濾液。殘留物在硅膠上通過快速色譜進行純制，其中使用甲醇/氯仿作為洗脫劑，形成化合物(14)。
將三甲基溴化硅(0.26ml，1.96mmol)添加至四異丙基酯(14)(0.35g，0.39mmol)在二氯甲烷(4ml)中的溶液，然后在惰性氣氛下于室溫攪拌該混合物24小時。減壓濃縮反應(yīng)混合物，殘留物用水(15ml)和甲醇(3ml)稀釋，并攪拌8小時。過濾混合物，然后凍干濾液，形成化合物(15)。
將化合物(15)(0.21g，0.31mmol)和9-乙?；?18mg)在甲醇(80ml)中的溶液放置在ACE 500ml光反應(yīng)器中，并用氮氣清洗溶液15分鐘。將反應(yīng)混合物冷卻至0℃，然后用從鈾酰玻璃中濾過的400W Hanovia燈照射2小時。過濾反應(yīng)混合物，并減壓濃縮濾液。殘留物用水(10ml)稀釋。過濾混合物，凍干濾液，形成題述結(jié)合物(16)。實施例3合成1α，24-(OH)2-3-氨基烷基-1，1-二磷酸酯-D2(21)參考圖3所示的反應(yīng)路線。將醇(11)(0.5g，0.85mmol)在甲苯(2.5ml)中的溶液添加至12.3ml的12.5％光氣甲苯溶液，然后在室溫下攪拌溶液20小時。減壓濃縮反應(yīng)混合物，以形成氯甲酸酯(17)。
將吡啶(0.081ml，1mmol)添加至(17)(0.45g，0.69mmol)和四異丙基4-氨基丁基-1，1-二磷酸酯(0.41g，1mmol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液，然后在室溫下攪拌混合物3天。減壓濃縮反應(yīng)混合物，并在硅膠上通過快速色譜純制殘留物，其中使用甲醇/氯仿作為洗脫劑，產(chǎn)生化合物(18)。
在室溫下攪拌化合物(18)(0.47g，0.46mmol)在THF(6.5ml)中的溶液和TBAF(0.7ml的1.0M THF溶液，0.7mmol)24小時。用水(30ml)稀釋反應(yīng)混合物，然后用二氯甲烷(3×30ml)萃取。合并二氯甲烷部分，用無水硫酸鈉干燥，過濾，然后減壓濃縮濾液。殘留物在硅膠上通過快速色譜進行純制，其中使用甲醇/氯仿作為洗脫劑，產(chǎn)生化合物(19)。
將三甲基溴化硅(0.23ml，1.74mmol)添加至四異丙基酯(19)(0.31g，0.34mmol)在二氯甲烷(4ml)中的溶液，然后在惰性氣氛下于室溫攪拌該混合物24小時。減壓濃縮反應(yīng)混合物，然后用水(15ml)和甲醇(3ml)稀釋殘留物，并攪拌8小時。過濾混合物，然后凍干濾液，形成化合物(20)。
將化合物(20)(0.21g，0.31mmol)和9-乙酰基蒽(18mg)在甲醇(80ml)中的溶液放置在ACE 500ml光反應(yīng)器中，并用氮氣清洗溶液15分鐘。將反應(yīng)混合物冷卻至0℃，然后用從鈾酰玻璃中濾過的400W Hanovia燈照射2小時。過濾反應(yīng)混合物，并減壓濃縮濾液。殘留物用水(10ml)稀釋。過濾混合物，凍干濾液，形成題述結(jié)合物(21)。實施例4合成1α-氨基烷基-1，1-二磷酸酯-25-(OH)-D3(32)參考圖4A和4B中的反應(yīng)路線。將已知酮(22)(3.1g，11.1mmol)(見Baggiolini等人，51 J.Org.Chem.(1986)，3098-3108，該文獻在此并入作為參考)、3，4-二氫-2H-吡喃(1.52ml，16.7mmol)和吡啶鎓對甲苯磺酸(0.1g，0.4mmol)溶解在二氯甲烷(50ml)中，然后在室溫下攪拌24小時。反應(yīng)混合物用水(30ml)進行洗滌，并用無水硫酸鈉干燥有機相，過濾，然后真空濃縮濾液。用硅膠快速色譜純制殘留物，形成酮化合物(23)。
