本發(fā)明屬于藥用活性成分提取分離技術(shù)及食品、藥品用途技術(shù)領(lǐng)域，涉及黃毛草莓黃酮類物質(zhì)的提取、分離制備方法。制備得到的黃毛草莓正丁醇提取物可以降低血糖、改善糖尿病引起的消瘦、改善糖尿病“三多”癥狀、修復(fù)聽力損傷。

背景技術(shù)：

黃毛草莓為薔薇科草莓屬植物，別名銹毛草莓、白草莓，生長在海拔700-3000m的山坡草地或溝邊林下，資源豐富，分布于我國云南、廣西、四川、貴州等地，有清熱解毒、活血祛瘀的功效，具有較好的藥用價值。糖尿病是一種由遺傳或后天胰島素分泌缺陷引起的以糖代謝紊亂及高血糖為特征的代謝性疾病。糖尿病患者伴隨著血糖持續(xù)升高，體重急劇減輕，肝、腎、胰功能異常。另外，糖尿病患者紊亂的代謝往往會產(chǎn)生大量氧自由基，造成其它并發(fā)癥的產(chǎn)生。目前還未見有黃毛草莓具有降低血糖、改善糖尿病引起的消瘦、改善糖尿病“三多”癥狀、修復(fù)聽力損傷的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明首次提出黃毛草莓正丁醇提取物的提取方法，以黃毛草莓為原料，使用乙醇-正丁醇萃取，來制備黃毛草莓正丁醇提取物。本發(fā)明的方法操作簡單，制備得到的黃毛草莓提取物具有明顯降低血糖的作用。

本發(fā)明提供的黃毛草莓正丁醇提取物的制備方法，所述方法包括以下步驟：

(1)將黃毛草莓干燥后切碎，使用乙醇浸提，得到黃毛草莓乙醇浸提物；

(2)將步驟(1)中的黃毛草莓浸提物蒸發(fā)后，過濾取上清，得到黃毛草莓乙醇粗提物；

(3)將步驟(2)中的黃毛草莓乙醇粗提物與足量正丁醇混合后浸提，得到黃毛草莓正丁醇浸提物；

(4)將步驟(3)中的黃毛草莓正丁醇浸提物蒸發(fā)，待正丁醇揮發(fā)干凈后，得到黃毛草莓正丁醇提取物，稀釋后使用。

步驟(1)中，所述干燥的溫度為25-37℃；優(yōu)選地，為32℃。

步驟(1)中，所述乙醇濃度為50％-95％(體積分?jǐn)?shù))；優(yōu)選地，為75％。

步驟(1)中，所述浸提的溫度為18-32℃；優(yōu)選地，為25℃(室溫)。

步驟(1)中，所述浸提的時間為2-4h；優(yōu)選地，為3h。

步驟(1)中，所述黃毛草莓與乙醇的用量比為(6-20)g：(300-600)ml；優(yōu)選地，為6g：400ml。

步驟(1)中，所述黃毛草莓，包括黃毛黃毛草莓植物的根、莖、葉或其混合物。

步驟(2)中，所述蒸發(fā)可采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)。

步驟(2)中，所述蒸發(fā)的時間為1-2小時；優(yōu)選地，為1.5小時。

步驟(2)中，所述蒸發(fā)溫度為35℃-45℃；優(yōu)選地，為40℃。

步驟(2)中，所述黃毛黃毛草莓乙醇粗提物物的生藥濃度可以為0.5g/ml；其中，所述生藥濃度是指蒸發(fā)所得原液濃度。

步驟(2)中，優(yōu)選在真空下條件下進(jìn)行。

步驟(3)中，正丁醇的用量是黃毛草莓乙醇粗提物的15～20倍(v/v)。

步驟(3)中，所述浸提的溫度為18-32℃；優(yōu)選地，為25℃(室溫)。

步驟(3)中，所述浸提的時間為2-4h；優(yōu)選地，為3h。

步驟(3)中，所述正丁醇可以由乙酸乙酯替代。

步驟(4)中，所述蒸發(fā)可采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)。

步驟(4)中，優(yōu)選在真空下條件下進(jìn)行。

步驟(4)中，所述蒸發(fā)的溫度為50℃-65℃；優(yōu)選地，為60℃。

步驟(4)中，所述蒸發(fā)的時間為1-2小時；優(yōu)選地，為1.5小時。

步驟(4)中，通常情況下，當(dāng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中所剩黃毛草莓正丁醇提取物的體積與黃毛草莓乙醇粗提物體積相同時，正丁醇即揮發(fā)完全。

