本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及丹參地上莖葉部分中總丹參酮、總丹酚酸以及多糖的聯(lián)合提取工藝以及利用提取有效成分剩下的丹參藥渣發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法。

背景技術(shù)：

丹參(salviamiltiorrhizabge.)是雙子葉唇形科植物，是最常用的活血化瘀中藥之一，具有祛瘀止痛、養(yǎng)血安神的功效。傳統(tǒng)藥用部位為根，一般棄去地上莖葉部位，不僅浪費(fèi)了大量資源，而且容易引起環(huán)境污染。研究表明，丹參莖葉中含有豐富的丹酚酸類、糖類等化學(xué)物質(zhì)，以及少量的丹參酮類化合物，具有抗病毒、抗腫瘤、抑菌、抗炎、抗氧化等生物活性。研究人員對(duì)丹參中的總丹參酮、總酚酸、多糖進(jìn)行了提取、純化和某些應(yīng)用研究。徐艷等用采用回流提取及超聲方法對(duì)丹參中的總丹參酮提取工藝進(jìn)行研究研究；薛治浦等用乙醇溶液/超聲輔助對(duì)丹參中的總酚酸提取工藝進(jìn)行研究；包華音等用回流提取及超聲方法研究了丹參多糖的提取工藝。但從丹參中聯(lián)合提取總丹參酮、總酚酸和多糖工藝未見報(bào)道。

此外，藥用植物丹參莖葉提取有效成分后其殘?jiān)ǔ１粡U棄，同樣會(huì)造成極大的資源浪費(fèi)及生態(tài)環(huán)境污染。實(shí)際上，丹參殘?jiān)泻胸S富的營(yíng)養(yǎng)成分，如粗蛋白、纖維素等。

因此，目前亟需研究一種丹參地上莖葉綜合利用的方法，為丹參的綜合利用提供一條新途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

由于現(xiàn)有技術(shù)中的傳統(tǒng)單一成分的提取工藝沒(méi)有充分利用原料，本發(fā)明嘗試采用體積分?jǐn)?shù)由高至低的單一乙醇溶液為溶劑，依次從丹參中聯(lián)合提取總丹參酮、總酚酸和多糖。由于超聲波輔助提取法具有方便、快速、簡(jiǎn)單、安全、易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明主要探討超聲波對(duì)丹參中總丹參酮、總丹酚酸和多糖聯(lián)合提取的影響，并應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)超聲波提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步提高丹參有效成分的利用率提供科學(xué)依據(jù)。因此，本發(fā)明的目的是解決傳統(tǒng)單一成分提取方法原料沒(méi)有充分利用的問(wèn)題，并解決中草藥藥渣污染環(huán)境的問(wèn)題。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種丹參地上莖葉部分綜合利用的方法，包括以下步驟：

(1)丹參地上莖葉中總丹參酮、總酚酸和多糖的聯(lián)合提?。?/p>

1)總丹參酮的提?。?/p>

將丹參地上莖葉進(jìn)行粉碎，然后采用乙醇溶液進(jìn)行超聲波提取，提取后固液分離，得到藥渣1和含有總丹參酮的提取液；

其中，提取的工藝參數(shù)為：乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為85～89％，液料比為40～42：1，提取溫度為48～52℃；

2)總酚酸的提?。?/p>

將藥渣1采用乙醇溶液進(jìn)行超聲波提取，提取后固液分離，得到藥渣2和含有總酚酸的提取液；

其中，提取的工藝參數(shù)為：乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為40～45％，液料比為20～25：1，提取溫度為40～45℃；

3)多糖的提取：

將藥渣2采用乙醇溶液進(jìn)行超聲波提取，提取后固液分離，得到藥渣3和含有多糖的提取液；

(2)丹參內(nèi)生白黃小脆柄菇菌株菌種活化、液體發(fā)酵種子液制備：

將白黃小脆柄菇接種于固體馬鈴薯綜合培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，然后接種到液體培養(yǎng)基上，震蕩培養(yǎng)后作為種子液；

(3)白黃小脆柄菇固態(tài)發(fā)酵藥渣3產(chǎn)纖維素酶：

將藥渣3過(guò)篩，加水，浸泡設(shè)定時(shí)間，滅菌冷卻，制成固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；然后接種白黃小脆柄菇種子液后進(jìn)行培養(yǎng)，用來(lái)提取纖維素酶；

