專利名稱：純尿激酶酶原與人血清白蛋白通過二硫橋鍵共價(jià)連接形成的血纖維蛋白溶酶原激活劑復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用尿激酶酶原作為溶解血栓的藥劑，以溶解患者體內(nèi)的血纖維旦白凝塊。
尿激酶酶原(UK酶原)由單鏈組成，分子量為55千道爾頓，是雙鏈尿激酶(UK)的前體(酶原)。在美國再頒專利32，221中Husain等人對(duì)尿激酶酶原作了詳細(xì)描述，在本文中作為參考。單鏈尿激酶酶原經(jīng)酶促轉(zhuǎn)化作用活化為雙鏈UK形式，其特征是轉(zhuǎn)移絲氨酸旦白酶家族到適當(dāng)位置。尿激酶酶原通過靜脈注射后很快從血漿中清除，約為5-8分鐘。這一清除時(shí)間比它的活性衍生物即高分子量的雙鏈UK的清除時(shí)間短。
本發(fā)明描述了由純尿激酶酶原與人血清白蛋白(HSA)共價(jià)連接形成的血纖維旦白溶酶原激活劑復(fù)合物。形成的復(fù)合物可明顯延遲尿激酶酶原從血漿中清除，同時(shí)保留了溶解血纖維旦白的特性。本文所說的“尿激酶酶原”是指天然存在的或重組產(chǎn)生的UK酶原(UK酶原的任何酶原缺失突變型)、或者是任何具生物學(xué)活性的UK酶原的單鏈衍生物或片段，該衍生物或片段含有一個(gè)能與HSA的游離半胱氨酸殘基進(jìn)行硫醇一二硫基轉(zhuǎn)換的胱氨酸殘基，在下文將詳細(xì)描述。本文所說的“HSA”是指天然存在的或重組的HSA。本文所說的“純”是指在使用前該復(fù)合物實(shí)質(zhì)上(占重量的95%或更大)不含其它物質(zhì)(如血液或組織培養(yǎng)物中的其他成分)。
由于本發(fā)明所述的復(fù)合物比UK酶原本身在體內(nèi)具有更長的半衰期，因而提高了它在血栓溶解治療中的使用價(jià)值。而本發(fā)明的復(fù)合物不僅可預(yù)防血栓形成，而且能長期地預(yù)防心血管病變，如已知與血纖維旦白溶解活性受抑制有關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化。
由于在體內(nèi)的半衰期得到改善，本發(fā)明所述的UK酶原HSA復(fù)合物可通過靜脈內(nèi)注射方法用于治療。從而改進(jìn)了UK酶原本身在治療中使用，因?yàn)閁K酶原在體內(nèi)的半衰期短，在治療時(shí)必須進(jìn)行連續(xù)靜脈內(nèi)注射，從而給治療帶來極大的不便，尤其是醫(yī)院外的治療。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)在下面描述的優(yōu)選實(shí)施例和權(quán)利要求中能明顯地看出。
首先對(duì)附圖進(jìn)行描述如下

圖1(a)是完整的單鏈UK酶原分子的模式圖，(Holmes et al，Biotechnology(1985)，3，923-929);圖1(b)顯示單鏈UK酶原與HSA的共價(jià)連接。
圖2顯示UK酶原/HSA混合物在37℃中溫育4小時(shí)后過濾層析結(jié)果。收集0.5ml餾出物測定蛋白質(zhì)含量(O)和血纖維旦白溶解活性(O)。
圖3是UK酶原在不同介質(zhì)中溫育后的酶譜。
泳道2-在緩沖液中溫育3-在HSA中溫育4-在CBS血漿中溫育5-在CBS血漿和HSA中溫育6-在血漿中溫育。
7-10表示經(jīng)過α(HSA)-Sephadex柱后UK酶原與HSA一起溫育。
圖4顯示泳道2-3表示純化的復(fù)合物的酶譜。
4-表示純化的復(fù)合物與α(HSA)溫育1小時(shí)后的酶譜，以及通過α(HSA)-Sephadex柱后純化的復(fù)合物的酶譜。泳道3中的樣品在電泳前先在SDS緩沖液中煮沸2分鐘，而不用在37℃ SDS緩沖液中溫育30分鐘這一經(jīng)典方法。
圖5中泳道2，3，4分別表示pH值為5，7.5，9時(shí)UK酶原與純化的HSA中溫育后的酶譜。泳道6，7，8分別是在Zn2+、Ca2+、以及Zn2+和Ca2+存在時(shí)UK酶原與純化的HSA溫育后的酶譜。泳道9是UK酶原與HSA濃度比為10時(shí)兩者一起溫育后的酶譜。
圖6中顯示泳道2-UK酶原在緩沖液中溫育后的酶譜泳道3、4、5和6分別表示UK酶原在血漿中溫育0小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)、6小時(shí)、的酶譜。
7-表示UK在緩沖液中溫育后的酶譜。
8、9-分別表示在血漿中溫育0，6小時(shí)后的酶譜。
10-表示在濃縮尿中溫育后酶譜。
圖7是HSA經(jīng)DFP和氯胺T處理(不影響形成復(fù)合物)以及BSA經(jīng)DTT處理(使之恢復(fù)與UK酶原形成復(fù)合物的能力)后得的酶譜。
泳道1-UK酶原在緩沖液中溫育。
2-UK酶原與HSA一起溫育。
3-UK酶原與緩沖液處理的HSA一起溫育4-UK酶原與DFP處理的HSA一起溫育5-UK酶原與緩沖液處理的HSA一起溫育。
6-UK酶原與氯胺T處理的HSA一起溫育。
7-UK酶原以二聚體形式存在于緩沖液。
8-相同二聚體形式的UK酶原與BSA一起溫育。
9-UK酶原與經(jīng)DTT處理的BSA(恢復(fù)硫醇形式)一起溫育。其中二聚體完全消除，存在有UK酶原BSA復(fù)合物。
圖8A和8B的酶譜表示PDI對(duì)復(fù)合過程的影響。
圖8A中泳道1表示單獨(dú)存在于緩沖液中的酶原酶譜。泳道2，3，4，5，6，7分別是重組UK酶原(0.5μg/ml)與硫醇白蛋白(40mg/ml)一起溫育，時(shí)間分別為0，15分鐘，30分鐘和1小時(shí)，2小時(shí)，4小時(shí)的酶譜。
圖8B中將8A中相應(yīng)的混合物在PDI(920μg/ml)存在時(shí)溫育。
圖9的酶譜表示劑量與形成的復(fù)合物的相關(guān)性中PDI的作用。
泳道1表示UK酶原單獨(dú)存在于緩沖液中。泳道2，3，4，5，6，7表示UK酶原(10μg/ml)和巰基白蛋白(40mg/ml)在PDI濃度分別為0，23，230，460，690，920(μg/ml)時(shí)溫育6hr。
圖10是UK酶原與來自于E。Coli的重組HSA(rec-HSA)形成的復(fù)合物的酶譜。