步驟(4)中，所述稀釋的濃度可以為：0.4g/ml和0.8g/ml等。

步驟(4)中，所述黃毛黃毛草莓正丁醇提取物的有效成分為黃酮類物質(zhì)，結(jié)構(gòu)與野黃岑苷相似。

步驟(4)結(jié)束后，還可以包括步驟(5)：將步驟(4)中的正丁醇提取液進(jìn)行冷凍干燥，得到黃毛草莓提取物干粉。

本發(fā)明中，黃酮類物質(zhì)易溶于乙醇及正丁醇中，溶于乙醇后，蒸發(fā)乙醇，即得到黃酮類物質(zhì)及其它可溶于乙醇類物質(zhì)，進(jìn)一步使用正丁醇提取，可將部分溶于乙醇但不溶于正丁醇雜物除去。

本發(fā)明還提供了一種黃毛草莓正丁醇提取物或其干粉，通過對黃毛草莓正丁醇提取物或其干粉進(jìn)行活性成分分析，所述黃毛草莓提取物的主要成分為與野黃岑苷結(jié)構(gòu)類似的黃酮類化合物。

本發(fā)明還提供了一種由上述方法制備得到的黃毛草莓正丁醇提取物或其干粉，所述黃毛草莓正丁醇提取物或其干粉的主要成分為黃酮類化合物。其中，野黃岑苷結(jié)構(gòu)如下式(i)所示：

本發(fā)明還提供了一種黃毛草莓正丁醇提取物有效成分的鑒定及分離方法，包括以下步驟：

(a)將上述方法步驟(5)制備的黃毛草莓提取物干粉溶解于酒精，加入相應(yīng)試劑定容后測吸光度，參照標(biāo)準(zhǔn)品測定干粉總黃酮含量。

(b)步驟(a)中黃毛草莓黃酮粗制品溶解于甲醇，使用薄層層鑒定其種類。

(c)步驟(5)中黃毛草莓黃酮粗制品hplc分析并收集有效成分

步驟(a)中，所述干粉溶解于60％乙醇中，與nano2(5％)混合(體積比為500:1)，6min后，加入1ml10％alcl3和10mlnaoh(1m)，最后將混合物用60％乙醇定容至25ml，搖勻，放置15min。

步驟(a)中，所述吸光度于500nm波長處測定。

步驟(a)中，所述標(biāo)準(zhǔn)品為蘆丁。

步驟(c)中，所述hplc色譜柱為：eclipsexdb-c18(4.6×250mm,5mm)，流動相：甲醇-0.06％磷酸溶液(50：50)，流速：1ml/min，檢測波長：360nm，柱溫：25℃，進(jìn)樣量：10ml。

步驟(c)中，所述標(biāo)準(zhǔn)品為野黃岑苷。

步驟(c)中，所述樣品及標(biāo)準(zhǔn)品用微孔濾膜過濾2次后使用。

本發(fā)明提供了所述黃毛草莓正丁醇提取物在制備降血糖相關(guān)的食品/保健品和藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了所述黃毛草莓正丁醇提取物在制備改善糖尿病引起消瘦的食品/保健品和藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了所述黃毛草莓正丁醇提取物在制備改善糖尿病“三多”癥狀的食品/保健品和藥物中的應(yīng)用。所述三多是指多飲、多食、多尿。