(4)纖維素酶粗酶液的制備：

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵培養(yǎng)物干燥、粉碎過(guò)篩，然后加入乙酸-乙酸鈉緩沖液，在恒溫35～40℃下提取1～1.5h，提取后的提取液經(jīng)離心，得到上清液，即為粗酶液。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案的有益效果如下：

(1)本發(fā)明采用體積分?jǐn)?shù)由高至低的單一乙醇溶液為溶劑，依次從丹參中聯(lián)合提取總丹參酮、總酚酸和多糖，采用此順序依次提取這三種有效成分，使得丹參中的有效成分得到了充分的利用，綠色環(huán)保，無(wú)污染，溶劑還可回收再用，節(jié)約成本。

(2)本發(fā)明采用體積分?jǐn)?shù)由高至低的單一乙醇溶液為溶劑，研究摸索得到對(duì)提取率有重要影響的因素，篩選優(yōu)化得到一組使得各個(gè)有效成分提取率均較高的工藝參數(shù)，包括乙醇的體積分?jǐn)?shù)、液料比和溫度。

(3)本發(fā)明采用了體積分?jǐn)?shù)由高至低的單一乙醇溶液為溶劑聯(lián)合超聲波提取的方法，高效提取得到三種有效成分，相比于現(xiàn)有技術(shù)的提取工藝，該工藝簡(jiǎn)單、成本較低、提取率較高；與單一提取工藝相比，原料得到了充分利用，可大大提高原料利用率，可為丹參的工業(yè)化生產(chǎn)鑒定理論基礎(chǔ)。

(4)本發(fā)明將丹參地上莖葉部分提取完總丹參酮、總丹酚酸以及多糖后剩下的殘?jiān)鼮榈孜铮捎脙?nèi)生白黃小脆柄菇bdf15固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，由于利用了合理的發(fā)酵工藝，使得粗酶液的活力較高，這不但具有一定的經(jīng)濟(jì)效益，還可以避免丹參殘?jiān)鼛?lái)的環(huán)境污染，另外還可使丹參殘?jiān)蔀槔w維素酶生產(chǎn)的新來(lái)源，為丹參的綜合利用提供一條新途徑。

附圖說(shuō)明

構(gòu)成本發(fā)明的一部分的說(shuō)明書附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。

圖1是丹參酮ⅱa對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2a～圖2d是因素間交互作用對(duì)總丹參酮提取率的影響圖。其中，圖2a.乙醇體積分?jǐn)?shù)和溫度的3d交互圖；圖2b.乙醇體積分?jǐn)?shù)和溫度的等高線圖；圖2c.液料比和溫度的3d交互圖；圖2d.液料比和溫度的等高線圖。

圖3是丹酚酸b對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖4a～圖4b是乙醇體積分?jǐn)?shù)和溫度交互作用對(duì)總酚酸提取率的影響圖。其中，圖4a.乙醇體積分?jǐn)?shù)和溫度的3d交互圖；圖4b.乙醇體積分?jǐn)?shù)和溫度的等高線圖。

圖5是多糖樣品測(cè)定中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖6a～圖6b是乙醇體積分?jǐn)?shù)和溫度交互作用對(duì)多糖提取率的影響圖。其中，圖6a.乙醇體積分?jǐn)?shù)和溫度的3d交互圖；圖6b.乙醇體積分?jǐn)?shù)和溫度的等高線圖。

圖7是纖維素酶測(cè)定中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說(shuō)明都是示例性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的說(shuō)明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語(yǔ)僅是為了描述具體實(shí)施方式，而非意圖限制根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說(shuō)明書中使用術(shù)語(yǔ)“包含”和/或“包括”時(shí)，其指明存在特征、步驟、操作和/或它們的組合。

正如背景技術(shù)所介紹的，現(xiàn)有技術(shù)中丹參莖葉有效成分的提取方法存在一定的不足，為了解決如上的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出了一種丹參地上莖葉部分的綜合利用方法，包括以下步驟：

一種丹參地上莖葉部分綜合利用的方法，包括以下步驟：

(1)丹參地上莖葉中總丹參酮、總酚酸和多糖的聯(lián)合提取：

1)總丹參酮的提?。?/p>

將丹參地上莖葉進(jìn)行粉碎，然后采用乙醇溶液進(jìn)行超聲波提取，提取后固液分離，得到藥渣1和含有總丹參酮的提取液；

其中，提取的工藝參數(shù)為：乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為85～89％，液料比為40～42：1，提取溫度為48～52℃；