將已知氧化膦(24)(1.35g，2.32mmol)在35ml無水THF中的溶液冷卻至-78℃，然后滴加m-丁基鋰(1.45ml的1.6M己烷溶液)進行處理。在-78℃下攪拌該陰離子溶液5分鐘，然后在10-15分鐘的時間內(nèi)添加溶解在無水THF(10ml)中的酮(23)(0.57g，1.56mmol)。在-78℃下攪拌反應(yīng)混合物2小時，然后用2N酒石酸鉀鈉溶液(6ml)和2N碳酸氫鉀溶液(6ml)稀釋。將溶液溫?zé)嶂潦覝?，然后用乙酸乙?4×25ml)萃取。用鹽水洗滌經(jīng)合并的有機部分，在無水硫酸鈉上干燥，過濾，然后減壓濃縮。殘留物在硅膠上通過快速色譜進行純制，其中使用乙酸乙酯/己烷作為洗脫劑，形成化合物(25)。
在室溫下攪拌化合物(25)(0.95g，1.3mmol)在THF(17ml)中的溶液和TBAF(3.9ml的1.0M THF，3.9mmol)24小時。用水(50ml)稀釋反應(yīng)混合物，然后用二氯甲烷(3×60ml)萃取。用無水硫酸鈉干燥經(jīng)合并的二氯甲烷相，過濾，然后真空濃縮濾液。在硅膠上通過快速色譜純制殘留物，其中使用甲醇/氯仿作為洗脫劑，形成二醇化合物(26)。
在二醇化合物(26)(0.55g，1.1mmol)、N，N-二甲基甲酰胺(8ml)和咪唑(0.255g，3.3mmol)的溶液中添加叔丁基二甲基氯化硅(0.166g，1.1mmol)。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物6小時，然后用水(30ml)稀釋，并用二氯甲烷(3×40ml)萃取。用鹽水(30ml)洗滌經(jīng)合并的有機相，用無水硫酸鈉干燥，過濾，然后減壓濃縮濾液。殘留物在硅膠上通過快速色譜進行純制，分別形成兩種產(chǎn)物。它們在圖4A中表示為醇(27)和(28)。
如圖4B的上部所示，將醇(27)(0.25g，0.41mmol)在甲苯(3ml)中的溶液添加至6ml的12.5％光氣甲苯溶液，然后在室溫下攪拌該溶液20小時。減壓濃縮反應(yīng)混合物，形成氯甲酸酯(29)。
將吡啶(0.047ml，0.57mmol)添加至(29)(0.27g，0.4mmol)和四異丙基4-氨基丁基-1，1-二磷酸酯(0.24g，0.57mmol)在二氯甲烷(4ml)中的溶液，然后在室溫下攪拌該混合物3天。減壓濃縮反應(yīng)混合物，殘留物在硅膠上通過快速色譜進行純制，其中使用甲醇/氯仿作為洗脫劑，形成化合物(30)。
在室溫下攪拌化合物(30)(0.36g，0.35mmol)在THF(5ml)中的溶液和TBAF(0.52ml的1.0M THF溶液，0.52mmol)24小時。用水(15ml)稀釋反應(yīng)混合物，然后用二氯甲烷(3×25ml)萃取。用無水硫酸鈉干燥經(jīng)合并的二氯甲烷部分，過濾，然后減壓濃縮濾液。殘留物在硅膠上通過快速色譜進行純制，其中使用甲醇/氯仿作為洗脫劑，形成化合物(31)。
將三甲基溴化硅(0.20ml，1.54mmol)添加至四異丙基酯(31)(0.28g，0.30mmol)在二氯甲烷(4ml)中的溶液，然后在惰性氣氛下于室溫攪拌該混合物24小時。減壓濃縮反應(yīng)混合物，殘留物用水(15ml)和甲醇(3ml)稀釋，并攪拌半小時。過濾混合物，然后凍干濾液，形成化合物(32)。實施例5合成1α，25-(OH)2-3-氨基烷基-1，1-二磷酸酯-D3(36)參考圖5所示的反應(yīng)路線。將醇(28)(0.26g，0.43mmol)在甲苯(3ml)中的溶液添加至6.2ml的12.5％光氣甲苯溶液，然后在室溫下攪拌溶液20小時。減壓濃縮反應(yīng)混合物，以形成氯甲酸酯(33)。
將吡啶(0.049ml，0.59mmol)添加至氯甲酸酯(33)(0.28g，0.42mmol)和四異丙基4-氨基丁基-1，1-二磷酸酯(0.25g，0.59mmol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液，然后在室溫下攪拌混合物3天。減壓濃縮反應(yīng)混合物，并在硅膠上通過快速色譜純制殘留物，其中使用甲醇/氯仿作為洗脫劑，產(chǎn)生化合物(34)。
在室溫下攪拌化合物(34)(0.37g，0.36mmol)在THF(5ml)中的溶液和TBAF(0.54ml的1.0M THF溶液，0.54mmol)24小時。用水(15ml)稀釋反應(yīng)混合物，然后用二氯甲烷(3×25ml)萃取。合并二氯甲烷部分，用無水硫酸鈉干燥，過濾，然后減壓濃縮濾液。殘留物在硅膠上通過快速色譜進行純制，其中使用甲醇/氯仿作為洗脫劑，產(chǎn)生四異丙基酯(35)。