本發(fā)明提供了所述黃毛草莓正丁醇提取物在制備保護聽力、修復(fù)聽力損傷的食品/保健品和藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明制備黃毛草莓正丁醇提取物的方法操作簡單，得到的黃毛草莓提取物的重要成分是黃酮類化合物，其結(jié)構(gòu)與野黃岑苷相似。本發(fā)明方法制備的黃毛草莓提取物對stz誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖升高具有顯著的降低作用，其濃度越高，降低作用越明顯。本發(fā)明方法制備的黃毛草莓提取物對stz誘導(dǎo)的糖尿病小鼠體重減輕、多食多飲多尿的“三多”癥狀有顯著的緩解作用，其濃度越高，降低作用越明顯。本發(fā)明方法制備的黃毛草莓提取物對聽力損傷小鼠聽覺能力具有顯著的恢復(fù)作用，其濃度越高，降低作用越明顯。

附圖說明

圖1為實施例3黃毛草莓正丁醇提取物對stz小鼠空腹血糖值的影響。

圖2為實施例4黃毛草莓正丁醇提取物對stz小鼠體重、飲水、攝食量的影響；a為黃毛草莓正丁醇提取物對stz小鼠飲水量的影響；b為黃毛草莓正丁醇提取物對stz小鼠體重的影響；c為黃毛草莓正丁醇提取物對stz小鼠體重攝食量的影響。

圖3為實施例5蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖4為薄層層析圖；其中，1.槲皮素，2.野黃岑苷，3.川陳皮素，4.樣品液。

圖5為野黃岑苷和黃毛草莓正丁醇提取物的hplc結(jié)果圖；a為野黃岑苷，b為黃毛草莓正丁醇提取物。

具體實施方式

結(jié)合以下具體實施例和附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實施本發(fā)明的過程、條件、實驗方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。

實施例1黃毛草莓正丁醇提取物的制備

將黃毛草莓干燥全株(包括根、莖、葉)切碎，75％乙醇400ml室溫下浸提3小時后，全部轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，真空下蒸煮1.5h，過濾取上清液，制成生藥濃度為0.5g/ml的黃毛草莓乙醇粗提物。

將黃毛草莓乙醇粗提物與足量正丁醇混合后室溫浸提3h，轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，60℃真空下蒸煮，將正丁醇揮發(fā)凈，得到黃毛草莓正丁醇提取物。

將黃毛草莓正丁醇提取物冰凍后轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機，得到黃毛草莓黃酮干粉。

實施例2stz誘導(dǎo)的糖尿病小鼠(stz小鼠)模型構(gòu)建

小白鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(stz)建立1型糖尿病模型。均按10ml·kg^-1體積注射，正常對照組注射ph4.6枸櫞酸鈉緩沖溶液，模型組按40mg·kg^-1劑量注射0.4％stz-枸櫞酸鈉溶液，1次/d，連續(xù)注射5d，stz注射14天后模型穩(wěn)定，連續(xù)禁食6小時測得空腹血糖值＞12mmol·l^-1視為造模成功，小于此值則棄去。

實施例3黃毛草莓正丁醇提取物對stz小鼠空腹血糖的影響

各組小鼠均按10ml·kg^-1體積灌胃，正常組和模型組灌胃蒸餾水，低劑量組、高劑量組分別按0.4g·ml^-1和0.8g/ml灌胃黃毛草莓正丁醇提取物，1次/d，共4周。每周測定小鼠血糖，禁食6h后尾靜脈采血，測定空腹血糖。

實驗結(jié)果如圖1所示，黃毛草莓正丁醇提取物能顯著降低糖尿病小鼠空腹血糖值，且濃度越高效果越明顯。結(jié)果表明黃毛草莓正丁醇提取物具有降低空腹血糖的作用。

實施例4黃毛草莓正丁醇提取物對糖尿病小鼠體重、攝食、飲水量的影響

按實施例3的方法處理后，分別測定小鼠的體重、攝食、飲水量；實驗結(jié)果如圖2所示，黃毛草莓正丁醇粗提物能有效改善糖尿病小鼠體重減輕的癥狀，明顯改善其“三多”癥狀。結(jié)果說明黃毛草莓提取物具有增高糖尿病小鼠體重，改善其多飲多食的作用.