圖11中泳道1，2，3，4，5，6，7，8，9，10分別表示37℃時(shí)0.5μg/ml的UK酶原在緩沖液中溫育0，6hr，在血漿中溫育0，1hr，4hr，6hr，以及在去除血纖維旦白溶酶原而加入aprotinin(20KIU/ml)的血漿中溫育0，1hr，4hr，6hr后，在37℃的SDS中制得樣品的酶譜。
圖12表示下列樣品的酶譜。
泳道1-表示37℃時(shí)0.5μg/ml UK酶原在緩沖液溫育。
泳道2-表示37℃時(shí)0.5μg/ml的UK酶原與CBS-HSA(40mg/ml)一起溫育。
3-表示UK酶原(0.5μg/ml)在去除HSA的血漿中溫育。
4-表示UK酶原(0.5μg/ml)在去除HSA的血漿中重新補(bǔ)充HSA后溫育。
5-表示血漿與未經(jīng)UK-Ab Sepharose柱過濾的UK酶原一起預(yù)保溫。
6-9分別表示血漿與經(jīng)過UK-Ab Sepharose柱過濾后流出的4個(gè)部分預(yù)培養(yǎng)。
圖13表示下列不同形式的UK(0.5μg/ml)和巰基白蛋白(40mg/ml)預(yù)培養(yǎng)6hr后的酶譜(10%SDS-PAGE)。
泳道1-HMW-UK存在緩沖液中的酶譜。
泳道2-HMW-UK和HSA預(yù)培養(yǎng)。
泳道3-LMW-UK存在于緩沖液中。
泳道4-LMW-UK和HSA一起培養(yǎng)。
泳道5-重組UK酶原與HSA培養(yǎng)。
泳道6-缺失突變型UK酶原存在于緩沖液中。
泳道7-缺失突變型UK酶原與HSA共培養(yǎng)。
圖14是利用UKAb與下列樣品進(jìn)行的Western免疫吸印反應(yīng)。
泳道1-UK酶原(0.3μg/ml)在緩沖液中37℃時(shí)培養(yǎng)7hr。
泳道2-UK酶原與未經(jīng)處理的BSA(40μg/ml)一起溫育。
泳道3-UK酶原與CBS-HSA共溫育。
泳道4-單獨(dú)存在的CBS-HSA泳道5-8表示分別與1-4相同的混和物樣品在還原性條件下培養(yǎng)。
圖15顯示泳道1-表示在緩沖液中培養(yǎng)的UK酶原的酶譜。
2，3分別表示在含有0.5mM和5mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)的緩沖液中培養(yǎng)的UK酶原的酶譜。
4-6分別表示UK酶原在血漿、含有0.5mM和 5mM的GSSG的血漿中培養(yǎng)時(shí)的酶譜。
圖16顯示的酶譜泳道1-5表示UK酶原分別培養(yǎng)于緩沖液、含有10-3M、3×10-3M，6×10-3M，10-2M的DTNB的緩沖液中的酶譜。泳道6-10表示UK酶原分別培養(yǎng)于血漿、含有10-3M、3×10-3M，6×10-3M，和10-2M的DTNB的血漿時(shí)的酶譜。
圖17酶譜表示pH和HSA濃度對(duì)形成復(fù)合物的影響。
泳道1-單獨(dú)存在于緩沖液中的UK酶原的酶譜。
泳道2-6分別表示pH為6，7.0，7.4，8.0，8.5時(shí)5μg/ml的UK酶原與巰基白蛋白(40mg/ml)在37℃時(shí)一起培養(yǎng)24hr后的酶譜。
泳道7-表示標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照泳道8-10表示5μg/mlUK酶原與濃度分別為80mg/ml，20mg/ml，10mg/ml的HSA在37℃pH＝8時(shí)培養(yǎng)24hr的酶譜。
圖18酶譜表示與CBS-HSA相關(guān)的UK活性。
泳道1-其中CBS-HSA來自于與UK酶原(0.5μg/ml)預(yù)培養(yǎng)20hr的血漿。
泳道2-其中CBS-HSA來自于富含(5μg/ml)UK酶原的血漿(但未經(jīng)預(yù)培養(yǎng)處理)泳道3-表示UK復(fù)合物與從新鮮血漿中分離的CBS-HSA發(fā)生免疫沉淀反應(yīng)。
圖19A是包含二組數(shù)據(jù)的曲線圖。X軸上標(biāo)示的二組數(shù)據(jù)表示血漿通過一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)G-75柱凝膠過濾，收集的餾出部分的數(shù)目。Y軸上開環(huán)數(shù)據(jù)表示在280nm的吸收值。Y軸上的閉環(huán)數(shù)據(jù)表示在血纖維旦白的平板上測得的溶解面積(mm2)圖19B顯示收集到的餾出部分(分別與圖11A中的A、B、C、D部分相同)UK免疫沉淀物的酶譜。
本發(fā)明所述的UK酶原白蛋白復(fù)合物具有下列特性1)在37℃的十二烷基磺酸鈉(SDS)中比在100℃時(shí)更穩(wěn)定。2)在還原性條件下不穩(wěn)定。3)用二硫蘇糖醇(DTT)預(yù)處理的HSA(恢復(fù)硫醇形式)可促進(jìn)復(fù)合。4)蛋白二硫同分異構(gòu)酶(PDI)催化復(fù)合反應(yīng)。5)復(fù)合過程受DTNB和GSSG的抑制。復(fù)合物的這些特性暗示在白蛋白的游離半胱氨酸殘基與UK酶原的胱AA殘基之間形成一個(gè)二硫鍵。由于UK酶原發(fā)生缺失突變(丟失了11-135殘基)或存在LMW-UK而不發(fā)生復(fù)合作用的實(shí)驗(yàn)中可推知形成一個(gè)二硫鍵的復(fù)合物中UK酶原的胱AA是在A鏈;很可能就是UK酶原NH2末端的配對(duì)胱AA之一。
純化的HSA貯存很長時(shí)間后，由于游離半胱AA被氧化，阻礙了二硫基交換，導(dǎo)致它與UK酶原形成復(fù)合物的能力喪失。但用DTT處理后能重新獲得與UK酶原結(jié)合的能力。這種處理是在酸性pH值條件下進(jìn)行的，以保證維持HSA旦白質(zhì)構(gòu)型的二硫鍵的完整性。
在下文將詳細(xì)描述本發(fā)明所述的溶解血栓組合物的二種制備方法。每一種方法，首先分別純化UK酶原和白蛋白，然后借助二硫鍵連接結(jié)合(見圖1A和1B)。
第一種方法，根據(jù)Peters，T.在Advances In Protein Chemistry，37∶161-245(1985)提出的方法，在pH＝6.0時(shí)用DTT處理白蛋白，使之恢復(fù)硫醇形式。通過滲析移走DTT，然后在PDI存在條件下，UK酶原與白蛋白結(jié)合。
第二種方法，純UK酶原與硫醇白蛋白在37℃pH＝8.0培養(yǎng)過程中相結(jié)合。
