專利名稱：具有抗增殖特性的肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有抗增殖特性的肽，編碼所述肽的核酸分子(DNA/RNA)，結構上與所述核酸同源的肽核酸，以及所述肽，所述核酸，所述肽核酸和/或其藥物組合物在生物技術，分子生物學，生物信息學和過度增殖性疾病，特別是癌癥和動脈粥樣硬化的診斷和治療中的用途。
在腫瘤學中，有多種不同的治療方式，這些方式主要基于外科方法，化學療法或放射性療法。然而，在癌癥治療中，這些方法并不能提供所需的結果。根據(jù)美國最新的統(tǒng)計學資料，每3個美國人中有1個會患癌癥，每5個人中有1個將死于癌癥。此數(shù)字可能也適用于全世界所有的工業(yè)化國家，在十多年的時間里此數(shù)字沒有明顯的變化。另外，也注意到在過去的20年時間內，治療癌癥的效力基本上沒有改善，因為對大多數(shù)癌癥類型而言，5年存活率基本上維持原狀(R.H.Proctor“The Sciences”,3月/4月1995,p20-24)。
因此，本發(fā)明的目的是提供抑制多種不同類型的癌癥生長，最終導致腫瘤消失的方法。
通過權利要求1的肽，權利要求13的核酸(DNA/RNA)，權利要求16的肽核酸，權利要求17的藥物組合物以及通過權利要求20的所述肽的用途，權利要求22的DNA/RNA的用途，權利要求23的肽核酸的用途和權利要求21的藥物組合物的用途可達到上述目的。優(yōu)選的實施方案示于從屬權利要求中。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)一種有希望的治療癌癥的方法，所述方法利用了可封閉導致癌癥之物質，尤其是致癌蛋白質的特異性肽。本發(fā)明肽的特征在于序列長度短，這使得它們在合成方面較經(jīng)濟。另外，它們也能有效地穿透細胞，因而能中和促進癌癥生長的細胞內蛋白質。
以前發(fā)現(xiàn)在多種癌癥類型中，腫瘤抑制基因缺失或突變的結果會導致不能充足提供相應的基因產物。這最終會導致癌癥的生長(A.G.Knudson，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA)(1993),vol90,p10914-10921；A.J.Levine，科學美國人，“科學與醫(yī)藥學”(Sci.Am.“Science &Medicine”),Jan./Feb,1995,p28-37)。
腫瘤抑制蛋白，如RB1的缺損對于其它過度增殖性疾病，如動脈粥樣硬化的病理似乎也是重要的。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)將腫瘤抑制蛋白質的一部分導入細胞以封閉加快細胞失控生長的生長因子即已足夠。不可能導入完整的腫瘤抑制蛋白，因為這種蛋白質太長，在多數(shù)情況下會遭遇蛋白酶降解，從而阻止蛋白質行使其作用。另一方面，如果僅利用腫瘤抑制蛋白的一部分，所述部分也會被很快地降解，即它們不夠穩(wěn)定。
因此，本發(fā)明的肽是合成的融合多肽，所述多肽由組分(A)和(B)組成，其中這些組分相互連接成AB或BA，第一組分(A)含有腫瘤抑制蛋白的有效部分(其類型為本發(fā)明人第一次發(fā)現(xiàn))，或其親水同源部分，第二組分(B)含有穩(wěn)定第一組分(A)的序列。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的肽與生長因子或生長因子受體結合，優(yōu)選與其中的序列LXCXE結合，更優(yōu)選與胰島素中的LXCXE結合，即與LVCGE結合(Radulescu等，生物化學和生物物理學研究通訊，1995,vol.206,p97-102)。由于生長因子IGF-1和IGF-2含有序列FVCGD，該序列與胰島素中的區(qū)段LVCGE親水同源(R.Radulescu & C.Wendtner，分子識別雜志(J.Mol.Recognition),1992,vol.5,p133-137)，因此本發(fā)明的肽能與IGF-1和IGF-2結合。