2)總酚酸的提?。?/p>

將藥渣1采用乙醇溶液進(jìn)行超聲波提取，提取后固液分離，得到藥渣2和含有總酚酸的提取液；

其中，提取的工藝參數(shù)為：乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為40～45％，液料比為20～25：1，提取溫度為40～45℃；

3)多糖的提?。?/p>

將藥渣2采用乙醇溶液進(jìn)行超聲波提取，提取后固液分離，得到藥渣3和含有多糖的提取液；

(2)白黃小脆柄菇菌種活化、液體發(fā)酵種子液制備：

將白黃小脆柄菇接種于固體馬鈴薯綜合培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，然后接種到液體培養(yǎng)基上，震蕩培養(yǎng)后作為種子液；

(3)白黃小脆柄菇固態(tài)發(fā)酵藥渣3產(chǎn)纖維素酶：

將藥渣3過(guò)篩，加水，浸泡設(shè)定時(shí)間，滅菌冷卻，制成固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；然后接種白黃小脆柄菇種子液后進(jìn)行培養(yǎng)，用來(lái)提取纖維素酶；

(4)纖維素酶粗酶液的制備：

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵培養(yǎng)物干燥、粉碎過(guò)篩，然后加入乙酸-乙酸鈉緩沖液，在恒溫35～40℃下提取1～1.5h，提取后的提取液經(jīng)離心，得到上清液，即為粗酶液。

步驟(1)中，三種物質(zhì)的超聲波提取的功率為220～250w，提取時(shí)間為30～40min。最優(yōu)選的，所述超聲波提取的功率為250w，提取時(shí)間為40min。

對(duì)于總丹參酮的提?。涸诒景l(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，提取的工藝參數(shù)為：乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為88％，液料比為40.8：1(液料比為乙醇溶液的體積/ml:物料的質(zhì)量/g)，提取溫度為50℃，采用此工藝參數(shù)提取的總丹參酮提取率最大，為0.72％。

對(duì)于總酚酸的提?。涸诒景l(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，提取的工藝參數(shù)為：乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為41.2％，液料比為20.2：1，提取溫度為40.6℃，采用此工藝參數(shù)提取的總酚酸提取率最大，為3.8％。

對(duì)于多糖的提?。涸诒景l(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，提取的工藝參數(shù)為：乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為11.44％，液料比為43.2：1，提取溫度為42.3℃，采用此工藝參數(shù)提取的多糖提取率最大，為3.06％。

總丹參酮的提取采用響應(yīng)面法設(shè)定提取的變量參數(shù)，所述響應(yīng)面法設(shè)定提取的變量參數(shù)通過(guò)以下二次回歸方程模型：y＝0.71-0.014a+0.00625b-0.0025c+0.000ab-0.0075ac+0.013bc-0.039a2-0.039b2-0.047c2；

總酚酸的提取采用響應(yīng)面法設(shè)定提取的變量參數(shù)，所述響應(yīng)面法設(shè)定提取的變量參數(shù)通過(guò)以下二次回歸方程模型：

y＝3.62+0.10a+0.018b+0.064c-0.053ab-0.090ac+0.042bc-0.41a2-0.38b2-0.42c2；

多糖的提取采用響應(yīng)面法設(shè)定提取的變量參數(shù)，所述響應(yīng)面法設(shè)定提取的變量參數(shù)通過(guò)以下二次回歸方程模型：

y＝2.98+0.046a+0.14b+0.079c-0.025ab+0.14ac+0.000bc-0.24a²-0.21b²-0.21c²；

其中，y為相應(yīng)物質(zhì)的提取率，a為乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)，b為液料比，c為溫度。

步驟(1)中得到含有相應(yīng)有效成分的提取液后，再采用常規(guī)的純化工藝即可得到該有效成分。

步驟(2)中，從提高粗酶液中纖維素酶的活性來(lái)講，優(yōu)選的，所述白黃小脆柄菇為白黃小脆柄菇(psathyrellacandolleana)bdf15，是從山東省泰安市泰山(海拔800m)采集健康無(wú)病癥的白花丹參(salviamiltiorrhizabunge.f.albac.y.wueth.w.li)根中分離得到的，歸屬于傘菌目、鬼傘科、脆柄菇屬。該菌株在專利105543106a中公開，于2015年11月4日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為cgmccno11415。

所述固體馬鈴薯綜合培養(yǎng)基的組成為：馬鈴薯200g，麥麩50g，葡萄糖20g，mgso41.0g，蛋白陳5.0g，瓊脂20g，水加至1000ml，自然ph。

