本公開涉及藥物制備與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種用于創(chuàng)傷修復(fù)、瘢痕抑制的干細(xì)胞制劑的制備方法和干細(xì)胞制劑，以及，穩(wěn)定表達(dá)HGF的宮血干細(xì)胞在制備修復(fù)皮膚損傷和/或抑制瘢痕產(chǎn)生的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一種重要的抗纖維化因子，現(xiàn)有研究表明，其可以促進(jìn)皮膚傷口有效、高質(zhì)量的快速愈合，可以減少瘢痕的形成，對(duì)骨重塑具有重要作用，是一種應(yīng)用前景廣泛的蛋白類治療藥物。
但是HGF不易大量收集和獲取，目前工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用的最為廣泛的生產(chǎn)方式為原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要利用大腸桿菌表達(dá)蛋白，大腸桿菌的HGF表達(dá)量高但也易形成包涵體從而影響蛋白活性。而采用真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)的方式雖然避免了包涵體的形成，但是因其表達(dá)量低導(dǎo)致生產(chǎn)成本極高。此外，現(xiàn)有的以HGF作為有效成分的針劑或涂劑對(duì)皮膚瘢痕的修復(fù)不具有靶向性，而且直接使用HGF蛋白給藥的治療方法中存在HGF半衰期短的缺陷，即便進(jìn)行高頻率多次注射，也難以在體內(nèi)維持高水平的HGF濃度，從而造成HGF用量以及經(jīng)濟(jì)上的花費(fèi)巨大。另一方面，受蛋白制劑純化工藝水平的限制，現(xiàn)有的一些HGF制劑在治療中易產(chǎn)生不良反應(yīng)從而給治療帶來負(fù)作用。
因此有必要對(duì)HGF的應(yīng)用方式和獲取方法進(jìn)行改進(jìn)，提供一種大規(guī)模、穩(wěn)定、安全的HGF利用方法，以及一種用于創(chuàng)傷修復(fù)的制劑及其制備方法，為有效利用HGF的治療作用提供新的途徑。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本公開的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中HGF應(yīng)用于治療時(shí)所存在的上述問題，提供一種新的HGF的應(yīng)用形式和制劑從而有效的利用HGF的創(chuàng)傷修復(fù)功能。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種用于創(chuàng)傷修復(fù)、瘢痕抑制的基因重組干細(xì)胞制劑的制備方法，干細(xì)胞制劑包括獨(dú)立存放的細(xì)胞針劑和噴涂劑；該制備方法包括：
(1)將SEQ ID NO.1所示的慢病毒載體pLVX-EF1α-hHGF包裝為慢病毒感染顆粒后感染宮血干細(xì)胞，并篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF的細(xì)胞系；所述宮血干細(xì)胞為CD3陽性且CD28陽性的宮血干細(xì)胞；
(2)將穩(wěn)定表達(dá)HGF的細(xì)胞系進(jìn)行4-6代的擴(kuò)增培養(yǎng)，然后在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)48-72小時(shí)，接著分離出細(xì)胞成分和培養(yǎng)上清；
(3)將所述細(xì)胞成分制備為細(xì)胞針劑；將所述培養(yǎng)上清制備為噴涂劑。
本公開的一個(gè)方面還提供了利用上述方法制備的用于創(chuàng)傷修復(fù)的干細(xì)胞制劑。
本公開的一個(gè)方面還提供了穩(wěn)定表達(dá)HGF的宮血干細(xì)胞在制備修復(fù)皮膚損傷和/或抑制瘢痕產(chǎn)生的藥物中的用途；其中，穩(wěn)定表達(dá)HGF的宮血干細(xì)胞通過包括如下步驟的方法制備得到：
(1)將SEQ ID NO.1所示的慢病毒載體pLVX-EF1α-hHGF包裝為慢病毒感染顆粒后感染宮血干細(xì)胞，并篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF的細(xì)胞系；所述宮血干細(xì)胞為CD3陽性且CD28陽性的宮血干細(xì)胞；
(2)將穩(wěn)定表達(dá)HGF的細(xì)胞系進(jìn)行4-6代的擴(kuò)增培養(yǎng)。