本文所用術語“親水同源”的根據(jù)是Kyte和Doolittle(J.Kyte & R.F.Doolittle，分子生物學雜志，1982,vol.157,p105-132)和J.E.Blalock和Smith,E.M．(生物化學和生物物理學研究通訊，vol.121,no.1,p203-207(1984))的教導。
組分(A)其它的特征在于這樣一個事實，即它分別根據(jù)互補肽理論(J.E.Blalock，生物技術趨勢(Trends in Biotechnology),vol.8,p140-144,1990年6月)或根據(jù)三維構型與生長因子或生長因子受體的片斷親水互補。生長因子的例子是胰島素，IGF-1,IGF-2,EGF,FGF，血管生成素，NGF和PDGF。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明肽之組分(A)的有效區(qū)域可得自下列腫瘤抑制基因產物RB1,P107,P130,WT1,TP53,NF1,NF2,VHL,APC,NB1,MLM,MEN1,BCNS,RCC,BRCA1,BRCA2,DCC,MTS1=p16,MTS2,p21,p27等。在優(yōu)選的實施方案中，組分(A)含有RB1的一部分，尤其是RB1的氨基酸649-654，即LFYKKV或其親水同源部分。
融合肽的組分(B)作為輔因子具有穩(wěn)定所述組分(A)以使后者在細胞中不會被蛋白酶降解的特性。通過快速到達它們不易在其中被蛋白酶降解的細胞核中(R.Fahraeus等，Current Biology,1996,vol.6,no.1,p84-91)的本發(fā)明肽，或通過使用支化的組分(B)，如聚賴氨酸支鏈或聚賴氨酸核心(core)，或通過使用D-氨基酸可達到此目的。在優(yōu)選的實施方案中，組分(B)是聚賴氨酸核心(R.Radulescu等，生物化學和生物物理學研究通訊，1995,Vol.206,p97-102；和G.Fassina,EPO 0 481 930 A2)或核定位序列(NLS)，尤其是SV40 NLS或Penetratin或二分的NLS或RNP A1 NLS(M9區(qū)域)。有關優(yōu)選被導入(directed)細胞核中的肽的構建的一般性參考文獻見Sheldon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.92,p2056-2060(1995)；Dingwall等，生化科學動態(tài)(Trends in Biochemical Science)16,p478-481(1991)；M.S.Moore，當代生物學(Current Biology),vol.6,no.2,p137-140(1996)；D.A.Jans，歐洲分子生物學聯(lián)合會雜志(FASEB Joumal),1994,vol.8,p841-847；J.Moroianu&J.F.Riordan,PNAS,1994,vol.91,p1677-1681和D.Derossi等，生物化學雜志，1994,vol.269,p10444-10450。
