照，63°C反 應(yīng)2h，反應(yīng)產(chǎn)物加2X上樣緩沖液（90%甲酰胺，0? 5%EDTA，0? 1%二甲苯藍(lán)，0? 1%溴酚藍(lán))， 煮沸5min，急速冷卻，20%尿素變性電泳，120V電泳2h，銀染分析切割條帶。反應(yīng)產(chǎn)物的電 泳結(jié)果見圖13,其中T表示靶核酸1SEQIDNo. 15,UP表示上游探針1SEQIDNo. 13,DP表 示下游探針1SEQIDNo. 14,與沒有酶作用的對照組相比(泳道3)，在Flap核酸內(nèi)切酶1的 作用下，下游探針1寡核酸SEQIDNo. 14被切割產(chǎn)生片段長度更短的切割產(chǎn)物Flap片段 (泳道1箭頭所示)，在重組酶A3N的作用下，下游探針1寡核酸SEQIDNo. 14也被切割產(chǎn) 生與泳道1所示結(jié)果相同的Flap片段(泳道2箭頭所示)，證明所表達(dá)的重組酶A3N具有識 別侵入核酸結(jié)構(gòu)（圖5)的活性。
[0057] 實施例5〈重組結(jié)構(gòu)識別核酸內(nèi)切酶A3N體外切割活性驗證〉
[0058] 重組酶A3N擁有FokI位于C端的非特異性DNA切割區(qū)域，并依靠其切割底物。 Flap核酸內(nèi)切酶1可識別雙鏈DNA5'突出核酸結(jié)構(gòu)，重組酶A3N擁有Flap核酸內(nèi)切酶1 的識別結(jié)構(gòu)域，因此重組酶A3N也應(yīng)該可識別雙鏈DNA5'突出核酸結(jié)構(gòu)，選用雙鏈DNA5' 突出核酸結(jié)構(gòu)為反應(yīng)底物，檢測A3N的切割活性。如A3N作用產(chǎn)生不同于底物的小片段，則 證明A3N有切割活性。
[0059] 將lOpmoL上游探針1寡核苷酸SEQIDNo. 13,lOpmoL靶核酸1寡核苷酸SEQID No. 15,以及Mix(10mmol/LMOPSpH7.5,0.05%Tween-20,0.05%NonidetP40)充分混勻，用 超純水補(bǔ)足體積10uL。以"95°C5min，55°ClOmin"程序雜交，加入13. 8pmoL重組結(jié)構(gòu)識 別核酸內(nèi)切酶A3N(實施例3制備)，37°C反應(yīng)2h，反應(yīng)產(chǎn)物加2X上樣緩沖液（90%甲酰胺， 0? 5%EDTA，0. 1%二甲苯藍(lán)，0? 1%溴酚藍(lán))，煮沸5min，急速冷卻，20%尿素變性電泳，120V電泳 2h，銀染分析切割條帶。電泳結(jié)果見圖14,其中T表示靶核酸2寡核苷酸SEQIDNo. 15，UP 表示上游探針2寡核苷酸SEQIDNo. 13,上游探針2寡核苷酸被切割成小片段(泳道1箭頭 所示)，表明A3N并非發(fā)生了隨機(jī)切割，而是特異性切割。
[0060] 實施例6〈重組結(jié)構(gòu)識別核酸內(nèi)切酶A3N無序列依賴性驗證〉
[0061]將lOpmoL上游探針 2 寡核苷酸 5'-TGGITCCTCCTGAGGCCTCC-3'，即SEQIDNo. 16， lOpmoL靶核酸 2 寡核苷酸 5' -TCTACAACCCAAGGAGAGAGGCCTCAGGAGGAACCA-3'，即SEQID No. 17 以及Mix(10mmol/LMOPSpH7.5,0.05%Tween-20,0.05%NonidetP40)充分混勻， 用超純水補(bǔ)足體積lOuL。以"95°C5min，55°ClOmin"程序雜交，lOpmoL上游探針3寡核 苷酸 5'-CATGTCAAGATCACAGAITITGGGCC-3'，即SEQIDNo. 18 以及l(fā)OpmoL靶核酸 3 寡核苷 酸 5' -CAGCAGITTGGCCCGCCCAAAATCTGTGATCTTGACATG-3'，即SEQIDNo. 19 做同樣處理，分 別加入13.8pm〇L重組結(jié)構(gòu)識別核酸內(nèi)切酶A3N，分別37°C反應(yīng)2h，反應(yīng)產(chǎn)物加2X上樣緩 沖液（90%甲酰胺，0? 596EDTA，0? 1%二甲苯藍(lán)，0? 1%溴酚藍(lán))，煮沸5min，急速冷卻，20%尿素 變性電泳，120V電泳2h，銀染分析切割條帶，結(jié)果見圖15,與未添加添加重組結(jié)構(gòu)識別核酸 內(nèi)切酶A3N相比，添加重組結(jié)構(gòu)識別核酸內(nèi)切酶A3N的反應(yīng)底物均被不同程度地切割成小 片段(泳道箭頭所示)，說明重組結(jié)構(gòu)識別核酸內(nèi)切酶A3N的識別是沒有序列依賴性的。
