專利名稱：穩(wěn)定化的生長激素制劑和其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及穩(wěn)定化的生長激素(GH)制劑，尤其是通過摻入穩(wěn)定化賦形劑而被穩(wěn)定化的人生長激素(hGH)液體制劑。這些hGH的液體制劑具有改善的化學(xué)及物理穩(wěn)定性。本發(fā)明尤其涉及制備這些穩(wěn)定的GH制劑的方法。
發(fā)明的
背景技術(shù)：
人和動物的生長激素為在垂體前葉中發(fā)現(xiàn)的包含約191個氨基酸的蛋白質(zhì)。GH主要的生物學(xué)作用是在幼年人和動物中促進體征形成，在成年生物中維持組織。受GH影響的器官包括骨骼、肌肉、結(jié)締組織和內(nèi)臟。生長激素通過與靶細胞膜上的特異性受體相互作用而起作用。
人生長激素(hGH)是一種參與調(diào)節(jié)正常人體生長的關(guān)鍵激素，并且還影響各種生理和代謝功能，其中包括線性骨生長，泌乳和細胞能量使用。幼兒hGH的缺乏導(dǎo)致身材矮小，并且這種疾病已通過外源施用hGH而得到治療。
過去，努力集中在確定各個種類的生長激素的分子功能上。來自醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)領(lǐng)域的商業(yè)興趣已很強烈，并已克隆了hGH基因。目前正在哺乳動物和細菌細胞培養(yǎng)物系統(tǒng)中以生物合成來制備hGH和其衍生物甲硫氨酰-hGH(met-hGH)。
為了在商業(yè)上供應(yīng)hGH的治療用藥物制劑，必須制備穩(wěn)定的制劑。這些制劑必須能在適宜的貯藏期間保持活性；它們必須易于配制，并可被病人樂于接受施用。
業(yè)以各種方式配制了人GH。例如，美國專利號5,096,885公開了除開hGH，還包含甘氨酸、甘露糖醇、緩沖液和任選的一種非離子表面活性劑的穩(wěn)定的藥物學(xué)可接受的hGH制劑，其中hGH甘氨酸的摩爾比為1∶50-200。國際專利公開號WO93/19776公開了可注射用的GH制劑，其包含檸檬酸鹽作為緩沖物質(zhì)，和任選的生長因子如胰島素樣生長因子或表皮生長因子，氨基酸如甘氨酸或丙氨酸，甘露糖醇或其它糖醇，甘油和/或防腐劑如苯甲醇。國際專利公開號WO94/01398公開了包含hGH，緩沖液，非離子表面活性劑和任選的甘露糖醇、中性鹽和/或防腐劑的GH制劑。
在歐洲專利公開號0131864(和相應(yīng)的澳大利亞專利號579016)中，公開了一種分子量大于8500道爾頓的蛋白的水溶液，其中通過加入作為穩(wěn)定劑的包含線性聚氧化烯鏈的表面活性物質(zhì)而使這些蛋白被保護，在界面不被吸附從而防止變性及蛋白沉淀。
歐洲專利公開號0211601公開了一種促進生長的制劑，其包含生長促進激素和含聚氧乙烯-聚氧丙烯單元、平均分子量為約1,100-約40,000的嵌段共聚物的含水混合物，其中該制劑保留了生長促進激素的流動性及其在施用時的生物活性。隨后的歐洲專利公開號0303746公開了在含水環(huán)境中生長促進激素的各種其它穩(wěn)定劑，包括一些多元醇、氨基酸、在生理pH下具有帶電側(cè)基的氨基酸聚合物及膽堿鹽。
hGH的藥物制劑一般不穩(wěn)定，尤其是在溶液中。物理不穩(wěn)定性可能導(dǎo)致產(chǎn)生化學(xué)降解物，如脫去酰氨基或次硫酸鹽形式的hGH，二聚體或高分子量聚集物(Becker等(1988)生物技術(shù)與應(yīng)用生物化學(xué)10,326；Pearlman和Nguygen(1989)，在D.Marshak和D.Liu(編)，治療用肽和蛋白質(zhì)、制劑、遞送和靶定，現(xiàn)代分子生物學(xué)通迅，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，pp23-30；Becker等(1987)生物技術(shù)與應(yīng)用生物化學(xué)9,478)。
