本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是涉及一種殺滅金黃色葡萄球菌persister休眠細(xì)胞的清除劑。

背景技術(shù)：

食源性病原物金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,Sa)屬于革蘭氏陽性球菌，可引起人類和動(dòng)物化膿感染的重要致病菌，也是造成人類食物中毒的常見致病菌之一。美國疾病控制中心報(bào)告指出由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌；在我國金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的疾病也時(shí)有發(fā)生。此外，金黃色葡萄球菌是引起皮膚感染的最常見原因之一。

一些細(xì)菌會(huì)形成遺傳抗性，而其他的則會(huì)通過形成被稱為“persister”的休眠細(xì)胞(在這種細(xì)胞中抗生素的酶目標(biāo)是失活的)而變得具有耐受性，能夠在抗生素存在下存活。試驗(yàn)結(jié)果表明金黃色葡萄球菌很容易形成persister，即便氨芐青霉素在其20倍MIC的濃度下仍然對(duì)這些頑固細(xì)胞束手無策。JosephBigger就發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌即使在高濃度的氨芐青霉素的作用下仍然有少數(shù)能夠存活下來，生存比例為1:10⁶～1:10⁴。這一極少部分細(xì)胞對(duì)氨芐青霉素具有抗性而幸存下來，但是這種抗性不具有遺傳性，當(dāng)移除抗生素后這部分細(xì)胞就會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，這種幸存下來的細(xì)胞被稱作persister。

金黃色葡萄球菌可以形成persister而很難被徹底根除，這就為臨床治療相關(guān)疾病造成了極大的挑戰(zhàn)，而之前公開的發(fā)明或文獻(xiàn)資料多研究的是對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用，而對(duì)抗生素耐受的persister休眠細(xì)胞無作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種殺滅金黃色葡萄球菌persister休眠細(xì)胞的清除劑，使得所述清除劑能夠完全殺滅金黃色葡萄球菌persister休眠細(xì)胞，具有明顯的增效作用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種殺滅金黃色葡萄球菌persister休眠細(xì)胞的清除劑，包括氨芐青霉素和肉桂醛。

氨芐青霉素是一種半合成的廣譜青霉素，其雖然對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用，但是對(duì)金黃色葡萄球菌persister休眠細(xì)胞卻無效。針對(duì)這一問題，本發(fā)明選擇肉桂醛與氨芐青霉素組成清除劑，兩者之間產(chǎn)生協(xié)同作用，有效殺滅了金黃色葡萄球菌persister休眠細(xì)胞。

其中，清除劑中所述氨芐青霉素的濃度至少為200μg/mL，所述肉桂醛的濃度至少為3mM。更優(yōu)選地為，所述氨芐青霉素的濃度為200-400μg/mL，所述肉桂醛的濃度為3-4mM。在本發(fā)明具體實(shí)施過程中，可按如下兩者的濃度組合使用：

(1)氨芐青霉素200μg/mL，肉桂醛3mM；

(2)氨芐青霉素300μg/mL，肉桂醛3mM；

(3)氨芐青霉素400μg/mL，肉桂醛3mM；

(4)氨芐青霉素200μg/mL，肉桂醛4mM；

(5)氨芐青霉素300μg/mL，肉桂醛4mM；

(6)氨芐青霉素400μg/mL，肉桂醛4mM；

本發(fā)明所述清除劑能夠在采用較低濃度的前提下，有效殺滅(80％以上)或完全殺滅金黃色葡萄球菌persister休眠細(xì)胞，特別是在上述6個(gè)濃度組合情形下，能夠?qū)崿F(xiàn)最佳的效果，清除劑整體具備明顯的協(xié)同增效作用。

作為優(yōu)選，本發(fā)明所述清除劑還包括溶劑，所述溶劑為不影響氨芐青霉素和肉桂醛活性的適宜溶劑，通過溶劑調(diào)整兩者的濃度，而后混合形成清除劑。在本發(fā)明具體實(shí)施過程中，可采用DMSO、水中的一種或兩種作為溶劑，更具體地可用水作為氨芐青霉素的溶劑，用DMSO作為肉桂醛的溶劑。

在氨芐青霉素和肉桂醛單獨(dú)作用金黃色葡萄球菌persister休眠細(xì)胞的試驗(yàn)中，隨著氨芐青霉素濃度升高(從5倍MIC至20倍MIC)，始終存在著部分金黃色葡萄球菌細(xì)胞不能夠被殺死，這部分細(xì)胞在恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)仍能夠被殺死，因此不屬于抗性細(xì)胞，符合本領(lǐng)域persister的定義(Maisonneuve E,Gerdes K.Molecular mechanisms underlying bacterial persisters[J].Cell,2014,157(3):539-548.)，結(jié)果說明氨芐青霉素不能有效清除金黃色葡萄球菌persister；而肉桂醛單獨(dú)用0，1，2，3，4，5mM的濃度分別處理金黃黃色葡萄球菌，結(jié)果顯示隨著肉桂醛處理濃度增大金黃色葡萄球菌存活的菌落數(shù)目逐漸減少，當(dāng)濃度達(dá)到5mM時(shí)才能將金黃色葡萄球菌完全殺死，即在5mM濃度下肉桂醛才能完全清除金黃色葡萄球菌persister。