優(yōu)選的，活化時(shí)間為6～7天。

優(yōu)選的，震蕩培養(yǎng)的時(shí)間為3～5天。

步驟(3)中，優(yōu)選的，過(guò)篩的目數(shù)為60目。

優(yōu)選的，所述藥渣3與水的添加量比例為1g：(1.5～2.5)ml；浸泡時(shí)間為6～12h。

優(yōu)選的，接種白黃小脆柄菇種子液25～30℃培養(yǎng)2周。

步驟(4)中，優(yōu)選的，粉碎過(guò)60目篩。

優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)物與乙酸-乙酸鈉緩沖液的添加量比例為1g：(20～25)ml，所述乙酸-乙酸鈉緩沖液的ph為4.5～5。

優(yōu)選的，在40℃恒溫水浴中提取1h。

為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本發(fā)明的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。

實(shí)施例1:丹參地上莖葉中總丹參酮的提取工藝優(yōu)化

1.1丹參酮ⅱa標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取丹參酮ⅱa10mg，置于50ml的容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.2mg/ml的對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，分別置于10ml量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，以甲醇為空白，于269nm波長(zhǎng)處分別測(cè)其吸光度。以對(duì)照品濃度(x)為橫坐標(biāo)，吸光度(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

1.2響應(yīng)面優(yōu)化總丹參酮提取工藝

精密稱量經(jīng)粉碎、過(guò)60目篩的丹參莖葉4或5份，每份各0.5g，采用超聲法進(jìn)行提取總丹參酮；超聲波提取的功率為250w，提取時(shí)間為40min。提取液經(jīng)過(guò)濾、離心后用甲醇溶解定容至25ml，各取3ml，以甲醇為空白，在波長(zhǎng)269nm處測(cè)定其吸光度，代入回歸方程，計(jì)算每份樣品中中總丹參酮的含量。采用由box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、溫度3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，以丹參總酮提取率為響應(yīng)值，試驗(yàn)結(jié)果見表1。提取總丹參酮剩下的濾渣(計(jì)作藥渣1)。

表1box-behnken試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與總酮提取率

對(duì)表1試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得丹參總酮提取率對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)(a)、液料比(b)和溫度(c)的二次多項(xiàng)式回歸模型：y＝0.71-0.014a+0.00625b-0.0025c+0.000ab-0.0075ac+0.013bc-0.039a²-0.039b²-0.047c²，對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析和系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

表2回歸模型的方差分析及回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

由回歸模型方差分析的結(jié)果可以看出，模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，表明模型不失擬；同時(shí)該模型的相關(guān)系數(shù)r²＝0.9962，表明該模型實(shí)際試驗(yàn)擬合較好，所建立的回歸二次模型成立，可用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)超聲波提取丹參總酮的工藝條件。從回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可得知：乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比一次項(xiàng)，乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和溫度的二次項(xiàng)的p值均小于0.01，說(shuō)明對(duì)提取丹參總酮得率的影響極顯著，而乙醇體積分?jǐn)?shù)和溫度、液料比和溫度的交互項(xiàng)p值小于0.01，說(shuō)明對(duì)提取丹參總酮得率的影響極顯著。響應(yīng)面優(yōu)化得到總酮的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)88.23％、液料比40.8:1、溫度49.98℃。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可靠性，采用上述最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)合實(shí)際操作條件，將最佳工藝條件修正為:乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為88％，液料比為40.8：1，提取溫度為50℃，在此條件下進(jìn)行3平行試驗(yàn)，總丹參酮提取率為0.72％，與理論預(yù)測(cè)值基本相符，說(shuō)明回歸方程能真實(shí)反映各因素對(duì)總丹參酮提取率的影響，優(yōu)化結(jié)果可靠。

因素間交互影響見圖2a，圖2b，圖2c，圖2d。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)固定時(shí)，隨著溫度的升高，丹參總酮提取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。這是由于超聲波對(duì)于丹參細(xì)胞壁的破碎需達(dá)到一定的溫度，隨著溫度的升高，細(xì)胞壁破碎到一定程度，組織釋放到反應(yīng)體系中的總酮量隨之增加。但超聲溫度的升高同時(shí)會(huì)使丹參有效成分受到破壞，故丹參總酮提取率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；同理當(dāng)溫度一定時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，總酚酸提取率升高，但乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高會(huì)使總酚酸提取率降低。同理液料比和溫度也表現(xiàn)出相同的交互作用。