由于hGH在溶液中不穩(wěn)定，hGH的藥物制劑趨于以在使用前必須再配制的冷凍干燥形式存在。冷凍干燥通常被用在一些其中在溶液中的穩(wěn)定性不夠的貯藏條件下以維持多肽的生物活性和生物化學(xué)完整性，然而，避免冷凍干燥將是有利的，因為它是一個昂貴和耗時的生產(chǎn)步驟。通常在使用前通過加入藥物學(xué)可接受的稀釋劑，如注射用無菌水、無菌生理鹽水或適宜的無菌生理上可接受的稀釋劑來再配制hGH的冷凍干燥制劑。優(yōu)選將hGH的再配制溶液貯藏在4℃下以將化學(xué)和物理降解反應(yīng)減至最少，然而，在最長可達14天的貯藏期限中將產(chǎn)生一些降解。
以液體形式提供的hGH藥物制劑，尤其是在長時間內(nèi)保持hGH穩(wěn)定性的藥物制劑將是尤為有利的。如上所述，目前的液體制劑在貯藏時間上受在加工和貯藏中產(chǎn)生的化學(xué)和物理降解反應(yīng)產(chǎn)物的限制。在Becker等(1987)(同上)中報道了與二聚體形成相關(guān)的問題，且以前避免hGH二聚體形成的努力沒有成功。
本發(fā)明的一個目的是提供不導(dǎo)致形成不希望的聚集物或不導(dǎo)致降低生物活性或改變受體識別的化學(xué)變化的穩(wěn)定的hGH液體制劑。另一個目的是提供可借助于用于皮下注射的無針頭注射器遞送，或可被制成用于肺部的煙霧劑的制劑。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，提供一種制備穩(wěn)定的生長激素液體制劑的方法，其中該制劑包含生長激素、緩沖液和穩(wěn)定化有效量的至少一種選自下面的穩(wěn)定劑(ⅰ)聚乙二醇-聚丙二醇非離子表面活性劑，(ⅱ)?；悄懰峄蚱潲}或衍生物，和(ⅲ)甲基纖維素衍生物，其中該方法包括在生長激素不暴露于大于2×制劑中的緩沖液或穩(wěn)定劑最終濃度的緩沖液或穩(wěn)定劑濃度的條件下，將生長激素與緩沖液和穩(wěn)定劑混合。
本發(fā)明還涉及由上面概述的方法制備的穩(wěn)定的生長激素液體制劑。
另一個方面，本發(fā)明還涉及一種穩(wěn)定的生長激素液體制劑，該制劑包含生長激素、緩沖液和穩(wěn)定化有效量的至少一種選自牛磺膽酸或其鹽或衍生物和甲基纖維素衍生物的穩(wěn)定劑。
除非本文另有說明，在本說明書中，詞語“包含”或其變化形式如“包括”應(yīng)理解為指包含所述的要素或要素組，但不排除任何其它的要素或要素組。
在一個尤其優(yōu)選的實例中，本發(fā)明提供一種制備穩(wěn)定的藥物學(xué)可接受的人生長激素的液體制劑的方法，該制劑包含(a)藥物學(xué)有效量的hGH，(b)0.01-5.0％w/v的至少一種選自上面概述組中的穩(wěn)定劑，和(c)藥物學(xué)可接受的緩沖液。
優(yōu)選地，該制劑包含0.05-2.0％w/v，較優(yōu)選0.08-1.0％w/v的穩(wěn)定劑。
特別優(yōu)選的穩(wěn)定劑為Pluronic多羥基化合物、?；悄懰峒捌潲}和羥丙基甲基纖維素。
該穩(wěn)定化的生長激素液體制劑優(yōu)選還包含藥物學(xué)可接受的緩沖液如磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖液，其濃度為2.5-50mM，較優(yōu)選為10-20mM。
制劑的pH優(yōu)選為5.0-7.5，較優(yōu)選為5.0-6.8，更優(yōu)選為5.2-6.5，最優(yōu)選為5.4-5.8。
在制備穩(wěn)定化的生長激素液體制劑中，在生長激素不暴露于大于2×制劑中的最終緩沖液濃度的緩沖液濃度的條件下，將生長激素與緩沖液混合，并接著在相應(yīng)條件下，向混合物中加入穩(wěn)定劑。
在尤其優(yōu)選的穩(wěn)定化的生長激素液體制劑的制備方法中，將生長激素的暴露限制在不大于各成分最終濃度的2倍的磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖液和Pluronic多羥基化合物的濃度。