氨芐青霉素和肉桂醛同時(shí)處理金黃色葡萄球菌時(shí)，金黃色葡萄球菌的persister細(xì)胞數(shù)量相比同濃度的肉桂醛明顯減少，而且隨著肉桂醛濃度的增大，persister的清除效率得到明顯提高。當(dāng)肉桂醛處理濃度達(dá)到3mM時(shí)，對(duì)于persister細(xì)胞的清除率最低已達(dá)到50％，最高超過80％；當(dāng)肉桂醛濃度達(dá)到4mM時(shí)，15倍和20倍MIC氨芐青霉素就可以清除所有的persister細(xì)胞，與單獨(dú)使用肉桂醛處理金黃色葡萄球菌將其完全殺死濃度減少1mM，這些試驗(yàn)結(jié)果表明兩者組合使用具有協(xié)同作用。

基于上述本發(fā)明清除劑的技術(shù)效果，本發(fā)明提出了所述清除劑在殺滅金黃色葡萄球菌persister休眠細(xì)胞及制備殺滅金黃色葡萄球菌persister休眠細(xì)胞產(chǎn)品中的應(yīng)用。

同時(shí)，本發(fā)明還提供了所述清除劑的制備方法，取氨芐青霉素和肉桂醛分別配制成溶液，然后將兩者混合均勻，獲得清除劑。更具體地，取氨芐青霉素加水配制成溶液，吸取肉桂醛用DMSO配制成溶液，然后將兩者混合均勻，獲得清除劑。

由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明將氨芐青霉素和肉桂醛復(fù)配組成一種針對(duì)金黃色葡萄球菌persister休眠細(xì)胞的清除劑，通過兩者的協(xié)同增效作用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)細(xì)菌的有效清除，相比各組分單獨(dú)使用的效果更加明顯，為臨床治療相關(guān)疾病提供新的治療途徑。

附圖說明

圖1所示為肉桂醛對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果；其中a為肉桂醛處理金黃色葡萄球菌24h和48h時(shí)OD₆₀₀值的折線圖，b為96孔板中肉桂醛處理金黃色葡萄球菌48h的生長(zhǎng)狀況；

圖2所示為氨芐青霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果；其中a為氨芐青霉素處理金黃色葡萄球菌24h和48h時(shí)OD₆₀₀值的折線圖，b為96孔板中氨芐青霉素處理金黃色葡萄球菌48h的生長(zhǎng)狀況；

圖3所示為氨芐青霉素處理下存活的金黃色葡萄球菌persister細(xì)胞；

圖4所示為肉桂醛對(duì)金黃色葡萄球菌persister細(xì)胞的抑制效果；

圖5所示為不同濃度肉桂醛協(xié)同氨芐青霉素對(duì)persister作用后的平板生長(zhǎng)狀況；

圖6所示為同濃度肉桂醛協(xié)同氨芐青霉素對(duì)persister作用后的折線圖，其中圖例表示肉桂醛的濃度。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明實(shí)施例公開了一種殺滅金黃色葡萄球菌persister休眠細(xì)胞的清除劑，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明所述清除劑已通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的清除劑進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

在具體實(shí)施方式中，如未特別說明，各濃度下的氨芐青霉素以及肉桂醛的使用量是相同的，保證試驗(yàn)的可對(duì)比性。

在試驗(yàn)過程中需要先對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行活化培養(yǎng)，方法為：

將菌種劃線培養(yǎng)，挑取金黃色葡萄球菌單克隆于50ml LB液體培養(yǎng)基中37℃，150r/min搖培過夜，再重新吸取培養(yǎng)液200μl于50ml培養(yǎng)基中繼續(xù)搖培至OD600＝1.0用于后期試驗(yàn)菌液。

其中，LB培養(yǎng)基配制方法為稱取酵母提取物5.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂15.0g，加水1000ml于磁力攪拌器上充分溶解，調(diào)節(jié)pH值為7.4-7.6，分裝三角瓶于121℃高壓滅菌20min。

同時(shí)，本發(fā)明所述清除劑使用時(shí)使其與金黃色葡萄球菌persister休眠細(xì)胞相接觸即可，如將清除劑以噴霧、擦拭、滴加等方式與金黃色葡萄球菌persister休眠細(xì)胞相接觸。

以下就本發(fā)明所提供的一種殺滅金黃色葡萄球菌persister休眠細(xì)胞的清除劑做進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1：配制本發(fā)明所述清除劑

肉桂醛采用DMSO為溶劑，吸取一定量的肉桂醛于DMSO中，配置合適的濃度于4℃條件下避光保存?zhèn)溆?；稱取適量的氨芐青霉素粉末于蒸餾水中溶解，用無菌濾膜過濾且于-20℃條件下避光保存?zhèn)溆?；按照如下任意一?xiàng)的終濃度要求混合兩者獲得清除劑：