將三甲基溴化硅(0.21ml，1.60mmol)添加至四異丙基酯化合物(35)(0.29g，0.31mmol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液，然后在惰性氣氛下于室溫攪拌該混合物24小時。減壓濃縮反應(yīng)混合物，然后用水(15ml)和甲醇(3ml)稀釋殘留物，并攪拌半小時。過濾混合物，然后凍干濾液，形成題述結(jié)合物(36)。實施例6合成1α-(OH)-25-氨基烷基-1，1-二磷酸酯-D3(41)參考圖6所示的反應(yīng)路線。向醚(25)(1.31g，1.8mmol)在甲醇(10ml)和水(2ml)中的溶液添加吡啶鎓對甲苯磺酸水合物(0.034g，0.18mmol)。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物1小時，用水(20ml)稀釋，然后用二氯甲烷(3×30ml)萃取。用無水硫酸鈉干燥經(jīng)合并的有機相，過濾，然后真空濃縮。殘留物在硅膠上通過快速色譜進行純制，其中使用甲醇/氯仿作為洗脫劑，產(chǎn)生醇(37)。
將醇(37)(1.09g，1.7mmol)在甲苯(9ml)中的溶液添加至25ml的12.5％光氣甲苯溶液，然后在室溫下攪拌溶液20小時。減壓濃縮反應(yīng)混合物，以形成氯甲酸酯(38)。
將吡啶(0.19ml，2.32mmol)添加至氯甲酸酯(38)(1.17g，1.65mmol)和四異丙基4-氨基丁基-1，1-二磷酸酯(0.98g，2.32mmol)在二氯甲烷(20ml)中的溶液，然后在室溫下攪拌混合物3天。減壓濃縮反應(yīng)混合物，并在硅膠上通過快速色譜純制殘留物，其中使用甲醇/氯仿作為洗脫劑，產(chǎn)生醇(39)。
在室溫下攪拌醇(39)(1.61g，1.5mmol)在THF(20ml)中的溶液和TBAF(4.5ml的1.0M THF溶液，4.5mmol)24小時。用水(60ml)稀釋反應(yīng)混合物，然后用二氯甲烷(3×60ml)萃取。合并二氯甲烷部分，用無水硫酸鈉干燥，過濾，然后減壓濃縮濾液。殘留物在硅膠上通過快速色譜進行純制，其中使用甲醇/氯仿作為洗脫劑，產(chǎn)生四異丙基酯化合物(40)。
將三甲基溴化硅(0.75ml，5.68mmol)添加至四異丙基酯化合物(40)(0.93g，1.1mmol)在二氯甲烷(20ml)中的溶液，然后在惰性氣氛下于室溫攪拌該混合物24小時。減壓濃縮反應(yīng)混合物，然后用水(30ml)稀釋殘留物。過濾混合物，然后凍干濾液，形成題述化合物(41)。
總之，本發(fā)明提供用于靶向給藥的維生素D結(jié)合物。所述結(jié)合物包括維生素D部分和對目標(biāo)組織具有親和性的靶向分子部分。該結(jié)合物的特征在于使維生素D化合物具有定位靶向作用，即、維生素D和骨親和劑的結(jié)合物用于將維生素D輸送至骨組織并釋放。
雖然已通過實施例具體描述和闡明了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員還可對本發(fā)明進行各種的改進和修改。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合物，其包含至少一種維生素D部分，該維生素D部分與對目標(biāo)組織具有親和性的靶向分子部分締合。
2.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合物，其中，所述至少一種維生素D部分與至少一種靶向分子部分的摩爾比為1∶1。
3.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合物，其中，所述維生素D部分通過連接基團與所述靶向分子部分締合。