在優(yōu)選的實施方案中，組分(A)具有下列序列或在至少兩個位置上與其同源的序列NH2-LFYKKV-COOH (P1)NH2-dLdFdYdKdKdV-COOH(P4)NH2-KVLYFKRQIKIWFQNRRMKWKK-COOH (P8)(線表示親水同源)從上述序列中可推知下列的本發(fā)明優(yōu)選肽NH2-[LFYKKVGGG]4-[KRG]2-KG-COOH(P2)此肽是序列P1與聚賴氨酸核心[GGG]4-[KRG]2-KG的聯(lián)合NH2-[LFYKKVGGG]4-[K]2-KG-COOH (P2i)此肽是序列P1與聚賴氨酸核心[GGG]4-[K]2-KG的聯(lián)合NH2-[dLdFdYdKdKdV-GGG]4-[1KdRG]2-1KG-COOH(P3)此肽是序列P4與聚賴氨酸核心[GGG]4-[1KdRG]2-1KG的聯(lián)合NH2-[dLdFdYdKdKdVGGG]4-[1K]2-1KG-COOH(P3i)
此肽是序列P4與聚賴氨酸核心[GGG]4[[1K]2-1KG的聯(lián)合NH2-LFYKKVPKKKRKV-COOH(P5)肽P5由序列P1和SV40病毒較大T抗原的核定位序列組成。
NH2-LFYKKVRQIKIWFQNRRMKWKK-COOH(P6)肽P6是序列P1與Penetratin的聯(lián)合，所述Penetratin是由位于Antennapedia同源區(qū)域內的16個氨基酸組成的序列，該序列介導跨膜的轉位，因此也是核定位。
NH2-[dKdVdLdYdFdKGGG]4-[1KdRG]2-1KG-COOH(P7s)肽P7s是P1親水同源的序列dKdVdLdYdFdK與聚賴氨酸核心[GGG]4-[1KdRG]2-1KG的聯(lián)合。
NH2-[dKdVdLdYdFdKGGG]4-[1K]2-1KG-COOH(P7)肽P7是與P1親水同源的序列dKdVdLdYdFdK與聚賴氨酸核心[GGG]4-[1K]2-1KG的聯(lián)合。
NH2-KVLYFKRQIKIWFQNRRMKWKK-COOH(P8)肽P8是與P1親水同源的序列dKdVdLdYdFdK與Penetratin的聯(lián)合。
“D”和“L”特指以單字母密碼表示的氨基酸構型。
本發(fā)明的肽一般含有L-和/或D-氨基酸，根據(jù)本發(fā)明，每種氨基酸的全-L-型，全-D-型，逆-反異構體以及L-和D-型的相應變換也在本發(fā)明的范圍之內。另外，根據(jù)本發(fā)明，每種氨基酸氧化和還原形式的所有變換，游離形式和攜有保護性基團的氨基酸也在本發(fā)明的范圍之內。本發(fā)明肽的最有效的濃度范圍為10-4-10-5M。根據(jù)具體的應用，其它有效的濃度也是可以的。就涉及支鏈肽而言，已顯示它們以全-D形式存在是有利的。假設含有NLS的線性肽進入細胞核；支鏈肽可能進入細胞核，但它們在核外也有效。
本發(fā)明的肽可被稱為“SCAP”，即“合成的輔因子-相關的抗-致癌肽”。
優(yōu)選根據(jù)普通的固相法進行本發(fā)明肽的制備(見G.A.Grant，“合成肽”，W.H.Freeman and Company,New York,1992)。隨后進行本發(fā)明肽的純化，并按所述檢定(R.Radulescu等，生物化學和生物物理學研究通訊，1995,vol.206,p97-102)。后一參考文獻也提供了使用本發(fā)明肽以生物技術純化如胰島素的生長因子和生長因子受體的例子。為了用生物技術分離生長因子和生長因子受體，可將攜有NLS的本發(fā)明肽與含有硫酸乙酰肝素基質的層析柱偶聯(lián)。
也可根據(jù)標準方法，將本發(fā)明肽的組分(A)和(B)從相應的蛋白質上切割下來，并相互連接。制備肽的其它技術是本領域技術人員熟知的(見G.A.Grant，“合成肽”，W.H.Freeman and Company,New York,1992)。
本發(fā)明另外涉及編碼本發(fā)明肽的DNA/RNA,DNA/RNA序列衍生自遺傳密碼。