[0062] 實施例7〈重組結(jié)構(gòu)識別核酸內(nèi)切酶A3N在體外酶切位點驗證〉
[0063] 將lOpmoL上游探針 1 寡核苷酸 5' -ATGTCACTTCCCCTTGGITCTCTCC-3'，即SEQID No. 13,10pmoL3'端生物素修飾的靶核酸 1 寡核苷酸 5'-CTATTGCACCAGGCCAGATGAGAGAACCAA GGGGAAGTGACAT-bio3，，即SEQIDNo. 15 以及Mix(10mmol/LMOPSpH7.5,0.05%Tween-20， 0.05%NonidetP40)用超純水補(bǔ)足體積 10iiL。以 "95°C5min，55°ClOmin"程序雜交，加 入13.8pmoL重組結(jié)構(gòu)識別核酸內(nèi)切酶A3N，分別37°C反應(yīng)2h。取2iiL親和素修飾的瓊 脂糖微球（beads),與20iiL反應(yīng)產(chǎn)物混合，37°C充分混勻30min，離心去上清，剩余beads 溶于8iiL1X退火buffer中制成測序樣本。取3iiL測序樣本，與40iiL焦測序反應(yīng)液 (0? 1MTris-HAcpH7.7,2mmol/LEDTA，10mmol/LMg(Ac)2,0.l%BSA，lmmol/LDTT，2mmol/L APS，0.4g/LPVP，0.4mmol/LD-熒光素，1.6U/mL三磷酸腺苷雙磷酸酶，適量商品熒光素酶， 2mmol/L三磷酸腺苷硫酸化酶和18U/mLExcTKlenowDNApolymerase)混和，在小型手提式 焦磷酸測序儀上充分振蕩，按一定順序加入核苷酸進(jìn)行測序。結(jié)果見圖16,與未加入A3N的 產(chǎn)物（圖16-B)相比，加入A3N的酶切產(chǎn)物測序產(chǎn)生了較好的信號（圖16-A)，其測序信號為 CCTTGGTTCT，推測探針被切割的位置在探針自3'端第14和15個核苷酸之間（圖16-C)。
[0064]將lOpmoL上游探針 1 寡核苷酸 5' -ATGTCACTTCCCCTTGGITCTCTCC-3'，即SEQID No. 13,10pmoL5'端生物素修飾的靶核酸 1 寡核苷酸 5'bio-CTAITGCACCAGGCCAGATGAGAGAAC CAAGGGGAAGTGACAT-3，jpSEQIDNo.l5#&Mix(10mmol/LM0PSpH7.5,0.05%Tween-20， 0.05%NonidetP40)用超純水補(bǔ)足體積 10iiL。以"95°C5min，55°C10min"程序雜交，加 入13. 8pmoLA3N酶，分別37°C反應(yīng)2h。取2iiLbeads，與20iiL反應(yīng)產(chǎn)物混合，37°C充分混 勻30min，離心去上清，剩余beads溶于8yLIX退火buffer中制成測序樣本。取3yL測 序樣本，與40yL焦測序反應(yīng)液混和，在小型手提式焦磷酸測序儀上充分振蕩，按一定順序 加入核苷酸進(jìn)行測序。結(jié)果見圖17,與未加入A3N的產(chǎn)物（圖17-B)相比，加入A3N的酶切 產(chǎn)物測序產(chǎn)生了較好的信號（圖17-A)，測序信號可分為兩部分，分別是AAGGGGAAGT和tga， 因此，推測靶核酸切割位置有兩處，均在與上游探針互補(bǔ)的部分，分別在向靶核酸3'端方向 第10和11個核苷酸之間，以及向靶核酸3'端方向第19和20個核苷酸之間（圖17-C)。 [0065]實施例8〈重組嵌合型核酸內(nèi)切酶A3N在體內(nèi)切割活性驗證〉
[0066]CH0-EGFP細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)EGFP蛋白，針對EGFP基因序列設(shè)計兩條長度為100bp， 能夠分別與兩條鏈雜交的探針，
[0067] 5, -GTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTACGTCG CCGTCCA GCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAACAGC-3'，即SEQIDNo. 20 ;
[0068] 5,-GTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACG