的探針，不需要更換酶，就可以 實現對任意核酸進行靶向切割，具有極強的通用性。
[0026] 本發(fā)明重組結構識別核酸內切酶不只可用于體外靶核酸的切割，還可用于細胞內 基因組切割，具有良好的創(chuàng)新性。
【附圖說明】
[0027] 圖1-是關于能被識別的5'突出核酸結構的示意圖
[0028] 圖2-是關于能被識別的3'突出核酸結構的示意圖
[0029] 圖3-是關于能被識別的切刻核酸結構的示意圖
[0030] 圖4-是關于能被識別的Y型核酸結構的示意圖
[0031] 圖5-是關于能被識別的侵入核酸結構的示意圖
[0032] 圖6-是關于能被識別的鼓泡(錯配/缺失）核酸結構的示意圖
[0033] 圖7-是關于一優(yōu)選例中切割位點的不意圖
[0034] 圖8-是關于實施例1的結果圖
[0035] 圖9-是關于實施例2中重組質粒結構示意圖
[0036] 圖10-是關于實施例2的結果圖
[0037] 圖11-是關于實施例3的結果圖，其中1:重組菌誘導后菌體總蛋白；2:重組菌 誘導后菌體上清蛋白；3 :宿主菌誘導后菌體上清蛋白4 :純化后的A3N;M:蛋白質分子量 Marker
[0038] 圖12-是關于實施例4的原理圖
[0039] 圖13-是關于實施例4的結果圖，其中1:加入Flap核酸內切酶1體系的反應產 物；2 :加入重組酶A3N體系的反應產物；3 :不加酶的反應體系；4 :Flap片段核酸探針；5 : 上游探針；6 :下游探針；7 :靶核酸
[0040] 圖14-是關于實施例5的結果圖，其中，1 :加入重組酶A3N且缺少下游探針體系的 反應產物；2 :靶核酸；3 :上游探針
[0041] 圖15-是關于實施例6的結果圖
[0042] 圖16-是關于實施例7的結果圖1
[0043] 圖17-是關于實施例7的結果圖2
[0044] 圖18-是關于實施例8的結果圖1
[0045] 圖19-是關于實施例8的結果圖2
[0046] 圖20-是關于實施例8的結果圖3
【具體實施方式】
[0047] 參照下列實施例更詳細描述本發(fā)明。然而，本發(fā)明不應解釋為限制于此。
[0048] 實施例1〈目的基因A的擴增〉
[0049] 根據下述PCR方法，擴增識別功能域的編碼基因A。將pET24a(+) -FEN1質粒模版 (SEQIDN0.9)，0.025U/iiLPrimestar酶、5mM1%2+、0.211]?寡核苷酸引物（5'-1六1六0六丁八丁6 GGTGCGGATATTGGTGA-3' 即SEQIDNo. 10 和 5'-TATAGAATTCGAACCACCTCTCAAGCGT-3' 即SEQ IDNo. 11)、0. 2mMdNTPs分別加至反應液中。利用熱循環(huán)儀，反應液在94°C熱處理3min， 然后以"94°C30s，60°C30s，72°C100s"的程序循環(huán)30次，利用PCR純化試劑盒純化PCR 擴增產物，依據純化試劑盒所附說明書進行純化處理，并用30yL超純水洗脫。經瓊脂糖電 泳分析，結果如圖8所示，其中泳道M為X-EcoT14IdigestDNAMarker，泳道1為PCR產 物擴增條帶，與Marker對比，條帶與Flap核酸內切酶1基因片段理論大小（1017bp)-致， 說明擴增產物是目的產物，將該PCR產物送測序，結果也與SEQIDN0. 3第58到1075bp- 致。
[0050] 實施例2〈重組質粒pET28a(+) -His-A3N的構建〉