本公開將HGF基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入宮血干細(xì)胞中，構(gòu)建獲得了穩(wěn)定高表達(dá)HGF細(xì)胞因子的宮血干細(xì)胞株，并利用該宮血干細(xì)胞株制備獲得了包括細(xì)胞針劑和噴涂劑的干細(xì)胞制劑。本公開的優(yōu)點(diǎn)在于，細(xì)胞針劑中的干細(xì)胞能夠穩(wěn)定高表達(dá)HGF，表達(dá)效率高，效果持久，能夠較長(zhǎng)時(shí)間的維持有效濃度，而且由于干細(xì)胞的歸巢效應(yīng)，能夠更利于藥物在體內(nèi)歸巢到需要進(jìn)行創(chuàng)傷修復(fù)的部位，達(dá)到更好的修復(fù)創(chuàng)傷、抑制瘢痕的作用。同時(shí)由于宮血干細(xì)胞能分泌豐富的細(xì)胞因子，如表皮生長(zhǎng)因子EGF、神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF等，可以更好的有助于創(chuàng)傷的修復(fù)。利用宮血干細(xì)胞株的培養(yǎng)上清所制備的噴涂劑中含有宮血干細(xì)胞所分泌的各種細(xì)胞因子及營養(yǎng)成分，這些細(xì)胞因子和營養(yǎng)成分能夠與肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF發(fā)揮協(xié)同作用進(jìn)行創(chuàng)傷修復(fù)。聯(lián)合使用所述干細(xì)胞制劑中的細(xì)胞針劑和噴涂劑，可以通過二者的協(xié)同增效作用促進(jìn)皮膚傷口有效、高質(zhì)量的快速愈合，減少瘢痕產(chǎn)生。為安全、有效的利用HGF的治療作用提供了新的途徑。
本公開的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說明。
具體實(shí)施方式
以下對(duì)本公開的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式僅用于說明和解釋本公開，并不用于限制本公開。
本公開提供一種用于創(chuàng)傷修復(fù)、瘢痕抑制的基因重組干細(xì)胞制劑的制備方法，所述干細(xì)胞制劑包括獨(dú)立存放的細(xì)胞針劑和噴涂劑；該制備方法包括：
(1)將SEQ ID NO.1所示的慢病毒載體pLVX-EF1α-hHGF包裝為慢病毒感染顆粒后感染宮血干細(xì)胞，并篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF的細(xì)胞系；所述宮血干細(xì)胞為CD3陽性且CD28陽性的宮血干細(xì)胞；
(2)將穩(wěn)定表達(dá)HGF的細(xì)胞系進(jìn)行4-6代的擴(kuò)增培養(yǎng)，然后在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)48-72小時(shí)，接著分離出細(xì)胞成分和培養(yǎng)上清；
(3)將所述細(xì)胞成分制備為細(xì)胞針劑；將所述培養(yǎng)上清制備為噴涂劑。
其中，所述慢病毒載體pLVX-EF1α-hHGF的啟動(dòng)子為EF1α啟動(dòng)子，利用該啟動(dòng)子使得HGF在原代細(xì)胞中的表達(dá)具有較高的啟動(dòng)效率。所述慢病毒載體pLVX-EF1α-hHGF的核苷酸序列可以通過基因工程方法改造現(xiàn)有的商品化載體得到或通過序列合成方法得到。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過包括如下步驟的方法制備擴(kuò)增培養(yǎng)的宮血干細(xì)胞：
S1、采集月經(jīng)產(chǎn)物，將月經(jīng)產(chǎn)物中的宮血與子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行分離；
S2、分離出宮血中的單核細(xì)胞，并對(duì)分離得到的單核細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，得到第一貼壁細(xì)胞；
S3、將子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行胰酶消化和細(xì)胞分離，并且對(duì)分離得到的細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，得到第二貼壁細(xì)胞；
S4、將所述第一貼壁細(xì)胞和所述第二貼壁細(xì)胞混合并進(jìn)行4-6代的傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，得到傳代擴(kuò)增細(xì)胞；
