本發(fā)明涉及酪酸梭菌在制備預防或治療抑郁癥制劑中的應用，具體是用酪酸梭菌預防或治療抑郁癥，減少抑郁癥狀。
背景技術(shù)：
：抑郁癥發(fā)病機理復雜，臨床證候多樣，且病程長、易復發(fā)。抑郁癥發(fā)生于全球各國、社會各階層和各種文化環(huán)境的人群中。隨著社會發(fā)展、應激源的增多，發(fā)病率也呈逐年增長的趨勢。世界衛(wèi)生組織(WHO)預測，到2020年抑郁癥將會成為發(fā)展中國家最嚴重的疾病負擔，屆時重度抑郁會成為死亡和殘疾的第二大原因。巨大生活工作壓力導致的多為中、重度抑郁癥，單純的心理療法已不能達到理想的臨床療效。因此臨床除給予患者必要的安慰、疏導、指導外，主要依靠藥物來控制，主要藥物包括三環(huán)類抗抑郁藥、四環(huán)類抗抑郁藥等?，F(xiàn)有藥物抗抑郁譜窄、毒副作用大、具有成癮性及禁忌癥等缺陷，嚴重地影響了臨床的治療和依從性。中藥副作用少于西藥，但療效緩慢。且中醫(yī)對于抑郁癥的診斷和治療仍然沒有一個公認的客觀完整的分型論治標準，如何系統(tǒng)的應用中醫(yī)中藥治療抑郁癥還有待進一步研究。因此，尋找能夠有效預防或治療抑郁癥、減少抑郁癥狀，且安全沒有任何毒副作用的藥物是臨床迫切需要的。本發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，酪酸梭菌能夠有效預防或治療抑郁癥，安全沒有任何毒副作用，效果優(yōu)于雙歧桿菌，且未見相關(guān)研究報道，特申請此發(fā)明專利。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種能預防或治療抑郁癥的制劑，該制劑由酪酸梭菌制成。本發(fā)明的制劑的制備優(yōu)選是通過下述步驟實施的，但不局限于此制備工藝，公知的能實現(xiàn)的制備工藝均可以：采取可能含酪酸梭菌的樣品，然后將樣品置于滅菌厭氧瓶內(nèi)，吹入氮氣同時充分混合，迅速從中取2克樣品加入18mL滅菌的稀釋液中，吹入氮氣同時充分混勻，在無菌操作臺內(nèi)，進行10-1、10-2、10-3、10-4，10-5，10-6，10-7梯度稀釋，取10-5，10-6，10-7三個稀釋梯度，分別涂布于酪酸梭菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基上，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37℃下培養(yǎng)48小時，選擇長勢良好的單菌落分別接種于液體擴增培養(yǎng)基中，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37℃下擴增培養(yǎng)48小時。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調(diào)制出干燥菌粉，然后進行菌種鑒定、產(chǎn)丁酸實驗、腸道長期定植實驗和毒性試驗，將能產(chǎn)生丁酸和無毒性的酪酸梭菌干燥菌粉按需要比例添加輔料制成片劑、膠囊、散劑、粉劑或液體制劑等各種劑型，也可加入其他活菌或低聚果糖等低聚糖起到協(xié)同作用。酪酸梭菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基優(yōu)選但不局限于：純化水1L，蛋白胨40.0g，Na2HPO45.0g，K2HPO41.0g，NaCl2.0g，MgSO40.1g，葡萄糖2.0g，瓊脂25.0g，調(diào)pH7.6，116℃滅菌20分鐘，待其冷至50℃左右，加入卵黃液50.0mL，加入終濃度為200μg/mL的硫酸多粘菌素B，加入終濃度200μg/mL的新霉素，充分混勻后，分注于平皿中。