本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種經(jīng)血干細(xì)胞在制備治療宮腔粘連的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

子宮內(nèi)膜對維持女性生理特征和生育能力具有舉足輕重的意義，它具有高度的再生能力和增殖活性，任何引起子宮內(nèi)膜破壞的因素都可引起宮腔粘連。隨著頻繁的宮腔操作及宮腔鏡手術(shù)的普及，子宮內(nèi)膜損傷所致宮腔粘連（intrauterine adhesions，IUA）的發(fā)生率和檢出率逐年增加，已成為女性繼發(fā)性不孕的第二大原因。IUA是由于子宮內(nèi)膜基底層損傷后形成纖維化瘢痕、修復(fù)障礙導(dǎo)致的宮腔部分或全部粘連閉塞，從而引起月經(jīng)量少、閉經(jīng)、不孕及反復(fù)流產(chǎn)等一系列并發(fā)癥，也被定義為Asherman綜合征。

目前治療IUA的主要手段是采用宮腔鏡手術(shù)分離粘連并置入粘連屏障包括宮內(nèi)節(jié)育器、Foley氣囊導(dǎo)尿管、透明質(zhì)酸和羊膜等預(yù)防粘連復(fù)發(fā)，同時配合藥物如雌激素、阿司匹林、中藥治療，以促進子宮內(nèi)膜再生，恢復(fù)其生理功能，但療效因人而異。尤其是中、重度粘連極易復(fù)發(fā)。此外，術(shù)后會出現(xiàn)不孕或多種妊娠并發(fā)癥的情況。這類難治性宮腔粘連導(dǎo)致的不孕給患者身心及家庭帶來極大痛苦。

近年，很多醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究人員進行宮腔粘連的臨床研究，努力探索一種可以有效恢復(fù)患者子宮內(nèi)膜再生能力的方法。大量研究表明子宮內(nèi)膜存在干細(xì)胞，深入子宮基底層的損傷，會引起干細(xì)胞的丟失或功能異常，最終導(dǎo)致子宮內(nèi)膜再生失敗，因此干細(xì)胞移植治療有望成為宮腔粘連患者更好的選擇。目前，國內(nèi)外已有研究報道應(yīng)用骨髓干細(xì)胞移植治療患者宮腔粘連或動物模型，患者在接受男性供者的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后，受者的子宮內(nèi)膜中出現(xiàn)了Y染色體陽性的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞參與內(nèi)膜的再生過程。但是，骨髓干細(xì)胞的主要缺憾是其獲得存在侵襲性和創(chuàng)傷性，易引起患者的不適或感染；另外骨髓中直接分離出的干細(xì)胞比例較低，通過細(xì)胞培養(yǎng)，在有限次數(shù)的傳代培養(yǎng)內(nèi)獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞也較困難，這在一定程度上限制了其應(yīng)用。故亟需尋找更加安全、易獲得、易擴增的干細(xì)胞才利于推廣干細(xì)胞在宮腔粘連病癥中的移植療法。

目前，已報道了將干細(xì)胞-經(jīng)血干細(xì)胞（menstrual blood stromal stem cells, MenSCs）用于治療腦中風(fēng)、下肢缺血、心肌梗死、肌營養(yǎng)不良、腸炎、卵巢早衰、敗血癥和糖尿病等多種動物模型。移植的MenSCs不同程度地促進了組織損傷修復(fù)，提高了動物的生存率或妊娠率?；诮?jīng)血干細(xì)胞的優(yōu)點，其有望應(yīng)用于制備治療宮腔粘連的藥物，而至今為止未見相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明提供了一種經(jīng)血干細(xì)胞在制備治療宮腔粘連的藥物中的應(yīng)用。該細(xì)胞存活率高，性狀穩(wěn)定，安全，易獲得，易擴增，對宮腔粘連的治療效果顯著。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種經(jīng)血干細(xì)胞在制備治療宮腔粘連的藥物中的應(yīng)用。

所述的經(jīng)血干細(xì)胞采用以下方法制備。

步驟1、經(jīng)血干細(xì)胞的原代分離、培養(yǎng)：將提取的經(jīng)血樣本用PBS稀釋，緩慢加至細(xì)胞分離液的上層，離心、分離單個核細(xì)胞層，棄去上清，細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)液重懸，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于 5％ CO₂、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