S5、用抗人CD3/CD28磁珠從所述傳代擴(kuò)增細(xì)胞中分離出CD3陽性且CD28陽性的宮血干細(xì)胞。
其中，在步驟S2中，可以利用Ficoll分離液對(duì)宮血進(jìn)行密度梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞，并用生理鹽水、PBS或空白培養(yǎng)基重懸單個(gè)核細(xì)胞后離心去除紅細(xì)胞、血小板和細(xì)胞碎片等雜質(zhì)。然后利用無血清培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。可選的，所述無血清培養(yǎng)基可以為GIBCOMSC SFM培養(yǎng)基。
其中，在步驟S3中，可以采用過篩網(wǎng)的方式使胰酶消化后的細(xì)胞分離，并用生理鹽水、PBS或空白培養(yǎng)基重懸單個(gè)核細(xì)胞后離心去除紅細(xì)胞、血小板和細(xì)胞碎片等雜質(zhì)。然后利用GIBCOMSC SFM培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。
其中，在步驟S4中，將第一貼壁細(xì)胞和第二貼壁細(xì)胞混合時(shí)二者的比例沒有特別的限制可以根據(jù)每種貼壁細(xì)胞的總量進(jìn)行靈活的調(diào)整。
其中，在步驟S5中，抗人CD3/CD28磁珠能夠與傳代擴(kuò)增細(xì)胞中CD3陽性和CD28陽性的宮血干細(xì)胞的表面標(biāo)志物發(fā)生特異性結(jié)合，從而達(dá)到細(xì)胞分離的目的，可選的，所述CD3/CD28磁珠可以為購自Thermo Fisher公司的商品化產(chǎn)品。
在本公開的一種實(shí)施方式中，在用慢病毒感染顆粒感染宮血干細(xì)胞前優(yōu)選使用含有20-40IU/mL的IL-2的培養(yǎng)基對(duì)CD3陽性且CD28陽性的宮血干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，并且將擴(kuò)增后的CD3陽性且CD28陽性的宮血干細(xì)胞用于慢病毒感染顆粒感染。
在本公開的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過包括如下步驟的方法制備慢病毒感染顆粒：
SSS1、在所述宮血干細(xì)胞中加入含有所述慢病毒感染顆粒的懸液以及聚凝胺，接著在30-35℃和500-600×g的離心速度下離心20-40min，然后培養(yǎng)20-26h，得到待篩選的培養(yǎng)物；
SSS2、在所述待篩選的培養(yǎng)物中加入抗生素進(jìn)行篩選，然后分離存活的細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)HGF的細(xì)胞系。
其中，在步驟SS1中，可以利用本領(lǐng)域常用的轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，例如可以使用PEI作為轉(zhuǎn)染試劑。可選的，為了提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率，可以采用電穿孔方法進(jìn)行慢病毒載體的轉(zhuǎn)染。
其中，在步驟SS2中，優(yōu)選使用opti-MEM培養(yǎng)基對(duì)所述轉(zhuǎn)染后的包裝細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中每5-8小時(shí)更換一次培養(yǎng)基，也可以在培養(yǎng)基中加入滴度增強(qiáng)劑以增加病毒滴度。收集轉(zhuǎn)染46-50小時(shí)后的細(xì)胞培養(yǎng)液并離心去除雜質(zhì)獲得純度較高的慢病毒感染顆粒。
在本公開的一種實(shí)施方式中，慢病毒感染顆粒感染宮血干細(xì)胞并篩選的操作包括：
SSS1、在所述宮血干細(xì)胞中加入含有所述慢病毒感染顆粒的懸液以及聚凝胺(polybrene)，接著在30-35℃和500-600×g的離心速度下離心20-40min，然后培養(yǎng)20-26h，得到待篩選的培養(yǎng)物；
SSS2、在所述待篩選的培養(yǎng)物中加入抗生素進(jìn)行篩選，然后分離存活的細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)HGF的細(xì)胞系。
其中，穩(wěn)定表達(dá)HGF的細(xì)胞系在熒光顯微鏡下可以被觀察到發(fā)出綠色熒光。