實(shí)施例2：丹參藥渣1中總丹酚酸的提取工藝優(yōu)化

2.1丹酚酸b標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別精密量取0.2mg/ml丹酚酸b標(biāo)準(zhǔn)品品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分別置比色管中，精密加水至2.0ml，分別精密加入10％的亞硝酸鈉0.5ml，搖勻，再分別精密加入10％硝酸鋁溶液1.0ml，搖勻，室溫下暗處放5min，加入2mol/l氫氧化鈉溶液6.0ml,搖勻,室溫下暗處放置10min后，在500nm波長(zhǎng)處測(cè)定od值。以od值(a)為縱坐標(biāo)，丹酚酸b含量(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。

2.2樣品溶液測(cè)定

藥渣1(0.5g)在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、溫度、時(shí)間下超聲提取一定時(shí)間，超聲波提取的功率為250w，提取時(shí)間為40min，提取液經(jīng)過(guò)濾、離心后用水定容至25ml。各取2ml，按丹酚酸b標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法顯色，在波長(zhǎng)500nm處測(cè)定其吸光度，代入回歸方程，計(jì)算每份中總酚酸的含量。由box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、溫度3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，以丹參總酚酸提取率為響應(yīng)值，試驗(yàn)結(jié)果見表3。提取總酚酸剩下的濾渣(計(jì)作藥渣2)。

表3box-behnken試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與總酚酸提取率

對(duì)表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得丹參總酚酸提取率二次多項(xiàng)式回歸模型：y＝3.62+0.10a+0.018b+0.064c-0.053ab-0.090ac+0.042bc-0.41a²-0.38b²-0.42c²對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析和系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。

表4回歸模型的方差分析及回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

由回歸模型方差分析的結(jié)果可以看出，模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，表明模型不失擬；同時(shí)該模型的相關(guān)系數(shù)r²＝0.9862，表明該模型實(shí)際試驗(yàn)擬合較好，所建立的回歸二次模型成立，可用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)超聲波提取丹參總酚酸的工藝條件。從回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可得知：乙醇體積分?jǐn)?shù)一次項(xiàng)，乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、溫度的二次項(xiàng)的p值均小于0.01，說(shuō)明對(duì)提取丹參總酚酸得率的影響極顯著，而溫度一次項(xiàng)、乙醇體積分?jǐn)?shù)和溫度的交互項(xiàng)p值小于0.05，說(shuō)明對(duì)提取丹參總酚酸得率的影響顯著。響應(yīng)面優(yōu)化得到總酚酸的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)41.17％、液料比20.19:1、溫度40.64℃。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可靠性，采用上述最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)合實(shí)際操作條件，將最佳工藝條件修正為:乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為41.2％，液料比為20.2：1，提取溫度為40.6℃，在此條件下進(jìn)行3平行試驗(yàn)，總丹酚酸提取率為3.8％，與理論預(yù)測(cè)值基本相符，說(shuō)明回歸方程能真實(shí)反映各因素對(duì)總丹酚酸提取率的影響，優(yōu)化結(jié)果可靠。

乙醇體積分?jǐn)?shù)和溫度的交互作用見圖4a，圖4b。在當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)固定時(shí)，隨著溫度的升高，丹參總酚酸提取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。這可能是由于超聲波對(duì)于丹參細(xì)胞壁的破碎需達(dá)到一定的溫度，隨著溫度的升高，細(xì)胞壁破碎到一定程度，組織釋放到反應(yīng)體系中的總酚酸量隨之增加。但超聲溫度的升高同時(shí)會(huì)使丹參有效成分受到破壞，故丹參酚酸提取率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；同理當(dāng)溫度一定時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，總酚酸提取率升高，但乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高會(huì)使總酚酸提取率降低。

實(shí)施例3：丹參藥渣2中多糖的提取工藝優(yōu)化

3.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確稱取105℃干至質(zhì)量恒定的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用蒸餾水定容至50ml容量瓶，搖勻，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml置于干燥試管，分別加水至1.0ml，再分別加入1.0ml的5％苯酚溶液，再加5.0ml濃硫酸混合均勻后40℃水浴30min，取出后室溫冷卻15min，在485nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以蒸餾水按照同樣顯色操作為空白，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)。