下文描述的第一種方法中，UK酶原是由Collaborative Research Inc.(Bedford，MA)提供的，是從人腎細(xì)胞系培養(yǎng)物基質(zhì)中純化得到的。為抑制微量的UK污染物，UK酶原與20μM丹磺酰一谷氨酸一甘氨酸-精氨酸氯甲基酮(GGACK)在37℃0.1M HEPES，0.2mg/ml BSA，0.001%吐溫，pH＝7.4時(shí)一起培養(yǎng)30分鐘(見Pannell等人在Blood，69∶22-26，1987中的描述)。在下文描述的第二種方法中，UK酶原制劑通過一個(gè)Sephadex G-75柱(1×45cm)過濾，用10mM NaAc，0.1m NaCl，0.001%吐溫pH＝4.8進(jìn)行平衡和洗脫，去除UK酶原二聚體。然后與上面描述的相同方法處理，以抑制微量UK污染物。
從貯存血漿中純化人血清白蛋白(HSA)的過程采用已公開的方法。以0.63%檸檬酸三鈉和0.9%NaCl平衡Cibacron Blue-Sepharose(CBS)柱(1.5×25cm)，將10ml貯存血漿上柱，過濾，當(dāng)在280nm的吸收值小于0.02時(shí)，用0.2M硫氰酸鈉洗脫HSA，然后在蒸餾水中滲析，凍干。
采用分批分離方法制備不含血纖維旦白溶酶原的血漿。先將1ml賴氨酸瓊脂糖和5ml血漿在0.005M HEPES和0.15M NaCl(pH＝7.4)中混勻，然后4℃時(shí)攪拌2hr，離心，取上清，用經(jīng)典的血凝塊溶解技術(shù)，測定上清中血纖維旦白溶酶原含量。
根據(jù)Laemmli描述的方法，進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)其中聚丙烯酰胺凝膠的含量為7.5%。在沒有其他特殊規(guī)定條件下，樣品制備需在非還原條件下進(jìn)行，將樣品與緩沖液(0.06M Tris-HCl，pH＝6.8 2% SDS)一起在37℃加熱37分鐘，然后電泳。電泳結(jié)束后，在2.5% TritonX-100中，洗凝膠，然后按照Wun等人描述的方法將膠鋪在血纖維旦白酶原血纖維旦白瓊脂板上得到酶譜。根據(jù)Towbin和Pluskal等人描述的方法(只在規(guī)格上作些更改)進(jìn)行Western吸印。聚丙烯酰胺凝膠和四張濾紙均勻地浸于吸印緩沖液(39mM甘AA，48mM Tris，20% 甲醇，0.0375%SDS)中平衡。二氟化聚偏乙烯(PVDF)膜預(yù)先在甲醇中浸幾秒鐘，然后在蒸餾水中平衡10分鐘。進(jìn)行吸印反應(yīng)的各個(gè)部件裝配成三明治形狀，在LKB Multipore Ⅱ Semi-dry吸印儀，0.8mA/cm2電流時(shí)電泳轉(zhuǎn)移1hr，然后用TTBS(100mM Tris，0.15M NaCl，0.1% Tween-80，pH＝7.5)洗PVDF膜，10分鐘，再在含3%BSA的TTBS浸1hr。
用第一種方法獲得吸印后的PVDF膜后，經(jīng)過下列兩次培養(yǎng)，然后進(jìn)行免疫著色試驗(yàn)。首先將上述得到的PVDF膜與兔的UK抗抗體(10μg/ml)或HSA的單克隆抗體(以1500稀釋度)在0.25%BSA的TTBS中37℃培養(yǎng)。然后將該膜與羊抗兔或兔抗鼠免疫球旦白(IgG)堿性磷酸酶結(jié)合物(Sigma)(以11000稀釋度)在0.25%BSA的TTBS中37℃時(shí)培養(yǎng)1hr。利用第二種方法獲得的膜，首先在13μg/ml的α(UK)和0.25%BSA的TTBS溶液中37℃培養(yǎng)2hr，然后與堿性磷酸酶結(jié)合物(以1500稀釋度)在0.25%BSA的TTBS中37℃培養(yǎng)2hr。
顏色反應(yīng)是利用5-Br-4-Cl-3-吲哚磷酸甲苯胺鹽(0.15mg/ml)和p-硝基藍(lán)tetrazolium Chloride(0.3mg/ml)在碳酸緩沖液(0.1M碳酸鈉，1mM MgCl2，pH9.8)中進(jìn)行。每次培養(yǎng)后，將PVDF膜在TTBS中洗三次，時(shí)間為10分鐘。最后在碳酸緩沖液中洗15分鐘，然后進(jìn)行顏色反應(yīng)。
按經(jīng)典方法在37℃時(shí)用Kabi底物S2444測定UK酶原/UK酰胺溶解活性。反應(yīng)緩沖液含0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，0.1mg/ml BSA，100μ/ml aprotinin，pH＝8.8，和0.75mM的底物。用1∶1的鹽水5%乙酸終止反應(yīng)，在405nm測定吸收值。血纖維旦白酶原激活因子的活性可用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂血纖維平板或谷氨酸-血纖維旦白酶原和Kabi底物S2251測定。
方法1根據(jù)Peters，T。在Adv，prot，chem，37∶161-245，1985中描述的方法，用10mM二硫基蘇糖醇(DTT)在50mM MES，0.15M NaCl pH＝6.0處理HSA或BSA，以再生硫醇形式HSA和BSA，且從理論上計(jì)算每分子巰基白蛋白應(yīng)含1個(gè)-SH。在pH為5-7時(shí)可保存維持構(gòu)型的二硫鍵。通過滲析移走DTT，在920μg/ml PDI存在時(shí)將5μg/ml UK酶原與一種HSA試劑(40mg/ml)或與BSA，在0.1M HEPES緩沖液(pH＝8.0)中37℃時(shí)至少培養(yǎng)4hr以制備UK酶原白蛋白復(fù)合物。最后將200μl上述混合物通過Sephadex G-75柱(1×45cm)過濾，用0.1M HEPES，pH7.5，0.15M NaCl，0.001%吐溫80，20KIU/ml aprotinin平衡和洗脫，收集0.5ml流出物，測定旦白質(zhì)含量(280nm時(shí)的吸收值)和溶解血纖維旦白的活性，在非還原性條件下，復(fù)合物遷移出表觀分子量約為100KDa的部分(已被定為標(biāo)準(zhǔn))，但在該條件下，復(fù)合物遷移發(fā)生在UK酶原形成二聚體后。因此UK酶原HSA復(fù)合物的實(shí)際分子量約為120KDa。相當(dāng)于120KDa復(fù)合物的3個(gè)流出部分被貯存。
應(yīng)該注意，在培養(yǎng)步驟中使用固定化PDI，而不是PDI溶液。
方法2UK酶原HSA復(fù)合物通過下列步驟制備。5μg/ml UK酶原與40mg/ml HSA在0.1M HEPES緩沖液中37℃培養(yǎng)4hr，然后將200μl該混和物通過Sephadex G-75柱，用0.1M HEPES pH＝7.5，0.15M NaCl，0.001%吐溫80，20KIU/ml aprotinin平衡和洗脫，收集0.5ml流出物，按標(biāo)準(zhǔn)旦白質(zhì)分析方法測定旦白質(zhì)含量，用血纖維旦白平板測得溶解血纖維旦白活性，結(jié)果見圖2，(其中30-31-32流出部分貯存)。
用一種不溶性的多克隆UK抗體識(shí)別UK酶原HSA復(fù)合物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3所示。已純化的UK酶原HSA復(fù)合物與HSA抗抗體在37℃培養(yǎng)1hr，在酶譜上顯示的120KD裂解帶被一條更高分子量的帶所代替，表明復(fù)合物與HSA的抗體結(jié)合(見圖4所示)。同樣，純化的復(fù)合物能結(jié)合到α(HSA)Sepharose柱上。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了復(fù)合物的組成成分。
HSA或BSA經(jīng)長期貯存后，由于游離半胱AA被氧化，使HSA或BSA與UK酶原形成復(fù)合物的能力降低。用5，5′-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)滴定有用的游離半胱AA(處于天然狀態(tài))方法測定不新鮮的商品HSA，結(jié)果表明每10分子商品HSA含1個(gè)游離半胱AA。相反，用上述方法2純化后的新鮮HSA，每2分子含有一個(gè)游離半胱AA，因此，在培養(yǎng)形成復(fù)合物前，建議在pH＝6.0時(shí)用DTT處理HSA和BSA。
pH＝8.0時(shí)對(duì)復(fù)合物形成更有利，圖5所示。在pH＝7.5時(shí)UK酶原與HSA能形成復(fù)合物(如其中3所示)，但在pH＝5或9時(shí)沒有復(fù)合物形成(見2和4所示)。6、7、8分別表示加入50μM Zn2+、5mM Ca2+和Ca2++Zn2+對(duì)復(fù)合物形成沒有影響，但是5-10μM Cu2+抑制復(fù)合物形成。
已發(fā)現(xiàn)在正常血漿中自發(fā)地產(chǎn)生UK酶原HSA復(fù)合物，從正常血漿中純化得到的HSA與UK酶原有關(guān)。因此，UK酶原HSA復(fù)合物天然存在。在這些實(shí)驗(yàn)中，UK酶原與不含血纖維旦白溶酶原的血漿一起培養(yǎng)，血纖維旦白溶酶原激活因子的分子量可用酶譜分析測定。
UK酶原加到500ng/ml的血漿中，在37℃培養(yǎng)1-6hr，在此過程中，其酶促活性的部分以表觀分子量為100KDa(實(shí)際分子量為120KDa)進(jìn)行遷移。圖6顯示遷移的酶譜。其中2-6和8-9分別表示存在于緩沖液中的UK酶原與UK的酶譜。3和8、4、5以及6和9分別表示UK酶原和UK在血漿中培養(yǎng)時(shí)間為0、1、2或6hr的酶譜。在血漿中產(chǎn)生的這種新的高分子量(HMW)譜帶是緩慢的依賴于時(shí)間現(xiàn)象。盡管由酶譜定量只不過是粗略估計(jì)，但從酶譜可大概知道在血漿中培養(yǎng)6hr后，酶活性的10%是由120KD(測得的實(shí)際值)分子產(chǎn)生的。從UK酶原在緩沖液中培養(yǎng)時(shí)沒有HMW裂解帶出現(xiàn)可排除UK酶原二聚體的形成。而且，如果UK酶原二聚體形成，應(yīng)該遷移至復(fù)合物的前面(見圖7、8B、9、10)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)暗示UK酶原結(jié)合一個(gè)分子量約65千道爾頓的血漿旦白形成一個(gè)約120千道爾頓的化合物。
曾在尿和血漿中觀察到由雙鏈UK和一種UK抑制物PAI-3組成的具相同分子量的復(fù)合物。但是，根據(jù)下列理由，說明上述發(fā)現(xiàn)中排除了這種復(fù)合物存在的可能性(1)UK酶原與PAI-3不形成復(fù)合物;(2)UK酶原在血漿中是穩(wěn)定的。在實(shí)驗(yàn)所用濃度時(shí)，UK酶原不會(huì)活化形成雙鏈UK。最后一點(diǎn)，復(fù)合物形成不受加入的UK抑制物(Glu Gly Arg氯甲基酮)、血纖維旦白溶酶原抑制物(aprotinin 20KIU/ml)的抑制或者由于去除血漿中的血纖維旦白溶酶原而阻礙形成。
再者，在UKPAI-1(血纖維旦白溶酶原激活因子抑制劑-1)復(fù)合物的培養(yǎng)和形成過程中活化UK酶原與上述結(jié)果不相符。因?yàn)楹笠环N復(fù)合物遷移的分子量約為95KD，同時(shí)伴隨有分子量約為125KD和155KD的其他抑制劑復(fù)合物的產(chǎn)生。(Kruith of，E.K.O.et al;Blood，64∶907-913(1984))，而且在凝膠頂端存在能與α2-巨球旦白-Ab反應(yīng)的第四種復(fù)合物。而且，為了減少在培養(yǎng)過程中UK酶原活化的可能性，可進(jìn)行附加實(shí)驗(yàn)將aprotinin(20KIU/ml)加入到去除血纖維蛋白酶原的血漿中。這些步驟沒有抑制120KD復(fù)合物的形成(圖11中7-10所示)。
但是，當(dāng)UK酶原與不含HSA的血漿(CBS血漿)培養(yǎng)時(shí)，沒有高分子量的激活因子復(fù)合物產(chǎn)生，如圖3所示。這些結(jié)果證明在血漿中觀察到的復(fù)合物是由UK酶原和HSA結(jié)合形成的。
5μg/ml UK酶原與新鮮純化的CBS-HSA(40mg/ml)在0.1M HEPES pH＝7.4 37℃一起至少培養(yǎng)4hr，用SDS-PAGE和酶譜鑒定該混和物時(shí)，常出現(xiàn)一條分子量約120KD的譜帶(圖12中的2所示)，相反UK酶原在不含CBS的血漿培養(yǎng)時(shí)，沒有復(fù)合物形成(見圖12的3所示)。在不含CBS的血漿中加入足量的CBS-HSA后重新形成復(fù)合物(見圖2中的4所示)。將含有所說復(fù)合物的血漿(圖2的5)通過一個(gè)UK-Ab sepharose柱移走該復(fù)合物(見圖2的6-9所示)。