4.如權(quán)利要求3所述的結(jié)合物，其中，所述連接基團是通過改性維生素D部分和靶向分子部分而形成的連接基團，以在它們之間形成鍵聯(lián)。
5.如權(quán)利要求3所述的結(jié)合物，其中，所述連接基團是二官能連接基團。
6.如權(quán)利要求3所述的結(jié)合物，其中，所述維生素D部分通過所述連接基團和至少一個其他連接基團而與所述靶向分子部分締合。
7.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合物，其中，所述靶向分子部分是二磷酸酯。
8.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合物，其中，所述靶向分子部分是脫氫表雄酮。
9.如權(quán)利要求7所述的結(jié)合物，其中，所述二磷酸酯在所述維生素D部分的C-1、C-3、C-24或者C-25位置處連接在所述維生素D部分上。
10.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合物，其中，所述靶向分子部分是金屬離子。
11.如權(quán)利要求5所述的結(jié)合物，其中，所述二官能連接基團是螯合于靶向分子部分上的氨基酸，而且其通過酰胺鍵連接在所述維生素D部分上。
12.如權(quán)利要求10所述的結(jié)合物，其中，所述金屬離子是選自以下組中的二價金屬離子Sr2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Ca2+、Cu2+、Co2+、Cr2+或Mo2+。
13.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合物，其中，所述靶向分子是抗體。
14.如權(quán)利要求13所述的結(jié)合物，其中，所述抗體靶向分子部分通過生物素—抗生物素蛋白鍵連而與所述維生素D部分締合，而且所述生物素連接在所述抗體上，抗生物素蛋白連接在所述維生素D部分上。
15.如權(quán)利要求13所述的結(jié)合物，其中，所述靶向分子是單克隆抗體。
16.如權(quán)利要求13所述的結(jié)合物，其中，所述靶向分子是多克隆抗體。
17.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合物，其中，除連接的維生素D外，還包括至少一種治療劑。
18.如權(quán)利要求17所述的結(jié)合物，其中，所述治療劑是選自以下組中的骨治療劑結(jié)合雌激素或者它們的等同物、抗雌激素、降鈣素、二膦酸酯、鈣添加劑、鈷胺素、百日咳毒素、硼、脫氫表雄酮、轉(zhuǎn)化生長因子β、抗生物素蛋白和骨形態(tài)發(fā)生蛋白。
19.如權(quán)利要求17所述的結(jié)合物，其中，所述治療劑是選自以下組中的細胞毒性藥劑estromustene、磷酸酯、松龍苯芥、順鉑、S-氟尿嘧啶、苯丙氨酸氮芥、羥基脲、絲裂霉素、去甲氧柔紅霉素、氨甲蝶呤、阿霉素和柔紅霉素。
20.一種藥物組合物，其包括包含至少一種維生素D部分的結(jié)合物，該維生素D部分與對目標(biāo)組織具有親和性的至少一種靶向分子部分締合；以及合適的藥物學(xué)上可接受的載體。
21.如權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其進一步包括用于包封結(jié)合物以定時釋放結(jié)合物的不同降解包衣。
22.如權(quán)利要求21所述的藥物組合物，其中，所述包衣是腸溶包衣。
23.一種向患者的目標(biāo)組織定位給藥維生素D部分的方法，其包括以下步驟a、提供包含在藥物學(xué)上可接受的載體中的維生素D部分的結(jié)合物，所述結(jié)合物包含至少一種與至少一種靶向分子部分締合的維生素D部分，所述靶向分子部分對目標(biāo)組織具有親和性。b、向所述患者給藥治療有效劑量的所述結(jié)合物。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述結(jié)合物口服給藥于患有骨疾病的患者，其劑量為0.5-50nmol每單元劑量。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述結(jié)合物口服給藥于患有過度增殖性疾病的患者，其劑量為1-100nmol每單元劑量。