實施例5黃毛草莓正丁醇提取物干粉的成分分析

精密稱取實施例1制備的黃毛草莓提取物干粉溶解于60％酒精中，取500ml與1mlnano2(5％)混合，6min后，加入1ml10％alcl3和10mlnaoh(1m)，最后將混合物用60％乙醇定容至25ml，搖勻，放置15min，在500nm波長處測量吸光度，以60％乙醇為空白對照組，蘆丁為參照標(biāo)準(zhǔn)品，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)定干粉總黃酮含量。圖3為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，y＝3.9064x+0.0021，r²＝0.9991。

黃毛草莓正丁醇提取物干粉與香草醛冰醋酸(5％,w/v,0.5ml)、1ml高氯酸混合，60℃孵育10min后，冰浴15min，然后加入5ml冰醋酸混勻，6min后在538nm波長下讀取吸光度。以熊果酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)曲線定干粉總?cè)坪俊?/p>

實驗結(jié)果如表1所示，黃毛草莓正丁醇提取物干粉的主要成分為黃酮類化合物。

表1.黃毛草莓正丁醇提取物干粉有效降糖成分檢測

實施例6黃毛草莓正丁醇提取物中黃酮種類鑒定

1)使用顯色反應(yīng)確定黃酮種類。

樣品液的顯色反應(yīng)：取2ml實施例1制備的黃毛草莓正丁醇提取物于試管中，在波長254nm紫外燈下觀察，記錄顏色。再用玻璃棒蘸取少許樣品液與濾紙上，進(jìn)一步確定顏色并記錄。

氨水反應(yīng)：取2ml樣品液及2ml氨水于試管中，混勻，在254nm紫外燈下觀察。以下步驟同樣品液的顯色反應(yīng)。

氫氧化鈉反應(yīng)：取2ml樣品液及2mlnaoh溶液于試管中，混勻，在254nm燈下觀察。以下步驟同樣品液的顯色反應(yīng)。

三氯化鋁反應(yīng)：取2ml樣品液與2ml1％的三氯化鋁乙醇液，混勻，在254nm處觀察。以下步驟同樣品液的顯色反應(yīng)。

2)使用薄層層析分析黃酮種類

用甲醇配制2mg/ml的黃毛草莓正丁醇提取物、野黃岑苷、川陳皮素、蘆丁、槲皮素對照品溶液備用。選用不同展層體系，如表2。用毛細(xì)管分別吸取樣品與對照品溶液，滴加到硅膠板上，吹風(fēng)機吹干，反復(fù)點樣三次。點樣后將硅膠板放置于含展層劑的展層缸中，于紫外觀測儀下觀察、記錄，計算rf值。

rf＝x/l

式(ii)

式(ii)中，x為分離出的黃酮類化合物移動距離(cm)；l為展開劑移動的距離(cm)。

薄層層析展開系統(tǒng)如表2所示；薄層層析結(jié)果如圖4所示，其中，1.槲皮素，2.野黃岑苷，3.川陳皮素，4.樣品液；由圖4可以看出，本發(fā)明的黃毛草莓正丁醇提取物和野黃岑苷移動距離最為相近，經(jīng)過計算其rf值即可得知，黃毛草莓正丁醇提取物和野黃岑苷結(jié)構(gòu)相似，表4進(jìn)一步說明兩者結(jié)構(gòu)相似。

顯色反應(yīng)實驗結(jié)果如表3所示，黃毛草莓正丁醇提取物中黃酮類化合物種類可能是黃酮、黃酮醇或異黃酮。

薄層層析實驗結(jié)果如表4所示，樣品液rf值為0.35時與野黃岑苷相同，且在紫外照射下呈現(xiàn)黃綠色熒光，故樣品中含有黃酮及黃酮醇類化合物，且結(jié)構(gòu)與野黃岑苷相同或相似。

表2.薄層層析展開系統(tǒng)