酪酸梭菌液體擴增培養(yǎng)基優(yōu)選但不局限于：純化水1L，胰蛋白胨10.0g，牛肉浸膏10.0g，酵母浸膏3.0g，葡萄糖5.0g，NaCl5.0g，可溶性淀粉1.0g，半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，醋酸鈉3.0g，瓊脂0.5g，調(diào)pH6.6-7.0，121℃，滅菌15分鐘。為進一步具體說明本發(fā)明，發(fā)明人利用上述方法通過酪酸梭菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基分離鑒定出了無毒性的酪酸梭菌，本發(fā)明所述酪酸梭菌并不局限于為說明本發(fā)明所述的菌，只要無毒性的酪酸梭菌均是本發(fā)明所述，均在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。本發(fā)明所述酪酸梭菌優(yōu)選但不限于酪酸梭菌DF96101保藏編號CGMCC0313.1或丁酸梭菌QA-08保藏編號CGMCC2303。本發(fā)明實施說明中優(yōu)選使用的酪酸梭菌的細菌學性質(zhì)：1、為說明本發(fā)明，本發(fā)明利用上述方法分離的酪酸梭菌為酪酸梭菌DF96101保藏編號CGMCC0313.1或丁酸梭菌QA-08保藏編號CGMCC2303。2、菌落形態(tài)顯微鏡觀察：長3.0-6.0微米，寬0.6-1.2微米，直桿或梭狀菌，革蘭氏染色陽性，產(chǎn)芽孢，孢子欠端生。平板形態(tài)：菌落圓形，邊緣不整齊，稍凸，不透明，顏色淡黃，表面無光澤。3、生理生化鑒定硫化氫:-；吲哚:-；明膠液化:-；氨:-；硝酸鹽還原:-；卵磷脂酶反應:-；脲酶:-；V-P試驗:-；接觸酶:-；是否需氧:厭氧性。4、糖酵解實驗鑒定阿拉伯糖:+；鼠李糖:+；纖維二糖:+；D-山梨醇:-；D-果糖:+；可溶性淀粉:+；D-半乳糖:+；蔗糖:+；葡萄糖:+；海藻糖:+；菊糖:+；木糖:+；乳糖:+；葡萄糖酸鹽(鈉):+；D(+)甘露糖:+；麥芽糖:+；D-甘露醇:+；甘油:+；D(+)棉籽糖:+；核糖:+；松三糖:+；蜜二糖:+。本發(fā)明所述的酪酸梭菌指活的生物個體。本發(fā)明是以有效劑量按上述方法分離的酪酸梭菌作為主要活性成份，按照一定的制劑工藝，加入常規(guī)的賦形劑、調(diào)味劑、崩解劑、防腐劑、潤滑劑、濕潤劑、黏合劑、溶劑、增稠劑、增溶劑等輔料，制成任何一種適合于使用的劑型，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、液體制劑、粉劑等劑型。本發(fā)明所述酪酸梭菌作為主要藥物活性成份制成活菌制劑。本發(fā)明所指有效劑量是指按上述方法分離的酪酸梭菌根據(jù)上面所述單獨或組合作為主要藥物活性成份制成的固體活菌制劑包含的總活菌數(shù)不能低于1×106CFU/g，一般在1×107CFU/g以上，最高可達到1×1012CFU/g或1×1012CFU/g以上。本發(fā)明所指有效劑量是指按上述方法分離的酪酸梭菌根據(jù)上面所述單獨或組合作為主要藥物活性成份制成的液體活菌制劑包含的總活菌數(shù)不能低于1×106CFU/mL，一般在1×107CFU/mL以上，最高可達到1×1012CFU/mL或1×1012CFU/mL以上。本發(fā)明所述制劑包括酪酸梭菌單獨應用或與其他藥物聯(lián)合應用，尤其包括酪酸梭菌單獨應用或與雙歧桿菌聯(lián)合應用。本發(fā)明所述雙歧桿菌指活的生物個體。本發(fā)明所述雙歧桿菌聯(lián)合應用的制劑中，固體制劑包含的雙歧桿菌總活菌數(shù)不低于1×106CFU/g，一般在1×107CFU/g以上，最高可達到1×1012CFU/g或1×1012CFU/g以上；或液體制劑包含的雙歧桿菌總活菌數(shù)不低于1×106CFU/mL，一般在1×107CFU/mL以上，最高可達到1×1012CFU/mL或1×1012CFU/mL以上。由于本發(fā)明首次公開了酪酸梭菌作為主要活性成份制成制劑在預防或治療抑郁癥中的應用，因此含上述酪酸梭菌的制劑在預防或治療抑郁癥制劑中的應用均屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明所述的酪酸梭菌在制成任何一種劑型時，均具有預防或治療抑郁癥的作用。如果其組份中含有酪酸梭菌成份制備成制劑，在其包裝或說明書等標識上或者在其他任何宣傳品上只要注明或提示具有預防或治療抑郁癥的作用，則落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明所述的酪酸梭菌可以制成藥品、保健食品、食品或飲品等。具體實施方式制備例說明：上述已經(jīng)對酪酸梭菌制劑的制備進行說明，這里通過酪酸梭菌DF96101保藏編號CGMCC0313.1或丁酸梭菌QA-08保藏編號CGMCC2303為例進行具體說明，其他酪酸梭菌菌種制劑的制備方法本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本實施例很容易掌握，其他劑型的制備方法本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本實施很容易掌握，在此不再一一敘述說明。制備方法并不局限于本發(fā)明實施例所述，公知的能夠達到制備目的的方法均可以，實施例的制備說明只是對本發(fā)明的說明，并不是對本發(fā)明保護范圍的限制。制備實施例1酪酸梭菌粉劑的制備1菌粉的制備和菌種的鑒定采取人的糞便樣品，然后將樣品置于滅菌厭氧瓶內(nèi)，吹入氮氣同時充分混合，迅速從中取2克樣品加入18mL滅菌的稀釋液中，吹入氮氣同時充分混勻，在無菌操作臺內(nèi)，進行10-1、10-2、10-3、10-4，10-5，10-6，10-7梯度稀釋，取10-5，10-6，10-7三個稀釋梯度，分別涂布于酪酸梭菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基上，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37℃下培養(yǎng)48小時，選擇長勢良好的單菌落分別接種于液體擴增培養(yǎng)基中，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37℃下擴增培養(yǎng)48小時。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調(diào)制出干燥菌粉，然后進行菌種鑒定，經(jīng)生理生化和產(chǎn)丁酸實驗分析鑒定為酪酸梭菌，為酪酸梭菌DF96101保藏編號CGMCC0313.1或丁酸梭菌QA-08保藏編號CGMCC2303。酪酸梭菌DF96101保藏編號CGMCC0313.1或丁酸梭菌QA-08保藏編號CGMCC2303菌粉制備，將酪酸梭菌DF96101保藏編號CGMCC0313.1或丁酸梭菌QA-08保藏編號CGMCC2303接種到酪酸梭菌液體擴增培養(yǎng)基中，厭氧37℃下擴增培養(yǎng)48小時。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調(diào)制出干燥菌粉，活菌數(shù)均為1×109CFU/g以上。2毒性試驗2.1動物及分組取30只SPF級別小鼠，6-8周齡，體重14-18g，隨機分入酪酸梭菌CGMCC0313.1組、丁酸梭菌CGMCC2303組和未給藥組，每組10只。2.2制備菌液將上述不同的酪酸梭菌菌粉分別用純化水調(diào)制為含菌數(shù)均為1×109CFU/mL的菌液。2.3方法各酪酸梭菌組和未給藥組均給予相同的基礎飼料，且飼養(yǎng)條件均一致，各酪酸梭菌組每天灌服酪酸梭菌菌液0.5mL，未給藥組每天灌服純化水0.5mL，飼喂14天，觀察體重及毒性反應。2.4結(jié)果各組小鼠均未出現(xiàn)異常情況，未發(fā)生振顫、痙攣、運動失調(diào)、姿態(tài)異常，無眼球突出，排尿正常，皮膚、呼吸正常，無死亡情況，未見中毒反應。3制備成粉劑等劑型根據(jù)上述步驟和方法分離鑒定后，經(jīng)實驗檢驗無毒性，就可將酪酸梭菌菌種制成菌粉，然后按照需要添加相關(guān)輔料制成各種劑型，優(yōu)選據(jù)酪酸梭菌菌粉的活菌數(shù)，按比例添加淀粉制成粉劑，使活菌數(shù)不低于1×107CFU/g，然后裝袋。應用效果實施例說明：本發(fā)明以酪酸梭菌DF96101保藏編號CGMCC0313.1或丁酸梭菌QA-08保藏編號CGMCC2303為代表說明酪酸梭菌的應用效果，菌粉由青島東海藥業(yè)有限公司提供。本發(fā)明中使用的雙歧桿菌為購買所得，公眾能夠購買到的雙歧桿菌活菌均可。應用效果實施例1：酪酸梭菌在治療抑郁癥中的應用1模型組制備：1.1實驗動物選取成年雄性SD大鼠(體重200-220g，購自維通利華實驗動物中心)，實驗前適應飼養(yǎng)一周：自然光照，室溫22±2℃，自由攝取食物和水，每日定時更換飼料，通風良好，排除其它應激因素干擾。1.2制備方式采用慢性不可預計溫和應激處理方法，針對上述適應飼養(yǎng)的實驗動物采取以下10種應激方式進行處理：禁食24h、禁水24h、夾尾(距大鼠尾根部1cm處)5min、晝夜顛倒24h、4℃冷水游泳5min、45℃環(huán)境5min、潮濕墊料24h、傾斜45度24h、行為束縛4h、水平震蕩60次/min45min。上述10種應激方法在28天內(nèi)進行隨機處理，每天采取一種方法，相同的刺激不能連續(xù)出現(xiàn)且至少間隔7天以上，建立大鼠抑郁癥模型。2藥物治療實驗：2.1實驗方法按1.1的方法適應飼養(yǎng)成年雄性SD大鼠一周，將大鼠隨機分為6組(n＝10)：酪酸梭菌(DF96101)治療組、酪酸梭菌(QA-08)治療組、雙歧桿菌治療組、氟西汀治療組、模型對照組、正常對照組。各治療組和對照組均給予相同的基礎飼料，且飼養(yǎng)條件均一致，酪酸梭菌(DF96101、QA-08)和雙歧桿菌治療組使用含菌數(shù)為1×106CFU/mL(用0.9％生理鹽水調(diào)制菌粉)的菌液灌服0.5mL，氟西汀治療組使用0.2g/kg的藥液(用0.9％生理鹽水調(diào)制為0.2mg/mL的藥液)灌服0.5mL，對照組組每天灌服0.9％生理鹽水0.5mL。使用1.2所述述慢性不可預見性應激方法建立大鼠慢性應激抑郁模型，并于每次造模前進行一次藥物干預，比較藥物干預對慢性不可預計性溫和應激模型大鼠的行為學變化。2.2藥物干預對慢性不可預計溫和應激模型大鼠的行為學評估實驗前后分別測定大鼠的體重，實驗結(jié)束后進行行為學評估，包括曠場實驗、強迫游泳實驗和糖水偏愛實驗。數(shù)據(jù)使用SPSS21.0進行統(tǒng)計學分析。3結(jié)果3.1藥物干預慢性不可預計溫和應激模型后大鼠的體重變化酪酸梭菌DF96101干預后大鼠體重為399.65±10.18g，QA-08干預后大鼠體重為401.26±10.82g，兩者之間無顯著差異(P＞0.05)，與氟西汀治療組(389.63±22.91g)之間也無顯著差異(P＞0.05)，與模型組(325.16±17.70g)相比極顯著升高(P＜0.01)。酪酸梭菌DF96101和QA-08干預后大鼠體重均顯著高于雙歧桿菌治療組(376.76±12.22g)(P＜0.05)。酪酸梭菌對大鼠慢性不可預計溫和應激后體重的增加有顯著療效，其體重增加量高于氟西汀治療組，并顯著高于雙歧桿菌治療組。見表1。表1藥物干預慢性不可預計應激模型后大鼠體重變化統(tǒng)計分析(x±s)分組例數(shù)(n)體重(g)酪酸梭菌(DF96101)治療組10399.65±10.18酪酸梭菌(QA-08)治療組10401.26±10.82雙歧桿菌治療組10376.76±12.22氟西汀治療組10389.63±22.91模型對照組10325.16±17.70正常對照組10439.88±11.573.2藥物干預慢性不可預計溫和應激模型后大鼠的行為學變化酪酸梭菌DF96101和QA-08干預后大鼠的曠場穿越次數(shù)、直立次數(shù)、理毛次數(shù)與模型組相比均極顯著提高(P＜0.01)，強迫游泳不動時間均極顯著縮短(P＜0.01)，糖水偏好性均極顯著提高(P＜0.01)，兩者之間無顯著差異(P＞0.05)，且與氟西汀治療組之間無顯著差異(P＞0.05)；酪酸梭菌DF96101和QA-08與雙歧桿菌相比，干預后大鼠的曠場穿越次數(shù)、直立次數(shù)、理毛次數(shù)均顯著提高(P＜0.05)，強迫游泳不動時間均顯著縮短(P＜0.05)，糖水偏好性均顯著提高(P＜0.05)。大鼠慢性不可預計溫和應激后，酪酸梭菌干預能顯著減少大鼠的抑郁行為，其效果顯著優(yōu)于雙歧桿菌，與氟西汀之間無顯著差異。見表2。表2藥物干預慢性不可預計應激模型后大鼠行為學變化統(tǒng)計分析(x±s)4討論慢性不可預計溫和應激模型組和正常對照組相比大鼠的體重明顯降低，而藥物干預組和模型組相比大鼠的體重均明顯上升，其中酪酸梭菌治療組的療效顯著好于雙歧桿菌治療組，且優(yōu)于氟西汀治療組。表明抑郁會導致機體代謝紊亂從而導致體重下降，酪酸梭菌干預能顯著恢復大鼠因抑郁而降低的體重。結(jié)合行為學評估結(jié)果顯示，酪酸梭菌干預后，慢性不可預計溫和應激出現(xiàn)的抑郁行為得到了顯著的改善，其效果明顯優(yōu)于雙歧桿菌治療組，且與氟西汀治療組干預后抑郁癥狀改善無顯著差異。表明酪酸梭菌作為主要活性成分能達到與氟西汀效果一致的抗抑郁作用，從而為抑郁癥的治療和預防提供了新的解決方法。酪酸梭菌制劑能夠有效預防或治療抑郁癥，明顯減少抑郁癥狀，且無任何毒副作用，應用依從性好，是預防或治療抑郁癥的新方法、新突破。本發(fā)明在實施過程中所使用的酪酸梭菌菌種已分別于1997年7月28日和2007年12月26日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101)保藏，共兩個下述菌種，但本發(fā)明所述的酪酸梭菌并不局限于這兩種微生物菌種。(1)分類命名：酪酸梭菌Clostridiumbutyricum，保存編號0313.1。(2)分類命名：丁酸梭菌Clostridiumbutyricum，保存編號2303。上述兩個菌種經(jīng)該微生物中心檢測，檢測結(jié)果均為存活。本發(fā)明在實施過程中所使用的雙歧桿菌來自于商業(yè)渠道，屬于購買所得。當前第1頁1 2 3