[0051] 利用NdeI和EcoRI酶切酶連反應，將實施例1中的擴增產物A插入質粒 pET28a(+)-His-3N(即SEQIDN0. 12,其中第1069到1716bp為編碼連接肽段和切割功能 域的序列）（上海捷瑞生物工程有限公司全基因合成）構成重組質粒pET28a(+)-His-A3N， 重組質粒結構如圖9所示。轉化入宿主菌ArcticExpress保存(購自中國微生物菌種資源 庫)。將菌種接種于5mLLB(含30iig/mL卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，37°C200r/min振搖培 養(yǎng)過夜，利用常規(guī)方法提取質粒。用限制性內切酶XbaI和XhoI處理提取的質粒，瓊脂糖 凝膠電泳驗證質粒的正確性，結果見圖10,其中泳道M為DL5, 000DNAMarker，泳道1為 pET28a(+)-His-A3N雙酶切產物，酶切片段條帶與Marker對比可見，與理論上應該被切下 的片段（1817bp)大小基本一致，說明pET28a(+)-His-A3N構建成功，將該重組質粒送測序， 結果如SEQIDN0. 3所示，也與理論序列一致。
[0052] 實施例3〈重組結構識別核酸內切酶A3N的表達和純化〉
[0053] 利用大腸桿菌重組蛋白表達系統(tǒng)，根據下述方法，表達該重組結構識別核酸內切 酶。首先，利用上述方法制備的重組質粒，以常用方法轉化進宿主菌ArcticExpress。將所 得轉化體接種至5mL含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，并在37°C下以振蕩培養(yǎng)方式溫育，直到 0D600達到0. 6。將所得培養(yǎng)物按1%接種至100mL含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，進一步 在37°C下以震蕩方式溫育，直到0D600達到0. 6。接著，將異丙基-0-硫代半乳糖吡喃糖 苷以終濃度〇.ImM加至培養(yǎng)物中，由此誘導所需蛋白的表達，以振蕩培養(yǎng)方式25°C誘導16 小時。收集誘導表達的菌體，超聲破菌，離心，由于重組蛋白含有組氨酸標簽，上清用鎳親和 層析純化，用30、50mmol/L咪唑緩沖液洗脫雜蛋白，300mmol/L咪唑緩沖液洗脫目的蛋白， 將親和層析純化得到的重組蛋白A3N進行超濾除鹽處理(采用截留分子量為30KDa的超濾 膜)，保存在重組蛋白A3N儲存緩沖液（50mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，lmmol/L DIT， 0. lmmol/L EDTA，50%甘油，pH7. 4)中，所得產物用SDS-PAGE分析，結果見圖11，誘導表達 16h的菌體總蛋白（泳道1)與無目的蛋白的菌體上清蛋白對比(泳道3)，發(fā)現從平板上挑取 的菌落為陽性克隆菌，表達了分子量約為65kDa的重組酶A3N，所表達的目的蛋白有較好的 可溶性(泳道2)，純化后的重組酶A3N(泳道4)基本滿足生物催化和酶學研究的要求。
[0054] 實施例4〈重組結構識別核酸內切酶A3N體外識別活性驗證〉
[0055] 重組酶A3N擁有Flap核酸內切酶1功能域，并依靠Flap核酸內切酶1的活性識 別目的核酸。Flap核酸內切酶1主要應用于侵入結構核酸反應，其活性也主要是利用侵入 結構核酸反應來測定，從而間接地在體外水平測定了重組酶A3N的識別活性。測定A3N識 別活性的原理如圖12所示，在反應體系中，重組酶A3N的Flap核酸內切酶1活性可識別侵 入結構，并切割下游探針，產生Flap片段，反應結果可由尿素聚丙烯酰胺變性電泳檢測，由 A3N能否產生于Flap核酸內切酶1相同的Flap片段，判斷所表達的重組酶A3N是否具有識 別核酸侵入結構的活性。
[0056]將lpmoL上游探針1寡核苷酸 5'-ATGTCACTTCCCCTTGGITCTCTCC-3'，即SEQID No. 13, lOpmoL下游探針1寡核苷酸 5'-AGCAGGACGGGATCTGGCCTGGTGC-3'，即SEQID SEQIDNo. 15,以及Mix(10mmol/LMOPSpH7.5,0.05%Tween-20,0.05%NonidetP40)充 分混勻，用超純水補足體積l〇yL。以"95°C5min，55°ClOmin"程序雜交，加入13. 8pmoL 重組結構識別核酸內切酶A3N(實施例3制備)，以Flap核酸內切酶1體系為對