在優(yōu)選的實施方案中，下列DNA/RNA序列編碼表示本發(fā)明肽之組分(A)的上述氨基酸序列(P1)和(P4):
5’-CUU UUC UAC AAG AAG GUU-3’(D1)在優(yōu)選的實施方案中，下列DNA/RNA序列編碼本發(fā)明的上述肽(P5):
5’-CUU UUC UAC AAG AAG GUU CCU AAG AAG AAG CGU AAGGUU-3’(D5)在優(yōu)選的實施方案中，下列DNA/RNA序列編碼本發(fā)明的上述肽(P6):
5’-CUU UUC UAC AAG AAG GUU CGU CAA AUA AAG AUA UGGUUC CAA AAU CGU CGU AUG AAG UGG AAG AAG-3’(D6)在優(yōu)選的實施方案中，下列DNA/RNA序列編碼上述肽(P8):
5’-AAG GUU CUU UAC UUC AAG CGU CAA AUA AAG AUA UGGUUC CAA AAU CGU CGU AUG AAG UGG AAG AAG-3’(D8)可將編碼本發(fā)明肽的DNA/RNA序列摻入適當載體中以用于癌癥的基因療法，方法學的綜述見R.C.Mulligan，科學，1993,vol.260,p926-932。
本領域技術人員應知道上述DNA/RNA序列含有在嚴緊條件下能與之雜交的DNA/RNA序列。這些序列具體地是在低于DNA/RNA解鏈溫度約20℃下與上述DNA/RNA序列雜交的DNA/RNA序列。另外，根據(jù)遺傳密碼的簡并性，上述DNA/RNA序列含有與上述DNA/RNA序列相關的DNA/RNA序列。
本發(fā)明也可應用于生物信息學和分子生物學，可使用下列策略鑒定與生長因子或其受體相互作用的腫瘤抑制蛋白。相應生長因子或其受體的cDNA分別得自NCBI數(shù)據(jù)庫，利用DNA Strider軟件，根據(jù)互補的肽策略可將此cDNA翻譯成互補的DNA和肽。對于所得的互補肽而言，通過利用OWL數(shù)據(jù)庫領航員(navigator)中的BLAST算法規(guī)則可發(fā)現(xiàn)同源的蛋白質/肽(想要的腫瘤抑制因子)。另一方面，可從腫瘤抑制基因的cDNA開始，以類似的方式分別尋找作為相互作用的伙伴的生長因子或其受體。此方法可分別加快和促進(新)腫瘤抑制蛋白或(新)生長因子或生長因子受體的克隆。例如，已從NCBI數(shù)據(jù)庫中拷貝出人EGF前體的cDNA，并將其拷貝到DNA Strider軟件中，利用所述軟件，已由EGF前體cDNA得到互補的DNA序列，此DNA序列已被翻譯成肽，翻譯成所謂的與EGF前體蛋白互補的肽。隨后，利用OWL數(shù)據(jù)庫領航員中的BLAST算法規(guī)則，尋找與這些互補的肽同源的肽/蛋白質，結果，幾個核蛋白質顯示出與EGF前體同源，例如結構和功能與RB1相關的p130蛋白，尤其是p130的氨基酸290-313。更具體地，如果相互之間以反平行的方式排列區(qū)域，EGF前體氨基酸209-213(REGSN)和p130氨基酸305-309(IGTLS)相互之間親水互補，因此是EGF前體和p130之間假定復合物的潛在結合位點。因此氨基酸序列IGTLS或與其親水同源的序列可代表本發(fā)明抗增殖肽的組分(A)(見權利要求1和2)。
就涉及治療應用而言，本發(fā)明的肽可或單獨或與幾種普通的佐劑，填充劑和/或添加劑一起用于藥物組合物。特別有利的實施方案分別是上述肽P3和P6以及P3和P5的聯(lián)合。就涉及藥物組合物的施用形式而言，下列形式是合適的軟膏，溶液，分散劑，乳劑，氣霧劑，泡沫，微粒物質(例如顆粒劑，塊粒劑(agglomerate)，粉末，微珠，吸附劑(adsorbate))，丸劑，軟錠劑，片劑，糖錠劑或膠囊。本發(fā)明的肽也可與細胞抑制劑療法一起使用，或與放射性療法聯(lián)合使用。優(yōu)選局部，皮膚內或穿透皮膚地施用肽，對于全身性施用而言，優(yōu)選靜脈內，動脈內，口服和直腸施用肽，優(yōu)選膜內，腹膜內或腔內將肽施用到腔內。
