一種對任意核酸實施靶向切割的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種對任意核酸實施靶向切割的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 分子生物學中對核酸的靶向切割常常使用限制性內(nèi)切酶，限制性核酸內(nèi)切酶是一 種能催化核酸斷裂的酶，只對一定堿基序列中的一定位置發(fā)生作用。限制性內(nèi)切酶主要分 成三大類，其中II型限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸序列，并在該序列中或者序列外的 固定位置切割雙鏈，產(chǎn)生粘性或平頭末端，是常用的工具酶。盡管目前有超過3700種限制 性內(nèi)切酶被開發(fā)，卻只能識別300種不同的核酸序列，很難滿足科研和應用的需要，因此， 數(shù)種拓展可被識別序列范圍的方法應運而生。
[0003] 第一種研究思路，是將現(xiàn)有限制性內(nèi)切酶的關(guān)鍵氨基酸突變，使其本身的識別切 害I]特性發(fā)生變化，得到不同性質(zhì)的限制性內(nèi)切酶，從而識別并切割不同序列。
[0004] 第二種研究思路，是將不同限制性內(nèi)切酶的識別功能域、切割功能域交叉互換，彼 此排列組合，形成新的限制性內(nèi)切酶，從而識別并切割不同序列。
[0005] 第三種研究思路，是通過頻繁變更內(nèi)切酶中的具有序列識別活性的功能域，實現(xiàn) 對多種序列的識別。鋅指蛋白核酸內(nèi)切酶（ZFNs)就是這樣一種酶，ZFNs的非特異性核酸 切割域源自FokI酶C端196個氨基酸肽段，與切割功能域相連的識別域是由一系列鋅指 蛋白串聯(lián)組成，每個鋅指蛋白特異性識別并結(jié)合一個特異的三聯(lián)體堿基，鋅指蛋白中alpha 螺旋的16個氨基酸決定了鋅指蛋白的DNA結(jié)合特異性，因此不同的鋅指蛋白可以識別并結(jié) 合不同的核酸序列，通過更換鋅指蛋白就可以實現(xiàn)對不同序列核酸底物的識別切割。同時， 人們還研究出了轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶（TALENs)，該酶與ZFNs的區(qū)別在于用轉(zhuǎn)錄 激活因子樣效應子代替了鋅指蛋白。前者可以識別不同的單個堿基，后者只能識別不同的 三聯(lián)體堿基，因此TALENs比ZFNs更加具有應用潛力。
[0006] 盡管ZFNs和TALENs實現(xiàn)了對許多不同序列的識別和切割，但其昂貴的價格、過 長的設計周期使得二者的廣泛應用受到嚴重限制，原因在于，頻繁變更內(nèi)切酶中的功能域， 其過程十分復雜。更加嚴重的是，盡管理論上可以針對任何序列設計相應的ZFNs，實際上 ZFNs幾乎只對G堿基含量較高的序列有較好的識別作用，這是因為鋅指蛋白中富含精氨 酸，精氨酸和G堿基之間相互作用比精氨酸與其它堿基之間的作用力強。并且ZFNs的非特 異切割嚴重，常常錯切導致細胞毒性。這些都證明通過頻繁變更內(nèi)切酶中具有序列識別活 性的功能域以實現(xiàn)對多種序列識別的方法有較大的局限性。
[0007] 為了提高通用性，降低成本，縮短設計周期，本發(fā)明引入了結(jié)構(gòu)識別目的核酸的概 念，替代傳統(tǒng)的序列識別目的核酸概念，通過一種能和目的核酸形成特殊結(jié)構(gòu)的探針以及 一種可識別該結(jié)構(gòu)的酶，實現(xiàn)對不同核酸的靶向識別切割。與頻繁變更內(nèi)切酶中的功能域 相比，變更探針更加節(jié)省時間和費用，具有較強的創(chuàng)新性、通用性以及應用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有核酸切割技術(shù)的上述不足，提供一種對任意核酸實施靶 向切割的方法。
[0009] -種對任意核酸實施靶向切割的方法，根據(jù)目標核酸的靶位點，設計針對靶位點 的核酸探針；加入核酸探針，使其與目標核酸雜交，形成能夠被一類識別核酸結(jié)構(gòu)并具有切 割活性的酶識別的結(jié)構(gòu)；在所述的識別核酸結(jié)構(gòu)并具有切割活性的酶存在的情況下，對核 酸探針與目標核酸形成的雜交結(jié)構(gòu)進行切割；對于序列不同的靶核酸，只需要更換對應的 核酸探針，無需更換酶，即可對任意序列核酸進行靶向切割。