本發(fā)明還涉及一種治療需要生長激素的人或動物患者的方法，該方法包括對所述患者施用藥物學(xué)有效量的如上概述的穩(wěn)定的生長激素液體制劑。
可通過使用煙霧劑裝置或無針頭注射器進行團塊的注射或通過連續(xù)靜脈內(nèi)輸注施用GH液體制劑。
在本文中，所涉及的“生長激素”包括所有種類的GH，包括人、牛、豬、綿羊和鮭魚及其它，尤其是hGH，以及GH的生物活性衍生物。GH衍生物指氨基酸序列有改變的人和動物種類的GH，如小的氨基酸缺失或被其它氨基酸殘基置換。還包括GH的截短形式和其衍生物，以及在蛋白的氨基或羧基末端加上了氨基酸的GH，如甲硫氨酰hGH。另一種類型的hGH修飾為通過向活性hGH氨基酸共價加成聚乙二醇而形成(Davis等，美國專利4,179,337)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供的GH和穩(wěn)定劑的液體制劑的制備方法產(chǎn)生一種在凝固溫度之上和之下適宜于延長期限的貯藏、以及適宜于治療施用的穩(wěn)定的液體GH制劑。包含這種穩(wěn)定劑的治療制劑是穩(wěn)定的，同時仍允許治療施用該制劑。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選具體實例，GH為hGH。(1)人生長激素組合物術(shù)語“人生長激素”或“hGH”代表例如通過從天然來源，或通過重組細胞培養(yǎng)物系統(tǒng)產(chǎn)生的人生長激素。hGH的序列和其特征描述在例如《激素藥物》，Gueriguigan等，USP會議，Rockville,MD(1982)中。如上所述，該術(shù)語還覆蓋在hGH整個序列中有一個或多個氨基酸不同的人生長激素的生物活性等同物，尤其是包括met-hGH。該術(shù)語還包括hGH的取代、缺失和插入氨基酸的變異體或翻譯后修飾物。用于本發(fā)明制劑的hGH通常通過前面討論的重組方法來制備。
GH尤其是hGH的“藥物學(xué)有效量”指在各種給藥方案中產(chǎn)生治療效果的量。本發(fā)明的組合物可被制備成包含至少約0.1mg/ml至約20mg/ml或更多量的GH，優(yōu)選為約1mg/ml至約10mg/ml，尤其優(yōu)選為約1mg/ml至約5mg/ml。(2)緩沖液和pH緩沖液可為任何藥物學(xué)可接受的緩沖劑，如磷酸鹽、tris-HCl、檸檬酸鹽等。優(yōu)選的緩沖液為磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖液。優(yōu)選緩沖液濃度大于或等于2mM而小于50mM，最有利地為10-20mM。用緩沖液調(diào)節(jié)的由此用于制備該制劑的適宜的pH范圍為約5-約7.5，最有利地為約5.6。制劑pH應(yīng)小于7.5以降低GH的脫酰胺作用。(3)穩(wěn)定劑根據(jù)本發(fā)明，該制劑包含一種或多種用于增加GH穩(wěn)定性的穩(wěn)定劑。該穩(wěn)定劑可為聚乙二醇-聚丙二醇非離子表面活性劑，如Pluronic多羥基化合物，如Pluronics F127,F68,L64,PE6800和PE6400，膽鹽，如?；悄懰猁}或其衍生物，或甲基纖維素衍生物，如羥丙基甲基纖維素(HPMC)。該制劑可包含單一穩(wěn)定劑或其兩種或多種的混合物。
加入的穩(wěn)定劑的濃度將通過選擇緩沖液和pH來確定，但有利的是在0.01％-5.0％(w/v)的范圍，較優(yōu)選0.05-2.0％，甚至更優(yōu)選0.08-1.0％。當(dāng)在一溫度范圍，包括凝固點上下經(jīng)歷延長的貯藏期時，或當(dāng)該制劑經(jīng)受界面應(yīng)力時，使用穩(wěn)定劑可增加制劑的穩(wěn)定性。