顯示出顯著的細胞毒效應的本發(fā)明肽，DNA/RNA序列和藥物組合物可用作藥物以治療癌癥，并可根據(jù)本發(fā)明以此方式應用。
觀察到抗乳腺癌細胞，骨肉瘤細胞和白血病細胞的特殊效力。歸功于構成概念的基礎，本發(fā)明的肽一般分別對顯示缺損的成視網(wǎng)膜細胞瘤基因或蛋白質的所有細胞起作用。
下文將參照15個附圖和表描述本發(fā)明，其中

圖1-圖12表示在存在或缺乏本發(fā)明不同肽時，G1-,S-和G2/M期中的MCF-7細胞或SAOS-2細胞之細胞群體的％；圖13表示肽P3對K562細胞的細胞毒效應；
圖14表示肽P3對CCRF-CEM細胞和CCRF-CEM/ACT 400細胞的細胞毒效應；圖15表示肽P3對正常的外周血單核細胞的效應；表1表示在MCF-7細胞中由P5-和P-6介導的對細胞循環(huán)漸進過程的抑制作用，與之相比，Penetratin不能介導這種抑制作用；表2表示在SAOS-2細胞中由P5-和P-6介導的對細胞循環(huán)連續(xù)的抑制作用，與之相比，Penetratin不能介導這種抑制作用。
圖1表示在無血清的條件下，濃度為10-5M的本發(fā)明肽P3在G0/G1期已同步的MCF-7細胞中縮短G1期而延長S期。用P3處理過的細胞形態(tài)學相當于編程死亡的細胞的形態(tài)學。
圖2表示濃度為10-5M的本發(fā)明肽P3在經(jīng)最適濃度為10-8M的胰島素類生長因子1(IGF-1)刺激的MCF-7細胞中導致G1和G2/M期的延長以及S期的縮短，從而P3封閉了IGF-1對MCF-7細胞的作用。具體地說，P3延遲了由IGF-1引起的細胞循環(huán)的連續(xù)，從而延遲了細胞分裂。用P3處理過的細胞形態(tài)學相當于編程死亡的細胞的形態(tài)學。
圖3表示在無血清的條件下，濃度為10-5M的肽P4,P5和P6中的每一種在G0/G1期已同步的MCF-7細胞中縮短G1期而延長S期。所述細胞，尤其是用P6處理過的那些細胞的形態(tài)學相當于編程死亡的細胞的形態(tài)學。
圖4表示濃度為10-5M的本發(fā)明肽P6在經(jīng)最適濃度為10-8M的IGF-1刺激的MCF-7細胞中延長G1期以及縮短S期，從而P6封閉了IGF-1對MCF-7細胞的作用。具體地說，P6延遲了由IGF-1引起的細胞循環(huán)的連續(xù)，從而延遲了細胞分裂。用P6處理過的細胞形態(tài)學相當于編程死亡的細胞的形態(tài)學。
圖5表示濃度各為10-5M的肽P3和P5的聯(lián)合以及濃度各為10-5M的肽P3和P6的聯(lián)合在經(jīng)10％胎牛血清(FCS)刺激的MCF-7細胞中導致G1和G2/M期的延長以及S期的縮短。用這些肽聯(lián)合處理過的細胞形態(tài)學相當于編程死亡的細胞的形態(tài)學。
圖6表示濃度為10-5M的本發(fā)明肽P3在經(jīng)最適濃度為10-9M的雌二醇(E2)刺激或經(jīng)最適濃度為10-8M表皮生長因子(EGF)刺激的MCF-7細胞中導致G1-和G2期的延長以及S期的縮短。用P3處理過的細胞形態(tài)學相當于編程死亡的細胞的形態(tài)學。
圖7表示本發(fā)明肽P3以劑量依賴的方式封閉由IGF-1[10-8M]導致的細胞循環(huán)的連續(xù)。用P3[5×10-6M]處理過的細胞，尤其是用P3[10-5M]處理過的細胞形態(tài)學各相當于編程死亡的細胞的形態(tài)學。