UK酶原與HSA和BSA的商品制劑一起培養(yǎng)時(shí)也可觀察到復(fù)合物的形成，但必須用DTT預(yù)處理以恢復(fù)硫醇形式。
以UK酶原與CBS-HSA一起培養(yǎng)形成的復(fù)合物可用Sepha-dex G-75凝膠過濾分離，然后用SDS-PAGE方法分析。將樣品煮沸，該復(fù)合物被完全分解，在凝膠酶譜圖上能看到37℃時(shí)只有部分(＜50%)化合物被分解(圖譜資料未列出)。
由于發(fā)現(xiàn)HMW-UK與HSA一起培養(yǎng)時(shí)也形成一種復(fù)合物(見圖13中的2所示)，但HMW-UK在緩沖液中培養(yǎng)時(shí)又不形成該復(fù)合物(圖13的1所示)，因此必須測定由UK和一種抑制物(與HSA在CBS柱上其純化得到)組成的復(fù)合物出現(xiàn)的可能性。
這種復(fù)合物遷移后在酶譜上顯示出的分子是約為120KD，相當(dāng)于UK酶原在血漿中培養(yǎng)時(shí)形成的復(fù)合物(圖13中5所示)。但是LMW-UK(Abbokinase)與HSA培養(yǎng)時(shí)沒有復(fù)合物形成(見圖13的3，4所示)。而且UK酶原的缺失突變體(丟失了第11-135位殘基)與HSA共培養(yǎng)時(shí)也不形成復(fù)合物(圖13的7所示)。這些結(jié)果表明復(fù)合物不是UK抑制物形成的，UK的A鏈參與復(fù)合反應(yīng)，旦白酶的另一條鏈不參與。
為進(jìn)一步排除UK抑制物復(fù)合物形成，用DFP預(yù)處理CBS-HSA，以抑制絲AA旦白酶污染物。DFP處理后不影響CBS-HSA與UK酶原形成復(fù)合物(如圖7中4所示，與2和3相比較)。其次，用能使Serpin s失活的氯胺T處理HSA制劑可排除Serpin污染物(Stief et al.，Biol.Chem，Hoppe-Seyler，369∶1337-1348(1988))。這種處理也不抑制復(fù)合物的形成。因此，觀察到的UK酶原或HMW UK形成的復(fù)合物中沒有抑制劑參與。(圖7的6所示，與5相比較，其中HSA未經(jīng)處理)。
UK酶原與CBS-HSA共培養(yǎng)時(shí)，用UK多克隆抗體進(jìn)行的Western免疫吸印反應(yīng)，產(chǎn)生一條分子量約為120KD的譜帶(見圖14中3所表示)。但如果UK酶原在緩沖液培養(yǎng)(圖14的1所示)或與未經(jīng)DTT預(yù)處理的BSA共培養(yǎng)(圖5的2所示)時(shí)不出現(xiàn)120KD譜帶。作為對(duì)照的CBS-HSA與該抗體不發(fā)生可見的反應(yīng)(見圖14中的4和8)在還原性條件下，分子量約為120KD的復(fù)合物發(fā)生分解，暗示該復(fù)合物是通過二硫鍵連接的(圖14中的7所示)。
有其他證據(jù)證明UK酶原白蛋白復(fù)合物是通過二硫鍵連接的。首先，當(dāng)類似于氧化型谷胱甘肽或DTNB的巰基試劑加到方法2的反應(yīng)混合物中時(shí)，能抑制復(fù)合物形成(下面詳述)。氧化型谷胱甘肽加入血漿中后，在37℃時(shí)反應(yīng)能進(jìn)行2hr。試驗(yàn)結(jié)果見圖15的酶譜，其中1-3表示在緩沖液中培養(yǎng)UK酶原時(shí)的酶譜。UK酶原HSA形成的復(fù)合物隨加入谷胱甘肽濃度的增大而減少，其中2和5表示加入的谷胱甘肽濃度為0.5mM，3和6表示加入谷胱甘肽濃度為5.0mM，如圖15中1-3所示，谷胱甘肽不會(huì)抑制UK酶原的溶解血纖維旦白活性。這種對(duì)谷胱甘肽的響應(yīng)暗示復(fù)合物中包含了白蛋白的游離半胱AA，從而說明UK酶原與HSA是通過二硫鍵連接。同樣，利用能與游離半胱AA反應(yīng)的DTNB進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明DTNB抑制復(fù)合物的形成。圖16是UK酶原培養(yǎng)于緩沖液中的酶譜(其中1-5所示)，其中6-10表示UK酶原與HSA在DTNB存在時(shí)共培養(yǎng)產(chǎn)生的酶譜。其中1和6所用DTNB濃度為0.0M，2和7所用DTNB濃度為1mM，3和8所用DTNB濃度為3mM，4和9所用DTNB濃度為6mM，5和10所用DTNB濃度為10mM。
其次，HSA或BSA的商品試劑與UK酶原形成少量或不形成復(fù)合物。如圖7中的8所示，(只形成一個(gè)UK酶原二聚體)以及圖14中的2所示，而且，與新鮮制劑CBS-HSA發(fā)生絡(luò)合隨著貯存時(shí)間增加而減少。但是，所有這些試劑用DTT處理后重新獲得與UK酶原形成復(fù)合物的能力。DTT對(duì)商品BSA試劑的影響如圖7中的9所示。在pH＝5-7時(shí)用DTT處理恢復(fù)硫醇形式的作用不會(huì)引起結(jié)構(gòu)型二硫鍵的分解，如Peters，T.在Adv.Prot.Chem.，37∶161-245(1985)所描述。因此該結(jié)果表明HSA或BSA中存在的一個(gè)有用的半胱AA巰基是與UK酶原形成復(fù)合物所必需的。
第三，DTNB滴定反應(yīng)表明DTT處理前與處理后，商品HSA中可利用半胱AA比例為0.10.6。處理后的數(shù)據(jù)可與新鮮制備的CBS-HSA相比。因此，HSA試劑中可利用半胱AA數(shù)目與該試劑與UK酶原形成復(fù)合物之間呈正相關(guān)性。
第四，培養(yǎng)混和物含有催化巰基-二硫基轉(zhuǎn)換的PDI(Freed-man，R.B.，Cell，57∶1069-1072(1989);Gilbert，H.F.，Biochem.，28∶7298-7305(1989))存在時(shí)，能加快復(fù)合反應(yīng)速度。如果沒有PDI存在，培養(yǎng)4hr后才能看到形成的復(fù)合物(圖8A所示)，但是在920μg/ml PDI存在時(shí)，培養(yǎng)1hr就能形成復(fù)合物(圖8B)。PDI的作用與它的濃度具相關(guān)性如圖9所示。其中UK酶原(10μμg/ml)與巰基白蛋白試劑(40mg/ml)在PDI濃度為0，23，230，460，680，或920μg/ml時(shí)一起培養(yǎng)6hr。PDI存在時(shí)UK酶原二聚體形成也進(jìn)一步增加(如圖8A，8B和9所示)。表明這些二聚體是通過二硫鍵連接的。所需PDI量越大說明該酶效能越低。