隨著濃度增加，穩(wěn)定劑增加制劑對界面應(yīng)力的穩(wěn)定性。然而，增加的穩(wěn)定劑濃度降低化學(xué)穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明，將穩(wěn)定劑濃度最佳化以獲得對界面應(yīng)力的高穩(wěn)定性，同時增加的化學(xué)不穩(wěn)定性最小。(4)穩(wěn)定劑和hGH的優(yōu)選制劑在根據(jù)本發(fā)明制劑的制備中，向hGH液體制劑中加入一種或多種穩(wěn)定劑。如上所述，在配制過程中，生長激素被暴露在不大于2倍緩沖液最終濃度的緩沖液濃度中，優(yōu)選在調(diào)節(jié)最終體積之前的片刻向制劑中加入穩(wěn)定劑。產(chǎn)生的制劑對變性具有增加的穩(wěn)定性，并且對在加工和貯藏中可能遇到的不希望的反應(yīng)不敏感。如本文所采用的，術(shù)語“加工”包括過濾、將hGH溶液裝入小瓶中以及在生產(chǎn)制劑中涉及的其它操作。
可通過將hGH和具有所需純度的穩(wěn)定劑與生理上可接受的賦形劑、緩沖液或防腐劑混合來制備用于治療給藥的hGH的液體制劑(Remington藥物科學(xué)，16th版，Osol,A.編(1980)。可接受的賦形劑為在采用的濃度和劑量下對病人無毒的那些，包括緩沖劑、防腐劑、抗氧化劑、pH和滲透壓調(diào)節(jié)劑。
如果需要，生長激素的液體制劑還可包括一種或多種其它穩(wěn)定化賦形劑。另外的穩(wěn)定化賦形劑可包括例如氨基酸，如甘氨酸或丙氨酸，甘露糖醇或其它糖醇或甘油。此外，液體制劑可包括其它生長因子，如胰島素樣生長因子或表皮生長因子。
本發(fā)明的優(yōu)選具體實例提供一種有效穩(wěn)定hGH的方法。該優(yōu)選制劑包含一種或多種選自Pluronic多羥基化合物、?；悄懰峄蚱潲}或其衍生物、和甲基纖維素衍生物的穩(wěn)定劑。制劑優(yōu)選包含基本上純的hGH，不含在人中發(fā)現(xiàn)的污染肽或蛋白或感染性物質(zhì)。該優(yōu)選具體實例的制劑可另外包含藥物學(xué)可接受的添加劑。這包括例如緩沖液、等滲和pH調(diào)節(jié)劑、螯合劑、防腐劑、抗氧化劑、助溶劑等，具體實例可包括檸檬酸鹽、磷酸鹽等。在制劑的預(yù)期應(yīng)用可能損害無菌性時可加入防腐劑，在這種情況下，可采用藥物學(xué)可接受的防腐劑，如苯甲醇或苯酚。
根據(jù)本發(fā)明制備的制劑提供的hGH的增加的穩(wěn)定性使得可廣泛使用可能比在不存在穩(wěn)定劑時通常使用的那些更濃的hGH制劑。例如，穩(wěn)定化的hGH液體制劑還降低在煙霧化或無針頭注射hGH制劑中發(fā)生的hGH的表面誘導(dǎo)的變性的發(fā)生?？蛇M行hGH制劑的進一步的最佳分配，其中本發(fā)明的hGH制劑被以1-50mg/小瓶，優(yōu)選2-25mg/小瓶，較優(yōu)選3-10mg/小瓶的量分配至小瓶中。hGH制劑增加的穩(wěn)定性使得能在適宜溫度如凝固點之下(最優(yōu)選為-20℃)，或凝固點之上優(yōu)選2-8℃，最優(yōu)選為4℃時得以長期貯藏。
用于體內(nèi)給藥的hGH制劑必須是無菌的。通過用無菌過濾膜過濾可容易地達到這一點。
治療用hGH液體制劑通常被放置在具有無菌入口的容器中，例如靜脈溶液袋或具有可被皮下注射針頭穿過的塞子的小瓶。
根據(jù)本發(fā)明的hGH液體制劑的給藥途經(jīng)與已知實踐一致，例如通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)、肌肉內(nèi)、眼內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)或病灶內(nèi)注射或灌注，或通過連續(xù)靜脈輸注。
本發(fā)明進一步的特征從下面的實施例以及附圖中將是顯而易見的。
附圖簡要說明

圖1表明在5mM磷酸鹽緩沖液(pH6.0-7.5)中hGH(1.5mg/ml)的化學(xué)穩(wěn)定性。
圖2表明通過界面應(yīng)力(旋渦攪拌)誘導(dǎo)的hGH(在10mM乙酸鹽緩沖液，pH4.1-4.5中，或在5mM磷酸鹽緩沖液，pH6.0-7.5中的2mg/ml溶液)的聚集對溶液pH的依賴性。
圖3圖示總結(jié)了各種穩(wěn)定劑降低界面應(yīng)力(旋渦攪拌)誘導(dǎo)的聚集化hGH沉淀的能力。