在步驟SSS1中，所述慢病毒感染顆粒在轉(zhuǎn)染體系中的滴度可以為3-6×107TU/mL，聚凝胺在轉(zhuǎn)染體系中的終濃度可以為3-10μg/mL。
并且，將穩(wěn)定表達(dá)HGF的細(xì)胞系進(jìn)行4-6代的擴(kuò)增培養(yǎng)時(shí)，所用的培養(yǎng)基為含有20-40IU/mL的IL-2的培養(yǎng)基。優(yōu)選的，用于擴(kuò)增培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)HGF的細(xì)胞系的培養(yǎng)基為含有雙抗(青霉素和鏈霉素)和20-40IU/mLIL-2的GIBCOMSC SFM培養(yǎng)基。
在本公開的一種實(shí)施方式中，將所述細(xì)胞成分制備為細(xì)胞針劑的操作包括：將細(xì)胞與注射緩沖液混合；
所述針劑中還可以含有營養(yǎng)成分，所述營養(yǎng)成分選自透明質(zhì)酸、多肽、維生素、氨基酸和核酸中的至少一種；所述注射緩沖液為生理鹽水、磷酸緩沖液、葡萄糖注射液或檸檬酸緩沖液；所述細(xì)胞針劑中的細(xì)胞濃度為0.1-1×107個(gè)/mL。
本發(fā)明中對(duì)于透明質(zhì)酸、多肽、維生素、氨基酸和核酸的具體種類沒有特別的限制，可以為本領(lǐng)域制備創(chuàng)傷修復(fù)類制劑時(shí)所常用的成分。
在本公開的一種可選的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞針劑中還可以含有趨化因子，所述趨化因子能夠趨化宮血干細(xì)胞靶向創(chuàng)傷修復(fù)部位，可選的，所述趨化因子的種類包括SDF-1(細(xì)胞衍生因子-1)和ActivinB中的至少一種。
在本公開的一種可選的實(shí)施方式中，將所述培養(yǎng)上清制備為噴涂劑的操作包括：
用3KD的超濾濃縮離心管對(duì)所述培養(yǎng)上清進(jìn)行超濾濃縮，獲得培養(yǎng)上清的8-10倍濃縮液；將所述濃縮液制備為噴劑。在本公開的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，可以將所述濃縮液與營養(yǎng)成分混合；所述營養(yǎng)成分選自透明質(zhì)酸、多肽、維生素、氨基酸和核酸中的至少一種。
其中，所述濃縮液中含有分子量為3KD以上的由干細(xì)胞所分泌的各種細(xì)胞因子。
在本公開的一種實(shí)施方式中，可以對(duì)所述濃縮液進(jìn)行濾膜過濾，再將能夠通過濾膜的部分置于無菌瓶中，在-20℃下保存待用，所述濾膜的孔徑可以為0.22μm。
噴涂劑中還可加入助懸劑，如聚乙烯吡咯烷酮、微晶纖維素、蔗糖、羥丙基甲基纖維素等；防腐劑，如尼泊金類、苯甲酸鈉、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯等。
本公開還提供了利用本公開所述的方法制備的用于創(chuàng)傷修復(fù)的干細(xì)胞制劑。
本公開還提供了穩(wěn)定表達(dá)HGF的宮血干細(xì)胞在制備修復(fù)皮膚損傷和/或抑制瘢痕產(chǎn)生的藥物中的用途；其中，穩(wěn)定表達(dá)HGF的宮血干細(xì)胞通過包括如下步驟的方法制備得到：
(1)將SEQ ID NO.1所示的慢病毒載體pLVX-EF1α-hHGF包裝為慢病毒感染顆粒后感染宮血干細(xì)胞，并篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF的細(xì)胞系；所述宮血干細(xì)胞為CD3陽性且CD28陽性的宮血干細(xì)胞；
(2)將穩(wěn)定表達(dá)HGF的細(xì)胞系進(jìn)行4-6代的擴(kuò)增培養(yǎng)。
以下通過結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實(shí)施例1
1)制備慢病毒感染顆粒：合成SEQ ID NO.1所示的慢病毒載體pLVX-EF1α-hHGF。將慢病毒載體pLVX-EF1α-hHGF與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑混合后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)染后的包裝細(xì)胞；將轉(zhuǎn)染后的包裝細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并收集慢病毒感染顆粒。