圖8表示在無血清的條件下，本發(fā)明肽P3[10-5M]在G0/G1期已同步的SAOS-2細胞中縮短G1期而延長S和G2/M期。用P3處理過的細胞形態(tài)學相當于編程死亡的細胞的形態(tài)學。
圖9表示肽P3[10-5M]在經(jīng)10％FCS刺激的SAOS-2細胞中延長G1期而縮短S期。用P3處理過的細胞形態(tài)學相當于編程死亡的細胞的形態(tài)學。
圖10表示本發(fā)明肽P3[10-5M]將不同步生長的MCF-7細胞的G1期縮短而延長其S期，所述細胞已在含有10％FCS的DMEM細胞培養(yǎng)基中溫育。用P3處理過的所述細胞的形態(tài)學相當于編程死亡的細胞的形態(tài)學。
圖11表示本發(fā)明肽P8[10-5M]在經(jīng)最適濃度為10-8M的IGF-1刺激的MCF-7細胞中延長G1期和G2/M期以及縮短S期，從而P8封閉了IGF-1對MCF-7細胞的作用。具體地說，P8延遲了由IGF-1引起的細胞循環(huán)的連續(xù)，從而延遲了細胞分裂。用P8處理過的所述細胞的形態(tài)學相當于編程死亡的細胞的形態(tài)學。
圖12表示本發(fā)明肽P7s[10-5M]在經(jīng)最適濃度為10-8M的IGF-1刺激的MCF-7細胞中延長G1期和G2/M期以及縮短S期，從而P7s封閉了IGF-1對MCF-7細胞的作用。具體地說，P7s延遲了由IGF-1引起的細胞循環(huán)的連續(xù)，從而延遲了細胞分裂。用P7s處理過的所述細胞的形態(tài)學相當于編程死亡的細胞的形態(tài)學。
圖13表示本發(fā)明肽P3[10-5M]對溫育于RPMI細胞培養(yǎng)基中的不同步生長的K562細胞的細胞毒效應是依賴于時間的，結果已被作圖為用P3處理過的活細胞相對于未經(jīng)P3處理過的活細胞的百分數(shù)。活細胞的數(shù)目是根據(jù)臺盼藍方法，通過在每個時間點至少計數(shù)200個細胞而測定的。
圖14表示本發(fā)明肽P3[10-5M]以細胞毒的方式對不同步生長的CCRF-CEM敏感細胞和CCRF-CEM/ACT400抗性細胞起作用，所述細胞已在含有10％FCS的RPMI培養(yǎng)基中溫育。
圖15表示本發(fā)明肽P3[10-5M]對正常的人外周血單核細胞不起作用，而不論所述細胞是靜止(a)狀態(tài)或激活(b)狀態(tài)，從而，經(jīng)P3處理過的細胞未顯示出任何形態(tài)學的變化，細胞與P3一起保溫24小時。
表1表示濃度各為10-5M的本發(fā)明肽P5和P6分別在經(jīng)IGF-1[10-8M]或胰島素[10-6M]刺激的MCF-7細胞中縮短S期，肽Penetratin[10-5M]如所期望的那樣未顯示出任何作用。
表2表示濃度各為5×10-5M的本發(fā)明肽P5和P6在經(jīng)10％FCS刺激的SAOS-2細胞中導致G1期的延長和S期的縮短。
總之，基于圖1-15和表1和2，可確證在特殊的細胞培養(yǎng)條件下，本發(fā)明的肽P3,P5,P6,P7s或P8單獨和/或聯(lián)合具有在相當程度上延遲細胞循環(huán)的連續(xù)，因而可延遲MCF-7乳腺癌細胞，SAOS-2骨肉瘤細胞或白血病細胞(K562,CCRF-CEM敏感細胞，CCRF-CEM/ACT400抗性)之細胞分裂的特性。所示的針對IGF-1[10-8M]的數(shù)據(jù)也適用于胰島素[10-6M]。
結果，這些肽具有也可成為有效的抗腫瘤劑的潛力，所述抗腫瘤劑可在人體內抵抗癌癥的生長。
