專利名稱：靶向抑制PPP2R5C基因表達(dá)和腫瘤T細(xì)胞增殖的PPP2R5C-siRNA799及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種siRNA，特別涉及一種靶向抑制PPP2R5C基因表達(dá)和腫瘤T細(xì)胞增殖的PPP2R5C-siRNA799及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血液腫瘤是發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，每年全國約有10萬初發(fā)病人，嚴(yán)重危害人們、尤其是青少年的健康。T細(xì)胞腫瘤是血液腫瘤的一種主要類型，主要由于T細(xì)胞惡性克隆增殖而形成，包括多種類型的T細(xì)胞白血病和淋巴瘤，多數(shù)惡性程度高，治療效果差， 預(yù)后不良。臨床治療上一直存在難治療、耐藥和易復(fù)發(fā)等難題，因此尋找更有效和特異的治療方案一直是研究者的一個重要目標(biāo)。隨著對腫瘤細(xì)胞分子特點(diǎn)的逐漸明確，不斷發(fā)現(xiàn)腫瘤T細(xì)胞特異的分子，設(shè)計和研制有效的靶向治療藥物，成為提高T細(xì)胞腫瘤治療效果的一個重要手段。PPP2R5C基因是在1996年被發(fā)現(xiàn)并克隆出來的。是蛋白磷酸酶2A(PP2A)的一個亞單位，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)化等過程中具有重要作用，目前研究認(rèn)為其屬于一種抑癌基因。近期研究提示其表達(dá)模式的改變與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)，我們的前期研究也發(fā)現(xiàn) PPP2R5C在T細(xì)胞腫瘤中有異常高表達(dá)情況。近年來，利用RNA干擾技術(shù)，將化學(xué)合成的小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)轉(zhuǎn)導(dǎo)至特定的細(xì)胞，沉默相關(guān)基因的表達(dá)，是研究基因功能最有效的手段之一，也是靶向基因治療最有吸引力的方法之一。選擇特異性的靶基因合成有效的siRNA，并且選擇合適轉(zhuǎn)染方式，使其在宿主細(xì)胞中高效作用，是實(shí)施這一靶向治療措施的重點(diǎn)。靶向針對 PPP2R5C基因的siRNA序列對于開發(fā)新的抗T細(xì)胞腫瘤基因藥物和提高T細(xì)胞腫瘤的治療效果有重要的意義，具有很大的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于提供一種靶向抑制PPP2R5C基因表達(dá)和腫瘤T細(xì)胞增殖的 siRNA，名稱為 PPP2R5C-siRNA799。本發(fā)明的另一目的在于提供上述PPP2R5C_siRNA799的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種靶向抑制PPP2R5C基因表達(dá)和腫瘤T 細(xì)胞增殖的PPP2R5C-siRNA799，核糖核苷酸序列如下所示正義鏈5，-GCAUAGCAGA⑶UACUGGAAAUAUU-3，；反義鏈5，-AAUAUUUCCAGUAACUCUGCUAUGC-3，。所述的靶向抑制PPP2R5C基因表達(dá)和腫瘤T細(xì)胞增殖的PPP2R5C_siRNA799用于制備抑制PPP2R5C基因表達(dá)的制劑。所述靶向抑制PPP2R5C基因表達(dá)的siRNA應(yīng)用于制備治療T細(xì)胞腫瘤的藥物。所述T細(xì)胞腫瘤為T細(xì)胞白血病。
本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果1、本發(fā)明所提供的PPP2R5C-siRNA799能高效抑制PPP2R5C基因的表達(dá)，mRNA的下調(diào)程度達(dá)到2 4倍，蛋白表達(dá)明顯得到抑制，如圖2和圖3所示。2、本發(fā)明所提供的PPP2R5C-siRNA799能有效抑制腫瘤性T細(xì)胞的增殖，如圖4所
7J\ ο3、本發(fā)明所提供的PPP2R5C_siRNA799對于開發(fā)新的抗T細(xì)胞腫瘤基因藥物和提高T細(xì)胞腫瘤的治療效果有重要的意義，其具有很大的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價值。