表3.黃酮類化合物的顯色反應(yīng)

表4.黃酮類化合物的rf值

實施例7高效液相色譜法分析黃毛草莓正丁醇提取物中的黃酮種類

高效液相色譜參數(shù)為：色譜柱：eclipsexdb-c18(4.6×250mm,5μm)，流動相：甲醇-0.06％磷酸溶液(50：50)，流速：1ml/min，檢測波長：360nm，柱溫：25℃，進(jìn)樣量：10μl。將樣品及標(biāo)準(zhǔn)品用微孔濾膜過濾2次后使用。

以野黃岑苷為標(biāo)準(zhǔn)品，對實施例1制備的黃毛草莓正丁醇提取物進(jìn)行分析。

實驗結(jié)果如圖5所示，其中a為野黃岑苷結(jié)果圖，b為黃毛草莓正丁醇提取物結(jié)果圖。在360nm下基線平穩(wěn)，野黃岑苷保留時間5.296min，樣品液在5.258、5.727min有兩個峰，與野黃岑苷保留時間相近，兩者合計峰面積比例為64.5％，占粗提物主要成分。表明黃毛草莓正丁醇提取物中含有與野黃岑苷結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)，可以收集本分離條件下收集5-6min洗出液，為黃毛草莓有效降糖成分。目前野黃岑苷降血糖及保護肝臟作用還未有報道。

實施例8聽力損傷小鼠模型的構(gòu)建

50只昆明小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機選擇10只作為正常組，其余小鼠暴露于4～45khz，110dbspl的白噪聲中，每日暴露9h，共暴露10d，耳廓反射，即耳廓豎起以適應(yīng)尖銳聲音的現(xiàn)象消除后，將其隨機分為模型組，鹽酸氟桂利嗪組、低劑量組、高劑量組。

實施例9黃毛草莓正丁醇提取物對小鼠聽覺能力的影響

各組小鼠均按10ml·kg^-1體積灌胃，正常組和模型組灌胃蒸餾水，鹽酸氟桂利嗪組灌胃1.5x10^-3g·kg^-1，低劑量組和高劑量組灌胃0.4g·kg^-1和0.8g·kg^-1實施例1制備的黃毛草莓正丁醇提取物1次/d，共4周。灌胃結(jié)束后，測各組小鼠耳蝸電圖(ecochg)，聽性腦干反應(yīng)(abr)。

小鼠腹腔注射4mg/kg苯巴比妥鈉液進(jìn)行麻醉，采用yssd-1000多功能誘發(fā)電位儀，刺激聲為短波，聲壓級90db，靈敏度6.2uv,帶通頻率100～1000hz,進(jìn)行abr及ecochg實驗。記錄小鼠雙耳各波潛伏期、波間期和復(fù)合動作電位(cap)振幅變化。

對cap振幅的影響結(jié)果如表5所示，與模型組相比，黃毛草莓正丁醇提取物組(低劑量組和高劑量組)cap振幅明顯上升。結(jié)果說明黃毛草莓正丁醇提取物能顯著恢復(fù)小鼠聽力損傷，且濃度越高效果越明顯。

對潛伏期和波間期的影響結(jié)果如表6所示，與模型組相比，黃毛草莓正丁醇提取物組(低劑量組和高劑量組)i、iii波潛伏期和i-iv、i-v波間期均有顯著恢復(fù)。說明實施例1制備的黃毛草莓正丁醇提取物能明顯改善聽覺中樞功能。結(jié)果表明黃毛草莓正丁醇提取物對噪聲性聽力損傷具有治療作用。

表5.實施例1黃毛草莓正丁醇提取物對cap振幅的影響(n＝10)

注：與模型組相比，^*p＜0.05，^*＊p＜0.01

表6.實施例1黃毛草莓正丁醇提取物對潛伏期和波間期的影響(n＝10)

注：與模型組相比，^*p＜0.05，^*＊p＜0.01

本發(fā)明的保護內(nèi)容不局限于以上實施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護范圍。