圖4表明不同之處僅在于將hGH導(dǎo)入賦形劑中的方法的兩個hGH(5mg/ml)制劑，和其中加入了0.005％w/v EDTA的第三個hGH制劑的穩(wěn)定性。
實施例實施例1．篩選穩(wěn)定劑的方法穩(wěn)定劑降低或預(yù)防由于界面應(yīng)力導(dǎo)致的GH尤其是hGH的聚集的能力已使用快速聚集方法得到評價，并通過大小排阻層析(SEC)進行了分析。使用串聯(lián)的兩個TSK G3000SW柱(7.8mm內(nèi)徑×300mm,ToyoSodo，日本)進行hGH的層析。流動相由0.1M磷酸鹽(pH7.0)緩沖液組成，并以0.9ml/分鐘的流速泵入，通過在214nm的UV吸光度檢測hGH的洗脫液，使用20μ1的樣品體積。
快速聚集方法包括通過在加蓋的聚丙烯試管(11mm內(nèi)經(jīng)×74mm)中以恒定速度旋渦攪拌hGH溶液15-60秒來導(dǎo)入高空氣/水界面，室溫下，將樣品平衡30分鐘以使沉淀發(fā)生，接著用0.2μm乙酸纖維素微離心濾紙過濾，用SEC分析濾液。沒有處理的各樣品的對照溶液包括在SEC分析中。
剩余的全部可溶性hGH的量(單體和高分子量物質(zhì)的峰面積)用適宜的未處理對照溶液的整個峰面積(出于hGH)的百分?jǐn)?shù)來表示。
表1表明各種穩(wěn)定劑對在pH7.0由界面應(yīng)力誘導(dǎo)的hGH聚集程度的影響。
表2表明各種穩(wěn)定對在pH6.0由界面應(yīng)力誘導(dǎo)的hGH聚集程度的影響。
表3表明各種穩(wěn)定劑對在pH5.6由界面應(yīng)力誘導(dǎo)的hGH聚集程度的影響。
表4表明等滲調(diào)節(jié)對在pH5.6在各種緩沖液中的hGH(1.5mg/ml)聚集程度的影響。
表5表明各種穩(wěn)定劑對在pH5.6由凍-融誘導(dǎo)的hGH聚集程度的影響。
如所附表格所示，一些賦形劑對降低或預(yù)防由于界面應(yīng)力誘導(dǎo)的hGH聚集非常有效。Pluronic多羥基化合物在濃度高于0.05％w/v時提供幾乎是定量的保護，僅剩余單體hGH。牛磺膽酸在濃度高于0.02％w/v時，提供幾乎是定量的保護，僅剩余單體hGH。在pH5.6時，脫氧?；悄懰猁}不適宜作為穩(wěn)定劑，因為它在不存在界面應(yīng)力時導(dǎo)致hGH二聚化。
表1在pH7.0并存在賦形劑時，由表面應(yīng)力誘導(dǎo)的hGH(1.5mg/ml)的聚集<

表2在pH6.0并存在賦形劑時，由界面應(yīng)力誘導(dǎo)的hGH(1.5mg/ml)的聚集

表3在pH5.6并存在賦形劑時，由界面應(yīng)力誘導(dǎo)的hGH(1.5mg/ml)的聚集<

在存在脫氧?；悄懰猁}，不存在界面應(yīng)力時發(fā)生的二聚化作用由于聚集作用被報道取決于磷酸鹽濃度(Pearlnan和Nguyen,1992,J.Pharm.Pharmacol.44:178-185)，研究了在加入或不加入氯化鈉(至等滲)的檸檬酸鹽或磷酸鹽(5或20mM)緩沖液中hGH(1.5mg/ml,pH5.6)的聚集特性。
按照如前所述的實驗方法，僅改變處理時間(15秒)。表4在pH5.6在各種緩沖液體系中的hGH(1.5mg/ml)的聚集

a 單體加上高分子量種類b hGH溶解性不足。
未發(fā)現(xiàn)hGH聚集取決于緩沖液的性質(zhì)或緩沖液濃度。hGH聚集與離子強度(當(dāng)用NaCl調(diào)節(jié)時)負相關(guān)。
研究了在存在賦形劑時，由凍-融誘導(dǎo)的hGH(在20mM等滲檸檬酸鹽緩沖液pH5.6中為1.5mg/ml)聚集。在-20℃時，在存在各種賦形劑時，將hGH樣品(100μl)冷凍24小時，接著室溫下融化，并平衡30分鐘以讓沉淀產(chǎn)生。如前所述通過SEC進行過濾樣品的分析。
表5在pH5.6并存在賦形劑時，由凍-融誘導(dǎo)的hGH(1.5mg/ml)的聚集