2)宮血干細(xì)胞的獲得：采集月經(jīng)產(chǎn)物，將月經(jīng)產(chǎn)物中的宮血與子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行分離；用Ficoll密度梯度離心分離出宮血中的單核細(xì)胞，用生理鹽水重懸單個(gè)核細(xì)胞后離心去除紅細(xì)胞、血小板和細(xì)胞碎片等雜質(zhì)。然后利用GIBCOMSC SFM培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，得到貼壁細(xì)胞；將子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行胰酶消化并過篩分離，用生理鹽水重懸單個(gè)核細(xì)胞后離心去除紅細(xì)胞、血小板和細(xì)胞碎片等雜質(zhì)。然后利用GIBCOMSC SFM培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，得到貼壁細(xì)胞；將上述兩種貼壁細(xì)胞混合并進(jìn)行3代的傳代擴(kuò)增培養(yǎng)(傳代擴(kuò)增培養(yǎng)的培養(yǎng)基為GIBCOMSC SFM培養(yǎng)基)，得到傳代擴(kuò)增細(xì)胞；用抗人CD3/CD28磁珠從傳代擴(kuò)增細(xì)胞中分離出CD3陽性且CD28陽性的宮血干細(xì)胞。
3)慢病毒感染顆粒感染宮血干細(xì)胞：使用含有30IU/mL的IL-2的GIBCOMSC SFM培養(yǎng)基對(duì)CD3陽性且CD28陽性的宮血干細(xì)胞擴(kuò)增3代后用于慢病毒感染顆粒感染；
在宮血干細(xì)胞中加入含有慢病毒感染顆粒的懸液以及聚凝胺獲得轉(zhuǎn)染體系(慢病毒感染顆粒在轉(zhuǎn)染體系中的滴度為5×107TU/mL，聚凝胺在轉(zhuǎn)染體系中的終濃度為8μg/mL)，接著在32℃和520×g的離心速度下離心30min，然后培養(yǎng)24h，得到待篩選的培養(yǎng)物；在待篩選的培養(yǎng)物中加入抗生素進(jìn)行篩選，經(jīng)3次傳代后分離存活的細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)HGF的細(xì)胞系。
在熒光顯微鏡下觀察到發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞，即為已成功導(dǎo)入目的基因的細(xì)胞。
4)干細(xì)胞制劑制備：將穩(wěn)定表達(dá)HGF的細(xì)胞系進(jìn)行P4-P6代的擴(kuò)增培養(yǎng)，所用的培養(yǎng)基為含有20-40IU/mL的IL-2的無血清培養(yǎng)基。擴(kuò)增培養(yǎng)后再將穩(wěn)定表達(dá)HGF的細(xì)胞在GIBCOMSC SFM無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時(shí)，接著分離出細(xì)胞成分和培養(yǎng)上清；
將細(xì)胞成分制備為細(xì)胞針劑：將細(xì)胞與生理鹽水混合；調(diào)整針劑中的細(xì)胞濃度為0.5×107個(gè)/mL制得細(xì)胞針劑。
將培養(yǎng)上清制備為噴涂劑的操作包括：將培養(yǎng)72小時(shí)后的干細(xì)胞培養(yǎng)上清收集到50mL離心管內(nèi)；在25℃和300×g的離心速度下離心5min后棄沉淀。用3KD的超濾管對(duì)干細(xì)胞上清進(jìn)行超濾濃縮，濃縮10倍獲得濃縮液；
將濃縮液用孔徑為0.22μm的濾膜進(jìn)行過濾，收集能通過濾膜的濾液制成噴劑。
實(shí)施例2
實(shí)施例1制備的干細(xì)胞制劑對(duì)Swiss裸鼠創(chuàng)傷修復(fù)試驗(yàn)。
18只體重為18-22g的裸鼠通過腹腔注射氯胺酮-二甲苯胺噻嗪(80mg/kg-12mg/kg；Ref.K-113，Sigma，F(xiàn)rance)進(jìn)行麻醉，將動(dòng)物隨機(jī)分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和3個(gè)對(duì)照組，每組各3只，然后在每只小鼠的右脅用0.5/10刀片進(jìn)行透皮損傷(長(zhǎng)1cm，深大約1到2mm)。
(1)實(shí)驗(yàn)組1和對(duì)照組1
對(duì)照組1受傷后10分鐘在動(dòng)物傷口上局部施用200μL生理鹽水；并經(jīng)尾靜脈注射1ml生理鹽水；
實(shí)驗(yàn)組1受傷后10分鐘在動(dòng)物傷口上局部施用實(shí)施例1中制備的噴涂劑200μL；并經(jīng)尾靜脈注射實(shí)施例1制備的細(xì)胞針劑1ml。