[0010] 其中，所述的識別核酸結(jié)構(gòu)并具有切割活性的酶為一種重組結(jié)構(gòu)識別核酸內(nèi)切 酶，包含識別功能域、切割功能域以及連接二者的肽段；所述的識別功能域為能夠識別結(jié)構(gòu) 為5'突出核酸結(jié)構(gòu)、3'突出核酸結(jié)構(gòu)、切刻核酸結(jié)構(gòu)、侵入核酸結(jié)構(gòu)、三鏈核酸結(jié)構(gòu)、Y型 核酸結(jié)構(gòu)以及由錯配或缺失核酸引起的鼓泡核酸結(jié)構(gòu)中的至少一種的識別功能域，優(yōu)選 TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN、MthFEN、E.coliMuts、Tthmuts或Taqmuts 中任意一種酶的識別功能域或全酶片段；所述的切割功能域為IIS型核酸內(nèi)切酶的切割功 能域，優(yōu)選FokI的部分或全部肽段；所述的連接肽段為不影響結(jié)構(gòu)識別與酶切功能的的 柔性肽段，優(yōu)選甘氨酸或絲氨酸的串聯(lián)組合。
[0011] 所述的識別核酸結(jié)構(gòu)并具有切割活性的酶的氨基酸序列優(yōu)選自SEQIDNO. 4、SEQ IDNO. 5、SEQIDNO. 6、SEQIDNO. 7、SEQIDNO. 8 中的任意一種。
[0012] 所述的核酸為DNA或RNA。
[0013] 所述的目標核酸為單鏈或者雙鏈，當為雙鏈時分別針對其中一條鏈的切割位置設 計探針。
[0014] 所述的核酸探針與靶核酸形成的結(jié)構(gòu)包括5'突出核酸結(jié)構(gòu)、3'突出核酸結(jié)構(gòu)、切 刻核酸結(jié)構(gòu)、侵入核酸結(jié)構(gòu)、三鏈核酸結(jié)構(gòu)、Y型核酸結(jié)構(gòu)以及由錯配或缺失核酸引起的鼓 泡核酸結(jié)構(gòu)中的至少一種。
[0015] 一種重組結(jié)構(gòu)識別核酸內(nèi)切酶，該重組結(jié)構(gòu)識別核酸內(nèi)切酶由識別功能域、切割 功能域以及識別功能域和切割功能域之間的連接片段組成，所述的識別功能域為能夠識別 二級結(jié)構(gòu)為5'突出核酸結(jié)構(gòu)、3'突出核酸結(jié)構(gòu)、切刻核酸結(jié)構(gòu)、侵入核酸結(jié)構(gòu)、三鏈核酸結(jié) 構(gòu)、Y型核酸結(jié)構(gòu)以及由錯配或缺失核酸引起的鼓泡核酸結(jié)構(gòu)中的任意一種的肽段；所述 的切割功能域為IIS型核酸內(nèi)切酶的切割功能域肽段；所述的連接片段主要由絲氨酸和甘 氨酸組成。
[0016]所述的識別功能域優(yōu)選自TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN、 MthFEN、E.coliMuts、Tthmuts或Taqmuts中任意一種的部分或全部肽段；進一步優(yōu)選 AfuFEN、TaqPol或Tthmuts中任意一種的部分或全部肽段；所述的切割功能域優(yōu)選自FokI 的C端196個氨基酸殘基；所述的連接片段優(yōu)選自SEQIDNO. 1或SEQIDNO. 2中的任意 一種。
[0017] 所述的識別核酸結(jié)構(gòu)并具有切割活性的酶的氨基酸序列優(yōu)選自SEQIDNO. 4、SEQ IDNO. 5、SEQIDNO. 6、SEQIDNO. 7、SEQIDNO. 8 中的任意一種。
[0018] 本發(fā)明所述的5'突出核酸結(jié)構(gòu)是指一種由兩條長度不等的互補核酸構(gòu)成的結(jié)構(gòu)， 短核酸的5'端與長核酸的3'端平齊，長核酸的5'端長于短核酸的3'端，即長核酸的5' 端有部分處于單鏈狀態(tài)，如圖1所示；
[0019] 本發(fā)明所述的3'突出核酸結(jié)構(gòu)是指由一種由兩條長度不等的互補核酸構(gòu)成的結(jié) 構(gòu)，短核酸的3'端與長核酸的5'端平齊，長核酸的3'端長于短核酸的5'端，即長核酸的 3'端有部分處于單鏈狀態(tài)，如圖2所示；
[0020] 本發(fā)明所述的切刻核酸結(jié)構(gòu)是指一種由兩條互補核酸組成的結(jié)構(gòu)，其中一條核酸 的兩個相鄰堿基之間缺少磷酸二脂堿，如圖3所示；
[0021] 本發(fā)明所述的Y型核酸結(jié)構(gòu)是指一種由兩條部分互補的核酸組成的結(jié)構(gòu)，兩條核 酸的一段完全互補，另一端不互補，形成Y型，如圖4所示；
[0022] 本發(fā)明所述的侵入核酸結(jié)構(gòu)是指一種由上游探針、下游探針以及模板探針組成的 結(jié)構(gòu)，上、下游探針均與模板互補，DNA雙鏈中上游探針侵入下游雙鏈至少一個堿基形成的 如圖5所示的結(jié)構(gòu)；
[0023] 本發(fā)明所述的錯配或缺失核酸引起的鼓泡核酸結(jié)構(gòu)是指由兩條不完全互補的核 酸所組成的結(jié)構(gòu)，其中因為錯配或者缺失的堿基而形成一個或若干堿基的不匹配，稱之為 鼓泡結(jié)構(gòu)，如圖6所示。
[0024] 有益效果：
[0025] 本發(fā)明方法對于不同的目標核酸，只需要更換對應