圖1是實(shí)施例1中通過流式細(xì)胞儀檢測Molt-4細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率圖，其中A為轉(zhuǎn)染Alexa Red Oligo的柱形圖；B為對照組的柱形圖。圖2是實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)組和對照組的實(shí)時定量PCR結(jié)果圖。圖3是實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)組和對照組的Wfestern Blot圖(RNA干擾后48h)。圖4是通過Armexin V/PI雙染后流式細(xì)胞儀得到的實(shí)驗(yàn)組和對照組的細(xì)胞凋亡圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1SiRNA的合成和轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株(Molt_4)(購自中科院上海細(xì)胞所)細(xì)胞條件的穩(wěn)定，具體步驟如下(1)設(shè)計和得到siRNA在 GenBank (http //blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)里查找 PPP2R5C 基因序列(ACCESSION NM 178587)，然后根據(jù) hvitrogen 公司(www.invitrogen.com)提供的Stealth RNAi設(shè)計法則，在線設(shè)計針對PPP2R5C的siRNA。本發(fā)明所涉及的靶向抑制PPP2R5C基因表達(dá)的siRNA是從PPP2R5C基因序列799bp開始的25nt siRNA (稱為siRNA-799)，同時設(shè)計與目的基因序列無同源性的無關(guān)序列siRNA (non-silencing scrambled control, SC,25nt)為對照組，siRNA均由美國hvitrogen公司化學(xué)合成。siRNA-799 的序列如下正義鏈序列5，-GCAUAGCAGA⑶UACUGGAAAUAUU-3，；反義鏈序列5，-AAUAUUUCCAGUAACUCUGCUAUGC-3，。無關(guān)序列siRNA的序列如下正義鏈序列5，-UAGUCUACCUAGCUUAACCCAGUAA-3，；反義鏈序列5，-UUACUGG⑶UAAGCUAGGUAGACUA-3，。(2)準(zhǔn)備處于對數(shù)生長期的Molt-4細(xì)胞將Molt-4細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%新生牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在含體積百分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱37°C連續(xù)培養(yǎng)，2 3天傳代PPP2R5Ci5 丨-GTAATAAAGCGGGCAGCAGG -3 ‘
PPP2R5Cb5'- C AAAGTC AAAGAGGACGCAACA -3 ‘
β2Μ5'- CAGCAAGGACTGGTCTTTCTAT -3 ‘
β2Μ5'- GCGGCATCTTCAAACCTC -3 ‘表2 實(shí)時定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后PPP2R5C基因mRNA水平變化
一次，得到處于對數(shù)生長期的Molt-4細(xì)胞。(3) PPP2R5C-siRNA799 轉(zhuǎn)染 Molt-4 細(xì)胞A、收集2. 5 X IO6個Molt-4細(xì)胞，200g離心lOmin，完全去除上清；B、用 100 μ 1 預(yù)熱至室溫的 Nucleofector Solution 和 Supplement 混合液 (Amaxa，德國)懸浮細(xì)胞；C、加入 IOOnM Alexa Red Oligo (Invitrogen，美國)，混勻后加入核轉(zhuǎn)杯(Amaxa, 德國)，啟動Molt-4特異性程序C-005 ；同時設(shè)置對照組，對照組與轉(zhuǎn)染Alexa Red Oligo 的步驟相同，但是沒有加入Alexa Red Oligo ；D、程序完成后立刻用核轉(zhuǎn)染試劑盒(Amaxa，德國)里配套的移液器將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞液接種于培養(yǎng)瓶中，終體積為5ml ；E、放入培養(yǎng)箱10小時后利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測熒光值，分析轉(zhuǎn)染效率。通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測的結(jié)果如圖1所示，可見通過上述轉(zhuǎn)染方法的轉(zhuǎn)染效率穩(wěn)定在56. 