凍-融后的hGH聚集不廣泛，但不隨賦形劑的加入而增加。實施例2圖1為hGH(15mg/ml)在5mM磷酸鹽緩沖液pH6.0-7.5(貯藏在40℃)的化學(xué)穩(wěn)定性的代表性分布圖。根據(jù)美國藥典(USP1990)中描述的方法，使用Vydac C-4柱通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)分析降解的樣品。根據(jù)美國藥典預(yù)告(1990年11-12日)中描述的方法確定降解產(chǎn)物為脫酰胺hGH或氧化hGH。存在于降解樣品中的天然hGH(圖A)、脫酰胺hGH(圖B)和氧化hGH(圖C)的量用相對于pH6.0(○)、pH6.5(●)、pH7.0()和pH7.5()的整個峰面積(出于hGH)的(天然hGH或降解物)峰面積百分?jǐn)?shù)來表示。
發(fā)現(xiàn)天然hGH的損失在6.0-7.5的pH范圍中遵循一級動力學(xué)，在8-40℃的溫度范圍中遵循Arrhenius行為。發(fā)現(xiàn)40℃的一級速率常數(shù)在pH6.0時的2.4×10-2天-1至pH7.5時的7.4×10-2天-1的范圍內(nèi)。與公開的報道一致(Pearlman和Nguyen,1989，見上文)，脫酰胺作用和氧化作用是hGH降解的主要途徑。脫酰胺hGH以大于氧化hGH形成的速率形成，在pH值為6.0或更低時化學(xué)穩(wěn)定性增強。
圖2表明使用如實施例1中描述的方法，通過界面應(yīng)力誘導(dǎo)的在10mM乙酸鹽緩沖液(pH4.1-4.5)或5mM磷酸鹽緩沖液(pH6.6-7.5)中hGH(2mg/ml)的聚集和沉淀。單體hGH(由于單體的峰面積)或剩余的全部可溶性hGH(由于單體加上更高等級的聚集物的峰面積)的量用相對于適宜的未處理對照溶液的峰面積的百分?jǐn)?shù)來表示。數(shù)據(jù)表示在旋渦攪拌30秒(○)或60秒(●)后剩余的可溶性單體hGH(圖A)或全部可溶性hGH(圖B)的量。
在pH5-6的區(qū)域，hGH的聚集作用和后來的沉淀作用最大。在pH4.1-6.0范圍內(nèi)，在界面應(yīng)力后，僅單體hGH保留在溶液中。在pH7.0-7.5范圍內(nèi)，主要存在可溶性聚集物(二聚體和更高級聚集物)。
圖3表明賦形劑(％w/v)對如圖2所述通過以恒定速度旋渦攪拌60秒由界面應(yīng)力誘導(dǎo)的hGH(在5mM磷酸鹽緩沖液pH5.6中為1.5mg/ml)的聚集作用的影響。數(shù)據(jù)表示在存在Pluronic F-68(○)、Pluronic F-127(●)、?；悄懰徕c()或HPMC()時，以相對于適宜的對照溶液中SEC分析的hGH峰面積的百分?jǐn)?shù)表示的處理后仍保留的全部可溶性hGH(單體加上更高等級的聚集物)的百分?jǐn)?shù)。
在不存在賦形劑時，小于1％的hGH仍保留在溶液中。加入Pluronic多羥基化合物、?；悄懰猁}或HPMC導(dǎo)致剩余的可溶性hGH大量增加。尤其是Pluronics F-68和F-127和?；悄懰猁}對hGH提供了幾乎是定量的抗聚集保護。實施例3圖4表明配制方法對hGH制劑穩(wěn)定性的影響。通過將純化的hGH溶液濃縮至7-7.5mg/ml，并加入2倍濃度的包含所有賦形劑并且被調(diào)節(jié)至一定pH的溶液，所述pH使得不用進一步調(diào)節(jié)即可產(chǎn)生pH5.6的液體制劑，最后用水調(diào)節(jié)以獲得5mg/ml的最終hGH濃度來配制制劑1。
通過緩沖液交換，通過交換至包含所需濃度的所有賦形劑(除開Pluronic F-68)的緩沖液中將純化的hGH溶液濃縮至所需濃度來配制制劑2。接著加入足量的固體Pluronic F-68以產(chǎn)生所需濃度。隨后檢查pH，如果需要調(diào)節(jié)pH。
制劑1和2具有相同的成分hGH(生長激素)5mg檸檬酸-水合物2.04mg/ml檸檬酸三鈉二水合物 2.85mg/ml氯化鈉 6.23mg/ml氫氧化鈉 0.388mg/ml苯甲醇 0.9％Pluronic F-680.08％pH 5.6如制劑2那樣配制制劑3，其包含與制劑1和2相同的成分，并加有0.005％w/vEDTA。