(1)氨芐青霉素200μg/mL，肉桂醛3mM；

(2)氨芐青霉素300μg/mL，肉桂醛3mM；

(3)氨芐青霉素400μg/mL，肉桂醛3mM；

(4)氨芐青霉素200μg/mL，肉桂醛4mM；

(5)氨芐青霉素300μg/mL，肉桂醛4mM；

(6)氨芐青霉素400μg/mL，肉桂醛4mM。

實(shí)施例2：肉桂醛和氨芐青霉素對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的抑制作用

1、肉桂醛對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制

取適量制備好的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液，用液體LB培養(yǎng)基稀釋至OD₆₀₀＝0.02，于96孔板中，每孔加入菌液200μl，用肉桂醛處理，終濃度分別為0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0mM，每個(gè)處理做三個(gè)平行，37℃靜置避光培養(yǎng)24h和48h，用酶標(biāo)儀測(cè)其OD₆₀₀值，以吸光值的變化得出肉桂醛對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果以及對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑制濃度MIC值，結(jié)果見圖1。

由圖1可以看出，不同濃度的肉桂醛處理金黃色葡萄球菌后其生長(zhǎng)受到不同程度的抑制并且都呈現(xiàn)出濃度效應(yīng)，即隨著處理濃度的增大抑制作用增強(qiáng)。當(dāng)肉桂醛處理濃度達(dá)到3mM時(shí)OD值基本不再變化。因此，肉桂醛對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑制濃度MIC值為3mM。

2、氨芐青霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制

取適量制備好的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液，用液體LB培養(yǎng)基稀釋至OD₆₀₀＝0.02，于96孔板中，每孔加入菌液200μl，分別用氨芐青霉素處理，終濃度分為0，2.5，5，10，15，20，25，30μg/ml，每個(gè)處理做三個(gè)平行，37℃靜置避光培養(yǎng)24h和48h，用酶標(biāo)儀測(cè)其OD₆₀₀值，以吸光值的變化得出氨芐青霉素對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的MIC值，結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，不同濃度的氨芐青霉素處理金黃色葡萄球菌，隨著氨芐青霉素濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到20μg/ml時(shí)OD值基本上不再變化，因此氨芐青霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑制濃度MIC值20μg/ml。

實(shí)施例3：金黃色葡萄球菌persister的獲得與檢測(cè)

吸取制備好的OD₆₀₀＝1.0的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液，100，200，300，400μg/ml(5倍MIC至20倍MIC)氨芐青霉素處理，于37℃150r/min條件下?lián)u培24h和48h。5000r/min離心5min，用生理鹽水重懸，且梯度稀釋滴平板，每個(gè)梯度做三個(gè)平行試驗(yàn)。將滴好平板在37℃條件下培養(yǎng)24h，統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)。

實(shí)施例4：氨芐青霉素對(duì)金黃色葡萄球菌persister的抑制效果

吸取OD₆₀₀＝1.0的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液，100，200，300，400μg/ml氨芐青霉素處理，于37℃150r/min條件下?lián)u培24h，5000r/min離心5min，用生理鹽水重懸，且梯度稀釋滴板，每個(gè)梯度做三個(gè)平行。將滴好平板于37℃條件下培養(yǎng)24h，統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)，結(jié)果見圖3。

圖3結(jié)果顯示，隨著氨芐青霉素濃度升高，始終存在著部分金黃色葡萄球菌細(xì)胞不能夠被殺死，由于這部分細(xì)胞在恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)仍能夠被殺死，因此不屬于抗性細(xì)胞，符合本領(lǐng)域persister的定義(Maisonneuve E,Gerdes K.Molecular mechanisms underlying bacterial persisters[J].Cell,2014,157(3):539-548.)。氨芐青霉素不能有效清除金黃色葡萄球菌persister。

實(shí)施例5：肉桂醛對(duì)金黃色葡萄球菌persister的抑制效果

單獨(dú)用0，1，2，3，4，5mM的肉桂醛處理金黃黃色葡萄球菌，結(jié)果顯示隨著肉桂醛處理濃度增大金黃色葡萄球菌存活的菌落數(shù)目逐漸減少，當(dāng)濃度達(dá)到5mM時(shí)才能將金黃色葡萄球菌完全殺死，如圖4所示。

實(shí)施例6：氨芐青霉素協(xié)同肉桂醛清除persister

氨芐青霉素和肉桂醛同時(shí)處理金黃色葡萄球菌時(shí)，金黃色葡萄球菌的persister細(xì)胞數(shù)量明顯減少，見圖5和圖6，而且隨著肉桂醛濃度的增大，persister的清除效率得到明顯提高。當(dāng)肉桂醛處理濃度達(dá)到3mM時(shí)，對(duì)于persister細(xì)胞的清除率最低已達(dá)到50％，最高超過80％；當(dāng)肉桂醛濃度達(dá)到4mM時(shí)，15倍和20倍MIC氨芐青霉素就可以清除所有的persister細(xì)胞，與單獨(dú)使用肉桂醛處理金黃色葡萄球菌將其完全殺死濃度減少1mM，由于氨芐青霉素對(duì)persister細(xì)胞無效，則上述技術(shù)效果表明兩者復(fù)配具有協(xié)同增效作用。

以上所述只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利的保護(hù)范圍。