步驟2、經(jīng)血干細(xì)胞的傳代：當(dāng)細(xì)胞長滿至80-90%，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即加入完全培養(yǎng)液終止消化；反復(fù)吹打瓶壁形成細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液吸入離心管，離心，棄上清；沉淀用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于培養(yǎng)瓶中；置37℃、5％ CO₂、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)；培養(yǎng)代數(shù)2～3代。

所述的經(jīng)血干細(xì)胞優(yōu)選于患者經(jīng)期中的經(jīng)血干細(xì)胞。

所述的PBS稀釋，按照與經(jīng)血干細(xì)胞的體積比例為1:1進行稀釋。

所述的完全培養(yǎng)液含10%人體血清或胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液，優(yōu)選含10%人體血清。

本發(fā)明的有益效果。

本發(fā)明采用更加適用于內(nèi)膜再生的干細(xì)胞-經(jīng)血干細(xì)胞（menstrual blood stromal stem cells, MenSCs）。MenSCs是從女性月經(jīng)血中分離、培養(yǎng)出來的新型成體干細(xì)胞。研究提示，MenSCs包含了脫落的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞和循環(huán)血液中的骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞。MenSCs具備間充質(zhì)干細(xì)胞的所有特征，且極易擴增，在體外連續(xù)培養(yǎng)保持二倍體核型。它表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記CD29、CD73、CD90和CD105，同時表達(dá)胚胎干細(xì)胞的多潛能性標(biāo)記OCT-4?，F(xiàn)有的研究已證實MenSCs可被誘導(dǎo)分化為多種組織細(xì)胞，包括神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞、胰島細(xì)胞和卵巢樣細(xì)胞；MenSCs還可被成功誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞（iPS），具有其自我更新、自我復(fù)制能力的多潛能性。基于經(jīng)血干細(xì)胞自我更新能力強，易于獲得，體外培養(yǎng)穩(wěn)定，而且優(yōu)選方案自體移植具備減少患者的精神和心理壓力的優(yōu)點；其在遠(yuǎn)期臨床應(yīng)用前景上遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；經(jīng)血干細(xì)胞藥物的移植可對宮腔粘連患者進行內(nèi)膜修復(fù)治療。

附圖說明

圖1流式細(xì)胞術(shù)分析經(jīng)血干細(xì)胞的表面標(biāo)志（同型對照：黑色，特異性抗體：灰色）；其中1-1為CD34、1-2為CD38、1-3為CD44、1-4為CD45、1-5為CD73、1-6為CD90、1-7為CD105和1-8為SSEA-4抗體。

圖2患者接受MenSCs藥物移植前、后子宮內(nèi)膜厚度比較。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的內(nèi)容做進一步說明。

實施例1。

出于人道主義角度考慮，患者更傾向于采集自體經(jīng)血干細(xì)胞制備藥物，治療自身的宮腔粘連疾病。經(jīng)血干細(xì)胞可以選擇自體采取，進行藥物的配制。

一、自體干細(xì)胞體外分離與培養(yǎng)。

1.所用設(shè)備，材料，試劑：超凈工作臺、CO₂培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、離心機（采購于eppendorf公司）、恒溫水浴箱（采購于JULABO公司）、B超機、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、離心管（50 mL，15 mL）、吸管、5 mL注射器、人工授精導(dǎo)管、胚胎移植管、采血針、DMEM-F12培養(yǎng)液（采購于HyClone公司，貨號：SH30023）、青霉素、鏈霉素（采購于SIGMA公司，貨號：V900929）、0.25%胰蛋白酶（采購于SIGMA公司，貨號：T4049）、磷酸鹽緩沖液（PBS，采購于SIGMA公司HyClone公司，貨號：SH30256）、樣本密度分離液（采購于天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，貨號：HY2015）。

2.經(jīng)血干細(xì)胞的原代分離、培養(yǎng)：（1）靜脈血收集：患者月經(jīng)來潮后第1天來院，用采血針取靜脈血30 mL。采集的血液于4℃冰箱靜置12 h后，3000 rpm離心處理10 min，取上層血清。將血清置于56℃恒溫水浴箱中，經(jīng)過30 min的滅活補體后，將得到血清于-20℃冰箱保存，備用。（2）月經(jīng)血收集：患者在月經(jīng)來潮后第2天來院，進入無菌手術(shù)室，截石位臥于手術(shù)臺上，應(yīng)用碘伏消毒陰道后，用5 mL注射器連接人工授精導(dǎo)管抽取月經(jīng)血樣本2-5 mL，全程嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作。（3）經(jīng)血干細(xì)胞的分離培養(yǎng)：取經(jīng)血樣本1-5 mL，用等體積PBS稀釋后，緩慢加至3mL樣本密度分離液的上層，450 g離心處理25 min，分離細(xì)胞層。離心結(jié)束后分為3層，用吸管吸取中間層的單個核細(xì)胞，將所得到的細(xì)胞加至10 mLPBS中混勻，250 g離心處理20 min后，棄去上清，細(xì)胞沉淀用5 mL完全培養(yǎng)液（含10%自體血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)液）重懸，接種于培養(yǎng)瓶中置于 5％ CO₂、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)約2周。每2-3 d全量更換為新鮮配制的5 mL完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)過程中通過顯微鏡觀察，可見經(jīng)血干細(xì)胞為貼壁生長，呈短棒狀或梭形，有較長的突起。

3．經(jīng)血干細(xì)胞的傳代：當(dāng)細(xì)胞貼壁長滿至80-90%，吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液，加入PBS 2 mL，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，以洗去殘留在瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，吸棄 PBS，重復(fù)1次該操作過程。培養(yǎng)瓶內(nèi)加入預(yù)熱至37℃的0.25%胰蛋白酶2 mL，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液0.25%胰蛋白酶流遍所有細(xì)胞表面，置于37℃培養(yǎng)箱孵育3 min。在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，立即加入完全培養(yǎng)液2 mL終止消化。反復(fù)吹打瓶壁形成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液吸入離心管，1500rpm離心處理10 min，棄上清。沉淀用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10⁵/mL，接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶5 mL，置37℃、5％ CO₂、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)代數(shù)2～3代，備用。

4.無菌試驗：在細(xì)胞培養(yǎng)第4天，對細(xì)胞上清液作無菌試驗，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，進行細(xì)菌、真菌、內(nèi)毒素及肝炎病毒檢測。檢測結(jié)果表明細(xì)胞上清液沒有細(xì)菌和真菌生長、內(nèi)毒素水平達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)小于10pg/ml、肝炎病毒呈陰性，見表1。

表1經(jīng)血干細(xì)胞培養(yǎng)上清液無菌性試驗檢測結(jié)果。

5．經(jīng)血干細(xì)胞的表型鑒定：細(xì)胞藥物移植當(dāng)天，先將所有培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液。取1×10⁶細(xì)胞與FITC或PE標(biāo)記的CD34、CD38、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105和SSEA-4抗體，置于4℃冰箱孵育30 min，用PBS清洗一遍，洗去未結(jié)合抗體。以相應(yīng)的同型對照抗體作為陰性對照組。用FACS Canto流式細(xì)胞儀收集數(shù)據(jù)，用FACS Diva 軟件分析，具體數(shù)據(jù)見圖1和表2。

表2 FACS Diva 軟件分析結(jié)果。

利用流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)血干細(xì)胞低表達(dá)CD34、CD38、CD45和SSEA-4，高表達(dá)CD44、CD73、CD90和CD105。

二、自體經(jīng)血干細(xì)胞藥物給藥方案。

（一）患者于取經(jīng)血后第16 天來院進行干細(xì)胞藥物移植（選擇第16天原因：一方面是子宮內(nèi)膜這個時間點最易接受移植，另一方面月經(jīng)第2天開始培養(yǎng)細(xì)胞，正好培養(yǎng)2周后傳代2-3代）。取消化傳代培養(yǎng)所得的自體經(jīng)血干細(xì)4×10⁶/ml，用0.5mlPBS重懸至2×10⁶/ml（重懸過程進行計數(shù)，此細(xì)胞數(shù)通過計數(shù)所得）?；颊呷“螂捉厥唬瑸榱思?xì)胞藥物移植后更易種植在內(nèi)膜中，先行輕度搔刮，B超引導(dǎo)下，將移植管的外管置入宮頸內(nèi)口上方，將裝有0.5 ml PBS重懸所得的自體MenSCs的內(nèi)管送入到宮腔，將干細(xì)胞藥物推注至子宮底部，臥床觀察2 h。

（二）激素刺激內(nèi)膜生長及胚胎移植：定期給予激素治療刺激子宮內(nèi)膜生長：首次取經(jīng)血后，月經(jīng)第5天開始口服雌激素-補佳樂4 mg/d，連用服用至藥物移植當(dāng)天，藥物移植后補佳樂6 mg/d，連用21 d；如果B超檢測子宮內(nèi)膜厚度仍小于7 mm，給予黃體酮40 mg/日肌注，連用10天；下次月經(jīng)3-5天開始重復(fù)上述激素治療療程。當(dāng)在激素治療周期，檢測到子宮內(nèi)膜厚度≥7 mm時，將其前期接受試管嬰兒手術(shù)保存的冷凍胚胎解凍移植，黃體酮40 mg日兩次肌注以支持黃體功能，繼續(xù)口服補佳樂6 mg/d，移植14 d后，化驗血絨毛膜促性腺激素（hCG）值。如果化驗hCG陽性，移植28 d超聲檢查，隨訪至分娩；如果患者的輸卵管通暢，當(dāng)內(nèi)膜厚度≥7 mm時，指導(dǎo)自然受孕。

三、典型病例。

對10個患者進行干細(xì)胞藥物移植的效果進行統(tǒng)計，其中3例不符合病例入選標(biāo)準(zhǔn)，僅有7例可進行有效統(tǒng)計。

1.病例入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡20-40歲，存在月經(jīng)周期；（2）確診為單純女方宮腔粘連導(dǎo)致的不孕患者；（3）已經(jīng)過其他如雌孕激素人工周期治療、節(jié)育環(huán)、阿斯匹林和中藥治療等，均無明顯療效；（4）簽署知情同意書，同意經(jīng)血干細(xì)胞藥物移植治療。

2.排除標(biāo)準(zhǔn)：患者存在（1）生殖系統(tǒng)結(jié)核；（2）其它慢性消耗性或出血性疾病，（3）子宮肌瘤；（4）子宮腺肌癥；（5）輸卵管積水未處理等子宮因素或影響胚胎著床的不孕因素。

7例患者均經(jīng)宮腔鏡證實有不同程度的宮腔粘連，超聲檢查內(nèi)膜厚度均不大于4 mm，已經(jīng)過各種藥物及帶宮內(nèi)節(jié)育器等治療無效。收集患者的月經(jīng)血1-5 ml，成功分離出MenSCs，體外擴增后移植回子宮腔內(nèi)，輔以激素治療，超聲監(jiān)測子宮內(nèi)膜的厚度均顯著增長。5例增長至不小于7 mm，符合妊娠的條件，見圖2和表3。

表3干細(xì)胞藥物移植前后子宮內(nèi)膜的厚度。

差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（** p<0.01）。

其中，1例患者第二次干細(xì)胞移植后3個半月自然妊娠。其余4例患者治療后接受解凍胚胎移植手術(shù)，1例兩次胚胎移植后均為生化妊娠，1例妊娠但胚胎停滯，余下2例移植未妊娠。由此可以證實經(jīng)血干細(xì)胞移植能夠促進子宮內(nèi)膜再生，幫助大多數(shù)宮腔粘連患者實現(xiàn)生育的愿望。

在患者宮腔粘連病癥比較嚴(yán)重，出現(xiàn)月經(jīng)量少、閉經(jīng)等癥狀時，無法采集患者自身的月經(jīng)血，患者可以選擇預(yù)先采集的健康女性的月經(jīng)血樣本，進行藥物的配置和移植治療自身的病癥。

上述實施例僅為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓本技術(shù)領(lǐng)域的人員了解本發(fā)明的內(nèi)容并局限于此，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明技術(shù)方案所作的等效變化，都應(yīng)覆蓋在本法的保護范圍之內(nèi)。