40℃下，貯藏制劑1-3，并以40天的間隔通過大小排阻HPLC分析hGH含量。如圖4所示在該40℃的加速穩(wěn)定性試驗中，尤其與制劑1相比，制劑2和3顯示出更好的穩(wěn)定性。
權(quán)利要求
1．一種制備穩(wěn)定的生長激素液體制劑的方法，其中該制劑包含生長激素、緩沖液和穩(wěn)定化有效量的至少一種選自下面的穩(wěn)定劑(ⅰ)聚乙二醇-聚丙二醇非離子表面活性劑，(ⅱ)?；悄懰峄蚱潲}或衍生物，和(ⅲ)甲基纖維素衍生物，其中該方法包括在生長激素不暴露于大于2×制劑中的緩沖液或穩(wěn)定劑最終濃度的緩沖液或穩(wěn)定劑濃度的條件下，將生長激素與緩沖液和穩(wěn)定劑混合。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中生長激素為人生長激素。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中該制劑包含0.1-5.0％w/v，優(yōu)選0.05-2.0％w/v，更優(yōu)選0.08-1.0％w/v的穩(wěn)定劑。
4．根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中穩(wěn)定劑選自Pluronic多羥基化合物、?；悄懰岷推潲}、及羥丙基甲基纖維素。
5．根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項的方法，其中制劑包含0.08％w/v的Pluronic多羥基化合物作為穩(wěn)定劑。
6．根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項的方法，其中該制劑包含藥物學(xué)可接受的緩沖液，優(yōu)選磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖液，其濃度為2.5-5.0mM，優(yōu)選為10-20mM。
7．根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項的方法，其中制劑的pH為5.0-7.5，優(yōu)選為5.0-6.8，更優(yōu)選為5.2-6.5，最優(yōu)選為5.4-5.8。
8．根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項的方法，其中穩(wěn)定劑在調(diào)節(jié)最終體積之前的片刻被加入制劑中。
9．一種穩(wěn)定的生長激素液體制劑，其由根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項的方法制備。
10．一種穩(wěn)定的生長激素液體制劑，其包含生長激素、緩沖液和穩(wěn)定化有效量的至少一種選自?；悄懰峄蚱潲}或衍生物、及甲基纖維素衍生物的穩(wěn)定劑。
11．一種治療需要生長激素的人或動物患者的方法，其包括對所述患者施用藥物學(xué)有效量的根據(jù)權(quán)利要求9或權(quán)利要求10的制劑。
全文摘要
一種制備穩(wěn)定的生長激素液體制劑的方法,其中該制劑包含生長激素、緩沖液和穩(wěn)定化有效量的至少一種選自下面的穩(wěn)定劑:(i)聚乙二醇－聚丙二醇非離子表面活性劑,(ii)?；悄懰峄蚱潲}或衍生物,和(iii)甲基纖維素衍生物,其中該方法包括在生長激素不暴露于大于2×制劑中的緩沖液或穩(wěn)定劑最終濃度的緩沖液或穩(wěn)定劑濃度的條件下,將生長激素與緩沖液和穩(wěn)定劑混合。
文檔編號A61K47/38GK1214633SQ97193316
公開日1999年4月21日 申請日期1997年2月12日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月12日
發(fā)明者M·K·麥克納馬拉, W·N·查曼, S·A·查曼 申請人:Csl有限公司, 墨納什大學(xué)