本發(fā)明涉及有機合成和藥物化學領域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
痛風(gouty)，又稱痛風性關節(jié)炎(gouty arthritis)，是體內(nèi)嘌呤代謝紊亂所致的疾病，表現(xiàn)為血中尿酸過多，易于使尿酸鹽(MSU)在關節(jié)等組織析出結(jié)晶。痛風的急性發(fā)作是由于沉積在關節(jié)的MSU引起中性粒細胞局部浸潤和炎性反應。
西藥在痛風急性發(fā)作期選用三種藥：秋水仙堿、非甾體抗炎藥和腎上腺皮質(zhì)激素。秋水仙堿的作用機制是與中性粒細胞的微管蛋白結(jié)合，從而妨礙粒細胞的活動，抑制粒細胞浸潤。非甾體抗炎藥如吲哚美辛，抑制環(huán)氧酶(COX)活性而發(fā)揮抗炎作用，以及選擇性COX2抑制藥。它們雖然消炎止痛作用快，但毒副作用也相當明顯，如秋水仙堿的有效劑量與產(chǎn)生腹瀉等胃腸道癥狀的劑量相近，非甾體抗炎藥在有活動性消化性潰瘍、胃腸道出血情況下絕對禁用，而保泰松用藥短至3周也可致嚴重的粒細胞減少癥或再生障礙性貧血。
從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導化合物并進行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物最有重要價值。
本發(fā)明涉及的化合物I是一個2011年發(fā)表(Fan-Yu Meng et al.,2011.Schiglautone A,a New Tricyclic Triterpenoid with a Unique 6/7/9-Fused Skeleton from the Stems of Schisandra glaucescens.Organic Letters 13(2011)1502–1505)的化合物，我們對化合物I進行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物并對該組合物抗抗急性痛風活性進行了評價，其具有抗急性痛風活性。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明公開了一個新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分數(shù)分別為30％和70％。
本發(fā)明公開的組合物可以制成藥學上可接受的鹽或藥學上可接受的載體。
本發(fā)明用尿酸鈉(MSU)致人血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)損傷的急性痛風模型評價顯示，本發(fā)明組合物對MSU致HUVEC損傷具有保護作用，并抑制ICAM-1表達，可用于制備治療急性痛風炎癥藥物。本發(fā)明的目的在于提供本發(fā)明組合物在醫(yī)學中的新用途，具體地說是涉及本發(fā)明組合物在制備治療急性痛風藥物中的應用。
本發(fā)明的目的是通過以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
現(xiàn)代醫(yī)學病理研究說明，痛風性關節(jié)炎是MSU引起中性粒細胞局部浸潤和炎性反應，急性痛風產(chǎn)生的本質(zhì)是中性粒細胞(PMN)-血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)黏連增強(Terkeltaub R，et al.The murine homolog of the interleukin-8receptorcxcr-2is essential for the occurrence of neutrophilic inflammation in air pouch model of acute urate crystal-induced gouty synovitis.Arthritis Rheum,1998,41(5):900-909.)，HUVEC損傷，其分子生物學基礎在于PMN與HUVEC表面黏附分子的相互作用(FujiwaraY,et al.Interleukin-8stimulates leukocyte migration across amonolayer of cultured rabbit NF-α,IL-1β,IL-8,and IL-1rain Monosodium Urate Crystal induced rabbit arthritis.Labinvest,19998,78(5):559-569.)，其中細胞間黏附分子-1(ICAM-1)與粘附功能關系最密切，是急性痛風炎癥的重要指標之一(張春，唐怡，劉軍，等.痛風靈方對尿酸鈉致大鼠模型關節(jié)軟組織ICAM-1表達的影響，重慶醫(yī)學，2002,31(12)：1211-1213.)。
因此，針對急性痛風MSU致HUVEC損傷，ICAM-1表達增多的病理特征，本發(fā)明用MSU致HUVEC損傷的體外急性痛風模型(楊妍華，尹蓮，王明艷，等.尿酸鈉誘導HUVEC損傷的急性痛風模型研究，中華中醫(yī)藥學刊，2010,28(3)：592-594.)，評價本發(fā)明組合物抗急性痛風炎癥活性。MSU致人血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)損傷的急性痛風模型評價顯示，本發(fā)明組合物對MSU致HUVEC損傷具有保護作用，并抑制ICAM-1表達。
有益效果
研究結(jié)果表明，用MSU致HUVEC損傷的急性痛風模型評價顯示，本發(fā)明組合物可保護MSU致HUVEC損傷，減少細胞凋亡，提高細胞活性，抑制ICAM-1表達，具有抗急性痛風炎癥的活性，本發(fā)明組合物可用于制備治療急性痛風炎癥藥物。
以下通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明，但本發(fā)明的保護范圍不受具體實施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。
具體實施方式
實施例1化合物Schiglautone A的制備
化合物Schiglautone A(I)的制備方法參照Fan-Yu Meng等人發(fā)表的文獻(Fan-Yu Meng et al.,2011.Schiglautone A,a New Tricyclic Triterpenoid with a Unique 6/7/9-Fused Skeleton from the Stems of Schisandra glaucescens.Organic Letters 13(2011)1502–1505)的方法。
實施例2Schiglautone A的O-溴乙基衍生物(II)的合成
將化合物I(502mg，1.00mmol)溶于15mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨(TBAB)(0.08g)，1,2-二溴乙烷(7.520g，40.00mmol)和6mL的50％氫氧化鈉溶液?；旌衔镌?5攝氏度攪拌8h。8h之后將反應液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機相溶液。然后對有機相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌3次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:1.0，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的棕色粉末(508mg，71％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.40(s,1H),6.10(s,1H),5.63(s,1H),5.53(s,1H),3.85(d,J＝11.2Hz,4H),3.52(d,J＝10.8Hz,4H),2.96(s,1H),2.20(s,1H),2.16(s,2H),2.00(s,1H),1.84(d,J＝13.9Hz,4H),1.69(s,1H),1.58(dd,J＝22.2, 8.5Hz,4H),1.51(s,1H),1.47(s,1H),1.26(dd,J＝9.1,4.4Hz,4H),1.21(s,1H),1.08–0.98(m,4H),0.96-0.94(m,9H),0.94-0.85(m,6H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ211.46(s),209.14(s),170.06(s),161.12(s),143.51(s),132.01(s),127.77(s),85.96(s),82.40(s),70.19(s),69.10(s),57.14(s),52.73(s),51.90(s),45.77(s),40.67(s),38.57(s),38.32(s),35.04(s),33.55(s),33.27(s),29.85(s),28.98(s),26.71(s),25.50(s),24.05(s),22.31(s),21.06(s),20.56(s),20.00(s),18.69(s),18.11(s),15.07(s).
HRMS(ESI)m/z[M-H]-calcd for C34H51Br2O6:715.2032；found 715.2027.
實施例3Schiglautone A的O-(三唑基)乙基衍生物(III)的合成
將化合物II(358mg，0.5mmol)溶于10mL乙腈當中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和1,2,3-三氮唑(2760mg，40mmol)，混合物加熱回流3h。反應結(jié)束后將反應液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:1.0，v/v)，收集淡黃色集中洗脫帶即得到化合物III的黃色膠狀固體(245.7mg,71％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ18.00(s,1H),7.96(d,J＝15.5Hz,2H),7.67(d,J＝20.5Hz,2H),6.10(s,1H),5.63(s,1H),5.33(s,1H),4.29(d,J＝19.8Hz,2H),4.08(d,J＝4.0Hz,2H),3.83(d,J＝4.8Hz,4H),3.47(s,1H),2.39(d,J＝2.9Hz,3H),2.16(s,1H),1.84(d,J＝0.5Hz,4H),1.68–1.61(m,3H),1.61–1.50(m,3H),1.46(s,1H),1.39(d,J＝11.0Hz,2H),1.30–1.21(m,2H),1.21(s,1H),1.05–0.70(m,19H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ211.62(s),209.42(s),170.24(s),161.39(s),143.68(s),137.15(s),132.19(s),128.04(s),120.80(s),86.24(s),82.58(s),66.14(s),65.60(s),57.43(s),52.89(s),52.18(s),46.47(s),46.06(s),40.83(s),38.85(s), 38.50(s),35.31(s),33.72(s),30.12(s),29.15(s),27.00(s),25.66(s),24.33(s),22.49(s),21.33(s),20.73(s),20.29(s),18.85(s),18.39(s),15.25(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C38H57N6O6:693.4340；found:693.4338。
實施例4Schiglautone A的O-(二(2-甲硫基乙基)胺基)乙基衍生物的合成
1、Schiglautone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物的合成
將化合物II(358mg，0.5mmol)溶于15mL乙腈，加入無水碳酸鉀(0.345g，2.5mmol)，碘化鉀(0.084g，0.5mmol)和二乙醇胺(1.0514g，10mmol)，混合物加熱回流9h。反應結(jié)束后將反應液倒入冷水中，用二氯甲烷萃取三次，合并有機相，依次用水和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑。產(chǎn)物用硅膠柱層析純化(石油醚/丙酮100:1，v/v)，得到Schiglautone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物的淡黃色固體(0.199g,52％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ17.77(s,1H),6.00(s,1H),5.40(s,1H),5.20(s,1H),3.37(d,J＝17.8Hz,4H),3.28(s,8H),2.87(s,1H),2.51(d,J＝6.5Hz,4H),2.43(s,8H),2.24(s,2H),2.06(d,J＝12.7Hz,2H),1.76–1.68(m,5H),1.57(s,1H),1.53–1.39(m,8H),1.36(s,1H),1.24(s,1H),1.20–1.14(m,3H),1.11(s,1H),0.94–0.82(m,10H),0.80(s,3H),0.76(s,3H),0.72(d,J＝20.0Hz,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ211.39(s),208.98(s),169.80(s),160.73(s),143.02(s),131.42(s),127.05(s),85.91(s),82.25(s),66.70(s),65.63(s),58.62(s),56.55(s),56.61(s),53.30(s),52.45(s),51.52(s),45.29(s),40.06(s),38.52(s),38.17(s),34.73(s),33.17(s),29.35(s),28.38(s),26.34(s),25.00(s),23.45(s),22.05(s),20.67(s),20.07(s),19.31(s),18.41(s),17.73(s),14.59(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C42H73N2O10:765.5265；found:765.5261。
Schiglautone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物
2、Schiglautone A的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物的合成
按照上述步驟制備1g的Schiglautone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物，取Schiglautone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物(382mg，0.5mmol)溶于8mL氯仿，逐滴加入氯化亞砜(0.238g，2mmol)，反應物加熱回流2h。將反應物冷卻至室溫，滴加甲醇分解過量的氯化亞砜，減壓濃縮除去溶劑。產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化(石油醚/丙酮100:1，v/v)，得到Schiglautone A的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物的淡黃色膠狀固體(0.297g，71％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.87(s,1H),6.01(s,1H),5.50(d,J＝8.4Hz,2H),3.61(s,4H),3.55(s,4H),3.45(s,2H),3.40(s,2H),2.98(s,1H),2.73(d,J＝17.4Hz,4H),2.67–2.57(m,6H),2.54(s,2H),2.40(s,1H),2.10(s,1H),1.99(s,2H),1.78(s,1H),1.73(d,J＝16.9Hz,4H),1.58(d,J＝3.0Hz,2H),1.46(d,J＝3.0Hz,2H),1.43(s,1H),1.37(s,1H),1.22(s,1H),1.17(dd,J＝18.9,11.1Hz,4H),0.95–0.83(m,10H),0.80(d,J＝20.0Hz,3H),0.78(d,J＝20.0Hz,3H),0.73(d,J＝20.0Hz,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ211.19(s),208.87(s),169.79(s),160.85(s),143.24(s),131.74(s),127.50(s),85.69(s),82.13(s),66.71(s),65.84(s),56.87(s),55.80(s),53.19(s),52.44(s),51.64(s),45.51(s),40.38(s),39.22(s),38.30(s),38.05(s),34.77(s),33.28(s),29.56(s),28.72(s),26.45(s),25.21(s),23.79(s),22.05(s),20.77(s),20.30(s),19.76(s),18.41(s),17.85(s),14.81(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C42H69Cl4N2O6:839.3880；found:839.3881。
Schiglautone A的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物
3、Schiglautone A的O-(二(2-甲硫基乙基)胺基)乙基衍生物(IV)的合成
按照上述步驟制備1g的Schiglautone A的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物，將Schiglautone A的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物(0.419g，0.5mmol)溶于15mL乙醇，室溫下加入甲硫醇鈉(0.21g，3mmol)，反應物加熱回流3h。減壓濃縮除去溶劑，所得產(chǎn)物用硅膠柱層析進行純化(石油醚/丙酮100:0.2，v/v)，得到黃色固體物，即化合物IV(0.296g，67％)。
1H NMR(500MHz,Chloroform-d1)δ13.21(s,1H),6.02(s,1H),5.48(s,1H),5.44(s,1H),3.45(s,2H),3.38(s,2H),3.00(s,1H),2.57–2.48(m,20H),2.16–2.09(m,4H),1.96(s,12H),1.73(d,J＝15.4Hz,4H),1.55(s,1H),1.44(dd,J＝7.8,2.8Hz,4H),1.35(s,1H),1.29–1.14(m,6H),0.97–0.49(m,19H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ211.72(s),209.42(s),170.36(s),161.38(s),143.79(s),132.31(s),128.03(s),86.24(s),82.70(s),67.24(s),66.39(s),57.44(s),53.73(s),53.00(s),52.69(s),52.17(s),46.06(s),40.95(s),38.84(s),38.61(s),35.32(s),33.82(s),32.41(s),30.13(s),29.25(s),27.00(s),25.77(s),24.34(s),22.59(s),21.33(s),20.85(s),20.28(s),18.96(s),18.40(s),15.35(s),15.03(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C46H81N2O6S4+:885.4977；found:885.4979。