現(xiàn)通過下列實施例闡明本發(fā)明實施例實驗設置包括含完整成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白質的乳腺癌細胞系MCF-7的實驗，和含缺損的成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白質的骨肉瘤細胞系SAOS-2的實驗。以100000(=十萬)個細胞/孔/ml的密度將細胞接種于12孔培養(yǎng)板中的含10％FCS的RPMI培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基中，并使細胞貼壁24小時，隨后，通過在不含F(xiàn)CS的DMEM中溫育3天使細胞饑餓，以使它們在G0/G1期同步，然后分別加入10％FCS或10-8M IGF-1或10-6M胰島素達24小時以刺激細胞。檢測所加入的每種肽對上述每種刺激模式的效應，所述效應反映了細胞分裂的速率。在饑餓3天后0時固定對照細胞(在G0/G1期同步的細胞)，24小時后固定其余的細胞(+/-肽)。隨后通過FACS分析細胞的細胞循環(huán)分布，類似方法見于R.Fahraeus等，Current Biology,1996,vol.6,no.1,p84-91和L.Zhu等，基固和發(fā)育(Genes & Development),1993,vol.7,p1111-1125。
第二種實驗設置涉及白血病細胞系K562和CCRF-CEM和CCRF-CEM/ACT400。在6孔培養(yǎng)板中將100000個不同步生長的細胞/孔/mlRPMI/10％FCS各與每種肽一起溫育48小時，48小時溫育之后，根據(jù)臺盼藍方法(L.D.Attardi等，EMBO J.,1996,vol.15,no.14,p3693-3701和M.K.Reeder & H.C.Isom，細胞生長&分化，1996,vol.7,p449-460)測定死細胞/200計數(shù)細胞的讀出數(shù)目。死細胞越多，肽更具細胞毒性，因而肽更有效。
實施例的結果示于圖1-15和表1和2。
表1對照IGF-1P5+IGF-1P6+IGF-1Penetratin+IGF-1G1:70.247.3 54.053.7 50.5S: 17.745.4 32.427.7 39.3G2/M 12.17.313.618.6 10.1對照胰島素 P6+胰島素 Penetratin+胰島素G1:70.2 38.348.739.6S: 17.7 52.836.649.6G2/M: 12.1 8.9 14.610.9表2對照FCS P5+FCS P6+FCSPenetratin+FCSG1:79.663.1 73.5 76.662.3S: 12.032.5 13.2 12.229.9G2/M 8.4 4.413.3 11.27.8
權利要求
1．一種抗增殖肽AB或BA，它包括A組分，含有腫瘤抑制因子蛋白片段或其親水同源的肽序列并結合到生長因子或生長因子受體區(qū)段，B組分，它作為輔因子，穩(wěn)定A組分抗蛋白酶因而加強A組分的作用。
2．根據(jù)權利要求1的肽，一種抗增殖組分A，包含一個腫瘤抑制因子蛋白片段或其親水同源的肽區(qū)段，它對生長因子區(qū)段或生長因子受體區(qū)段親水互補，一種組分B，它作為輔因子，穩(wěn)定A組分抗蛋白酶并因而加強組分A的作用。
3．根據(jù)權利要求1或2的肽，其中，生長因子區(qū)段或生長因子受體區(qū)段包含一個具有親水性圖的氨基酸序列，疏水氨基酸X-疏水氨基酸-X-親水氨基酸，其中X是一個任意的氨基酸。
4．根據(jù)權利要求1-3中之一的肽，其中，生長因子區(qū)段或生長因子受體區(qū)段，包括氨基酸序列LXCXE，其中X是一個任意的氨基酸。