將樣品在SDS中煮沸2分鐘能抑制復(fù)合物形成(圖14中的3所示)，說明存在有在煮沸時(shí)不穩(wěn)定的二硫鍵連接的復(fù)合物。但是在抑制二硫基轉(zhuǎn)換的CuCl2存在時(shí)(CuCl2為1mm)，該復(fù)合物對(duì)沸騰具抗性。Volkin和Klibanov曾報(bào)導(dǎo)某些通過二硫鍵連接的結(jié)合物中二硫鍵在受熱時(shí)分解的特性。(Volkin et al.，J.Biol.Chem.，262∶2945-2950(1987))。
UK酶原的胱AA與白蛋白的未配對(duì)的半胱AA之間通過二硫鍵連接后，使結(jié)合白蛋白的UK酶原具有一個(gè)游離半胱AA。該游離的半胱AA能與另一個(gè)UK酶原分子的胱AA或另一個(gè)白蛋白分子的半胱AA反應(yīng)。在這種情況下，形成的復(fù)合物不是由一分子UK酶原和一分子白蛋白組成，而是二分子UK酶原分子與一分子白蛋白結(jié)合或二分子白蛋白與一分子UK酶原結(jié)合。本發(fā)明已鑒定的這種三者聯(lián)合的復(fù)合物屬于本發(fā)明所述的復(fù)合物范圍內(nèi)。
培養(yǎng)在pH為6-8.5范圍內(nèi)進(jìn)行時(shí)，可看到形成復(fù)合物的最適pH值約為8-8.5(圖17中的1-6所示)。因此，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)是在pH＝8.0時(shí)進(jìn)行。利用HSA試劑與UK酶原的一系列濃度比值范圍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明決定復(fù)合物形成的主要限制因子是HSA濃度，結(jié)果見圖17中的8-10所示。其中與UK酶原(5μg/ml)共培養(yǎng)的用DTT處理過的商品HSA濃度分別為80，20，10mg/ml。UK酶原濃度的提高不會(huì)加強(qiáng)復(fù)合物的形成。而且在過量HSA存在時(shí)，24hr后復(fù)合物形成逐漸達(dá)到停滯狀態(tài)。
上述結(jié)果暗示UK酶原復(fù)合物可能是HSA或BSA制劑中存在的少量污染物。將HSA試劑用DEAE cellulose層析或通過伴刀豆球旦白-A Sepharose過濾除去污染物的方法不會(huì)改變它與UK酶原試劑反應(yīng)的能力。因此，如果是存在有微量的旦白質(zhì)污染物，也只能是糖旦白。除少數(shù)例外(HSA，transthyretin，結(jié)合蛋白質(zhì)維生素A血漿旦白全是糖旦白(Peters，T，adv.prot.Chem.，37∶161-245(1985))。
根據(jù)方法1得到的UK酶原與高度純化的，經(jīng)DTT處理HSA形成的復(fù)合物經(jīng)SDS-PAGE電泳后從凝膠上電洗脫，然后，再次SDS-PAGE電泳。UK-Ab免疫吸印反應(yīng)表明復(fù)合物分子量約為120KD。但是，雖然在大量實(shí)驗(yàn)中這種復(fù)合物可通過HSA多克隆抗體識(shí)別，但在本實(shí)驗(yàn)中用HSA單抗體不能識(shí)別(沒有顯示資料)。這種相矛盾的結(jié)果可以解釋為是由于HSA分子中能被這種單克隆抗體識(shí)別的主要抗原決定基被復(fù)合物掩蓋了。而且，這種相反的發(fā)現(xiàn)說明UK酶原復(fù)合物有可能是存在于HSA或BSA中少量血漿旦白污染物。因此，實(shí)驗(yàn)中可使用來自于E.Coli的重組HSA(rec-HSA)進(jìn)行。這種HSA不含任何血漿旦白污染物。
用DTT處理前(-)和處理后(+)，將Rec-HSA和天然HSA(40mg/ml)分別與UK酶原(5μg/ml)一起培養(yǎng)6hr，對(duì)培養(yǎng)混和物進(jìn)行酶譜分析表明利用天然的或重組的HSA都能形成分子量約為120KD的復(fù)合物(c)，且用DTT預(yù)處理(+)HSA試劑可增加該復(fù)合物的形成。經(jīng)DTT處理后也可促進(jìn)高分子量復(fù)合物(c′)的形成，這種復(fù)合物中與HSA復(fù)合后的UK酶原可能含有未配對(duì)的半胱AA。從圖10可看出，UK酶原二聚體恰好遷移在120KD復(fù)合物之前。
可測定未被結(jié)合的UK酶原不能與HSA一起用CBS親和層析方法純化(用0.5M NaCl充分沖洗柱)。將UK酶原(5μg/ml)加入到血漿中立即進(jìn)行CBS親和層析實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了上述結(jié)論。在這些條件下，洗脫出的HSA在酶譜上不顯示可測定的溶解血纖維旦白活性(如圖18中的2所示)游離的UK酶原逐漸被0.5M NaCl沖洗掉。相反，如果將血漿與UK酶原(5μg/ml)在37℃預(yù)培養(yǎng)20hr，以形成復(fù)合物，經(jīng)CBS純化的HSA的酶譜上顯示出與之相關(guān)的溶解血纖維旦白活性。從這種HSA酶譜上可看到，具有120KD和55KD的兩條遷移譜帶(如圖18中的1所示)。由于游離UK酶原不能進(jìn)行共純化，因此55KD帶有可能是樣品制劑保存在SDS中，HSA復(fù)合物分解而產(chǎn)生的UK酶原的譜帶。