治療后48小時(shí)對(duì)創(chuàng)傷愈合的檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組1經(jīng)治療后傷口完全愈合有上皮形成，平均上皮生長(zhǎng)率達(dá)到100％，而對(duì)照組1經(jīng)治療后傷口仍沒有愈合，仍保持廣泛開放。
(2)實(shí)驗(yàn)組2和對(duì)照組2
對(duì)照組2受傷后10分鐘經(jīng)尾靜脈注射1ml生理鹽水；；
實(shí)驗(yàn)組2受傷后10分鐘經(jīng)尾靜脈注射實(shí)施例1制備的細(xì)胞針劑1ml。
治療后48小時(shí)對(duì)創(chuàng)傷愈合的檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組2經(jīng)治療后傷口已經(jīng)形成上皮，平均上皮生長(zhǎng)率達(dá)到80％，而對(duì)照組2經(jīng)治療后傷口仍沒有愈合，仍保持廣泛開放。
(3)實(shí)驗(yàn)組3和對(duì)照組3
對(duì)照組3受傷后10分鐘在動(dòng)物傷口上局部施用200μL生理鹽水；
實(shí)驗(yàn)組3受傷后10分鐘在動(dòng)物傷口上局部施用實(shí)施例1中制備的噴涂劑200μL。
治療后48小時(shí)對(duì)創(chuàng)傷愈合的檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組3經(jīng)治療后傷口已經(jīng)形成上皮，平均上皮生長(zhǎng)率達(dá)到75％，而對(duì)照組3經(jīng)治療后傷口仍沒有愈合，仍保持廣泛開放。
實(shí)施例3
實(shí)施例1制備的干細(xì)胞制劑抑制Swiss裸鼠瘢痕產(chǎn)生的試驗(yàn)。
6只體重為18-22g的裸鼠通過腹腔注射氯胺酮-二甲苯胺噻嗪(80mg/kg-12mg/kg；Ref.K-113，Sigma，F(xiàn)rance)進(jìn)行麻醉，將動(dòng)物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各3只，然后在每只小鼠的右脅切出一條深入皮下組織的縱向透皮傷口(長(zhǎng)1cm，深大約1-2mm)。
對(duì)照組受傷后10分鐘在動(dòng)物傷口上局部施用200μL生理鹽水；并經(jīng)尾靜脈注射1ml生理鹽水；
實(shí)驗(yàn)組受傷后10分鐘在動(dòng)物傷口上局部施用實(shí)施例1中制備的噴涂劑200μL；并經(jīng)尾靜脈注射實(shí)施例1制備的細(xì)胞針劑1ml。
觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的傷口愈合及瘢痕產(chǎn)生情況。手術(shù)后6-8小時(shí)實(shí)驗(yàn)組就出現(xiàn)疤痕，疤痕持續(xù)10-12天，然后自然脫落。根據(jù)肉眼可見的創(chuàng)傷表面判斷，疤痕下的組織愈合情況正常。受傷3周后，傷口局部的瘢痕平坦柔軟并呈現(xiàn)逐漸不明顯的趨勢(shì)。對(duì)照組的疤痕在兩天后才形成且疤痕表層較不平整，疤痕持續(xù)18-22天，然后自然脫落，根據(jù)肉眼可見的創(chuàng)傷表面判斷，形成了增生性瘢痕，瘢痕明顯高于周圍正常皮膚，局部增厚變硬，表面呈紅紫色，受傷4周后瘢痕狀態(tài)仍沒有明顯改善。
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)本公開的干細(xì)胞制劑治療的傷口與對(duì)照組間存在顯著的區(qū)別，創(chuàng)傷愈合所需時(shí)間更短，瘢痕消退更快，更加平整美觀。
以上詳細(xì)描述了本公開的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本公開并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本公開的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本公開的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這些簡(jiǎn)單變型均屬于本公開的保護(hù)范圍。
另外需要說明的是，在上述具體實(shí)施方式中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本公開對(duì)各種可能的組合方式不再另行說明。
此外，本公開的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本公開的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本公開所公開的內(nèi)容。