2 士 14. 14%。實(shí)施例2將siRNA-799轉(zhuǎn)染Molt-4細(xì)胞后，檢測PPP2R5C基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)， 明確其干擾效應(yīng)。(1)實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)組為轉(zhuǎn)染siRNA-799，對照組分別為無關(guān)序列對照組(SC)、轉(zhuǎn)染條件對照組(MOCK)和空白對照組(NC)，實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例1步驟(3)，各組的siRNA量均為3 μ g。轉(zhuǎn)染條件對照組系不加入siRNA，其余處理?xiàng)l件同實(shí)驗(yàn)組，空白對照組是未經(jīng)任何實(shí)驗(yàn)處理的細(xì)胞。(2)熒光實(shí)時定量PCR檢測分別收集各組轉(zhuǎn)染后24h、4 !和72h的細(xì)胞，按照 TRIZol試劑盒(invitrogen，USA)說明書操作步驟提取RNA，并使用AMMLV (promega，USA) 和OLIGO dT合成cDNA (根據(jù)AMMLV的說明書操作)。應(yīng)用于熒光實(shí)時定量PCR的引物序列見表1，以β 2M基因作為內(nèi)參照。總反應(yīng)體積為20 μ 1，包括Real Master Mix 9yL，上、下游引物的終濃度分別為0. 5 μ mol/L以及1 μ lcDNA。在95°C、3min變性后，共進(jìn)行40循環(huán)擴(kuò)增，每一循環(huán)包括95°C、10s和62°C、30s。采用相對定量法Q-"GtX100%，ACt = Ct目的 Η -Ct # Η)計算PPP2R5C mRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后24h、4 i和72h，與各對照組相比，siRNA-799組PPP2R5C的mRNA表達(dá)水平均明顯下調(diào)，下調(diào)倍數(shù)約為2 4倍不等(如表2和圖2所示)。表1應(yīng)用于實(shí)時定量PCR的引物序列
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上游引物下游引物上游引物下游引物
權(quán)利要求
1.一種靶向抑制PPP2R5C基因表達(dá)和腫瘤T細(xì)胞增殖的PPP2R5C-siRNA799，其特征在于其核糖核酸序列如下正義鏈5’ -GCAUAGCAGA⑶UACUGGAAAUAUU-3’ ； 反義鏈5’ -AAUAUUUCCAGUAACUCUGCUAUGC-3，。
2.權(quán)利要求1所述靶向抑制PPP2R5C基因表達(dá)和腫瘤T細(xì)胞增殖的PPP2R5C-siRNA799 的應(yīng)用，其特征在于所述的PPP2R5C-siRNA799用于制備抑制PPP2R5C基因表達(dá)的制劑或用于制備治療T細(xì)胞腫瘤的藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述靶向抑制PPP2R5C基因表達(dá)和腫瘤T細(xì)胞增殖的 PPP2R5C-siRNA799的應(yīng)用，其特征在于所述T細(xì)胞腫瘤為T細(xì)胞白血病。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種靶向抑制PPP2R5C基因表達(dá)和腫瘤T細(xì)胞增殖的PPP2R5C-siRNA799及其應(yīng)用。PPP2R5C-siRNA799的正義鏈為5’-GCAUAGCAGAGUUACUGGAAAUAUU-3’；反義鏈為5’-AAUAUUUCCAGUAACUCUGCUAUGC-3’。PPP2R5C-siRNA799能高效抑制PPP2R5C基因的表達(dá)，mRNA的下調(diào)程度達(dá)到2～4倍，蛋白表達(dá)明顯得到抑制；同時其能有效抑制腫瘤性T細(xì)胞的增殖。本發(fā)明所提供的siRNA對于開發(fā)新的抗T細(xì)胞腫瘤基因藥物和提高T細(xì)胞腫瘤的治療效果有重要的意義，具有很大的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價值。
文檔編號A61K48/00GK102373206SQ20111034041
公開日2012年3月14日 申請日期2011年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月31日
發(fā)明者劉思初, 李揚(yáng)秋, 李萡, 楊力建, 沈琦, 鄭海濤, 陳宇, 陳少華 申請人:暨南大學(xué)