實施例5組合物抗急性痛風炎癥實驗
1、溶液配制
5g尿酸加1000ml蒸餾水煮沸，加5％NaOH溶液調(diào)PH 7.4，攪拌，冷卻析晶制成尿酸鈉結(jié)晶(MSU)。將制好的MSU 10mg高壓滅菌，加不含血清的DMEM培養(yǎng)液10ml，研磨配成1mg/ml的DMEM溶液。實驗時，此溶液再加DMEM培養(yǎng)液配成不同濃度DMEM的MSU溶液。
組合物的制備：將研磨之后過200目網(wǎng)的30mg化合物III的粉末和研磨之后過200目網(wǎng)的70mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物，使用時用水溶解這100mg的組合物即得到組合物的溶液。
組合物、化合物III或者化合物IV 2.5mg，用二甲基亞砜(DMSO)溶解，DMSO終濃度<0.02％，再加無血清的DMEM培養(yǎng)液，配制成濃度25ug/ml。
2、血管內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)
人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞HUVEC株由南京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院提供，細胞經(jīng)支原體檢測，無支原體污染，細胞經(jīng)0.25％胰蛋白酶消化，含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中和，離心(1000r/min×6min)，去上清液，加含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，移入細胞培養(yǎng)瓶中，放37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。
3、對MSU刺激HUVEC活力的影響
HUVEC在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待生長至70％～80％融合時，以0.25％胰蛋白酶消化、離心，10％小牛血清DMEM培養(yǎng)液洗滌3次，用10％小牛血清DMEM培養(yǎng)液調(diào)成4×104/ml細胞懸液，植入96孔板(每孔200ul)，培養(yǎng)24小時后輕吸出原培養(yǎng)液，進行以下實驗，每組各8孔，具體分組及加液如下：對照組(200ul DMEM培養(yǎng)液)、模型組(100ug/ml MSU溶液)、干預組(100ug/ml MSU溶液+25ug/ml的組合物或者化合物)，加液后繼續(xù)放37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，收集上清液，剩余的HUVEC用于測定細胞活性，每孔再加5mg/ml MTT液20ul，繼續(xù)放37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時后，棄MTT液，加入二甲基亞砜200ul溶解，震蕩，于酶標儀讀取吸光度值，波長490nm。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計學處理，細胞活力(％)＝實驗組吸光度值/對照組吸光度值×100％，結(jié)果見表1。
與對照組相比，模型組細胞活力顯著減小(P<0.05)，組合物干預后細胞活力顯著提高(P<0.05)，并強于對照組，而化合物III和化合物IV無此活性。
表1組合物對MSU刺激的血管內(nèi)皮細胞活力的影響
注：與模型組相比，*P<0.05；與對照組相比，△P<0.05
4對ICAM-1表達影響
將處于對數(shù)生長期的HUVEC用0.25％的胰蛋白酶消化，輕輕吹打，制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度為5×109/L，接種于細胞培養(yǎng)瓶中。待細胞長滿后(約24h)，棄去上清液，分為下列組：對照組、模型組(100ug/ml MSU溶液)、干預組(100ug/ml MSU溶液+25ug/ml組合物或者化合物)，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，PBS收集細胞，離心去上清，加入CD54單克隆抗體，30min后，PBS洗滌，重懸細胞，應用流式細胞儀檢測其陽性細胞百分率(n＝10000)，重復3次，結(jié)果見表2。
表2組合物對MSU刺激的血管內(nèi)皮細胞ICAM-1表達的影響
注：與模型組相比，*P<0.05；與對照組相比，△P<0.05
結(jié)果顯示，空白組HUVEC幾乎無ICAM-1表達，模型組ICAM-1的表達最高，與模型組相比，組合物對ICAM-1的表達有較強的抑制作用，而化合物III和化合物IV無此活性。
結(jié)論：用MSU致HUVEC損傷的急性痛風模型評價顯示，組合物可保護MSU致HUVEC損傷，減少細胞凋亡，提高細胞活性，抑制ICAM-1表達，具有抗急性痛風炎癥的活性，組合物可用于制備治療急性痛風炎癥藥物。而化合物III和化合物IV不能保護MSU致HUVEC損傷，不能減少細胞凋亡，不能提高細胞活性，不能抑制ICAM-1表達，不具有抗急性痛風炎癥的活性，不能用于制備治療急性痛風炎癥藥物。
實施例6本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備
取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機制成100片。
實施例7本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備
取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。