3.2響應(yīng)面優(yōu)化多糖提取工藝

藥渣2(0.5g)在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、溫度、時(shí)間下超聲提取一定時(shí)間提取液過(guò)濾后離心，超聲波提取的功率為250w，提取時(shí)間為40min，用水溶解定容至25ml，搖勻，即為供試品溶液。各取1ml，按葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法顯色，在波長(zhǎng)485nm處測(cè)定其吸光度，代入回歸方程，計(jì)算每份中多糖的含量。由box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、溫度3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，以丹參多糖提取率為響應(yīng)值，試驗(yàn)結(jié)果見表5。提取多糖剩下的濾渣(計(jì)作藥渣3)。

表5box-behnken試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與丹參多糖提取率

對(duì)表5結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得丹參多糖提取率的二次多項(xiàng)式回歸模型：y＝2.98+0.046a+0.14b+0.079c-0.025ab+0.14ac+0.000bc-0.24a²-0.21b²-0.21c².對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析和系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如表6所示。

表6回歸模型的方差分析及回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

由回歸模型方差分析的結(jié)果可以看出，模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，表明模型不失擬；同時(shí)該模型的相關(guān)系數(shù)r²＝0.9390，表明該模型實(shí)際試驗(yàn)擬合較好，所建立的回歸二次模型成立，可用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)超聲波提取丹參多糖的工藝條件。從回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可得知：液料比一次項(xiàng)，乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、溫度的二次項(xiàng)的p值均小于0.01，說(shuō)明對(duì)提取丹參多糖得率的影響極顯著，而乙醇體積分?jǐn)?shù)和溫度的交互項(xiàng)p值小于0.05，說(shuō)明對(duì)提取丹參多糖得率的影響顯著。響應(yīng)面優(yōu)化得到多糖的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)11.44％、液料比43.19:1、溫度42.31℃。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可靠性，采用上述最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)合實(shí)際操作條件，將最佳工藝條件修正為:乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為11.4％，液料比為43.2：1，提取溫度為42.3℃，在此條件下進(jìn)行3平行試驗(yàn)，多糖提取率為3.06％，與理論預(yù)測(cè)值基本相符，說(shuō)明回歸方程能真實(shí)反映各因素對(duì)多糖提取率的影響，優(yōu)化結(jié)果可靠。

由圖6可知，在當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)固定時(shí)，隨著溫度的升高，丹參多糖提取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。這可能是由于超聲波對(duì)于丹參細(xì)胞壁的破碎需達(dá)到一定的溫度，隨著溫度的升高，細(xì)胞壁破碎到一定程度，組織釋放到反應(yīng)體系中的多糖量隨之增加。但超聲溫度的升高同時(shí)會(huì)使丹參有效成分受到破壞，故丹參多糖提取率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；同理當(dāng)溫度一定時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，多糖提取率升高，但乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高會(huì)使多糖提取率降低。

實(shí)施例4：丹參內(nèi)生白黃小脆柄菇bdf15固態(tài)發(fā)酵藥渣3產(chǎn)纖維素酶

4.1白黃小脆柄菇bdf15固態(tài)發(fā)酵粗酶液的制備

將bdf15接種于馬鈴薯綜合培養(yǎng)基(馬鈴薯200g，麥麩50g，葡萄糖20g，mgso41.0g，蛋白陳5.0g，瓊脂20g，水加至1000ml，自然ph)上活化7天后。接種到液體培養(yǎng)基，搖床震蕩培養(yǎng)3d，做為種子液。

取4.0g經(jīng)過(guò)60目篩的丹參殘?jiān)?，加?毫升水，ph值自然，浸泡過(guò)夜，經(jīng)121℃滅菌30min后冷卻，制成固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。接種白黃小脆柄菇bdf15種子液后，28℃培養(yǎng)2周左右。將發(fā)酵培養(yǎng)物烘干、粉碎過(guò)60目篩，準(zhǔn)確稱取發(fā)酵培養(yǎng)物1.000g，分別加25mlph4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液，并于40℃恒溫水浴中提取1h，提取液經(jīng)8000r/min離心10min，上清液即為粗酶液。

本發(fā)明所采用的真菌菌株，除了采用白黃小脆柄菇bdf15，也可以采用其他能產(chǎn)纖維素酶的真菌。

4.2cmc酶活的測(cè)定

將菌種按照固態(tài)發(fā)酵14天后，向比色管中加入2.0ml0.2mol/lph＝4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液和2.0ml5％cmc，然后加0.5ml粗酶液，50℃處理30min之后，加入2.5mldns試劑進(jìn)行顯色，沸水浴5min，經(jīng)流水冷卻后定容至25ml，搖勻，以不加酶液為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)540nm處測(cè)定吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖7)計(jì)算cmc酶活性為132.6iu/g。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。