為測定血漿本身含有的UK酶原能否與HSA形成同樣的復(fù)合物，通過CBS層析方法(用0.5M NaCl充分洗滌層析柱)將約600mg的HSA從新鮮血漿中純化。純化后的HSA用葡萄球菌旦白A UK抗抗體吸附劑處理(如前面圖中6-9所示)，然后用以識(shí)別復(fù)合物中的UK酶原。產(chǎn)生的免疫沉淀在SDS樣品緩沖液中煮沸以分解抗原-抗體復(fù)合物。這些條件也引起UK酶原HSA復(fù)合物分解。隨后得到的酶譜出現(xiàn)了55KD裂解帶，暗示在HSA試劑中存在有UK酶原(圖18中的3所示)。由于游離的UK酶原不能用CBS親和層析方法純化，上述結(jié)果也證明在CBS柱上從血漿中分離出的UK酶原已經(jīng)與HSA形成結(jié)合物。因此，在正常血漿中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果和在富含UK酶原的血漿培養(yǎng)6hr或6hr以上后觀察到的結(jié)果相一致。從CBS親和層析方法分離出的UK是一種UK抑制劑復(fù)合物，而不是UK酶原HSA復(fù)合物的可能性幾乎是不存在的，因?yàn)閁K形成的抑制劑結(jié)合物在100℃的SDS中是穩(wěn)定的(Kruithof，Blood，64∶907-913(1984);Cieplak et al.，Thrombos.Haemostas.，53∶36-44(1985);Stump et al.，J.Biol.Chem.，261∶12834-12841(1986))，從而在SDS-PAGE 后遷移的分子量≥95KD。
為了測定血漿本身含有的UK酶原(以復(fù)合物形式存在)的含量，將20ml新鮮血漿(含20KIU/ml aprotinin)通過Sephadex G-75柱過濾。使血漿旦白分解為兩個(gè)主峰值(見圖19A)。在凝膠過濾前以富含UK酶原的血漿樣品校對(duì)過濾柱，37℃預(yù)培養(yǎng)20hr以形成復(fù)合物然后測定游離UK酶原和UK酶原HSA復(fù)合物的位置。在血纖維旦白平板上測定收集到流出物的溶解血纖維旦白的活性(如圖19A所示)。在相應(yīng)于D區(qū)域的112-119號(hào)流出物中發(fā)現(xiàn)有游離UK酶原存在，在對(duì)應(yīng)于B區(qū)域的95-100號(hào)流出物中發(fā)現(xiàn)有UK酶原HSA復(fù)合物存在。
此后，正常血漿用上面所說的Sephadex G-75柱凝膠過濾進(jìn)行分析。血漿本身的溶解血纖維旦白活性可通過免疫沉淀和酶譜分析測定。流出物被分成四批貯存如圖19A所示。圖19B表示能測定的溶解血纖維旦白的活性主要存在于相應(yīng)于具高分子量的流出部分的B貯存部分中。在這些分子中含有洗脫出的UK酶原復(fù)合物(圖19A)。在具更高分子量的A貯存部分中也發(fā)現(xiàn)存在有少量UK活性(如圖19B)。用UK酶原與純化的HSA培養(yǎng)的某些實(shí)驗(yàn)中也會(huì)形成高分子量的UK酶原HSA復(fù)合物(如圖10)，可推斷復(fù)合物中含有多于1分子的HSA或UK酶原。在相當(dāng)于游離UK酶原分子量的D貯存部分沒有UK活性。因此，在血漿中測得的所有UK活性者是以復(fù)合物形式存在的。由于在SDS中制備樣品時(shí)，復(fù)合物發(fā)生分解產(chǎn)生了在酶譜上看到分子量約為55KD的酶帶(如圖19B的酶譜)。因此觀察到的復(fù)合物不是一種UK抑制劑復(fù)合物。這種發(fā)現(xiàn)暗示正常血漿自身所含UK酶原的大部分是以相當(dāng)于由UK酶原與HSA形成復(fù)合物的形式存在的。
假定肝臟中UK酶原分子的UK受體識(shí)別位點(diǎn)掩蔽在本發(fā)明所述的復(fù)合物內(nèi)，因此，結(jié)合態(tài)的UK酶原的半衰期長(幾小時(shí)-幾天)。相應(yīng)的游離UK酶原半衰期只有5-8分鐘。復(fù)合物中的UK酶原的溶解血纖維旦白的特性不受損失，UK酶原白蛋白復(fù)合物有希望成為治療上更合適的溶解血栓藥物。本發(fā)明應(yīng)從實(shí)質(zhì)上減少UK酶原的劑量，不需要不斷的注射，從而促進(jìn)了治療速度。
本發(fā)明所述的UK酶原白蛋白復(fù)合物與其他血纖維旦白酶原激活劑如t-PA，UK，和UK酶原可用于治療相同的癥狀。目的是溶解血管內(nèi)的血凝塊(血栓)?，F(xiàn)代的臨床病癥包括心肌梗塞、深靜脈血栓形成，肺栓塞。本發(fā)明所述的復(fù)合物與合適的生物學(xué)載體基質(zhì)如鹽水相混合，通過靜脈內(nèi)注射引入體內(nèi)。復(fù)合物與t-PA，或與UK酶原具協(xié)同效應(yīng)的物質(zhì)混合后更具優(yōu)點(diǎn)。這種混和物也可通過簡單的靜脈內(nèi)注射引入體內(nèi)，簡化了治療程序，且可以攜帶到家里。t-PA啟動(dòng)溶解反應(yīng)且很快清除，由作用時(shí)間長的UK酶原完成溶解過程。
另外，本發(fā)明的復(fù)合物能用于提高血液本身的溶解血纖維旦白的活性，從而可用于長期抑制與溶解血纖維旦白活性降低有關(guān)的心血管疾病。長期以來，人們認(rèn)為血栓形成是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化病變的致病因素。利用本發(fā)明所述的復(fù)合物以每周或每月進(jìn)行周期性靜脈內(nèi)注射可抑制動(dòng)脈粥樣硬化。
最后，具酶解活性的HMW-UK和白蛋白的復(fù)合物形式也有一定的臨床使用價(jià)值，因?yàn)镠MW-UK是UK酶原的酶活性形式。它能與幾種血漿抑制劑反應(yīng)。因此只有在這些抑制劑被消耗后，才能延長這種復(fù)合物的半衰期，因此這種復(fù)合物由于具有更長的半衰期從而比HMW或LMW-UK具有優(yōu)點(diǎn)，由于半衰期長，降低了費(fèi)用，簡化了治療程序。
實(shí)施例1用于血栓應(yīng)急治療的靜脈內(nèi)注射方法，將5-20mg凍干的UK酶原白蛋白復(fù)合物與鹽水混和，使之進(jìn)入注射器管腔內(nèi)將丸劑注射到病人靜脈內(nèi)。
實(shí)施例2快速溶解冠狀血栓的方法，將5-20mg凍干UK酶原白蛋白復(fù)合物溶于鹽水中，與2mg UK一起注射。UK可加快溶解啟動(dòng)。由于復(fù)合物半衰期長，因而可抑制血栓的重新形成，又可完全溶解已形成的血栓。
實(shí)施例3治療深血管血栓、肺血栓時(shí)，將5-20mg凍干UK酶原白蛋白復(fù)合物溶于鹽水中，靜脈注射，如果需要可重復(fù)注射，所用的幾種注射劑量不會(huì)產(chǎn)生非特異性的血纖維旦白酶原的活化。