5．根據(jù)權利要求1-4中之一的肽，其中，片段組分A，是一個來自成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白(RB1)的腫瘤抑制因子蛋白。
6．根據(jù)權利要求1-5中之一的肽，其中，組分(B)是一個聚賴氨酸核心或一個核定位的序列(NLS)。
7．根據(jù)權利要求1-6中之一的肽，其中，包含氨基酸序列FYKK或一個在至少二個位置上與其親水同源的氨基酸序列。
8．根據(jù)權利要求1-7中之一的肽，其中，組分(A)包含氨基酸序列LFYKKV或一個在至少二個位置與其親水同源的氨基酸序列。
9．根據(jù)權利要求1-8中之一的肽的核酸(DNA/RNA)，它相當于基因密碼。
10．編碼權利要求7的肽的核酸(DNA/RNA)，其中DNA/RNA包含(a)5′-UUCUACAAGAAG-3＇(DO)或一個從中通過一個或多個核苷酸不同的DNA/RNA，但它編碼DO相同的肽，(b)一個具有來自a)雜交的DNA/RNA的DNA/RNA，或(c)一個具有來自a)或b)的DNA/RNA，它通過遺傳密碼的簡并性相關于該DNA/RNA。
11．編碼權利要求8的肽的核酸，其中DNA/RNA包含(a)以下序列5＇-CUU UUC UAC AAG AAG GUU-3＇(D1)或一個由此通過一個或多個核苷酸不同的DNA/RNA，但它編碼D1相同的肽，(b)一個具有來自(a)雜交的DNA的DNA/RNA，或(c)一個具有來自(a)或(b)的DNA/RNA，它通過遺傳密碼的簡并性相關于該DNA。
12．肽核酸，它對按權利要求9-11中之一的一個DNA/RNA是結構同源。
13．藥物組合物，它包含一個或多個權利要求1-8中之一的肽。
14．根據(jù)權利要求13的藥物組合物，它可以呈膏劑、溶液劑、分散劑、乳劑、氣霧劑、泡沫劑、微粒狀物質(如，粒狀、塊粒、粉末狀、微珠狀、吸附劑)、丸劑、錠劑、片劑、糖錠劑或膠囊。
15．根據(jù)權利要求1-8中之一的肽的用途，它用于治療和細胞加強增殖或過增殖有關的疾病，即治療例如良性和惡性腫瘤以及動脈粥樣硬化癥。
16．根據(jù)權利要求1-8中之一的肽的用途，它用于生物提純生長因子和生長因子受體。
17．根據(jù)權利要求9-11中之一的DNA/RNA的用途，它用于診斷和/或治療過增殖疾病，如癌癥或動脈粥樣硬化癥。
18．根據(jù)權利要求12的肽核酸的用途，它用于診斷或治療過增殖的疾病，如癌癥或動脈粥樣硬化癥。
19．根據(jù)權利要求1-8中之一的肽，根據(jù)權利要求9-11中之一的DNA/RNA以及根據(jù)權利要求12的肽核酸的用途，它用作鑒定和克隆生長因子、生長因子受體以及腫瘤抑制因子蛋白的助劑。
20．根據(jù)權利要求1-8中之一的肽，根據(jù)權利要求9-11中之一的DNA/RNA以及根據(jù)權利要求12的肽核酸的用途，它用作予后助劑以及用于證明生長因子和/或生長因子受體與腫瘤抑制因子蛋白的配合物形成。
21．根據(jù)權利要求13的藥物組合物的用途，它用于診斷和/或治療過增殖的疾病，如癌癥或功脈粥樣硬化癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及得自腫瘤抑制蛋白并與生長因子區(qū)段或生長因子受體區(qū)段結合的抗增殖肽,本發(fā)明也涉及編碼這些肽的核酸(DNA/RNA)和結構上同源的肽核酸和含有這種肽的藥物組合物,本發(fā)明也可用于生物技術,分子生物學,生物信息學和過度增殖性疾病,特別是癌癥和動脈粥樣硬化的診斷和治療中。
文檔編號A61P43/00GK1214694SQ97193351
公開日1999年4月21日 申請日期1997年3月26日 優(yōu)先權日1996年3月26日
發(fā)明者拉茲文·T·拉都勒斯丘 申請人:拉茲文·T·拉都勒斯丘