26.如權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述結(jié)合物在給藥于所述患者后被釋放至目標(biāo)組織。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中，所述靶向分子部分在將所述結(jié)合物釋放至所述目標(biāo)組織后斷開，由此增強所述結(jié)合物中維生素D部分的效用。
28.式(I)的結(jié)合物(D)m*(T)n(I)其中D代表維生素D部分；T代表靶向分子部分；n和m代表1或更大的整數(shù)；而*表示所述靶向分子部分與所述維生素D部分締合。
29.一種包含如權(quán)利要求28所述之結(jié)合物的抗增殖組合物，其中，T是能夠?qū)ぐ邪┘毎S生素D受體的試劑
30.如權(quán)利要求28所述的結(jié)合物，其中，T是單克隆、多克隆抗體或其片段、金屬離子、骨尋靶劑、或者腫瘤尋靶劑。
31.如權(quán)利要求30所述的結(jié)合物，其中，所述骨尋靶劑是二磷酸酯、四環(huán)素、聚丙二酸酯或者脫氫表雄酮。
32.式(IV)的結(jié)合物[(T)n-(G′)f]g*[(G″)h-(D)m]k(IV)其中G′代表相同或不同的連接基團；G″代表相同或不同的連接基團；D代表維生素D部分；T代表靶向分子部分g、k、n和m分別獨立地代表1或更大的整數(shù)；f和h分別獨立地代表0或更大的整數(shù)；—表示在存在連接基團時的鍵；而*表示D通過連接基團G′或G″或者在這兩個連接基團都存在時通過這兩個連接基團而與T締合。
33.如權(quán)利要求32所述的結(jié)合物，其中，G′是生物素；G″是抗生物素蛋白，而*表示生物素—抗生物素蛋白鍵連。
34.式(XV)的結(jié)合物(D)m*(T)n*(A)p(XV)其中D代表維生素D部分；T代表靶向分子部分；A代表除維生素D外的治療劑，m、n和p代表1或更大的整數(shù)，而*表示靶向分子部分與維生素D部分締合以及與除維生素D外的治療劑締合。
35.如權(quán)利要求34所述的結(jié)合物，其中，A是細胞毒性劑或者骨治療劑。
36.如權(quán)利要求35所述的結(jié)合物，其中，T是骨尋靶劑。
37.一種治療人骨疾病的方法，其包括向所述患者給藥治療有效量的如權(quán)利要求36所述的結(jié)合物。
38.如權(quán)利要求34所述的結(jié)合物，其中，T是骨尋靶劑，而A是骨尋靶劑。
39.一種治療人骨疾病的方法，其包括向所述患者給藥治療有效量的如權(quán)利要求38所述的結(jié)合物。
40.一種包含如權(quán)利要求34所述之結(jié)合物的抗增殖組合物，其中，T是能夠?qū)ぐ邪┘毎S生素D受體的試劑，而A是細胞毒性劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種結(jié)合物,其包含至少一種維生素D部分和至少一種靶向分子部分。本發(fā)明還涉及包含該結(jié)合物的藥物組合物,以及使用該結(jié)合物向目標(biāo)組織定位給藥維生素D或其類似物的方法。在將特別優(yōu)選的結(jié)合物給藥于患者時,本發(fā)明之結(jié)合物中的靶向分子部分可尋靶并結(jié)合于目標(biāo)組織,如骨或腫瘤組織,其中所述維生素D具有治療作用。
文檔編號A61P35/00GK1254293SQ98802534
公開日2000年5月24日 申請日期1998年2月13日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月13日
發(fā)明者理查德·B·馬澤斯, 查爾斯·W·畢曉普 申請人:骨療國際公司