實(shí)施例4t-PA與凍干UK酶原白蛋白復(fù)合物組成的協(xié)同結(jié)合物通過靜脈注射治療血栓時(shí)，將5-20mg t-PA與5-20mg UK酶原白蛋白復(fù)合物混和，通過簡單的靜脈注射引入體內(nèi)，t-PA將很快被清除，而復(fù)合物將留在血液循環(huán)中，以完全溶解血栓，抑制血栓再形成，不降低特效。
實(shí)施例5快速溶解冠狀血栓的另一種方法，將約5-20mg凍干UK酶原白蛋白復(fù)合物與大約30mg/hr凍干t-PA溶于鹽水中一起注射。
實(shí)施例6由于UK酶原白蛋白復(fù)合物具有特長的半衰期，因而可用于抑制血栓的形成。用于這種治療時(shí)，只需使用小劑量，如每星期1-5mg。
實(shí)施例7活化的HMW-UK白蛋白復(fù)合物是HMW或LMW-UK的更經(jīng)濟(jì)的取代物。
實(shí)施例8治療深血管血栓，大約5-20mg凍干UK酶原HSA復(fù)合物溶于鹽水中，單獨(dú)或與t-PA一起注入體內(nèi)。
實(shí)施例9對(duì)反復(fù)無常的心絞病或即將發(fā)生的心肌梗塞的治療，用5-10mg UK酶原HSA復(fù)合物丸藥靜脈注射。用于這方面治療時(shí)，具有長半衰期的血纖維旦白激活劑特別有用，因?yàn)樗谂R床使用時(shí)能維持幾天。
實(shí)施例10用另外的血纖維溶酶旦白酶原激活劑在percutaneous transluminal血管成形術(shù)的或急性的溶解血栓的治療之后以預(yù)防血栓的再形成。只需相對(duì)低劑量本發(fā)明所述的UK酶原HSA復(fù)合物就足夠了。例小于10mg。
實(shí)施例11用于血纖維旦白溶解活性受抑制而產(chǎn)生的心血管病變的預(yù)防。利用該復(fù)合物周期性地注射可提高溶解血纖維旦白活性。例如每月注射1-5mg UK酶原與HSA的復(fù)合物。
權(quán)利要求
1.一種純化的血纖維旦白溶酶原激活復(fù)合物，其特征在于由純尿激酶原通過一個(gè)二硫鍵與人血清白蛋白共價(jià)結(jié)合產(chǎn)生的。該二硫鍵是由所說的UK酶原的一個(gè)AA殘基的一個(gè)S原子與所說的人血清白蛋白的一個(gè)AA殘基的一個(gè)S原子形成的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說的激活復(fù)合物，其中所說的二硫鍵連接是在所說的人血清白蛋白的一個(gè)半胱AA殘基和所說的UK酶原的一個(gè)胱AA殘基之間形成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所說的激活復(fù)合物，其中所說的UK酶原的胱AA殘基是在A鏈UK酶原的氨基末端。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所說的激活復(fù)合物，其中所說的二硫鍵連接形成是在旦白質(zhì)二硫同分異構(gòu)酶(PDI)存在時(shí)發(fā)生。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所說的激活復(fù)合物，其中所說的復(fù)合物是指與(存在于健康人體血液中)UK酶原和人血清白蛋白形成的復(fù)合物具相同的分子結(jié)構(gòu)的復(fù)合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所說的激活復(fù)合物，其中所說的二硫鍵連接是與人血清白蛋白相同半胱AA殘基和UK酶原相同胱AA殘基之間形成的，如在健康人體血液中的UK酶原HSA復(fù)合物中形成的二硫鍵。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的激活復(fù)合物，其中所說的UK酶原是指重組產(chǎn)生的UK酶原。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的激活復(fù)合物，其中所述的UK酶原和人血清白蛋白是重組產(chǎn)生的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的激活復(fù)合物，其中所說的UK酶原是具溶解血纖維旦白活性的UK酶原片段，在UK酶原肽鏈氨基末端的11，31，33，39，51，53或63位任一氨基酸含有一個(gè)半胱AA殘基。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所說的激活復(fù)合物，其中所說的UK酶原是指具溶解血纖維旦白活性的尿激酶酶原形式，含有相當(dāng)尿激酶的第1-45位氨基酸殘基的一條AA鏈。
11.權(quán)利要求1所述激活復(fù)合物組成治療組合物，特征是與一種藥理學(xué)上可接受的載體基質(zhì)相混和。
12.溶解病人體內(nèi)血栓的治療方法，包括將一定的溶解血栓劑量的權(quán)利要求11所說的藥劑組合物引入病人體內(nèi)。
13.病人體內(nèi)心血管病變?nèi)缰鄻觿?dòng)脈硬化癥的治療或預(yù)防方法，包括將一定劑量的權(quán)利要求11所說的藥劑組合物引入病人體內(nèi)，使病人體內(nèi)溶解血纖維旦白活性水平有足夠的提高。
14.制備權(quán)利要求1所說的溶血栓激活劑復(fù)合物的方法，包括在合適的條件下培養(yǎng)純?nèi)搜灏椎鞍缀图兡蚣っ?，給以足夠時(shí)間形成所說的復(fù)合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其特征進(jìn)一步包括以二硫蘇糖醇預(yù)處理人血清白蛋白，使之恢復(fù)硫醇形式。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的方法，其特征還包括在培養(yǎng)過程中加入旦白質(zhì)二硫同分異構(gòu)酶。
全文摘要
一種尿激酶酶原復(fù)合物，由尿激酶酶原通過一個(gè)二硫鍵與人血清白蛋白共價(jià)連接形成，該復(fù)合物激活血纖維蛋白溶酶原溶解血纖維蛋白該復(fù)合物在血漿中半衰期比UK酶原本身更長。
文檔編號(hào)A61P7/02GK1049865SQ90103940
公開日1991年3月13日 申請日期1990年4月13日 優(yōu)先權(quán)日1989年4月13日
發(fā)明者維克托·古列維奇, 杰羅米·布雷頓 申請人:血管實(shí)驗(yàn)室有限公司